专利名称：小鼠皮肤冷冻保存方法
技术领域：
本发明涉及种质资源保存、转基因、低温冷冻保存、组织工程等领域。
背景技术：
核移植技术的诞生对转基因动物生产和灭绝品种的恢复以及资源保存带来了新的希望。核移植技术需要两个细胞体系的支持，一是来自受体卵巢组织的卵母细胞，另一是来自供体的胚胎干细胞或体细胞。目前科学家们已经成功地能将活体采样得来的胎儿和成年动物的体细胞在体外培养而卵母细胞的获得常常受到母畜繁殖周期的制约，在临床上会出现供与需时间不相一致的矛盾。目前卵巢组织和体细胞的冷冻保存已经被广泛地应用在包括人、鼠、兔、羊、牛、猪、绒猴和大象等物种的临床研究和动物育种中。通常可作为冷冻保护剂应用的化学物质有二甲基亚砜(DMSO)、甘油(GLY)、乙二醇(EG)、丙二醇(PROH)、甲醇等。但它们对不同物种和不同细胞的适应性差异较大。有关组织细胞对各类保护剂的耐受性和保存效果的研究仅见于人、牛卵巢组织和牛胎儿皮肤细胞。
发明内容
本发明目的是研究一种针对小鼠的皮肤冷冻保存方法，以建立冷冻保存体细胞的新方法。
将小鼠皮肤组织置于冷冻保护液中，用干冰熏蒸法冷冻至保护液冻结后，转移置-80℃的冷冻器中。
本发明可通过以下三种具体方法实现方法一冷冻前，先将小鼠皮肤组织在环境温度为4℃条件下平衡20～25min，然后，将小鼠皮肤组织置于含10％～30％的甘油(GLY)的冷冻保护液中，用干冰熏蒸法或液氮冷冻至保护液冻结后，转移置-80℃的冷冻器中。
方法二冷冻前，先将小鼠皮肤组织在环境温度为22℃条件下平衡20～25min，然后，将小鼠皮肤组织置于含10％～30％的丙二醇(PROH)的冷冻保护液中，用干冰熏蒸法或液氮冷冻至保护液冻结后，转移置-80℃的冷冻器中。
方法三冷冻前，先将小鼠皮肤组织在环境温度为4℃条件下平衡20～25min，然后，将小鼠皮肤组织置于含10％～30％的二甲基亚砜(DMSO)的冷冻保护液中，用干冰熏蒸法或液氮冷冻至保护液冻结后，转移置-80℃的冷冻器中。
以上方法均可获得对小鼠组织冷冻保存，解冻后，皮肤组织生长能力。本发明无需特殊的冷冻仪器要求，简单容易操作，体细胞组织样本的收集非常方便，适合于珍稀动物或珍贵细胞的长期保存。
为了降低冷冻剂对细胞的毒性以及对冷冻前细胞内外渗透压的平衡，特设定冷冻前，分别在4℃和22℃环境温度下，将小鼠皮肤组织置于冷冻保护剂中平衡。
为了使冷冻前细胞内外渗透压达到充分的平衡，上述平衡时间为20～25min。
另，甘油浓度为10％，或二甲基亚砜浓度为10％，或丙二醇浓度为20％时生长效果最好。
具体实施例方式
1、新鲜皮肤样本的获取脱臼法处死，切开腹部皮肤，使皮下组织暴露出来。收集皮下组织和皮肤底层组织，置于盛有预热的无菌PBS的培养皿中，漂洗4～5次，剪成1mm3大小的组织块。随机挑取10～20块新鲜组织块，用EDTA-牛血浆贴附在25mm2培养瓶内壁上直接进行培养作为对照，Hoechst染色鉴定细胞生长情况。
2、皮肤组织的毒性试验在4℃和22℃两个不同条件下分别置于三个梯度浓度(10％、20％、30％)的三种不同冷冻保护剂(二甲基亚砜DMSO、甘油GLY、丙二醇PROH)中。20～25min后，用预热的新鲜培养液分别漂洗三次。EDTA-牛血浆贴附在25mm2培养瓶内壁上直接进行培养，Hoechst染色鉴定细胞生长情况。
结果观察到组织在22℃平衡条件下，生长率比在4℃平衡条件下均高。小鼠组织在4℃平衡条件下，在甘油GLY中的生长情况较二甲基亚砜DMSO、丙二醇PROH好，差异显著(P＜0.05)。各浓度之间以10％GLY，20％PROH生长效果最好，与其他浓度之间差异显著(P＜0.05)。但在22℃平衡条件下，在DMSO中的生长情况最好，各浓度之间以10％DMSO，20％PROH生长效果最好，其余保护液较差。
3、皮肤组织的冷冻和解冻冷冻及解冻的过程如下随机取3～5块皮肤组织块放入到事先装有0.5ml不同浓度不同保护液的冷冻管中，然后分成四组进行处理。第一组在室温下平衡20～25min，第二组未经平衡作为对照。第三和第四组均在室温下平衡20～25min。第三组经平衡后在干冰上降温并冷冻保存，而第四组则直接投入液氮中保存，之后捞取并保存在-80℃条件下。干冰降温过程是将冷冻管放在干冰面上方支架上慢速降温至培养液冻结后转移置-80℃的冷冻器中。经过1～2周的低温保存后，将冷冻管取出直接放到37℃的水浴中解冻1-1.5min。用含10％FCS的新鲜预热的DMEM漂洗3次，去除冷冻保护剂。在经过解冻后，将这些组织用EDTA-牛血浆贴附在25mm2培养瓶内壁上添加培养液进行培养。
4、冷冻后皮肤组织的培养小鼠皮肤组织培养液组成为含10％FCS、2mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1％非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM。Hoechst染色鉴定细胞生长情况。
皮肤组织置培养瓶中，每天换新鲜的培养液进行培养。
在培养11天内，成年小鼠(120日龄以上)皮肤组织生长能力差，不易扩展，生长率平均为25.0％，冷冻后的情况与此相似。然而，幼龄小鼠(45日龄以下)的皮肤组织的生长率为100％。组织的生长率受皮肤扩展能力和来源的影响。小鼠的结缔组织(85.7％)比皮肤底层(66.7％)更容易培养。同样，幼龄小鼠皮肤(100％)比成年小鼠(25.0％)的生长率高。小鼠新鲜的皮肤组织(57.1％)比耳组织(25％)的生长率高。但是，组织长出细胞的能力和开始生长细胞的时间有个体差异。
结果显示，对小鼠皮肤组织来说，所有组织解冻后开始生长的时间比新鲜组织晚3-4天。在分别用干冰和液氮降温时，GLY和DMSO作为保护剂的生长率均比较高。但是，10％GLY的保护效果明显好于其它组和对照组，生长率(干冰和液氮)分别为33.3％和19.4％，差异非常显著(P＜0.01)。此外，用液氮降温冷冻的组织，保存在30％GLY，20％PROH和30％PROH中的组织均未见有细胞生长。结果还显示冷冻前在保护液中平衡25min和不平衡时，用GLY，DMSO和PROH保护的组织生长情况之间存在显著差异(P＜0.01)。
本发明比较了二甲基亚砜(DMSO)、甘油(GLY)、丙二醇(PROH)三种不同冷冻保护剂以不同梯度浓度，采用干冰和液氮降温对小鼠组织冷冻保存的效果。并将新鲜组织块直接暴露在DMSO，GLY和PROH中进行毒性试验。用本方法保存结果证明，用干冰冷冻和10％GLY做保护剂对保存小鼠皮肤组织最有效。
权利要求
1.小鼠皮肤冷冻保存方法，其特征在于将小鼠皮肤组织置于冷冻保护液中，用干冰熏蒸法冷冻至保护液冻结后，转移置-80℃的冷冻器中。
2.根据权利要求1所述小鼠皮肤冷冻保存方法，其特征在于所述冷冻保护液是浓度为10％～30％的甘油，冷冻前，先在环境温度为4℃条件下平衡20～25min。
3.根据权利要求2所述小鼠皮肤冷冻保存方法，其特征在于所述甘油浓度为10％。
4.根据权利要求1所述小鼠皮肤冷冻保存方法，其特征在于所述冷冻保护液是浓度为10％～30％的丙二醇，冷冻前，先在环境温度为22℃条件下平衡20～25min。
5.根据权利要求4所述小鼠皮肤冷冻保存方法，其特征在于所述丙二醇浓度为20％。
6.根据权利要求1所述小鼠皮肤冷冻保存方法，其特征在于所述冷冻保护液是浓度为10％～30％的二甲基亚砜，冷冻前，先在环境温度为22℃条件下平衡20～25min。
7.根据权利要求6所述小鼠皮肤冷冻保存方法，其特征在于所述二甲基亚砜浓度为10％。
全文摘要
小鼠皮肤冷冻保存方法，涉及种质资源保存、转基因、低温冷冻保存、组织工程等领域。将小鼠皮肤组织置于冷冻保护液中，用干冰熏蒸法冷冻至保护液冻结后，转移置－80℃的冷冻器中。通过本发明可获得对小鼠组织冷冻保存，解冻后，皮肤组织生长能力。本发明无需特殊的冷冻仪器要求，简单容易操作，体细胞组织样本的收集非常方便，适合于珍稀动物或珍贵细胞的长期保存。
文档编号C12N5/06GK1821392SQ20061003861
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月2日 优先权日2006年3月2日
发明者李碧春 申请人:扬州大学