专利名称：Cpt－2晶体的制作方法
内碱棕榈酰转移酶(CPT)系统促进长链脂肪酸进入高等真核细胞的线粒体。CPT-1整合到线粒体外膜上并且催化长链酰基部分从酰基辅酶A转移到肉碱上。逆反应通过定位在线粒体内膜基质侧的蛋白质CPT-2实现。调节组织特异性CPT-1同种型的催化活性是开发针对非胰岛素依赖型(2型)糖尿病和肥胖症的新药的焦点。
蛋白质的晶体结构可用于鉴定和优化结合至酶活性位点的化合物。迄今为止，CPT-2的晶体结构还没有被解出。
本发明涉及单独的全长大鼠CPT-2的结构或者与可逆CPT抑制剂ST1326(模仿棕榈酰肉碱的底物类似物)复合的全长大鼠CPT-2的结构。在与ST1326形成的复合体中CPT-2的结构使我们了解了在CPT-1/2中保守的残基和短链转移酶在蛋白质-配体相互作用中的作用。
确定了3种不同晶形的CPT-2的结构，对于脱辅基酶在2.0和1.6的分辨率下确定并且对于与ST1326形成的复合物在2.5分辨率下确定(详见实施例和表1)。
CPT-2的总体折叠情况可再分为氨基末端结构域(残基111-440)和羧基末端结构域(残基441-658，加上残基32-110)。这些结构域由六个中心反平行β链和周围的α螺旋组成(
图1/2)，其中两个β链(β1，β16)介导主要结构域的接触。CPT-2的二级结构包含27个α螺旋和18条β链。连接螺旋22和23的环在脱辅基结构中采用了螺旋构象因此被定义为螺旋22B。ST1326复合物结构中的相应区域接近于晶体接触处，这可能会干扰二级结构的形成。与其他肉碱酰基转移酶相比，CPT-2中存在的独特的30个氨基酸插入片段(在L-CPT-1的情况下为29个氨基酸，图2)突出于氨基末端结构域之外。
已精确定义了大鼠CPT-2的完整的催化中心的电子密度。用来结晶的构建体中起始的26个氨基末端氨基酸包含His-tag和5个CPT-2序列的残基，其在复合物和脱辅基结构中都是无序的。在羧基末端末尾的具有可判断的电子密度的残基为Lys654(ST1326复合物)和Ile656(脱辅基，P43212)，而在斜方晶(C2221)脱辅基结构的A链中可见完整的羧基末端。
脱辅基CPT-2和ST1326复合物结晶成不同的晶形，但如通过等价Cα间0.38的r.m.s距离所显示，它们的结构具有相似的构象。在全部三种结构中，活性位点的残基Arg 498在Ramachandran图大体允许的区域，Leu129和Asn230并不遵从Ramachandran图适合的几何排列，但这些残基明确的电子密度是明显的。Leu129是II型回折中的第二个残基(与小鼠CrAT的Ile116相当，小鼠CrAT的PDB代码为1t7n)，而Asn230则位于β-转角，这一转角的几何结构可能因为其与相邻的Asp297和Arg124的相互作用而导致扭曲。Arg124的突变与遗传性CPT-2缺乏有关(见下)。
因此，本发明涉及分离和纯化的蛋白质，其具有由如图4或图5所示结构坐标定义的结构。本发明还涉及蛋白质CPT-2的三种晶形。一种CP-2晶体的晶胞参数为a＝b＝66至70，c＝302至312；α＝β＝γ＝90°并且晶体为P43212对称。在另一个实施方案中，晶体的晶胞参数为a＝93至97，b＝94至98，c＝304至312；α＝β＝γ＝90°并且晶体为C2221对称。本发明还涉及蛋白质CPT-2和结合到CPT-2活性位点上的配体的共晶体，其中共晶体的晶胞参数为a＝83至87，b＝94至98，c从121至127；α＝β＝γ＝90°并且晶体为P212121对称。
表1.数据收集及精修统计
*βOG去污剂分子(平均数B＝54.92)，2个C16烷基部分(平均数B＝23.32)和2个剩余的、非特异性结合的辅酶A分子(平均数B＝37.72)不包括在统计中。
CPT抑制剂ST1326与CPT-2的活性位点结合，此位点位于在结构域表面贯穿CPT-2的隧道中(图3)。ST1326是CPT-2生理学底物棕榈酰肉碱的不可剪切类似物。CPT-2三重活性位点的酰基和肉碱隧道(Nic a’Bhaird，N.等人，Comparison of the active sites of the purified carnitineacyltranferases from peroxisomes and mitochondria by using areaction-intermediate analogue.Biochem J.，294，645-651(1993))被ST1326占据，而辅酶A-隧道可以根据基于CrAT和辅酶A的复合物结构的同源建模排布(图3)。ST1326亲水的氨基肉碱头部基团被紧紧结合在氢键网络中。催化碱性His 372与ST1326的氨基氮(N11)组成氢键，其中氨基氮取代天然配体棕榈酰肉碱的酯基氧。在肉碱酰基转移酶中保守的Ser-Thr-Ser模体的Ser 590与配体的氨甲酰基氧(O13)形成氢键。羧基末端结构域的Tyr 486、Ser 488和Thr 499直接通过氢键连接到ST1326的羧基氧(O9和O10)上。结合Arg 544的胍基的氢键进一步稳定了Tyr 486和Thr 499的定向。氨基末端结构域的Trp 116、Tyr 120和Asp 376以及联合固定的水分子也是结合到ST1326羧基的氢键网络的一部分。Arg 498与Asp 376的侧链形成强的氢键，并且它的胍基与催化环中的Ser 373主链羧基氧相互作用，因此使活性位点的残基位于理想的适合催化的位置上。通过与保守的Phe 602的阳离子-pi相互作用稳定ST1326上的带正电荷的叔胺。
接纳ST1326的脂族十四酰尾部的疏水隧道用β链1和16以及2个羧基末端β链17和18的残基排列，其中β链1和16在结构域界面形成反平行β折叠。在2.5δ下所绘模拟退火fofc图显示了结合到活性位点上的配体ST1326的清楚的电子密度。与CrAT和CrOT(PDB代码1ndb、1t7n和1xl8)中的紧密排列相比，形成疏水隧道的β链被转移开为底物类似物ST1326伸出的疏水尾部制造空间。甘氨酸残基Gly 600位于在CrAT(Met564)和CrOT(Gln 552)中较大残基所在的位置上，这允许在CPT-2中结合LCFA肉碱衍生物，并由此确定底物的特异性。与CrAT和CrOT相反，在CPT-2中，酰基隧道开口于表面。
CPT-2的Glu 487和Glu 500在全部肉碱酰基转移酶中保守，已经通过突变分析方法证明他们参与底物结合和催化(Zheng，G.等人，Identification by mutagenesis of a conserved glutamate(Glu487)residueimportant for catalytic activity in rat liver carnitine palmitoyltransferase II.J.Biol.Chem.，277，42219-42223(2002))。CPT-2的晶体结构显示，Glu487确实定位在接纳辅酶A的活性位点隧道的部分上。Glu 487与高度保守的Asp 464一起组成了带负电荷的膜片，此膜片可能对于引导底物结合到活性位点中是必需的。Glu 500的侧链与保守的Arg 554的主链相互作用，这是对于结合酰基转移酶底物肉碱部分所必需氢键网络中的重要组成成分。
尽管应用更高质量的数据集和分辨率进行结构分析，脱辅基结构中的Tyr 120和催化性His 372的侧链也是混乱的。在活性位点中与ST1326亲水头部基团相互作用的这些残基以及Ser 590从配体结合中移开，但是在脱辅基酶中预先形成了活性位点隧道的总体形状。
临床异质性疾病CPT-2缺乏是由于CPT-2基因中的多种突变引起的，并且通过常染色体隐性方式遗传(Bonnefont，J-P.等人，Carnitinepalmitoyltransferases 1 and 2biochemical，molecular and medical aspects.Mol.Aspects Mde.，25，495-520(2004)；Bonnefont，J.P.等人，Carnitinepalmitoyltransferase deficiencies.Mol.Genet.Metab.，68，424-440(1999))。疾病的两种不同表现形式可以基于发作时间来区别，即早期发作(新生期和婴儿期)的CPT-2缺乏和更普遍的成人形式的CPT-2缺乏。早期发作形式的特点在于具有包括心肌病和低酮性低血糖症在内的严重症状，并且和婴儿猝死综合征中的急性肝功能衰竭相关联(Demaugre，F.等人，Infantileform of carnitine palmitoyltransferase II deficiency with hepatomuscularsymptoms and sudden death.Physiopathological approach to carnitinepalmitoyltransferase II deficiencies.J.Clin.Invest.，87，859-864(1991))。成人CPT-2缺乏的临床体症是在禁食和运动后产生复发性肌痛和肌红蛋白尿。
除了缺失/插入引起的蛋白质移码和截短外，已经在CPT-2的编码区鉴定了30多个可以导致酶中单一的氨基酸改变的点突变。其中，CPT-2基因的截短会通过CPT-2功能的丧失必然导致严重的新生儿形式的CPT-2缺乏，对于在纯合的情况下已经描述了这些错义突变，基因型和临床表型之间的阶段关联是明显的(表2)(Bonnefont，J.P.等人，Carnitinepalmitoyltransferase deficiencies.Mol.Genet.Metab.，68，424-440(1999)；Thuillier，L.等人，Correlation between genotype，metabolic data，andclinical presentation in carnitine palmitoyltransferase 2(CPT-2)deficiency.Hum.Mutat.，21，493-501(2003))。在这种关联中，一个例外是Arg631Cys突变，在具有成人形式和婴儿形式CPT-2缺乏的纯合的病人中都曾鉴定出Arg 631Cys突变。得到CPT-2的晶体结构可以允许作图和阐明所述突变的影响(在表2中总结)。大多数(60％)情况的成人CPT-2缺乏与Ser113Leu突变有关。Ser 113定位在接近结构域界面的氨基末端的α5螺旋上。Ser 113的侧链与周围的氨基酸并没有直接接触，但是将这一残基突变为更大的、疏水的Leu则改变了其与相邻的Phe 117的相互作用。这改变了在催化中重要的残基Trp 116和Arg 498的位置和环境，导致酶活性降低(Taroni，F.等人，Identification of a common mutation in thecarnitine palmitoyltransferase II gene in familial recurrent myoglobinuriapatients.Nat.Genet.，4，314-320(1993))。
Asp 213和Glu 487被天然发生的突变影响，并且通过生物化学分析已经确定Asp 213和Glu 487对于CPT-2的功能具有重要作用(Zheng，G.，等人，Identification by mutagenesis of a conserved glutamate(Glu487)residue important for catalytic activity in rat liver carnitinepalmitoyltransferase II.J.Biol.Chem.，277，42219-42223(2002)；Liu，H.，等人，Cysteine-scanning mutagenesis of muscle carnitinepalmitoyltransferase I reveals a single cysteine residue(Cys-305)isimportant for catalysis.J.Biol.Chem.，280，4524-4531(2005))。Asp 213位于CPT-2的β3和α10之间的环上，与在所有人类CPT-1同种型中保守的半胱氨酸排成一行。将此半胱氨酸突变为Ala将使人M-CPT-1的酶活性完全丧失，表明这一位点对于所有CPT同种型的结构完整性都是至关重要的。在CPT-2中，Asp 213的侧链和His 496的主链氮具有强烈的相互作用。这对于参与底物结合的Arg 498和Arg 499的定位是非常重要的。在β13中Glu 487突变为天冬氨酸导致CPT-2活性几乎完全丧失。这一突变会影响辅酶A的结合，因为Glu 487是辅酶A-隧道表面的一部分。从CPT-2的晶体结构可以预测，在位置487的天冬氨酸会与保守的STS模体上的Thr 589的侧链形成强的氢键，由此使活性位点的几何构象变形。Glu 487Lys变换是在CPT-2缺乏中所确定的6个突变之一，这些突变会破坏在CPT-1、CrAT和CrOT中完全保守的内部盐桥或氢键相互作用(表2)。Arg296的胍基氮与Asp 353的侧链氧之间产生强(2.7)的联系，这在肉碱酰基转移酶中是保守的。在M-CPT-1中等价的残基Asp 454也被认为是催化三联体的一部分(Liu，H.等人，Cysteine-scanning mutagenesis of musclecarnitine palmitoyltransferase I reveals a single cysteine residue(Cys-305)is important for catalysis.J.Biol.Chem.，280，4524-4531(2005))，然而，CPT-2晶体结构表明该残基形成保守的盐桥。尽管所报道的与CPT-2缺乏相关的突变在三维结构中都是均一分布的，但它们当中没有一个位于内部。
表2.在人CPT-2缺乏中突变的残基。所有受到影响的残基均在大鼠和人CPT-2中保守。对于人和大鼠CPT-II同种型的残基编号相同。用A标记的纯合突变与晚期发作成人形式的CPT-2缺乏相关；用I标记的为与婴儿期表现形式的早期发作相关。
本发明的脱辅基衍生物和共晶体可以通过蛋白质结晶学技术领域中众所周知的技术得到，这些技术包括分批结晶、(改良的)油下结晶、液体桥、透析、蒸汽扩散法和悬滴法(见例如McPherson，1982，Preparation andAnalysis of Protein Crystals，John Wiley，NY；McPherson，1990，Eur.J.Biochem.1891-23；Webber，1991，Adv.Protein Chem.411-36；Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，由Arnaud Ducruix和Richard Giege编辑，Oxford University Press；Protein CrystallizationTechniques，Strategies，and Tips，由Terese Bergfors编辑，InternationalUniversity Line，1999)。通常，本发明的脱辅基晶体或共晶体通过将基本上纯的CPT-2多肽放置在水缓冲液中生长，在该水缓冲液含有的沉淀剂浓度刚刚低于沉淀蛋白质所需要的浓度。通过控制蒸发将水从溶液中去除以产生结晶条件，维持此条件直到晶体生长停止。
如本文所使用，“缓冲的水溶液”是指基于水的溶液，其包含当酸或碱加入此溶液中时将溶液pH值改变减到最小的物质。
如本文所使用，“摩尔过量”是指配体分子的数量大于蛋白质分子的数量。
如本文所使用，“蒸汽扩散”是指在本技术领域中众所周知的蛋白质结晶方法，其中结晶溶液仅通过气相形式与沉淀剂贮液池溶液保持平衡。
在本发明的优选的实施方案中，脱辅基晶体或共晶体通过蒸汽扩散生长。在该方法中，多肽/沉淀剂溶液在一个密闭容器中与具有适于产生晶体的最佳浓度沉淀剂的大的贮液池保持平衡。通常，少于10μl左右的基本纯的多肽溶液与等量或接近体积的贮液池溶液混合，使得沉淀剂的浓度为结晶需要浓度的大约一半。此溶液以液滴的形式悬浮于盖玻片之下，并在贮液池顶部密封。将密封容器放置一天至一年，通常为大约2-6周，直到晶体生长。
对于本发明的晶体，已经发现用以下方法可以生成适合高分辨率X-射线结构确定的晶体悬滴包含2-5μl室温下生长的大鼠CTP-2[大鼠CPT-2以3.75-50mg/ml溶解于25mM Tris/HCl pH8.0、0.15M NaCl、2mM TCEP、1％(w/v)正辛基-β-D-吡喃葡糖苷(βOG)或0.33％(w/v)CHAPS或1.15mM正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DBM)以及0.02％(w/v)NaN3]和等量或类似量的贮液池溶液(索引21，37，61，62，69，75，76，79，88，90，91，92，Hampton Research，以及通过改变pH或它们的组分的浓度得到的溶液)，将此液滴悬浮在0.33至1.0mL的贮液池缓冲液上大约1-7天。特别优选的条件为用大约0.1μl-1μl大鼠CPT-2(以13.5mg/ml溶解于25mM Tris/HCl pH8.0、0.15M NaCl、2mM TCEP和1％(w/v)β-D-OG中)与3倍摩尔过量的ST1326预温育的(改良)油下结晶法；以及用1μl至5μl大鼠CPT-2(常规表达得到或者为用硒代甲硫氨酸标记的蛋白质，以12mg/ml溶解于25mM Tris/HCl pH8.0、0.15M NaCl、2mM TCEP和1％(w/v)β-D-OG中)与0.5μl至2μl的索引91(Hampton Research)沉淀剂溶液混合悬浮在0.33ml至1.0ml的贮液池溶液上(索引91，Hampton Research)的悬滴法。
用悬滴法生成的所有晶体在用液氮冷冻或安放在装配有液氮冷冻设备的测角器上之前，都浸入到添加20％(w/v)至30％(w/v)聚乙二醇200(PEG200)的各自母液中，并且在复合物结构情况下需要添加适量浓度的配体。用油下结晶法生成的晶体既可以用上述用于悬滴法生成晶体的冷冻方法，也可以将晶体周围的母液和油对100％(v/v)石蜡油交换。
冷冻晶体的2.0衍射数据用SLS(Villigen，瑞士)在同步加速器光源X10SA(PX1)或X10SA(PX2)下收集。在最佳条件下，记录的数据可达到1.6。
当然，本领域的技术人员应当认识到上述结晶条件可以改变。这些改变可以是单独的或者是组合的，包括包含1mg/mL和60mg/mL之间浓度多肽的多肽溶液、可维持pH从大约3.0至大约11.0的任何商业可得到的缓冲液体系、多种浓度的还原性成分(二硫苏糖醇、dithioeritol、β-巯基乙醇或本领域公认的其他等价物)、浓度在0％(w/v)和30％(w/v)之间的稳定性组分如糖类或甘油或者用其它已知结合CPT-2的配体的取代、包含浓度在大约1％(w/v)和大约30％(w/v)之间的聚乙二醇(PEG)(聚乙二醇的平均分子量在大约200和大约20,000道尔顿之间)的沉淀剂溶液和贮液池溶液、以及4℃和30℃之间的温度范围。
因此，本发明还涉及CPT-2与结合至活性位点的配体共结晶的过程，该过程包括提供含有3.75至50mg/ml CPT-2的缓冲水溶液、加入摩尔过量的配体到CPT-2水溶液中、以及用含有0％至30％(w/v)PEG的缓冲的贮液池溶液通过蒸汽扩散或油下结晶法结晶，其中PEG具有200道尔顿至20,000道尔顿的平均分子量。PEG可以作为单甲酯加入。可使用平均分子量为500Da至5,000Da的PEG。缓冲的贮液池溶液还包含0M至2M柠檬酸三铵pH7、0M至1M L-脯氨酸、0M至1M三甲胺-N-氧化物、0M至1M硫酸铵、0M至1M硫酸锂、0M至1M醋酸铵、0M至1M甲酸钠或甲酸镁、和0M至1M D/L-苹果酸pH7。可以改良所述油下结晶法。本发明进一步涉及通过上文所述过程产生的晶体。
本发明的衍生晶体可以依据X-射线晶体学领域的技术人员已知的方法通过将脱辅基晶体或共晶体浸泡在含有重金属原子的盐的母液中得到。
本发明的共晶体可以通过将脱辅基晶体或带有低亲合性配体的CPT-2的晶体浸泡在母液中或含有结合活性位点的配体的任何其他稳定溶液中得到，或者通过在一个或多个结合活性位点的配体存在下共结晶CPT-2多肽得到。
本文中描述的获得晶体CPT-2的三维结构和原子结构坐标的方法是在本领域众所周知的(见，例如D.E.McRee，Practical ProteinCrystallography，由Academic Press出版，San Diego(1993)，及其其中引用的文献).
本发明的晶体以及从其中得到的特定的原子结构坐标具有广泛多样的用途。例如，本文描述的晶体和结构坐标作为开发新治疗剂的方法特别用于鉴定抑制或通常改变CPT-2活性的化合物。
本文描述的结构坐标可以作为定相模型用于确定另外的天然或突变CPT-2的晶体结构，也可用来确定结合抑制剂或激活剂的该CPT-2的共晶体结构。从其中得到的结构坐标以及三维结构模型也可用于帮助阐明天然或突变CPT-2的基于溶液的结构，例如通过NMR得到的那些结构。由此，本发明的晶体和原子结构坐标提供了方便的方法来阐明CPT-2的结构和功能。
因此，本发明还提供鉴定能结合蛋白质CPT-2的化合物的方法，包括的步骤有把三维分子建模算法应用到在图4或图5所示蛋白质CPT-2的原子坐标上以确定蛋白质CPT-2的结合袋的空间坐标；针对蛋白质CPT-2结合袋的空间坐标对所储存的一系列候选化合物的空间坐标进行电子筛选以鉴定能够结合蛋白质CPT-2的化合物。
在上文所述晶体、共晶体、方法和过程的实施方案中，所述CPT-2蛋白质是大鼠CPT-2蛋白质。另外，所述大鼠CPT-2蛋白质为Seq ID No.2的蛋白质。
为了清楚的说明和讨论，本发明中的晶体通过参考特定CPT-2的代表性脱辅基晶体和共晶体描述。本领域的技术人员应意识到，本文描述的原理普遍地应用于任何哺乳动物的CPT-2晶体，包括但不限于Seq ID No.2的CPT-2。
如本文所使用，“脱辅基晶体”是指没有加入位点特异性配体而形成的CPT-2晶体。
附图简述图1ST1326结合到活性位点上的大鼠CPT-2的结构。配体ST1326及其周围的fofc模拟退火电子密度图(以2.5δ描绘轮廓)在A-C中以粉色图示。A，ST1326结合在大鼠氨基末端(橙色)和羧基末端(青色)结构域的界面上。B，中心β链(蓝色)周围围绕着α螺旋(绿色)，CPT-2特异性的插入(红色)从氨基末端结构域突出。C，与B相同但是旋转90°至背面。
图2大鼠CPT-2(rCPT-2)和人CPT-1(hCPT-1)氨基酸序列的比对。指明了二级结构元件(S.S.)。残基编号对应着rCPT-2前体并且其线粒体输入序列用斜体标出。CPT-2特异性插入(氨基酸179-208)用下划线标出。rCPT-2的酰基肉碱结合位点的关键残基用粗体标出并且当其在hCPT-1中完全保守时用*标记。已报道过的在CPT-2缺乏中突变的残基用红色标出。
图3A，垂直于结构域界面观察到的活性位点隧道的立体图像。关键的活性位点残基用黄色描绘。共结晶的ST1326用粉色标示，辅酶A分子(蓝色)根据来自于CrAT-CoA复合物结构(PDB代码1t7q)中的辅酶A坐标建模。B，带有原子编号的ST1326费歇尔投影式。
图4脱辅基1(C2221)晶体的坐标。
图5脱辅基1(P43212)晶体的坐标。
图6CPT-2/ST1326共晶体的坐标。
实施例实施例1蛋白质表达和纯化将编码大鼠CPT-2氨基酸27-658的DNA(由苏格兰Ayr的Hannah研究所的V.A.Zammit博士惠赠)亚克隆进Novagen pET28a载体。此构建体用于在大肠杆菌(E.coli)BL21DE3株中于20℃下表达全长CPT-2(除去了CPT-2前体中的氨基酸1-26的线粒体输入序列)。细胞破裂后，其裂解液(溶解在50mM HEPES/NaOH pH8、0.15M NaCl、5mM TCEP、10mMMgCl2、30mg/l DNase I、30片/l Roche完全蛋白酶抑制剂)用0.1％(v/v)Triton-X-100调节。溶解和离心后(30,000g，45分钟)，将其在Ni-NTA树脂上进行固化金属亲和层析。将柱子中的去污剂换成1％(v/v)正辛基-β-D-吡喃葡糖苷(βOG)。将来自IMAC步骤的洗脱液加载到用25mM Tris/HCl pH8、0.15M NaCl、2mM TCEP、1％(v/v)βOG、0.02％(w/v)NaN3平衡的大小排阻层析柱中。用ESI-MS证实CPT-II的特征并且表明此蛋白质被氨基末端的α-N-gluconoylation修饰(Geoghegan，K.F.等人，Spontaneous alpha-N-6-phosphogluconoylation of a″His tag″inEscherichia colithe cause of extra mass of 258 or 178 Da in fusion proteins.Anal.Biochem.，267，169-184(1999))(资料未显示)。His-标签不能被凝血酶切开。10l的发酵物(45g生物量)产出了30mg电泳纯的、单体和单分散的蛋白质。
实施例2蛋白质结晶脱辅基CPT-2和ST1326[(R)-N-十四烷基氨基甲酰基-氨基肉碱]]复合物晶体(在H2O/NaOH的33mM贮存液中)在蛋白质浓度为15mg/ml(于25mM Tris/HCl pH8.0、150mM NaCl、2mM TCEP、1％(w/v)正辛基-β-D-吡喃葡糖苷和0.02％(w/v)NaN3中)和21℃下，用包含25％(w/v)PEG 1500的悬滴法或者用包含0.15M DL-苹果酸pH7.0、20％(w/v)PEG 3350的改良油下结晶法(D’Arcy，A.等人，The advantages of using a modifiedmicrobatch method for rapid screening of protein crystallization conditions.Acta Cryst.D59，396-399(2003))分别获得(索引37和91，HamptonResearch)。对于复合物的形成，在结晶前将CPT-2与3倍摩尔过量的抑制剂ST1326在冰上温育3h。在将晶体浸于添加25％(w/v)PEG200的母液30秒后(对于脱辅基晶体)或将过量母液和Al’s油对100％(v/v)石蜡油交换后(对于与ST1326复合的晶体)在液氮中瞬间冷冻。
实施例3数据收集和处理脱辅基CPT-2和ST11326复合物的数据集在SLS(Villigen，瑞士)的X10SA光源下收集。测量在100K，λ＝0.97853(对于脱辅基的Se峰波长)和λ＝1.008(对于ST1326)下进行。数据集用XDS处理和测量(Kabsch，W.Automatic processing of rotation diffraction data from crystals ofinitially unknown symmetry and cell constants.J.Appl.Cryst.，26，795-800(1993))。将空间群确定为P43212(脱辅基四方晶，a＝b＝67.6，c＝307.3，α＝β＝γ＝90°，Matthew系数＝2.4(Matthews，B.W.J.Mol.Biol.，33，491-497(1968)))，C2221(脱辅基斜方晶，a＝95.2，b＝97.3，c＝310.4，Matthew系数＝2.4)和P212121(ST1326，a＝85.8，b＝96.2，c＝124.3，α＝β＝γ＝90°，Matthew系数＝3.5)。脱辅基CPT-2最初的晶体衍射数据分辨率可以达到1.9，但是不能明确给定空间群。相反，用标准方法(Chene，C.等人，Crystallizationof the complex of human IFN-gamma and the extracellular domain of theIFN-gamma receptor.Proteins，23，591-594(1995))从硒代甲硫氨酸标记的材料得到的脱辅基晶体具有较好的衍射质量，这源自因标记中的不同培养基组成以及细菌蛋白质表达谱而改善的蛋白质质量。
XDS排斥统计报告了0.26％的排斥错合(misfit)，这完全支持复合晶体选择P212121作为正确空间群，尽管Rmerge值相当高(16.7％)。数据统计总结在表1中。这两种晶形在每个不对称的单元中都包含一个CPT-2分子。
结构解析和精修在CCP4界面上用AmoRe进行分子置换(Navazza，J.AMoRea newpackage for molecular replacement，in Molecular replacement.Proceedings of the CCP4 Study Weekend，87-90，Daresbury Laboratory，Warrington，英国(1992)；Collaborative Computational Project，Number4.The CCP4 suitePrograms for protein crystallography.Acta Cryst.，D50，760-763(1994))。对于ST1326复合物，大鼠CPT-2的同源模型用XSAE(C.Broger，F.Hoffmann La-Roche)基于作为搜索模型的小鼠CrAT(Hsiao，Y.S.等人，Structural and biochemical studies of the substrate selectivity ofcarnitine acetyltransferase.J.Biol.Chem.，279，31584-31589(2004))(PDB代码1t7n)构建。解析通过CNS的模拟退火进行精修(Brünger，A.T.X-PLOR Manual Version 3.1.New Haven，CT，USA，Yale UniversityPress(1992))。使用在MOLOC中所建立模型(Gerber，P.R.Peptidemechanicsa force field for peptides and proteins working withentire residues as small units.Biopolymers，32，1003-1017(1992))、在autoBUSTER中所建立的解析(Roversi，P.等人，Modelling priordistributions of atoms for macromolecular refinement and completion.Acta Cryst.D 56，1316-1323(2000))以及在Refmac中精修(Murshudov，G.N.，Vagin，A.A.，Lebedev，A.Wilson，K.S.& Dodson，E.J.Efficientanisotropic refinement of macromolecular structures using FFT.ActaCryst.，D 55，247-255(1999))的重复循环构建最终模型。硒标记的脱辅基结构可以通过使用精修的复合物结构作为搜索模型的分子置换来解析，之后用Arp/wArp(Perrakis，A.等人，Automated protein model buildingcombined with iterative structure refinement.Nat.Struct.Biol.，6，458-463(1999))和重复的Refmac和MOLOC循环进行自动模型构建。对于斜方晶(四方晶)脱辅基结构，94.0％(92.7％)的残基位于Ramachandran图的最适合区域，5.4％(6.8％)位于另外允许的区域。对于ST1326复合物结构，这些值分别为88.2％和11.3％。Arg 498(通常位于允许区域)和Leu 129以及Asn 230(Ramachandran异常值)说明了与100％之间的差异。
精修统计总结在表1中。分子代表物的图是用PyMol(DeLano，W.L.The PyMOL User′s Manual，DeLano Scientific，San Carlos，CA，USA(2002))和MOE(Chemical Computing Group Inc.，MOE，1010 SherbrookeStreet West，Suite 910，Montreal，Canada，H3A 2R7)制作的。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>CPT-2晶体<130>23284<160>2<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>658<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>大鼠CPT-2<222>(1)..(658)<223>Swissprot登录号P18886<400>1Met Met Pro Arg Leu Leu Phe Arg Ala Trp Pro Arg Cys Pro Ser Leu1 5 10 15Val Leu Gly Ala Pro Ser Arg Pro Leu Ser Ala Val Ser Gly Pro Asp20 25 30Asp Tyr Leu Gln His Ser Ile Val Pro Thr Met His Tyr Gln Asp Ser35 40 45Leu Pro Arg Leu Pro Ile Pro Lys Leu Glu Asp Thr Met Lys Arg Tyr50 55 60Leu Asn Ala Gln Lys Pro Leu Leu Asp Asp Ser Gln Phe Arg Arg Thr65 70 75 80Glu Ala Leu Cys Lys Asn Phe Glu Thr Gly Val Gly Lys Glu Leu His85 90 95Ala His Leu Leu Ala Gln Asp Lys Gln Asn Lys His Thr Ser Tyr Ile100 105 110Ser Gly Pro Trp Phe Asp Met Tyr Leu Thr Ala Arg Asp Ser Ile Val115 120 125
Leu Asn Phe Asn Pro Phe Met Ala Phe Asn Pro Asp Pro Lys Ser Glu130 135 140Tyr Asn Asp Gln Leu Thr Arg Ala Thr Asn Leu Thr Val Ser Ala Val145 150 155 160Arg Phe Leu Lys Thr Leu Gln Ala Gly Leu Leu Glu Pro Glu Val Phe165 170 175His Leu Asn Pro Ser Lys Ser Asp Thr Asp Ala Phe Lys Arg Leu Ile180 185 190Arg Phe Val Pro Pro Ser Leu Ser Trp Tyr Gly Ala Tyr Leu Val Asn195 200 205Ala Tyr Pro Leu Asp Met Ser Gln Tyr Phe Arg Leu Phe Asn Ser Thr210 215 220Arg Ile Pro Arg Pro Asn Arg Asp Glu Leu Phe Thr Asp Thr Lys Ala225 230 235 240Arg His Leu Leu Val Leu Arg Lys Gly His Phe Tyr Val Phe Asp Val245 250 255Leu Asp Gln Asp Gly Asn Ile Val Asn Pro Leu Glu Ile Gln Ala His260 265 270Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Asp Ser Ser Pro Val Pro Glu Phe Pro Val275 280 285Ala Tyr Leu Thr Ser Glu Asn Arg Asp Val Trp Ala Glu Leu Arg Gln290 295 300Lys Leu Ile Phe Asp Gly Asn Glu Glu Thr Leu Lys Lys Val Asp Ser305 310 315 320Ala Val Phe Cys Leu Cys Leu Asp Asp Phe Pro Met Lys Asp Leu Ile325 330 335His Leu Ser His Thr Met Leu His Gly Asp Gly Thr Asn Arg Trp Phe340 345 350Asp Lys Ser Phe Asn Leu Ile Val Ala Glu Asp Gly Thr Ala Ala Val
355 360 365His Phe Glu His Ser Trp Gly Asp Gly Val Ala Val Leu Arg Phe Phe370 375 380Asn Glu Val Phe Arg Asp Ser Thr Gln Thr Pro Ala Ile Thr Pro Gln385 390 395 400Ser Gln Pro Ala Ala Thr Asn Ser Ser Ala Ser Val Glu Thr Leu Ser405 410 415Phe Asn Leu Ser Gly Ala Leu Lys Ala Gly Ile Thr Ala Ala Lys Glu420 425 430Lys Phe Asp Thr Thr Val Lys Thr Leu Ser Ile Asp Ser Ile Gln Phe435 440 445Gln Arg Gly Gly Lys Glu Phe Leu Lys Lys Lys Gln Leu Ser Pro Asp450 455 460Ala Val Ala Gln Leu Ala Phe Gln Met Ala Phe Leu Arg Gln Tyr Gly465 470 475 480Gln Thr Val Ala Thr Tyr Glu Ser Cys Ser Thr Ala Ala Phe Lys His485 490 495Gly Arg Thr Glu Thr Ile Arg Pro Ala Ser Ile Phe Thr Lys Arg Cys500 505 510Ser Glu Ala Phe Val Arg Asp Pro Ser Lys His Ser Val Gly Glu Leu515 520 525Gln His Met Met Ala Glu Cys Ser Lys Tyr His Gly Gln Leu Thr Lys530 535 540Glu Ala Ala Met Gly Gln Gly Phe Asp Arg His Leu Tyr Ala Leu Arg545 550 555 560Tyr Leu Ala Thr Ala Arg Gly Leu Asn Leu Pro Glu Leu Tyr Leu Asp565 570 575Pro Ala Tyr Gln Gln Met Asn His Asn Ile Leu Ser Thr Ser Thr Leu580 585 590
Asn Ser Pro Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Ala Pro Val Val Pro Asp595 600 605Gly Phe Gly Ile Ala Tyr Ala Val His Asp Asp Trp Ile Gly Cys Asn610 615 620Val Ser Ser Tyr Ser Gly Arg Asn Ala Arg Glu Phe Leu His Cys Val625 630 635 640Gln Lys Cys Leu Glu Asp Ile Phe Asp Ala Leu Glu Gly Lys Ala Ile645 650 655Lys Thr<210>2<211>632<212>PRT<213>褐家鼠<220>
<221>成熟大鼠CPT-1<222>(1)..(632)<223>位置1相当于Seq ID No.1中的位置27<400>2Ala Val Ser Gly Pro Asp Asp Tyr Leu Gln His Ser Ile Val Pro Thr1 5 10 15Met His Tyr Gln Asp Ser Leu Pro Arg Leu Pro Ile Pro Lys Leu Glu20 25 30Asp Thr Met Lys Arg Tyr Leu Asn Ala Gln Lys Pro Leu Leu Asp Asp35 40 45Ser Gln Phe Arg Arg Thr Glu Ala Leu Cys Lys Asn Phe Glu Thr Gly50 55 60Val Gly Lys Glu Leu His Ala His Leu Leu Ala Gln Asp Lys Gln Asn65 70 75 80Lys His Thr Ser Tyr Ile Ser Gly Pro Trp Phe Asp Met Tyr Leu Thr85 90 95
Ala Arg Asp Ser Ile Val Leu Asn Phe Asn Pro Phe Met Ala Phe Asn100 105 110Pro Asp Pro Lys Ser Glu Tyr Asn Asp Gln Leu Thr Arg Ala Thr Asn115 120 125Leu Thr Val Ser Ala Val Arg Phe Leu Lys Thr Leu Gln Ala Gly Leu130 135 140Leu Glu Pro Glu Val Phe His Leu Asn Pro Ser Lys Ser Asp Thr Asp145 150 155 160Ala Phe Lys Arg Leu Ile Arg Phe Val Pro Pro Ser Leu Ser Trp Tyr165 170 175Gly Ala Tyr Leu Val Asn Ala Tyr Pro Leu Asp Met Ser Gln Tyr Phe180 185 190Arg Leu Phe Asn Ser Thr Arg Ile Pro Arg Pro Asn Arg Asp Glu Leu195 200 205Phe Thr Asp Thr Lys Ala Arg His Leu Leu Val Leu Arg Lys Gly His210 215 220Phe Tyr Val Phe Asp Val Leu Asp Gln Asp Gly Asn Ile Val Asn Pro225 230 235 240Leu Glu Ile Gln Ala His Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Asp Ser Ser Pro245 250 255Val Pro Glu Phe Pro Val Ala Tyr Leu Thr Ser Glu Asn Arg Asp Val260 265 270Trp Ala Glu Leu Arg Gln Lys Leu Ile Phe Asp Gly Asn Glu Glu Thr275 280 285Leu Lys Lys Val Asp Ser Ala Val Phe Cys Leu Cys Leu Asp Asp Phe290 295 300Pro Met Lys Asp Leu Ile His Leu Ser His Thr Met Leu His Gly Asp305 310 315 320Gly Thr Asn Arg Trp Phe Asp Lys Ser Phe Asn Leu Ile Val Ala Glu325 330 335
Asp Gly Thr Ala Ala Val His Phe Glu His Ser Trp Gly Asp Gly Val340 345 350Ala Val Leu Arg Phe Phe Asn Glu Val Phe Arg Asp Ser Thr Gln Thr355 360 365Pro Ala Ile Thr Pro Gln Ser Gln Pro Ala Ala Thr Asn Ser Ser Ala370 375 380Ser Val Glu Thr Leu Ser Phe Asn Leu Ser Gly Ala Leu Lys Ala Gly385 390 395 400Ile Thr Ala Ala Lys Glu Lys Phe Asp Thr Thr Val Lys Thr Leu Ser405 410 415Ile Asp Ser Ile Gln Phe Gln Arg Gly Gly Lys Glu Phe Leu Lys Lys420 425 430Lys Gln Leu Ser Pro Asp Ala Val Ala Gln Leu Ala Phe Gln Met Ala435 440 445Phe Leu Arg Gln Tyr Gly Gln Thr Val Ala Thr Tyr Glu Ser Cys Ser450 455 460Thr Ala Ala Phe Lys His Gly Arg Thr Glu Thr Ile Arg Pro Ala Ser465 470 475 480Ile Phe Thr Lys Arg Cys Ser Glu Ala Phe Val Arg Asp Pro Ser Lys485 490 495His Ser Val Gly Glu Leu Gln His Met Met Ala Glu Cys Ser Lys Tyr500 505 510His Gly Gln Leu Thr Lys Glu Ala Ala Met Gly Gln Gly Phe Asp Arg515 520 525His Leu Tyr Ala Leu Arg Tyr Leu Ala Thr Ala Arg Gly Leu Asn Leu530 535 540Pro Glu Leu Tyr Leu Asp Pro Ala Tyr Gln Gln Met Asn His Asn Ile545 550 555 560
Leu Ser Thr Ser Thr Leu Asn Ser Pro Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe565 570 575Ala Pro Val Val Pro Asp Gly Phe Gly Ile Ala Tyr Ala Val His Asp580 585 590Asp Trp Ile Gly Cys Asn Val Ser Ser Tyr Ser Gly Arg Asn Ala Arg595 600 605Glu Phe Leu His Cys Val Gln Lys Cys Leu Glu Asp Ile Phe Asp Ala610 615 620Leu Glu Gly Lys Ala Ile Lys Thr625 630
权利要求
1.具有通过如图4或图5所示结构坐标所定义结构的分离和纯化的蛋白质。
2.蛋白质CPT-2的晶体，其中晶体的晶胞参数为a＝b＝66至70，c＝302至312；α＝β＝γ＝90°，并且晶体为P43212对称。
3.蛋白质CPT-2的晶体，其中晶体的晶胞参数为a＝93至97，b＝94至98，c＝304至312；α＝β＝γ＝90°，并且晶体为C2221对称。
4.蛋白质CPT-2与结合至CPT-2活性位点的配体的共晶体，其中晶体的晶胞参数为a＝83至87，b＝94至98，c从121至127；α＝β＝γ＝90°，并且晶体为P212121对称。
5.鉴定能够与蛋白质CPT-2结合的化合物的方法，其包括步骤把三维分子建模算法应用到在图4或图5所示蛋白质CPT-2的原子坐标上以确定蛋白质CPT-2的结合袋的空间坐标；以及针对蛋白质CPT-2结合袋的空间坐标对所储存的一系列候选化合物的空间坐标进行电子筛选以鉴定能够结合蛋白质CPT-2的化合物。
6.将CPT-2与结合至活性位点的配体共结晶的过程，该过程包括提供含有3.75至50mg/ml CPT-2的缓冲的水溶液，加入摩尔过量的配体到CPT-2水溶液中，以及使用含有0％至30％(w/v)PEG的缓冲的贮液池溶液通过蒸汽扩散或油下结晶法结晶，其中PEG具有200道尔顿至20,000道尔顿的平均分子量。
7.权利要求6所述的过程，其中缓冲液贮液池另外还包含0M至2M柠檬酸三铵pH 7、0M至1M L-脯氨酸、0M至1M三甲胺-N-氧化物、0M至1M硫酸铵、0M至1M硫酸锂、0M至1M醋酸铵、0M至1M甲酸钠或甲酸镁、和0M至1M D/L-苹果酸pH 7。
8.根据权利要求6或7的过程产生的晶体。
9.根据上述权利要求、特别是关于前述实施例的晶体、方法和过程。
全文摘要
本发明提供肉碱棕榈酰转移酶(CPT)晶体和CPT与抑制剂化合物的共晶体，这使得可以通过基于本文所公开的晶体坐标确定共晶体的结构从而筛选新的CPT－2抑制剂。
文档编号C12N9/10GK1924011SQ20061012659
公开日2007年3月7日 申请日期2006年8月29日 优先权日2005年8月29日
发明者J·本兹, B·格塞尔, M·亨尼格, A·拉弗尔, M·斯蒂尔, R·托马 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司