安丝菌素的固体发酵方法

专利名称：：安丝菌素的固体发酵方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物工程与
技术领域：
的发酵方法，具体地，涉及一种安丝菌素的固体发酵方法。
背景技术：
：Ansaraitocin(安丝菌素)是珍贵橙色束丝放线菌(Actinosyn固apretiosum)来源的美登素衍生物，其母核为19-C的大环内酰胺环，C-3连接不同长度的碳链，主要活性成份AP-3的侧链为异丁酰基，在低浓度下可抑制非白血性白血病细胞系及人类固体肿瘤。由于肠胃副效应及神经毒性，其研究还停留在临床二阶段。然而，由于安丝菌素可在临床一期中作为抗体毒素结合物及免疫结合物，各方面的研究仍在进行中。固体发酵是接近于自然状态的一种发酵，它与液体深层发酵有许多不同，在较少的能耗和发酵时间下生产更高浓度的产物。与液体发酵比较，珍贵橙色束丝放线菌在固体发酵条件下能产生具有活性的安丝菌素苷类化合物。珍贵橙色束丝放线菌菌丝发达，在YMG固体培养时与培养基结合紧密，无法直接测，因此无法简单直接地用单位体积表征安丝菌素的产量。同时，间接测定方法均有一定的局限性，02和0)2的代谢量会随菌龄变化；测定细胞的特殊生物组分含量会因不定，并且由于菌丝生长的多态性，不同批次的菌体生长量也有很大的不同，这同菌种、培养条件和培养时间而不同，检测时间长、过程繁复影响测定的精确性；对DNA的检测则会受菌体是否产胞外脱氧核糖核酸酶限制等影响。经对现有技术文献的检索发现，目前已报道的野生型珍贵橙色束丝放线菌产安丝菌素主要为液体发酵，一般通过多步骤工艺来回收并提纯安丝菌素。如专利号为US6573074的美国专利中描述了一种提纯安丝菌素的方法，该方法是利用甲苯或二甲苯从发酵液中粗提产物并浓縮，经石油醚沉淀后，再经过各种柱层析进一步分离纯化及结晶，以乙酸乙酯和庚烷为溶剂二次结晶后得到一定产量和纯度的安丝菌素，然而这种方法涉及多种有机溶剂和提取方法，给大规模的工业发酵带来一定的困难。同时，由于珍贵橙色束丝放线菌在液体培养过程中菌丝体成片生长，发酵中后期整个培养体系呈高度粘稠状态，大量菌丝体紧密吸附在培养容器壁，不利于传质，大大减少了产物量。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种安丝菌素的固体发酵方法。本发明中的方法是在固体发酵技术的基础上，通过在琼脂平板上铺一层可再生纤维素薄膜支持物，使得固体发酵完毕可以将菌丝体刮下，简单快速地收集菌丝体，定量单位细胞的产素量，同时通过确定最佳种子活化时间以及固体发酵的最佳接种量来提高安丝菌素的产量，本发明的方法有助于发酵过程优化调控，对工业化生产具有潜在价值。本发明是通过以下技术方案实现的第一步，种子培养将在蔗糖溶液中冷冻保存的产安丝菌素的菌体划线平板，28'C下倒置活化2-9天后转移至种子培养基中，28'C下培养该种子液；所述培养皿直径为10cm，装液量15ml。所述蔗糖溶液中蔗糖的质量百分比为10.3%。第二步，固体发酵将第一步中得到的种子液稀释至102-l(fCFU/ml的浓度涂布到铺有可再生纤维素薄膜支持物的发酵培养基平板上，28。C下培养7天。所述发酵培养基为YMG培养基，其组成成分的重量百分比为酵母提取物质0.4%、麦芽糖1%、葡萄糖0.4%、琼脂粉1.4%和蒸馏水96.8%。所述可再生纤维素薄膜支持物的贴加方法如下可再生纤维素薄膜剪成直径为10cm的圆形，于12rC灭菌20分钟后，50'C烘干，无菌操作条件下，用镊子夹一张纤维膜，贴入倒有培养基的固体平板，并保证纤维膜完全伸展覆盖整个平板。本发明利用可再生纤维素薄膜支持物进行固体发酵菌体收集，并且应用于安丝菌素的固体发酵生产过程中。同时，通过确定最佳种子活化时间以及固体发酵的最佳接种量，并且在此最佳条件下进行固体发酵。本发明的方法与和液体发酵相比安丝菌素的产量高出2倍多，单位细胞含量高出近4倍；同时固体发酵能耗小，样品处理简单，有利于其工业化制备。本发明中所涉及的菌株为珍贵橙色束丝放线菌(ActinosynnemapretiosumATCC31565)。图1不同种子活化时间条件下固体发酵与液体发酵的安丝菌素产量对比图。图2不同接种密度对安丝菌素产量的动态影响图。具体实施例方式以下结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1YMG培养基固体发酵和YMG培养基液体发酵的安丝菌素产量的比较种子及发酵培养种子培养基为YMG培养基，其组成部分的重量百分比为酵母提取物质0.4%、麦芽糖1%、葡萄糖0.4%、琼脂粉1.5%及蒸熘水96.7%，培养皿直径为10cm，装液量15ml。使用保存于质量百分比为10.3%的蔗糖的高浓度菌体划线YMG培养基平板，28'C倒置活化9天，用接种铲接种到装有30mlYMG培养基的250ml的摇瓶中，28°C，220转/分培养2天，按102CFU/ml的接种量涂布于铺有可再生纤维素薄膜支持物的YMG培养基平板，28'C下培养7天，同时以相同接种量用接种铲接种到装有30mlYMG培养基的250ml的摇瓶中，28°C，220转/分培养7天。样品处理及检测方法(1)固体培养结束后，切成小块，用15ml乙酸乙酯浸泡2次，每次1小时，合并两次乙酸乙酯浸泡液；(2)液体培养结束后，发酵液用等体积的乙酸乙酯150转/分混合萃取2次，每次1小时，合并两次乙酸乙酯萃取液。上述乙酸乙酯液于5(TC旋转蒸发后，加入1/10体积的甲醇溶解，0.22iim有机膜过滤后4'C保存备用。C18反向柱(流动相85%甲醇和15%水，流速0.6ml/min)检测安丝菌素含量。实验结果在不同种子活化时间条件下，两种发酵方式的安丝菌素产量如图1所示。实验结果表明固体发酵在不同活化时间的种子条件下，安丝菌素的产量均比液体培养高，接种较短活化时间(5天)的种子，两种发酵方式的安丝菌素产量相差约8倍。实施例2利用可再生纤维素薄膜支持物比较不同培养基组成的固液发酵生产安丝菌素种子培养种子培养基为YMG培养基，其各组成部分的质量百分比为酵母提取物质0.4%、麦芽糖1%、葡萄糖0.4%、琼脂粉1.5%和蒸馏水96.7%，培养皿直径为10cm，装液量15ml。10.3%蔗糖保存的高浓度菌体划线YMG平板，28。C倒置活化5天，用接种铲接种到装有30mlYMG培养基的250ml的摇瓶中，28。C下以220转/分的转速培养2天，逐级稀释后，以106CFU/ml的浓度涂布于铺有可再生纤维素薄膜支持物的YMG平板，28°C，培养9天，同时以相同接种量接种装有30mlYMG培养基的250ml的摇瓶中，28°C，28'C下以220转/分的转速培养9天。。对照组使用的发酵培养基L各组成成分的质量百分比为果糖1%，葡萄糖0.5%、糊精5%，甘油2%，酵母提取粉0.5%，玉米粉1%，氯化铵0.5%，碳酸钙0.5%、磷酸氢二钾0.05%、七水合硫酸亚铁0.0002%、余量为蒸馏水。液体发酵以3.3%的接种量接种于60ml的发酵培养基L，28'C下以220转/分的转速培养9天。固体发酵以106CFU/ml的接种量涂布铺有再生纤维素薄膜支持物的上述发酵培养基L平板(装液量15ml)，28"C下培养9天。样品处理及检测方法(l)液体培养结束后，发酵液于5000转/分离心10min，上清用等体积的乙酸乙酯150转/分混合萃取2次，每次1小时，合并两次乙酸乙酯萃取液。上述乙酸乙酯液于50。C旋转蒸发后，加入1/10体积的甲醇溶解，0.22ym有机膜过滤后4。C保存备用。C18反向柱(流动相85%甲醇和15%水，流速0.6ml/min)检测安丝菌素含量。离心后余下的菌丝体用去离子水洗2次，再用0.1M的的HC1洗一次后，烘干至恒重。(2)固体培养结束后，揭下薄膜，琼脂切成小块，用15ml乙酸乙酯浸泡2次，每次1小时，合并两次乙酸乙酯浸泡液，5(TC旋转蒸发后，加入1/10体积的甲醇溶解，0.22um有机膜过滤后4'C保存备用。C18反向柱(流动相85%甲醇和15%水，流速0.6ml/min)检测安丝菌素含量。纤维薄上的菌体用刀片轻轻刮下，用去离子水洗3次，5(TC烘干至恒重。实验结果固体发酵5天，有80%以上的安丝菌素分泌到琼脂内，随发酵时间增加，高达98%的分泌到琼脂内，因此固体发酵结束后，直接以乙酸乙脂浸提胞外的产物。上述实验结果表明，安丝菌素在固体发酵产量比液体发酵高，与发酵培养基的固体和液体发酵相比，使用YMG培养基进行固体发酵中安丝菌素的产量高出2倍多，单位细胞含量高出近4倍，液体发酵则基本上检测不到产物，结果如表1所示。表l不同培养基组成固液发酵比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>因此证明，使用YMG培养基进行固体发酵，可以获得安丝菌素的最高产量。实施例3利用可再生纤维素薄膜支持物比较固体发酵中不同接种密度对安丝菌素的影响。种子及发酵培养种子培养各组份的质量百分比为酵母提取物质0.4%、麦芽糖1%、葡萄糖0.4%、琼脂粉1.5%和蒸馏水96.7°/。，培养皿直径为10cm,装液量15ml。10.3。/。蔗糖保存的高浓度菌体划线YMG平板，28。C倒置活化2天后，用接种伊伊下一小块接种于盛有30mlYMG培养基且体积为250ml的摇瓶中，28'C下以220转/分的转速培养2天，逐级稀释后，以10tFU/ml的浓度涂布于铺有可再生纤维素薄膜支持物的YMG平板，28°C，培养10天。可再生纤维素薄膜支持物的贴加方法如实施例1所述。样品处理及检测方法(1)固体培养结束后，揭下薄膜，琼脂切成小块，用15ml乙酸乙酯浸泡2次，每次l小时，合并两次乙酸乙酯浸泡液，5(TC旋转蒸发后，加入1/10体积的甲醇溶解，0.22iitn有机膜过滤后4'C保存备用。C18反向柱(流动相85%甲醇和15%水，流速0.6ml/min)检测安丝菌素的含量。(2)纤维薄上的菌体用刀片轻轻刮下，用去离子水洗3次，5or烘干至恒重。为了定量起始接种量，均采用涂布接种，种子采用IO倍稀释法，并涂布O.lml于贴加有纤维膜的YMG琼脂平板；不同的种子密度以单菌落计数(CFU/ml)。实验结果如图2所示，以104CFU/ml(按上述培养的种子液再稀释100倍)的接种量进行固体发酵，安丝菌素的单位细胞含量达20mg/g干细胞，发酵8天后，最高产量达29mg/L，远大于YMG液体发酵。其它批次实验表明，接种密度为107CFU/ml，最高的安丝菌素含量约为4mg/g干细胞，说明固体发酵过程中，接种密度是关键因子。通过添加固体支持物(再生纤维素薄膜)收集菌丝体的方法，能有效地比较固体与液体发酵的安丝菌素含量和效率，为进一步阐明固体与液体发酵机理提供依据一方面从细胞量上比较产素差别，另一方面有利于后续的基因工程操作(如DNA和RNA的提取等)，同时固体发酵样品处理简单，能耗小，有利于大规模制备安丝菌素；并且较低水平的接种密度可减少前期的种子制备。权利要求1、一种安丝菌素的固体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤第一步，种子培养将在蔗糖溶液中冷冻保存的产安丝菌素的菌体划线培养基平板，28℃下倒置活化2-9天后转移至种子培养基中，28℃下培养该种子液；第二步，固体发酵将第一步中得到的种子液稀释至102-106CFU/ml的浓度涂布到铺有可再生纤维素薄膜支持物的发酵培养基平板上，28℃下培养7-10天。2、根据权利要求l所述的安丝菌素的固体发酵方法，其特征是，第一步中所述蔗糖溶液中蔗糖的质量百分比为10.3%。3、根据权利要求l所述的安丝菌素的固体发酵方法，其特征是，第二步中所述发酵培养基为YMG培养基，其组成成分的重量百分比为酵母提取物0.4%、麦芽糖1%、葡萄糖0.4%、琼脂粉1.4%和蒸馏水96.8%。4、根据权利要求l所述的安丝菌素的固体发酵方法，其特征是，第二步中所述可再生纤维素薄膜支持物的贴加方法为可再生纤维素薄膜剪成直径为10cm的圆形，于12rC灭菌20分钟后，5(TC烘干，无菌操作条件下，用镊子夹一张纤维膜，贴入倒有培养基的固体平板，并保证纤维膜完全伸展覆盖整个平板。全文摘要一种安丝菌素的安丝菌素的固体发酵方法，该方法包括如下步骤第一步，种子培养将在蔗糖溶液中冷冻保存的产安丝菌素的菌体划线培养基平板，28℃下倒置活化2-9天后转移至种子培养基中，28℃下培养该种子液；第二步，固体发酵将第一步中得到的种子液稀释至10²-10⁶CFU/ml的浓度涂布到铺有可再生纤维素薄膜支持物的发酵培养基平板上，28℃下培养7-10天。本发明的方法与常规液体发酵方法相比安丝菌素的产量高出2倍多，单位细胞含量高出近4倍；同时固体发酵能耗小，样品处理简单，有利于其工业化制备。文档编号C12P17/18GK101319241SQ200810040688公开日2008年12月10日申请日期2008年7月17日优先权日2008年7月17日发明者林锦霞,钟建江申请人:上海交通大学