专利名称：一种检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片的制作方法
技术领域：
本发明为一种检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片。可满足不同层次医院的要求，适用于糖尿病患者和高危人群的检测，有助于临床特殊类型糖尿病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。
背景技术：
糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍所致的复杂代谢性疾病，发病率逐年上升，我国的糖尿病发病人数位居世界第二，其中90％为2型糖尿病，且发病年龄趋向年轻化。持续高血糖所引发的慢性并发症已成为肾功能衰竭、失明和心脑血管疾病的主要原因，给个人、社会和国家医疗保健带来了沉重的负担，成为全球性的社会卫生和经济问题。线粒体基因缺陷赋予了个体一定的糖尿病遗传易感性。1999年世界卫生组织制定了新的糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病，属于β细胞遗传缺陷疾病，线粒体糖尿病成为糖尿病中的主要亚型之一。然而目前临床上对糖尿病的诊断通常只分为1型和2型，仅根据临床实验室的一般生化和免疫项目检测难以正确诊断线粒体糖尿病，因此，检测糖尿病的线粒体DNA易感基因位点，对于糖尿病的正确分类、线粒体糖尿病的早期诊断和积极预防有着重要的意义。
传统的糖尿病线粒体基因突变检测方法主要包括PCR-RFLP、AS-PCR和DNA测序方法等，这些方法在基因突变检测中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，诸如检测基因位点有限、耗时长、操作繁琐等，不适用于大批量、系统检测，给线粒体糖尿病的临床诊断带来困难。
快速准确地检测糖尿病线粒体基因突变是早期诊断线粒体糖尿病的关键指标。PCR-RFLP方法是经典的生物学方法，但由于限制性内切酶识别位点有限，难以实现同时检测多个位点，且耗时较长；AS-PCR方法虽能准确检测突变，但要求扩增条件非常优化，且引物要有高度的特异性，否则易出现假阴性或假阳性结果(Urata M，Wada Y，Kim SH，et al.High-sensitivity detection of the A3243Gmutation of mitochondrial DNA by a combination of allele-specific PCR and peptidenucleic acid-directed PCR clamping.Clin Chem，2004，502045-2051.)；DNA测序虽是目前公认的检测新突变的金标准，但由于其对特殊结构DNA序列无法测序，而且只有异质性水平＞25％时才能检出，而临床常用标本外周血白细胞中异质性水平通常都达不到这个标准，很易漏检(MaitraA，Cohen Y，Gillespie SE，et al.TheHuman MitoChipa high-throughput sequencing microarray for mitochondrialmutation detection.Genome Res，2004，14812-819.)。因此，如何快速、准确检测糖尿病线粒体基因突变是线粒体糖尿病临床诊断的主要难题之一。
基因芯片是近年来兴起的一项重要生物技术，越来越多地应用于基因表达、基因突变检测、多态性分析和基因诊断(Poddar SK.Symmetric vs asymmetric PCRand molecular beacon probe in the detection of a target gene of adenovirus.Mol CellProbes，2000，1425-32.王军，王升启，程晓霞，等.寡核苷酸微阵列法检测高血压患者血管紧张素转换酶基因多态性的临床应用.中华检验医学杂志[J]，2005，28276-277.)。Chee等于1996年利用标准的光刻和固相DNA合成技术合成寡核苷酸探针，成功研制了第一张线粒体基因测序芯片(Chee M.，Yang R.，Hubbell E.etal.Accessing genetic information with high-density DNA arrays.SCIENCE，1996，274610-614.)；其后，Maitra等于2004年也利用该项技术研发了用于癌症线粒体基因突变检测的双链测序芯片(Maitra A，Cohen Y，Gillespie SE，et al.TheHuman MitoChipa high-throughput sequencing microarray for mitochondrialmutation detection.Genome Res，2004，14812-819.)。这两种测序芯片可对线粒体基因进行系统的分析，但检测技术和设备要求高，难以在临床实践中普遍应用。2005年Park等研制了Cy3标记的RNA靶探针寡核苷酸芯片对年轻的成人发病型糖尿病(MODY)的HNF-1α突变进行了检测(Park HG，Ham HO，Kim KH，HuhN.Oligonucleotide chip for the diagnosis of HNF-1αmutations.Biosensors andBioelectronics，2005，21637-644.)。Du等于2003年利用功能化单层金芯片检测了线粒体tRNALeu(UUR)基因3243、3251、3256、3260、3302、3303和tRNAlys基因的8344共7个位点突变(Du WD，Marsac C，Kruschina M et al.Functionalizedself-assembled monolayer on gold for detection of human mitochondrial tRNA genemutations.Analytical Biochemistry，2003(322)14-25.)。但总的来说，这些芯片检测的基因位点有限，均在十个以内，而且均不是针对糖尿病相关的线粒体基因突变检测。因此，本课题组对糖尿病线粒体基因突变进行了相关研究，制备的8个突变位点(tRNALeu(UUR)基因3256，3290；ND1基因3316，3394，3593，3606，3618，3688)检测芯片，以尼龙膜作为载体，8条探针的5′或3′端加载长臂8T，采用加样枪点样(0.5μl/次×5次)，自然风干后，经紫外照射固定在尼龙膜上，被检测的目的DNA以生物素标记。利用该膜芯片对经PCR-RFLP方法筛选出的已知突变标本进行了检测，初步摸索了试验条件，不足之处是芯片未设立对照、实验耗时太长、样点大小不均、以及所检测位点少(刘松梅，周新，李霞等.2型糖尿病线粒体基因8个突变位点的研究.中国病理生理杂志，2006，22586-591.)。之后，又研制了检测28个突变位点(tRNALeu(UUR)基因3243，3250，3251，3252，3254，3256，3260，3264，3290，3302，3303；ND1基因3316，3391，3394，3398，3399，3421，3426，3460，3537，3593，3606，3618，3688，4136，4164，4200，4216)的检测芯片，以尼龙膜为载体，56条探针经长臂8T修饰后，用478A手工点样仪(美国Axon)点样，通过紫外线照射固定在尼龙膜上，被检测的目的DNA以生物素标记，阳性对照为生物素标记的3243位点野生型探针和突变型探针混合液，阴性对照为5×SSC探针稀释液，平行对照为同一探针的平行点。利用该膜芯片对200例2型糖尿病标本和210名正常对照标本进行了检测，检出了7种突变位点，具有成本低，无需特殊设备，经济实用特点。不足之处是该膜芯片不能系统检测整个线粒体突变位点(刘松梅，周新，郑芳等.基因芯片筛查2型糖尿病线粒体DNA碱基突变.中华医学杂志，2006，86(40)2853-2857.)。因而，本课题组进一步研制了45个突变位点检测的膜芯片。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片。该芯片设计了监控系统和检测系统监控系统包括碱基序列设计合理的野生型和突变型探针组成的阳性对照和平行对照，以及探针稀释液组成的阴性对照；检测系统由待检的mtDNA 45个位点的野生型和突变型寡核苷酸探针组成。每张芯片包含90条探针、196个样点(14行×14列)，其中16个阳性对照点，布控合理、规整度高。实验操作流程简单，省时，成本低，仅需1次不对称PCR扩增、1次生物素标记、1次杂交反应，即可检测线粒体基因45个位点。该芯片的检测结果准确、效率高，克服了传统和现有方法中存在的不足(如漏检、耗时长等)，达到了快速检测线粒体糖尿病的临床效果。可满足不同层次医院的要求，适用于糖尿病患者和高危人群的检测，有助于临床特殊类型糖尿病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施(1)计算机软件辅助设计探针和引物该膜芯片是一种检测多位点极为复杂的反应体系，涉及90条探针和18条引物的设计和筛选。本发明按疾病相关遗传基因生物学规律，结合PCR理论，考虑一次性快速准确检测线粒体糖尿病，既不漏诊，也不误诊等方方面面，进行设计、排列组合，巧妙布控。采用生物软件Primer Premier 5.0(PREMIER BiosoftInternational，CA)和NCBI BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)辅助设计和分析所需的探针和引物，使目的片段扩增和杂交反应，能在同一条件下完成，要求苛刻，技术含量高。
(2)芯片矩阵布控设计一张膜芯片上同时固定检测mtDNA 45个突变位点的探针90条，囊括目前国内外报道的与糖尿病相关的整个线粒体基因突变位点。每个基因位点的野生型和突变型探针，平行点印2个样点，即4个样点检测1个基因位点，共点印196个样点(14行×14列)，包括阳性对照、阴性对照和平行对照，组成膜芯片的质量保证和检测监控体系，确保检测的准确性，既防漏检，又防误诊，减小误差。具体布控矩阵如图1所示。
(3)涉及多种复杂的反应过程该膜芯片涉及多种复杂反应过程，包括物理过程、化学反应、生物化学反应和分子生物学反应，如尼龙膜的预处理，点样，固定，DNA模板的提取，PCR扩增和标记，杂交、洗涤、显色等。
检测线粒体糖尿病时，只需患者的外周血100μl或带毛囊的头发3-5根、进行一次不对称PCR和一次杂交反应，即可于8小时内准确地完成，被检标本是否存在上述45个基因位点突变的检测过程。
(4)靶DNA标记和显色
该膜芯片被检测目的片段为生物素标记，以AP-亲和素作用于NBT/BCIP显色，可目视化观察实验结果，降低成本。
一种快速检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片的制备步骤是(1)以尼龙膜为载体剪1.5cm×2cm的尼龙膜，放入灭菌DdH2O浸泡10min，再浸入5×SSC 30min(20×SSC-Buffer8.766g氯化钠，4.412g柠檬酸钠，双蒸水定容至50ml，氢氧化钠调pH至7.5)，取出，自然风干，4℃保存备用。
(2)设计引物和探针本发明研制的膜芯片可检测目前国内外报道的与糖尿病相关的线粒体基因45个突变位点。首先从MITOMAP、mtSNP、mtDB、PubMed、中国期刊网和重庆维普数据库中检索与糖尿病相关的线粒体基因突变位点，再以线粒体基因剑桥序列(GenBank#J01415.0 gi337188)作为参考序列，采用Primer Premier 5.0(PREMIER Biosoft International，CA)和NCBI BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，针对mtDNA 45个突变位点，设计特异性野生型和突变型寡核苷酸探针90条(请见表1，mtDNA 45个位点野生型和突变型探针序列)，退火温度为59.2±1.4℃(56.7℃～62℃)，以及特异性扩增9个目的DNA片段序列(Sequence ID 1-9)引物18条(请见表2，9个目的片段特异性扩增引物)。
未公开的引物7F和7R扩增范围为mtDNA 14470-14944(Sequence ID 7)，该片段涵盖了mtDNA 14577 T→C，14693 A→G，14709 T→C 3个突变位点。未公开的34条探针(表1中下划线标示的碱基序列)的G+C碱基含量为40％～60％、退火温度为57.1～62℃，与已公开的28个位点探针相近，确保能在同一个杂交反应体系，既可检测位于线粒体16S rRNA基因、ND2基因、ND4基因、tRNAGlu基因和D-loop区的17个位点的碱基突变，又可检测线粒体tRNALeu(UUR)基因和ND1基因的28个突变位点(已公开的膜芯片检测位点)，进一步完善了膜芯片的设计和应用，达到了系统地检测与糖尿病相关的整个线粒体基因的45个突变位点，检测效率大为提高，不会漏检上述17个突变位点，实现了使用该膜芯片检测线粒体糖尿病既无漏诊、又无误诊的目标。
(3)芯片点阵布控所研制的膜芯片为196个样点组成的14行×14列的矩阵(请见附图1)，包括监控系统和检测系统。
监控系统包括3个部分，分别为①芯片阴性对照，为探针稀释液(5×SSCBuffer)，布控在有公共野生型探针的位点处，点样矩阵中，mtDNA 3200、3205与3206位点公用1条野生型探针，在mtDNA 3200和3205位点的突变型探针点样处下方，点印阴性对照。若阴性对照杂交后无信号，表明正常；若有杂交信号，表明探针稀释液有污染或点样过程有污染。②芯片阳性对照，为生物素标记的mtDNA 3243位点的野生型和突变型探针1∶1混合的25μM溶液，布控在膜芯片的4个角，共16个阳性对照样点，如图1所示。若杂交后有信号，表明正常；若无信号，则说明实验失败。③芯片平行对照，为各位点的25μM的探针溶液平行点印2个点，在矩阵中mtDNA 1888位点的野生型探针和突变型探针各点印2个样点，即4个样点检测1个基因位点。若信号强度均一，说明杂交和洗涤过程控制良好，探针的结合能力好，具有可重复性，否则表明探针的结合能力或特异性存在问题，或是杂交或洗涤过程控制欠佳。
检测系统由mtDNA 45个位点的90条野生型和突变型寡核苷酸探针布控的样点组成；每条探针均采用5×SSC Buffer稀释为25μM溶液，并点印2个平行点，即4个样点(野生型和突变型探针各2个样点)检测1个基因位点，45个基因位点按照从左到右从小到大的顺序排列(图1)。如果杂交后某个位点的突变型探针信号远远强于野生型探针信号则判为突变型。
(4)芯片点样和固定监控系统与检测系统的点阵布控在同一区域，采用478A芯片点样仪(美国UVP公司)点印于经灭菌双蒸水和5×SSC Buffer预处理后的尼龙膜条；紫外线照射8min交联固定；4℃保存备用。该膜芯片洗涤过程为，室温以2×SSC-0.1％SDS振动洗涤5min×2次，0.5×SSC-0.1％SDS振动洗涤15min。
表1 mtDNA 45个位点野生型和突变型探针序列
注带下划线的17个突变位点的探针序列为本发明的特征技术，其它位点探针序列在研制者发表的文章中已公开。
表2 9个目的片段特异性扩增引物
注带下划线引物序列(7F，7R)为本发明内容，其余的16条引物序列在研制者发表的文章中已公开或来自文献(Levin BC，cheng H，Reeder DJ(1999)A human mitochondrialDNA standard reference material for quality control in forensic identification，medical diagnosis，and mutation detection. Genomics 55135-146. Fukuda M，Nakano S，Imaizumi N，Kitazawa M，Nishizawa M，Kigoshi T，Uchida K(1999)Mitochondrial DNA mutations are associated with bothdecreased insulin secretion and advanced microvascular complications in Japanese diabeticsubjects.J Diabetes Complications 13277-283.)一种快速检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片的检测步骤是(1)收集病人标本，提取模板DNA。
(2)采用表2中9对引物进行不对称多重PCR扩增目的DNA(Sequence ID 1-9)。不对称PCR反应液是由10×buffer(晶美公司)，10μmol/L的各正向引物(1F-9F)，1μmol/L各反向引物(1R-9R)，25mmol/LMgCl2(晶美公司)，10mmol/LdNTPs，1U Tag DNA聚合酶(晶美公司)和无菌双蒸水组成。引物1和4，2和3，5和6可行多重不对称PCR。扩增条件为95℃预变性3min，35个循环(94℃变性45s，58℃退火35s，72℃延伸45s)，72℃延伸7min。
(3)产物纯化后(QIAGEN公司)用生物素(Invitrogen公司)进行标记，100℃煮沸变性，-20℃聚冷。
(4)42℃预杂交30min封闭膜芯片非特异性结合，将变性的生物素标记ssDNA与预热的杂交液1∶10混匀，放入膜芯片42℃杂交2h。标记的被检标本扩增的目的片段在相同的杂交反应条件下同时与监控系统和检测系统的所有探针反应。
(5)洗涤后，AP-亲和素作用于NBT/BCIP显色，目视化观察结果(图2)。根据杂交结果，即可对线粒体糖尿病进行筛查和确诊。
(6)检测效果比较见表3，所有检出的突变位点均经DNA测序验证(图3)。
表3 已公开的与本发明的探针和引物检测效果比较
发明的优点和效果本发明研制了一种快速检测线粒体糖尿病45位点膜芯片。该膜芯片具有很多优点①芯片包含监控系统和检测系统两个体系，可系统检测糖尿病相关的线粒体基因45个突变位点，并有质量控制；②操作简单，易于掌握，省时，成本低；③可适应不同层次医院的临床需求，具有很好的应用市场和经济效益。因此，该芯片可快速检测线粒体基因45个位点突变，适用于糖尿病患者和高危人群的筛查，辅助线粒体糖尿病的确诊。本发明为进一步拓展线粒体基因突变相关疾病的筛查提供了一条新的思路、奠定了基础。
图1mtDNA 45个突变位点检测膜芯片点样矩阵示意中●，阳性对照；◎，突变型探针；⊙，野生型探针；○，阴性对照；数字为基因位点图2生物素标记mtDNA45个突变位点检测微阵列膜芯片检测结果中a，3290 T→C突变；b，16223 T基因型图3膜芯片检测的mtDNA15个突变位点经测序验证结果中箭头所指为突变后的碱基，数字为突变的基因位点具体实施方式
实施例1样品的处理和标记(1)新鲜全血标本采用改良NaI方法(喻红，彭芳芳.医学生物化学与分子生物学实验技术，第1版，武汉大学出版社，2003)提取DNA模板。
(2)血痕标本取1.5×1.5cm2大小的血痕，浸人1ml双蒸水中，振荡混匀后，12,000rpm离心3min，去上清，加双蒸水洗涤一次，然后加入200μl5％的Chelex-100，56℃孵育20～30min后，煮沸8min，10,000rpm离心3min，取上清进行PCR扩增。
(3)毛球标本将3～4根毛发在距离根部3～4mm处剪断，毛球浸于Chelex-100溶液中，置56℃保温6～10h。振荡5～10s。100℃煮沸10min后，10000r/min离心3min，取上清液待用。
样本处理好之后，进行目的DNA扩增不对称PCR反应液是由10×buffer，10μmol/L的各正向引物，1μmol/L各反向引物，25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs和无菌双蒸水组成。且引物1和4，2和3，5和6可行多重不对称PCR。扩增条件为95℃预变性3min，35个循环(94℃变性45s，58℃退火35s，72℃延伸45s)，72℃延伸7min；PCR产物经琼脂糖电泳鉴定后，QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)纯化，生物素标记(Invitrogen)，100℃煮沸10min变性后，放入-20℃冰箱聚冷，备用。
实施例2芯片制作方法尼龙膜放入DdH2O浸泡10min，浸入5×SSC 30min(20×SSC-Buffer8.766g氯化钠，4.412g柠檬酸钠，双蒸水定容至50ml，氢氧化钠调pH至7.5)，自然风干；将45个位点的90条氨基修饰的野生型和突变型探针，用5×SSC-Buffer稀释为终浓度为25μm的探针溶液，按点样矩阵(图1)排列在384孔板，用478A芯片点样仪(美国UVP公司)点印；紫外线照射8min交联固定；4℃保存备用。
实施例3杂交反应和免疫显色检测突变42℃预热杂交液(Roche)，将膜芯片浸入预杂交液，预杂交30min，以封闭基片非特异性结合；生物素标记的ssDNA与预热杂交液按1∶10混匀，42℃杂交2h。取出膜芯片，按下述步聚洗涤显色。
(1)室温(25℃～30℃)以2×SSC-0.1％SDS(十二烷基磺酸钠，Sigma公司)振动洗涤5min×2次，0.5×SSC-0.1％SDS振动洗涤15min。
(2)马来酸Buffer-0.3％Tween20洗脱5min(马来酸Buffer马来酸(顺丁烯二酸)2.32克，氯化钠1.7532克，溶于200ml双蒸水，氢氧化钠调pH为7.5；Tween20，Sigma公司)。
(3)1×封闭液封闭30min(1×封闭液9ml马来酸Buffer+1ml10×封闭液(Roche))。
(4)浸入含0.025％的avidin-AP(华美公司)的1×封闭液中反应30min。
(5)马来酸Buffer-0.3％Tween20洗脱15min。
(6)检测液(三羟甲基氨基甲烷1.2114克，氯化钠0.5844克，氯化镁1.0165克，溶于100ml双蒸水，pH 9.5)平衡4min。
(7)在含2％的NBT/BCIP的检测液中避光显色(100μl+检测液5ml)。
(8)待阳性对照的颜色深度达到要求时，以高压超纯水冲洗膜条终止反应。
根据蓝紫色信号强弱判读结果，若野生型探针的杂交信号远远强于突变型探针，则为野生型；若突变型探针的杂交信号远远强于野生型探针，则为突变型；若两者信号强度比较接近，则疑为异质型，需测序验证。结果见图2，检出的突变位点与测序结果一致(图3)。
SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>一种检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片<130>mtDNA1657-2216<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>560<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1cttgaccgct ctgagctaaa cctagcccca aacccactcc accttactac cagacaacct 60tagccaaacc atttacccaa ataaagtata ggcgatagaa attgaaacct ggcgcaatag120atatagtacc gcaagggaaa gatgaaaaat tataaccaag cataatatag caaggactaa180cccctatacc ttctgcataa tgaattaact agaaataact ttgcaaggag agccaaagct240aagacccccg aaaccagacg agctacctaa gaacagctaa aagagcacac ccgtctatgt300agcaaaatag tgggaagatt tataggtaga ggcgacaaac ctaccgagcc tggtgatagc360tggttgtcca agatagaatc ttagttcaac tttaaatttg cccacagaac cctctaaatc420cccttgtaaa tttaactgtt agtccaaaga ggaacagctc tttggacact aggaaaaaac480cttgtagaga gagtaaaaaa tttaacaccc atagtaggcc taaaagcagc caccaattaa540gaaagcgttc aagctcaaca560<210>2<211>596<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1agcgccttcc cccgtaaatg atatcatctc aacttagtat tatacccaca cccacccaag 60aacagggttt gttaagatgg cagagcccgg taatcgcata aaacttaaaa ctttacagtc120agaggttcaa ttcctcttct taacaacata cccatggcca acctcctact cctcattgta180cccattctaa tcgcaatggc attcctaatg cttaccgaac gaaaaattct aggctatata240caactacgca aaggccccaa cgttgtaggc ccctacgggc tactacaacc cttcgctgac300gccataaaac tcttcaccaa agagccccta aaacccgcca catctaccat caccctctac360atcaccgccc cgaccttagc tctcaccatc gctcttctac tatgaacccc cctccccata420cccaaccccc tggtcaacct caacctaggc ctcctattta ttctagccac ctctagccta480gccgtttact caatcctctg atcagggtga gcatcaaact caaactacgc cctgatcggc540gcactgcgag cagtagccca aacaatctca tatgaagtca ccctagccat cattct596<210>3
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1.一种检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片，它包括下列步骤A、以尼龙膜作为载体剪1.5cm×2cm的尼龙膜，放入灭菌DdH2O浸泡10min，再浸入5×SSC 30min，取出，风干，4℃保存备用；B、设计引物和探针首先从MITOMAP、mtSNP、mtDB、PubMed、中国期刊网和重庆维普数据库中检索与糖尿病相关的线粒体基因/mtDNA突变位点；其次是以mtDNA剑桥序列/GenBank #J01415.0 gi337188为序列，采用PrimerPremier 5.0和NCBI BLAST软件，针对mtDNA45个突变位点，设计特异性扩增目的DNA序列引物和野生型及突变型寡核苷酸探针，退火温度为56.7℃～62℃，在5′或3′端修饰8个多聚T；C、芯片点阵布控膜芯片为196个样点组成的14行×14列的矩阵，包括监控系统和检测系统，监控系统为①芯片阴性对照，为探针稀释液5×SSCBuffer，布控在有公共野生型探针的位点处，点样矩阵中，mtDNA 3200、3205与3206位点公用1条野生型探针，点样矩阵中，mtDNA 3200，3205与3206位点公用1条野生型探针，在mtDNA 3200和3205位点的突变型探针点样处下方，点印阴性对照；②芯片阳性对照，标记生物素的mtDNA 3243位点的野生型和突变型探针按1∶1比例混合的25μM溶液，设计布控在膜芯片的4个角，共16个阳性对照样点；③芯片平行对照，采取25μM的探针溶液，于各位点平行点印2个点，在矩阵点样中，对mtDNA 1888位点的野生型探针和突变型探针，各点印2个样点，共4个样点检测1个基因位点；检测系统由mtDNA 45个位点的野生型和突变型寡核苷酸探针，设计布控样点组成，每条探针采用5×SSC Buffer稀释为25μM溶液，同时点印2个平行点，共4个样点检测1个基因位点，45个基因位点按照从左到右从小到大的顺序排列；D、芯片点样固定监控系统与检测系统点阵布控在同一区域，采用478A芯片点样仪，点印于经灭菌双蒸水和5×SSC Buffer预处理后的尼龙膜条；紫外线照射8min交联固定，4℃保存备用；所述的特异性野生型和突变型寡核苷酸探针
所述的目的DNA序列引物
2.根据权利要求1所述的一种检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片，其特征在于所述的膜芯片洗涤过程为，室温以2×SSC-O.1％SDS振动洗涤5min×2次，0.5×SSC-0.1％SDS振动洗涤15min。
全文摘要
本发明公开了一种检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片，其步骤首先是以尼龙膜为载体，其次是设计引物和探针，第三是芯片点阵布控，最后是芯片点样和固定。该芯片监控系统由碱基突变位点的阴性对照、阳性对照和平行对照组成；检测系统为待检的mtDNA 45个位点的野生型和突变型探针。每张芯片包含90条探针、196个样点，布控合理、规整度高。实验操作流程简单，省时，成本低，仅需1次不对称PCR扩增、1次生物素标记、1次杂交反应，即可检测mtDNA45个位点。检测结果准确、快速、效率高，可满足不同层次医院的要求，适用于糖尿病患者和高危人群的检测，有助于临床特殊类型糖尿病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。
文档编号C12N15/11GK1970791SQ20061012537
公开日2007年5月30日 申请日期2006年12月8日 优先权日2006年12月8日
发明者刘松梅, 周新, 李霞, 郑芳, 涂建成, 汤冬玲, 曲喜英, 田艳丽, 蔡春林 申请人:武汉大学