专利名称：柿叶提取物的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及以柿叶提取物作为有效成份的纯天然药物制剂，以及其在治疗高血压、冠心病、糖尿病的应用。
背景技术：
柿叶为柿科柿属植物柿(Diospyros kaki L.)的新鲜或干燥叶。本发明对该药进行了大量的研究，实验发现，本品能显著降低大鼠血压、增加冠脉流量、阻抗因心肌缺血引起的心律失常，明显降低大鼠血脂，能拮抗肾上腺素的升糖效应和降低链脲佐菌素所致糖尿病小鼠的血糖，此外还能明显改善糖脂紊乱状况，增加胰岛素的分泌，保护和修复胰岛β细胞，对糖尿病尤其并发症的治疗有较大的潜在应用价值。
目前，尚未发现有把柿叶水提物、醇提物、总黄酮等活性部位制成制剂并用于临床的报告。
发明内容
本发明的目的是把柿叶水提物、醇提物制成片剂、合剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂等药物制剂，应用于高血压、冠心病、糖尿病的治疗。
本发明所采取的技术方案将柿叶粗粉进行水提取、醇提取、提取分离总黄酮，加入适当药用辅料制成片剂、合剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂，并进行药效学研究。
1、柿叶水提物的提取柿叶干燥粗粉，加10倍量水，煮3次，每次2h，收集水煮液，浓缩成稠膏。
2、柿叶醇提物的提取柿叶干燥粗粉，加10倍量95％乙醇，回流提取3次，每次2h，提取液回收乙醇，浓缩成稠膏。
3、柿叶总黄酮的提取分离柿叶粗粉，加10倍量浓度70％乙醇浸泡30min后，回流提取2h，过滤。药渣再加8倍量70％乙醇，回流提取1h，过滤。合并两次滤液，离心(3000γ/min)15min。回收乙醇后，收集提取液，减压浓缩，用石油醚萃取2次，除去叶绿素，弃醚相，水相用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相浓缩干燥得总黄酮。
4、制剂的制备柿叶水提物、醇提物、总黄酮加入适当药用辅料制成片剂、合剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂。
5、抗高血压作用的研究经颈动脉插管用MS4000生物信号定量分析系统测定柿叶水提物、醇提物、总黄酮对大鼠颈动脉压的影响；经灌胃给药用ALC-NIBP无创尾动脉压测量分析系统测尾动脉压，观察柿叶水提物、醇提物、总黄酮对清醒大鼠血压的影响；从右颈动脉插管至左心室，并同时插右侧股动脉，用MPA-心功能分析系统测定柿叶水提物、醇提物、总黄酮对大鼠心率、心肌力学以及心肌氧供需等心脏血流动力学指标的影响。
6、柿叶水提物、醇提物、总黄酮对心脏血流动力学和冠脉流量的影响以Langendorff法制备大鼠离体心脏，观察心肌收缩幅度并测定冠脉流量。
7、柿叶水提物、醇提物、总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用以Wistar大鼠制备MIRI模型(结扎冠状动脉5min后再灌注30min)，观察对心肌梗死面积及心肌组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力及血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)活性生化指标的影响。
8、柿叶提物、醇提物、总黄酮治疗糖尿病作用的研究采用肾上腺素致高血糖小鼠模型和链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)致糖尿病小鼠模型方法研究柿叶水提物、醇提物、总黄酮降低高血糖的作用。
本发明是对广西民族特色天然药物资源进行挖掘整理，将为中草药的深度开发提供新思路，对促进我国中草药产业现代化具有重大意义。为高血压、冠心病及糖尿病的治疗提供一种新的天然药物制剂。
具体实施例方式
1、柿叶水提物的提取1000g柿叶干燥粗粉，加10L水，煮3次，每次2h，收集水煮液，浓缩成稠膏。加入相应辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、合剂。
2、柿叶醇提物的提取1000g柿叶干燥粗粉，加10L95％乙醇，回流提取3次，每次2h，提取液回收乙醇，浓缩成稠膏。加入相应辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、合剂。
3、柿叶总黄酮的提取分离称取柿叶粗粉5.0g，加70％乙醇50ml浸泡30min后，回流提取2h，过滤。药渣再加70％乙醇40ml，回流提取1h，过滤。合并两次滤液，离心(3000γ/min)15min。回收乙醇后，收集提取液，减压浓缩，用石油醚萃取2次，除去叶绿素，弃醚相，水相用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相浓缩干燥得总黄酮。加入相应辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、合剂。
药效学研究1、抗高血压作用的研究1.1颈动脉压的观察Wistar大鼠以乌拉坦(1.2g·kg-1)腹腔麻醉，气管插管，行颈动脉插管，连接BL生物信号分析系统，记录收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均压(MBP)、心率(HR)，同时记录肢体II导朕心电图。股静脉给药，每次均待血压恢复至药前水平10min后再次给药。记录给药前后SBP、DBP、MBP及HR变化情况。结果表明，柿叶水提物、醇提物、总黄酮经股静脉给药有明显降压作用，与药前相比SBP、DBP、MBP，均有P＜0.05或P＜0.01。
表1 柿叶提取物对Wistar大鼠血压的影响(x±s，n＝10)
注与药前比较*P＜0.05，**P＜0.01。黄酮、水提物、醇提物各组剂量均以生药材(g生药/kg)计算1.2SHR尾压的观察用ALC-NIBP无创尾动脉压测量分析系统测定清醒大鼠尾动脉压，观察给药前后血压变化情况。结果发现，给予柿叶水提物、醇提物、总黄酮组大鼠的血压有明显下降，给药40天其降压作用更为明显。
表2 柿叶提取物对SHR大鼠血压的影响(x±s，n＝10)
注与药前比较*P＜0.05，**P＜0.01。黄酮、水提物、醇提物各组剂量均以生药材(g生药/kg)计算。
2、对心脏血流动力学和冠脉流量的影响2.1大鼠心脏血流动力学实验Wistar大鼠以20％乌拉坦0.5mL·kg-1腹腔麻醉，气管插管，从右颈动脉插管入左心室，分离股动脉行股动脉插管，连接MPA-心功能分析系统，观察10min，待稳定后记录心率(HR)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)、左室压上升最大变化速率(dp/dtmax)、左室下降最大变化速率(-dp/dtmax)等心肌收缩和舒张指标。从股静脉给药，每次均待血压恢复至药前水平10min后再次给药。
结果表明，柿叶水提物(25g生药/kg)、醇提物(25g生药/kg)、总黄酮(25g生药/kg)能明显降低HR，LVSP，dp/dtmax，总体上表现出了负性肌力和负性频率作用。
表3 柿叶提取物对大鼠心脏血流动力学的影响(x±s，n＝10)
注与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2.2离体大鼠心脏冠脉流量测定实验以Langendorff法制各离体大鼠心脏，固定好后经压力换能器连接MS4000多媒体生物信号分析系统，记录心收缩幅度，灌注15min后，连续测定3次每分钟冠脉流量(CF)，待值恒定后以蠕动泵通过三通管给药，测定给药前后CF及心收缩幅度。
结果发现，柿叶水提物、醇提物、总黄酮能明显减轻心肌缺血再灌注引起心肌损伤，缩小心肌梗死范围，降低MDA含量，提高心肌组织中SOD活性及降低血清中CK和LDH的活力。
表4 柿叶提取物对大鼠心脏冠脉流量的影响(x±s，n＝10)
注与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。黄酮、水提物、醇提物各组剂量均以生药材(g生药/kg)计算。
3、对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用各组大鼠以乌拉坦(1.2g/kg)腹腔麻醉，气管插管，开胸后立即连接人工呼吸机，再灌注结束后立即取心脏，冷冻后称重，顺房室沟从心尖到心基部将心室切成0.1cm厚的心肌片，置于0.5％NBT溶液中37℃水浴温孵10min染色。沿梗死边缘切取梗死部分心肌并称重，以梗死心肌与全左室肌重的百分比(MI/LV×100％)表示心肌梗死范围。
结果表明，柿叶水提物、醇提物、总黄酮可明显降低心肌梗死范围。
4、治疗糖尿病作用的研究采用肾上腺素致高血糖小鼠模型和链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)致糖尿病小鼠模型方法研究柿叶水提物、醇提物、总黄酮降低高血糖的作用。每天上午给药一次，连续给药15天。期间观察记录小鼠饮食、饮水、体重、大小便等一般情况，并在相应时间采血测定空腹血糖(FBG)、药后2h血糖(2hBG)、甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血清肌酐(Cr)、尿素(BU)、尿酸(UA)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)等指标，并做胰腺组织和肾脏病理切片观察。结果给药15天后，柿叶水提物、醇提物、总黄酮各剂量组能拮抗肾上腺素诱导的小鼠高血糖(P＜0.01或0.05)，并明显降低链脲佐菌素所致糖尿病小鼠的血糖(P＜0.01或0.05)，改善糖尿病小鼠的糖脂代谢紊乱状态，提高胰岛素水平，保护并修复胰岛β细胞。同时柿叶水提物、醇提物、总黄酮能不同程度地降低血清Cr、UA(P＜0.01或0.05)；升高Alb，TP(P＜0.01或0.05)；对升高HDL-C和降低TG、TC、ALT、AST有一定趋势。
实验结果证实，柿叶水提物、醇提物、总黄酮能拮抗肾上腺素的升糖效应和降低链脲佐菌素所致糖尿病小鼠的血糖，此外还能明显改善糖脂紊乱状况，增加胰岛素的分泌，保护和修复胰岛β细胞，对糖尿病尤其并发症的治疗有较大的潜在应用价值。
表5 柿叶提取物对正常小鼠血糖的影响(x±s，n＝10)
注与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。黄酮、水提物、醇提物各组剂量均以生药材(g生药/kg)计算。
表6 柿叶提取物对小鼠肾上腺素性高血糖的影响(x±s，n＝10)
注与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。黄酮、水提物、醇提物各组剂量均以生药材(g生药/kg)计算。
表7 柿叶提取物对链脲霉素糖尿病小鼠血糖的影响(x±s，n＝10)
注与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。a第15天降糖率。黄酮、水提物、醇提物各组剂量均以生药材(g生药/kg)计算。
表8 柿叶提取物对链脲霉素糖尿病小鼠药后2h血糖的影响(x±s，n＝10)
与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
表9 柿叶提取物对链脲霉素糖尿病小鼠血清胰岛素水平的影响(x±s，n＝10)
与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
实施例实施例1、柿叶水提物的提取及其制剂的制备1.1柿叶水提物的制备取柿叶干燥粗粉10kg，加100L水，煮3次，每次2h，过滤，收集水煮液，浓缩成比重为1.3的稠膏。
1.2制水提物片剂取柿叶干燥粗粉10kg，同第1.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入2倍量食用淀粉，并加入80％酒精混均，过筛制粒，60℃下干燥，整粒，加入3％的滑石粉、4％的羧甲基淀粉钠，压片(素片要求为0.3g/片)，包糖衣片(或薄膜衣片)，检查符合规定后即可。
1.3制水提物胶囊剂取柿叶干燥粗粉10kg，同第1.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80％酒精混均，过筛制粒，60℃下干燥，整粒，分装入胶囊(0.5g/颗)。
1.4制水提物颗粒剂取柿叶干燥粗粉10kg，同第1.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加1倍量糊精和1倍糖粉搅拌混合均匀，制成干湿合适的松软团块，压过10目筛子，颗粒于50～60℃干燥，干燥过的颗粒再过12～14目筛，取过筛颗粒装袋密封，规格为10g/袋。
1.5制水提物合剂取柿叶干燥粗粉10kg，同第1.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入5倍量蒸馏水溶解，高压灭菌，加0.1％苯甲酸，分装入瓶中(10ml/瓶)。
1.6制水提物注射剂取柿叶干燥粗粉10kg，同第1.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入10倍量蒸馏水搅拌溶解，过滤，滤液加入0.3％活性炭，煮沸10min，脱色，过滤，冷却后加入0.2％吐温80，搅匀后过滤，在滤液中加入1％～2％苯甲醇，混匀，再用10％氢氧化钠调pH6.5左右，4～8℃保存过夜，经粗滤后，用94号玻璃除菌漏斗过滤，或通过除菌滤板，如未达到澄明度应再过滤一次，除菌后的药液即装入安瓿中，封口。安瓿再次经蒸汽灭菌。
实施例2、柿叶醇提物的提取及其制剂的制备2.1柿叶醇提物的制备取柿叶干燥粗粉1kg，加10L浓度95％乙醇，回流提取3次，每次2h，过滤，提取液回收乙醇，浓缩成比重为1.3的稠膏。
2.2制醇提物片剂取柿叶干燥粗粉1kg，同第2.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80％酒精混均，过筛制粒，60℃下干燥，整粒，加入3％的滑石粉、4％的羧甲基淀粉钠，压片(素片要求为0.2g/片)，包糖衣片(或薄膜衣片)，外观检查符合规定后即可。
2.3制醇提物胶囊剂取柿叶干燥粗粉1kg，同第2.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80％酒精混均，过筛制粒，60℃下干燥，整粒，分装入胶囊(0.2g/颗)。
2.4制醇提物颗粒剂取柿叶干燥粗粉1kg，同第2.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加1倍量糊精和1倍糖粉搅拌混合均匀，制成干湿合适的松软团块，压过10目筛子，颗粒于50～60℃干燥，干燥过的颗粒再过12～14目筛，取过筛颗粒装袋密封，规格为1g/袋。
2.5制醇提物合剂取柿叶干燥粗粉1kg，同第2.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入5倍量蒸馏水溶解，高压灭菌，加0.1％苯甲酸，分装入瓶中(10ml/瓶)。
2.6制醇提物注射剂取柿叶干燥粗粉1kg，同第2.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入10倍量蒸馏水搅拌溶解，过滤，滤液加入0.3％活性炭，煮沸10min，脱色，过滤，冷却后加入0.2％吐温80，搅匀后过滤，在滤液中加入1％～2％苯甲醇，混匀，再用10％氢氧化钠调pH6.5左右，4～8℃保存过夜，经粗滤后，用94号玻璃除菌漏斗过滤，或通过除菌滤板，如未达到澄明度应再过滤一次，除菌后的药液即装入安瓿中，封口。安瓿再次经蒸汽灭菌。
实施例3、柿叶总黄酮的提取及其制剂的制备3.1柿叶总黄酮的制备称取柿叶粗粉1kg，加70％乙醇10L浸泡30min后，回流提取2h，过滤。药渣再加70％乙醇80L，回流提取1h，过滤。合并两次滤液，离心(3000γ/min)15min。回收乙醇后，收集提取液，减压浓缩，用石油醚萃取2次，除去叶绿素，弃醚相，水相用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相浓缩干燥得总黄酮。
3.2制总黄酮片剂取柿叶干燥粗粉1kg，同第3.1项方法制备总黄酮，称重并记录总黄酮重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80％酒精混均，过筛制粒，60℃下干燥，整粒，加入3％的滑石粉、4％的羧甲基淀粉钠，压片(素片要求为0.1g/片)，包糖衣片(或薄膜衣片)，外观检查符合规定后即可。
3.3制总黄酮胶囊剂取柿叶干燥粗粉1kg，同第3.1项方法制备总黄酮，称重并记录总黄酮重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80％酒精混均，过筛制粒，60℃下干燥，整粒，分装入胶囊(0.2g/颗)。
3.4制总黄酮颗粒剂取柿叶干燥粗粉1kg，同第3.1项方法制备总黄酮，称重并记录总黄酮重量，加1倍量糊精和1倍糖粉搅拌混合均匀，制成干湿合适的松软团块，压过10目筛子，颗粒于50～60℃干燥，干燥过的颗粒再过12～14目筛，取过筛颗粒装袋密封，规格为0.5g/袋。
3.5制总黄酮合剂取柿叶干燥粗粉1kg，同第3.1项方法制备总黄酮，称重并记录总黄酮重量，加入5倍量蒸馏水搅拌混匀，高压灭菌，加0.1％苯甲酸，分装入瓶中(10ml/瓶)。
3.6制总黄酮注射剂取柿叶干燥粗粉1kg，同第3.1项方法制备总黄酮，称重并记录总黄酮重量，加入10倍量蒸馏水并用10％氢氧化钠调pH7.2搅拌溶解，过滤，滤液加入0.3％活性炭，煮沸10min，脱色，过滤，冷却后加入0.2％吐温80，搅匀后过滤，在滤液中加入1％～2％苯甲醇，混匀，再用10％氢氧化钠调pH7.2左右，4～8℃保存过夜，经粗滤后，用94号玻璃除菌漏斗过滤，或通过除菌滤板，如未达到澄明度应再过滤一次，除菌后的药液即装入安瓿中，封口。安瓿再次经蒸汽灭菌。
权利要求
1.一种治疗高血压、冠心病、糖尿病的柿叶水提物制剂，其特征在于柿叶水提物是从柿叶粗粉水提取分离得到，加入相应药用辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、合剂。
2.根据权利要求1所述的柿叶水提物制剂，其特征在于柿叶水提物制剂用于治疗高血压、冠心病、糖尿病。
3.一种治疗高血压、冠心病、糖尿病的柿叶醇提物制剂，其特征在于柿叶醇提物是从柿叶粗粉用乙醇提取分离得到，加入相应药用辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、合剂。
4.根据权利要求3所述的柿叶醇提物制剂，其特征在于柿叶醇提物制剂用于治疗高血压、冠心病、糖尿病。
5.一种治疗高血压、冠心病、糖尿病的柿叶总黄酮制剂，其特征在于柿叶总黄酮是从柿叶粗粉提取分离得到，加入相应药用辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、合剂。
6.根据权利要求5所述的柿叶总黄酮制剂，其特征在于柿叶总黄酮的制备方法是柿叶粗粉，加10倍量浓度70％乙醇浸泡30min后，回流提取2h，过滤；药渣再加8倍量70％乙醇，回流提取1h，过滤；合并两次滤液，离心，回收乙醇后，收集提取液，减压浓缩，用石油醚萃取2次，除去叶绿素，弃醚相，水相用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相浓缩干燥得总黄酮。
7.根据权利要求5所述的柿叶总黄酮制剂，其特征在于柿叶总黄酮制剂用于治疗高血压、冠心病、糖尿病。
全文摘要
本发明是从广西民间药材柿叶粗粉提取分离得到柿叶水提物、醇提物和总黄酮。加入适当药用辅料制成片剂、合剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂。申请人对该药进行了大量的研究，实验发现，本品能显著降低大鼠血压、增加冠脉流量、阻抗因心肌缺血引起的心律失常，明显降低大鼠血脂，能拮抗肾上腺素的升糖效应和降低链脲佐菌素所致糖尿病小鼠的血糖，此外还能明显改善糖脂紊乱状况，增加胰岛素的分泌，保护和修复胰岛β细胞，对糖尿病尤其并发症的治疗有较大的潜在应用价值。本发明的研究是对民间药材进行挖掘整理，将为民族草药的深度开发提供新思路，对促进中草药产业现代化具有重大意义。
文档编号A61K9/08GK101028328SQ200710034708
公开日2007年9月5日 申请日期2007年4月6日 优先权日2007年4月6日
发明者黄仁彬, 蒋伟哲, 林兴, 焦杨, 张程修, 覃斐章, 罗昱澜, 邓航, 付书婕, 谢海源 申请人:黄仁彬