专利名称：一种利迪链菌素发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，是涉及一种利迪链霉菌发酵工艺。
背景技术：
利迪链霉菌Streptomyces luteogriseus为我实验室从土壤分离筛选得到，并于2006年4月13日，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，(保藏地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC1692。利迪链霉菌CGMCC1692所产生的利迪链霉素是一个聚酮抗生素，具有抗肿瘤，抗HIV蛋白酶以及抗G+细菌活性，尤其是作为RNA聚合酶抑制剂，近几年受到了越来越多的重视，2005年Cell杂志就有两篇相关的论文。国内目前没有相关产品及文献报道。国外也没有利迪链霉素大规模生产的文献报道。国外的文献资料显示，利迪链霉素的发酵水平都比较低，只能得到很少量的晶体，影响其进一步的研究及应用。因此，有必要放大生产规模，改进发酵控制工艺，提高利迪链霉菌的生产能力，获得更多的利迪链霉素晶体。
发明内容
本发明的目的是提供一种放大生产规模，确定种子和发酵培养基成分及配比，结合菌株的特性，改进发酵过程控制条件，提高利迪链霉菌CGMCC1692的生产水平，得到更多的利迪链霉素晶体的利迪链霉素发酵工艺。
本发明的技术方案概述如下1.一种利迪链菌素发酵工艺，由如下步骤组成(1)配制培养基①摇瓶种子培养基的配制取淀粉4～8g，优选6g，葡萄糖5～15g，优选7.5g，蛋白胨1～5g，优选3g，Mg2SO4·7H2O 0.3～1g，优选0.75g，NaCl 0.3～1g，优选0.75g，加水至100～300ml，优选150ml，分装于3个锥形瓶，灭菌；②种子培养基的配制取淀粉20～60g，优选45g，葡萄糖5～15g，优选7.5g，黄豆饼粉6～15g，优选13.5g，玉米浆3～10g，优选8g，K2HPO40.2～0.7g，优选0.6g，Mg2SO4·7H2O 0.3～0.8g，优选0.75g，NaCl 0.3～0.8g，优选0.75g，泡敌0.1～0.4g，优选0.3g，加水至1.5L，调节pH为6.0～7.5，优选6.8，灭菌；③发酵培养基的配制取淀粉300～900g，优选600g，葡萄糖50～200g，优选100g，黄豆饼粉150～250g，优选200g，玉米浆30～90g，优选60g，K2HPO44～8g，优选6g，Mg2SO4·7H2O 8～12g，优选10g，NaCl 8～12g，优选10g，花生油2～10g，优选6g，泡敌2～8g，优选4g，加水至20L，调节pH为6.0～7.5，优选6.8，灭菌；(2)发酵①摇瓶种子培养将利迪链霉菌(Streptomyces luteogriseus)CGMCC1692接入摇瓶种子培养基中，25～35℃，优选28℃，培养20～70小时，优选培养48小时，制得摇瓶种子液100～300ml；②种子培养将制得的摇瓶种子液接入种子培养基中，在2L种子罐中，通气量2～6L/h，优选通气量为4L/h，搅拌转速400～600rpm，优选500rpm，25～35℃培养20～70小时，优选制28℃培养36小时，得种子培养液；③发酵培养将种子培养液接入装有10～28L无菌发酵培养基的30L发酵罐中，通气量1300～2000L/h，优选1600L/h，搅拌转速400～600rpm，优选500rpm，25～35℃，优选28℃，在0～24小时，用浓氨水或NaOH水溶液调节8.0≥pH≥5.8；优选调节7.5≥pH≥6.0，发酵从24小时开始至终点，连续流加质量比为30～50％的葡萄糖水溶液，纯葡萄糖流加率为0.40～0.70g/l·h，优选0.55g/l·h，硫酸铵0.002～0.005g/l·h，优选0.0035g/l·h，用浓氨水或NaOH水溶液调节8.0≥pH≥6.50，优选7.5≥pH≥6.80，从36～72小时流加丙酸钠0.5～1mg/l·h，优选0.8mg/l·h培养72～120小时，优选培养时间为96小时；(3)将发酵液过滤后，经纯化得利迪链菌素。
纯化过程可以是滤液用乙酸乙酯或乙酸丙酯或乙酸丁酯或二氯甲烷或二氯乙烷或氯仿或丁醇或戊醇或甲基戊酮萃取2～5次，所加溶剂的量是过滤液量的0.5～3倍，于-0.05～-0.15MPa，20～60℃减蒸，浓缩至100～500ml，加浓缩液3～5倍丁烷结晶，过滤干燥，得利迪链菌素。
优选的是所述滤液用乙酸乙酯萃取，所述萃取次数为3次，于-0.10MPa，温度为30℃减蒸，浓缩至200ml，丁烷的加入量为浓缩液的4倍。
本发明的优点是本发明确定了一种适合利迪链菌素大规模生产的新工艺，包括种子和发酵培养基成分及配比的确定，新的发酵控制工艺，以及下游的分离纯化。新工艺的实施，大幅度提高了利迪链菌素的生产水平，得到了预期的利迪链霉素纯品。在国内，第一次制得了利迪链霉素。
图1为利迪链菌素随发酵时间的变化曲线，图中为利迪链霉菌CGMCC1692优化后的发酵生产(Optimized)及摇瓶培养(Control)对比。
图2为利迪链霉菌CGMCC1692发酵生产萃取液的HPLC谱。
图3为LC-ESI-MS分析的总离子流谱及其主峰对应的质量色谱图，样品为利迪链霉菌CGMCC1692发酵96小时所得。
图4为图3中的主峰对应的负离子质量色谱ESI-MS图。
图5为图3中主峰的UV吸收波长谱。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明实施例1种子培养①摇瓶种子培养基的配制取淀粉6g，葡萄糖7.5g，蛋白胨3g，Mg2SO4·7H2O 0.75g，NaCl 0.75g，加水至150ml，分装于三个锥形瓶，121℃保温20分钟灭菌；②种子培养基的配制取淀粉45g，葡萄糖7.5g，黄豆饼粉13.5g，玉米浆8g，K2HPO40.6g，Mg2SO4·7H2O 0.75g，NaCl 0.75g，泡敌0.3g，加水至1.5L，调pH6.8，121℃保温20分钟灭菌；③摇瓶种子培养将利迪链霉菌CGMCC1692接入摇瓶种子培养基中，28℃，培养48小时，制得摇瓶种子液；④种子培养将制得的摇瓶种子液150ml接入种子培养基中，在2L种子罐中，通气量4L/h，搅拌转速500rpm，28℃培养36小时，得种子培养液。
实施例2发酵培养①发酵培养基的制备取淀粉600g，葡萄糖100g，黄豆饼粉200g，玉米浆60g，K2HPO46g，Mg2SO4·7H2O 10g，NaCl 10g，花生油6g，泡敌4g，加水至20L，调pH6.8，121℃保温20分钟灭菌；②发酵将实施例1制得的种子培养液1.5L接入装有20L无菌发酵培养基的30L发酵罐中，通气量1600L/h，500rpm，28℃培养96小时；发酵过程控制在0～24小时，用浓氨水调节7.5≥pH≥6.0，发酵24小时开始至终点，连续流加补入40％的葡萄糖水溶液，纯葡萄糖流加率为0.55g/l·h，硫酸铵流加率为0.0035g/l·h，控制发酵液7.5≥pH≥6.80，由流加浓氨水来实现，36～72小时丙酸钠流加率为0.8mg/l·h；③96小时取样进行HPLC测定，利迪链菌素的效价为312μg/ml。
实施例3代谢产物的分析取发酵96小时的培养液少量，过滤除菌丝体，取样20ml，用同体积的乙酸乙酯萃取三次，汇总萃取液，于-0.08MPa，30℃减蒸至干，加4ml甲醇溶解，用于HPLC及LC-ESI-MS分析。总离子谱(TIC)及质量色谱图(ESI-MS)对比显示，增加的产物为利迪链菌素。
实施例4利迪链菌素的分离纯化将实施例2得到的发酵液过滤，去除菌丝体，用同体积的乙酸乙酯萃取3次，汇总萃取液，于-0.10MPa，30℃减蒸浓缩至200ml，加4倍丁烷结晶，过滤干燥，得利迪链菌素结晶4.2g。
实施例5种子培养①摇瓶种子培养基的配制取淀粉4g，葡萄糖15g，蛋白胨5g，Mg2SO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.3g，加水至100ml，分装于三个锥形瓶，121℃保温20分钟灭菌；②种子培养基的配制取淀粉20g，葡萄糖5g，黄豆饼粉15g，玉米浆8g，K2HPO40.6g，Mg2SO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.8g，泡敌0.1g，加水至1.5L，调pH6.0，121℃保温20分钟灭菌；③摇瓶种子培养将利迪链霉菌CGMCC1692接入摇瓶种子培养基中，25℃，培养70小时，制得摇瓶种子液100ml；④种子培养将制得的摇瓶种子液100ml接入种子培养基中，在2L种子罐中，通气量2L/h，搅拌转速600rpm，35℃培养20小时，得种子培养液。
实施例6①摇瓶种子培养基的配制取淀粉8g，葡萄糖5g，蛋白胨1g，Mg2SO4·7H2O 1g，NaCl1g，加水至300ml，分装于三个锥形瓶，121℃保温20分钟灭菌；②种子培养基的配制取淀粉60g，葡萄糖15g，黄豆饼粉6g，玉米浆3g，K2HPO40.2g，Mg2SO4·7H2O 0.8g，NaCl 0.8g，泡敌0.4g，加水至1.5L，调pH6.0，121℃保温20分钟灭菌；③摇瓶种子培养将利迪链霉菌CGMCC1692接入摇瓶种子培养基中，35℃，培养20小时，制得摇瓶种子液300ml；
④种子培养将制得的摇瓶种子液300ml接入种子培养基中，在2L种子罐中，通气量6L/h，搅拌转速400rpm，25℃培养70小时，得种子培养液。
实施例7①摇瓶种子培养基的配制取淀粉7g，葡萄糖10g，蛋白胨3g，Mg2SO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，加水至200ml，分装于三个锥形瓶，121℃保温20分钟灭菌；②种子培养基的配制取淀粉30g，葡萄糖10g，黄豆饼粉11g，玉米浆10g，K2HPO40.7g，Mg2SO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.3g，泡敌0.2g，加水至1.5L，调pH7.5，121℃保温20分钟灭菌；③摇瓶种子培养将利迪链霉菌CGMCC1692接入摇瓶种子培养基中，30℃，培养40小时，制得摇瓶种子液200ml；④种子培养将制得的摇瓶种子液200ml接入种子培养基中，在2L种子罐中，通气量4L/h，搅拌转速500rpm，30℃培养50小时，得种子培养液。
实施例8发酵培养①发酵培养基的制备取淀粉900g，葡萄糖50g，黄豆饼粉250g，玉米浆90g，K2HPO48g，Mg2SO4·7H2O 8g，NaCl 12g，花生油10g，泡敌8g，加水至20L，调pH7.5，121℃保温20分钟灭菌。②发酵将实施例6制得的种子培养液1.5L接入装有10L无菌发酵培养基的30L发酵罐中，400rpm，通气量2000L/h，25℃培养120小时；发酵过程控制在0～24小时，用NaOH水溶液调节8.0≥pH≥5.8，发酵24小时开始至终点，连续流加补入30％的葡萄糖水溶液，纯葡萄糖流加率为0.70g/l·h，硫酸铵流加率为0.002g/l·h，控制发酵液8.0≥pH≥6.50，由流加NaOH水溶液调节来实现，36～72小时丙酸钠流加率为0.5mg/l·h。
实施例9发酵培养①发酵培养基的制备取淀粉300g，葡萄糖200g，黄豆饼粉150g，玉米浆30g，K2HPO44g，Mg2SO4·7H2O 12g，NaCl 8g，花生油2g，泡敌2g，加水至20L，调pH6.0，121℃保温20分钟灭菌；②发酵将实施例5制得的种子培养液1.5L接入装有28L无菌发酵培养基的30L发酵罐中，600rpm，通气量1300L/h，35℃培养72小时；发酵过程控制在0～24小时，用浓氨水调节8.0≥pH≥5.8，发酵从24小时开始至终点，连续流加质量百分比为50％的葡萄糖水溶液，纯葡萄糖流加率为0.40g/l·h，硫酸铵流加率为0.005g/l·h，控制发酵液8.0≥pH≥6.50，由流加浓氨水调节来实现，36～72小时丙酸钠流加率为1mg/l·h。
实施例10利迪链菌素的分离纯化将实施例2得到的发酵液过滤，去除菌丝体，用2倍体积的乙酸丙酯萃取2次，汇总萃取液，于-0.05MPa，20℃减蒸浓缩至100ml，加3倍丁烷，过滤干燥，得利迪链菌素结晶。
实施例11利迪链菌素的分离纯化将实施例8得到的发酵液过滤，去除菌丝体，用3倍体积的乙酸丁酯萃取5次，汇总萃取液，于-0.15MPa，60℃减蒸浓缩至500ml，加3倍丁烷，过滤干燥，得利迪链菌素结晶。
实施例12利迪链菌素的分离纯化将实施例8得到的发酵液过滤，去除菌丝体，用0.5倍体积的二氯甲烷萃取4次，汇总萃取液，于-0.10MPa，40℃减蒸浓缩至200ml，加5倍丁烷，过滤干燥，得利迪链菌素结晶。
实施例13利迪链菌素的分离纯化将实施例2得到的发酵液过滤，去除菌丝体，用1倍体积的二氯乙烷萃取3次，汇总萃取液，于-0.10MPa，40℃减蒸浓缩至250ml，加4倍丁烷，过滤干燥，得利迪链菌素结晶。
实施例14步骤同实施例10，所用溶剂为氯仿。
实施例15步骤同实施例10，所用溶剂为丁醇。
实施例16步骤同实施例10，所用溶剂为戊醇。
实施例17步骤同实施例10，所用溶剂为甲基戊酮。
权利要求
1.一种利迪链菌素发酵工艺，其特征是由如下步骤组成(1)配制培养基①摇瓶种子培养基的配制取淀粉4～8g，葡萄糖5～15g，蛋白胨1～5g，Mg2SO4·7H2O0.3～1g，NaCl 0.3～1g，加水至100～300ml，分装于3个锥形瓶，灭菌；②种子培养基的配制取淀粉20～60g，葡萄糖5～15g，黄豆饼粉6～15g，玉米浆3～10g，K2HPO40.2～0.7g，Mg2SO4·7H2O 0.3～0.8g，NaCl 0.3～0.8g，泡敌0.1～0.4g，加水至1.5L，调节pH为6.0～7.5，灭菌；③发酵培养基的配制取淀粉300～900g，葡萄糖50～200g，黄豆饼粉150～250g，玉米浆30～90g，K2HPO44～8g，Mg2SO4·7H2O 8～12g，NaCl 8～12g，花生油2～10g，泡敌2～8g，加水至20L，调节pH为6.0～7.5，灭菌；(2)发酵①摇瓶种子培养将利迪链霉菌(Streptomyces luteogriseus)CGMCC 1692接入摇瓶种子培养基中，25～35℃培养20～70小时，制得摇瓶种子液100～300ml；②种子培养将制得的摇瓶种子液接入种子培养基中，在2L种子罐中，通气量2～6L/h，搅拌转速400～600rpm，25～35℃培养20～70小时，制得种子培养液；③发酵培养将种子培养液接入装有10～28L无菌发酵培养基的30L发酵罐中，通气量1300～2000L/h，搅拌转速400～600rpm，25～35℃，在0～24小时，用浓氨水或NaOH水溶液调节8.0≥pH≥5.8；发酵从24小时开始至终点，连续流加质量比为30～50％的葡萄糖水溶液，纯葡萄糖流加率为0.40～0.70g/l·h，硫酸铵0.002～0.005g/l·h，用浓氨水或NaOH水溶液调节8.0≥pH≥6.50，从36～72小时流加丙酸钠0.5～1mg/l·h，培养72～120小时；(3)将发酵液过滤后，经纯化得利迪链菌素。
2.根据权利要求1所述的一种利迪链菌素发酵工艺，其特征是所述摇瓶种子培养基的配制是取淀粉6g，葡萄糖7.5g，蛋白胨3g，Mg2SO4·7H2O 0.75g，NaCl 0.75g，加水至150ml，灭菌；
3.根据权利要求1所述的一种利迪链菌素发酵工艺，其特征是所述种子培养基的配制是取淀粉45g，葡萄糖7.5g，黄豆饼粉13.5g，玉米浆8g，K2HPO40.6g，Mg2SO4·7H2O 0.75g，NaCl 0.75g，泡敌0.3g，加水至1.5L，调节pH为6.8，灭菌；
4.根据权利要求1所述的一种利迪链菌素发酵工艺，其特征是所述发酵培养基的配制是取淀粉600g，葡萄糖100g，黄豆饼粉200g，玉米浆60g，K2HPO46g，Mg2SO4·7H2O 10g，NaCl 10g，花生油6g，泡敌4g，加水至20L，调节pH为6.8，灭菌；
5.根据权利要求1至4之一所述的一种利迪链菌素发酵工艺，其特征是所述摇瓶种子培养温度为28℃，所述培养时间为48小时。
6.根据权利要求1至4之一所述的一种利迪链菌素发酵工艺，其特征是所述种子培养的通气量为4L/h，搅拌转速为500rpm，培养温度28℃，所述培养时间为36小时。
7.根据权利要求1至4之一所述的一种利迪链菌素发酵工艺，其特征是所述发酵培养的通气量为1600L/h，搅拌转速为500rpm，培养温度为28℃，培养时间为96小时，在0～24小时，调节7.5≥pH≥6.0，发酵从24小时开始至终点，连续流加葡萄糖0.55g/l·h，硫酸铵0.0035g/l·h，用浓氨水或NaOH水溶液调节，7.5≥pH≥6.80，从36～72小时流加丙酸钠0.8mg/l·h。
8.根据权利要求1至4之一所述的一种利迪链菌素发酵工艺，其特征是所述发酵液过滤后纯化过程为滤液用乙酸乙酯或乙酸丙酯或乙酸丁酯或二氯甲烷或二氯乙烷或氯仿或丁醇或戊醇或甲基戊酮萃取2～5次，所加溶剂的量是过滤液量的0.5～3倍，于-0.05～-0.15MPa，20～60℃减蒸，浓缩至100～500ml，加浓缩液3～5倍丁烷结晶，过滤干燥，得利迪链菌素。
9.根据权利要求8所述的一种利迪链菌素发酵工艺，其特征是所述滤液用乙酸乙酯萃取，所述萃取次数为3次，所述压力为-0.10MPa，所述温度为30℃，浓缩至200ml，所述丁烷的加入量为浓缩液的4倍。
全文摘要
本发明公开了一种利迪链菌素发酵工艺，由如下步骤组成(1)配制培养基；(2)发酵将利迪链霉菌(Streptomyces luteogriseus)CGMCC 1692，经摇瓶种子培养基培养和种子培养后接入发酵培养基，在通气，搅拌下，25～35℃，在0～24小时，调节pH，发酵从24小时开始至终点，葡萄糖流加率为0.40～0.70g/l·h，硫酸铵0.002～0.005g/l·h，从36～72小时流加丙酸钠0.5～1mg/l·h，培养72～120小时；(3)经纯化得利迪链菌素，本发明确定了一种适合利迪链菌素大规模生产的新工艺，大幅度提高了利迪链菌素的生产水平，得到了预期的利迪链霉素纯品。
文档编号C12P17/10GK1970775SQ200610015570
公开日2007年5月30日 申请日期2006年9月1日 优先权日2006年9月1日
发明者元英进, 李小兵, 葛志强 申请人:天津大学