专利名称：一种降解邻硝基酚的产碱杆菌菌株及制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种降解邻硝基酚的产碱杆菌(Alcaligenes sp.)NyZ215，同时涉及这种产碱杆菌的制备方法。产碱杆菌NyZ215能够利用邻硝基酚作为唯一的碳源，氮源和能源生长，因此可以彻底降解污染物邻硝基酚。
背景技术：
目前，硝基类芳香烃化合物大量的生产，被广泛应用于工业，农业，制药业等行业，与人们的生活息息相关。它们大多是对人类有毒有害的化合物，并且在食物链中具有富积和放大效应，具有致畸、致突变、引发癌症等，威胁人类的健康和生存。人工合成的硝基类芳香烃化合物在利用时不可避免的泄漏到环境中，而且发生意外时会大量的泄漏，造成严重的环境污染。尽管人们已经认识到了问题的严重性，但这一问题仍呈上升的趋势。邻硝基酚(o-nitrophenol)属于硝基类芳香烃化合物，是重要的化工原料，常作为医药、染料、农药等的合成前体，还广泛应用于光化学品生产过程中和用作生化检测试剂.这类化合物常在生产和使用过程中被释放到环境中。邻硝基酚在环境中稳定，水溶性高，难以降解，它可抑制许多生物学机能，影响人体物质代谢，危害人类健康，是重要的环境污染物质之一。
硝基的吸电子特性以及邻硝基酚中硝基和羟基的立体结构特征，增加了邻硝基酚生物降解的难度。自50年代初科学家就开始了微生物降解邻硝基酚的研究，近60年来仅分离出几株降解邻硝基酚纯培养物，其中有三株革兰氏阴性菌都属于假单胞菌属Pseudomonas sp.由Germanier，R.et al，1963；Simpson，J.R.et al，1953；Zeyer J.et al，1984筛选得到和两株阳性菌分别为葡萄球菌Staphylococcus sp.和乳杆菌属的短乳杆菌Lactobacillus brevis由卢涛等人在2000，2003年分离得到.Zeyer等人对邻硝基酚降解菌Pseudomonas putida B2进行深入的研究，他们分离了能利用邻硝基酚作为唯一碳、氮源生长的降解菌，阐明了邻硝基酚降解途径。目前国内外还未见有革兰氏阴性产碱杆菌属的细菌降解邻硝基化合物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降解邻硝基酚的产碱杆菌菌株，该菌株能彻底降解邻硝基酚，从而为理论研究代谢机理及生物治理这类硝基化合物的污染提供充足的菌种资源。
本发明的另外一个目的在于提供了一种制备能降解邻硝基酚的产碱杆菌的制备方法，方法操作简便易行。
为了达到上述的目的，本发明采用以下的技术措施通过富集培养的方法，筛选到一株彻底降解邻硝基酚的产碱杆菌菌株。该菌株呈球杆状，革兰氏染色阴性。通过常用的细菌16S rDNA测序检测方法，并用美国生物信息学中心(NCBI)的BLAST程序对该菌的16S rDNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比较，发现与之序列同源性达到＞98％的菌种并已经验证的菌种是产碱杆菌菌属(Alcligenes sp.)的。所以鉴定该菌为产碱杆菌，并命名为产碱杆菌(Alcaligenes sp.)NyZ215。菌株由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号是CCTCC No.M206121。
1.产碱杆菌NyZ215的制备方法，包括如下步骤a.配制无机盐培养基成分为磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)14.3g；磷酸二氢钾(KH2PO4)3.0g；硫酸锰(MnSO4·H2O)0.28mg；硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.3mg；硫酸镁(MgSO4)0.06mg；氯化钙(CaCl2)1mg；硫酸铜(CuSO4)0.05mg和硫酸锌(ZnSO4)0.05mg。将其以双蒸水定容至1000ml，调pH7.0，121℃高压灭菌30分钟。
b.菌种的富集从化工厂活性污泥中取样，将土样混合入上述的无机盐培养基中配制成20％悬浮液，将悬浮液再以5-10％体积的接种量接种到含邻硝基酚的新鲜无机盐培养基中，恒温28-30℃，摇床培养5-10天，取5-10％富集培养液接入新鲜同样培养基中，继续传代培养。如此4-6次，直到获得有显著降解性能的富集培养物。
c.分离在获得有显著降解性能的富集培养物后，利用平板培养，将富集培养物在LB固体培养基中分离和纯化，然后将分离纯化的菌种逐个接种到含邻硝基酚的新鲜的无机盐培养基中，恒温28-30℃摇床培养，通过检测培养基中邻硝基酚的降低以及亚硝酸根离子的产生，筛选邻硝基酚降解菌。该菌株已保藏，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏日期2006年11月14日，保藏编号CCTCC NoM206121，分类命名Alcaligenessp.NyZ215。邻硝基酚用高效液相色谱(HPLC)来测量，亚硝酸根用试剂1％的氨基苯磺酸和0.02％N-(1-萘)乙二胺，来检测其浓度。
2.通过常规的革兰氏染色，鉴定为革兰氏阴性菌。
3.通过PCR扩增出16S rDNA片段，测序获得基因序列。并用美国生物信息学中心(NCBI)的BLAST程序对该菌的16S rDNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比较。网址是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/。产碱杆菌NyZ215，能够彻底降解邻硝基酚，若按5％接种量的培养物可在7小时内降解0.2mM的邻硝基酚，降解率达99％(图1)本发明具有如下优点其一.首次分离到邻硝基酚的产碱杆菌降解菌若按5％接种量的培养物可在7小时内降解0.2mM的邻硝基酚，降解率达99％(图1)。
其二.产碱杆菌NyZ215的分离和获得，为今后研究微生物邻硝基酚的降解代谢途径，以及从分子生物学水平揭示邻硝基酚的降解途径和机理，提供了材料。
其三.产碱杆菌NyZ215的分离为生物治理这类化合物污染提供了菌种资源。
图1是产碱杆菌NyZ215对邻硝基酚降解图谱图例说明，此图是双坐标图，左边的Y轴是浓度(Concentration，单位是毫摩尔mM)，右边的Y轴是细菌的在600nm的吸收值(A600)，X轴是时间(Time，单位是小时h)用高效液相色谱(HPLC)检测邻硝基酚的浓度；用亚硝酸根试剂1％的氨基苯磺酸和0.02％N-(1-萘)乙二胺，检测亚硝酸的浓度；用分光光度计检测菌的浓度(O.D.600或者A600)。
-□-代表在没有接种菌株的基本培养液中作为对照的邻硝基酚(Control(2NP))的浓度，起始浓度是0.225mM，7小时后降低为0.21mM。
-△-代表在接种菌株的基本培养液中亚硝酸根(Nitrite)的浓度，起始浓度是0.025mM，7小时后增加为0.2mM-○-代表在接种菌株的基本培养液中邻硝基酚(2NP)的浓度，起始浓度是0.21mM，7小时后降低为0.0001mM-●-代表在接种菌株的基本培养液中细菌的O.D.600，起始浓度是0.01，7小时后增加为0.03具体实施方式
产碱杆菌的制备分离，培养a.配制无机盐培养基成分为磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)14.3g；磷酸二氢钾(KH2PO4)3.0g；硫酸锰(MnSO4·H2O)0.28mg；硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.3mg；硫酸镁(MgSO4)0.06mg；氯化钙(CaCl2)1mg；硫酸铜(CuSO4)0.05mg和硫酸锌(ZnSO4)0.05mg。将其以双蒸水定容至1000ml，调pH7.0，121℃高压灭菌30分钟。
b.菌种的富集从化工厂活性污泥中取样，将土样混合入上述的无机盐培养基中配制成20％悬浮液，将悬浮液再以5-10％体积的接种量接种到含邻硝基酚的新鲜无机盐培养基中，恒温28-30℃，摇床培养5-10天，取5-10％富集培养液接入新鲜同样培养基中，继续传代培养。如此4-6次，直到获得有显著降解性能的富集培养物。
c.分离在获得有显著降解性能的富集培养物后，利用平板培养技术，将富集培养物在LB培养基中分离和纯化，然后将分离纯化的菌种逐个接种到含邻硝基酚的新鲜的无机盐培养基中，恒温摇床培养，通过检测培养基中邻硝基酚的降低以及亚硝酸根离子的产生，筛选邻硝基酚降解菌。邻硝基酚用高效液相色谱(HPLC)来测量，亚硝酸根用试剂1％的氨基苯磺酸和0.02％N-(1-萘)乙二胺，来检测其浓度。
产碱杆菌NyZ215的鉴定。
1.形态特征菌落呈淡黄色，光滑，边缘整齐。菌体呈球杆状，革兰氏染色阴性。
2.16S rDNA测序，比对1)序列约1500bp片段，16S rDNA为原核生物核糖体亚基16S RNA的DNA序列，在原核生物中具有较高的保守性，能够提供科、属、种等多层次的信息。
2)制备方法用E.Z.N.A.Bacterial DNA kit(Omega Bio-tek)制备细菌基因组DNA。以细菌16S rDNA通用引物1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和27F(5-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3)为扩增引物，细菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增降解菌的16S rDNA(约1500bp)片段，送交公司测序，并获得测序结果。
3)同源性比较用NCBI(Natioal Center for Biotechnology Information)中的BLAST程序(网址是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)对该菌的16S rDNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比较，16S rDNA序列与GenBank中的16S rDNA与之序列同源性达到＞98％的已经鉴定菌种过的是产碱杆菌属的(Alcaligenes sp.)。所以鉴定该菌为产碱杆菌并命名为产碱杆菌(Alcaligenessp.)NyZ215。
3.产碱杆菌NyZ215降解邻硝基酚产碱杆菌NyZ215能够彻底降解邻硝基酚，若按5％接种量的培养物可在7小时内降解0.2mM的邻硝基酚，降解率达99％(图1)。
产碱杆菌(Alcaligenes sp.)NyZ215降解邻硝基酚的特性如下接种产碱杆菌NyZ215于0.2mM邻硝基酚的10ml无机盐培养基，30℃摇床培养过夜，转接于含0.2mM邻硝基酚的60ml无机盐培养基中，30℃摇床培养数小时后，间隔取样，10000rpm离心，收集上清。用HPLC检测上清中邻硝基酚浓度，用亚硝酸根试剂1％的氨基苯磺酸和0.02％N-(1-萘)乙二胺来检测亚硝酸根，用分光光度计检测菌的浓度O.D.600。该菌种对邻硝基酚的降解率达99％，并作为唯一的碳源，氮源和能源生长。(图1)
权利要求
1.一种降解邻硝基酚的产碱杆菌菌株，其特征在于产碱杆菌(Alcaligenessp.)NyZ215，CCTCC NoM206121。
2.一种用于实现权利要求1所述的降解邻硝基酚的产碱杆菌的制备方法，包括如下步骤a.配制无机盐培养基成分为磷酸氢二钠14.3g；磷酸二氢钾3.0g；硫酸锰0.28mg；硫酸亚铁0.3mg；硫酸镁0.06mg；氯化钙1mg；硫酸铜0.05mg和硫酸锌0.05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH 7.0，121℃高压灭菌30分钟；b.菌种的富集从化工厂活性污泥中取样，将土样混合入上述的无机盐培养基中配制成20％悬浮液，将悬浮液再以5-10％体积的接种量接种到含邻硝基酚的新鲜无机盐培养基中，恒温28-30℃，摇床培养5-10天，取5-10％富集培养液接入新鲜同样培养基中，继续传代培养，如此4-6次，获得富集培养物；c.分离在获得富集培养物后，利用平板培养，将富集培养物在LB固体培养基中分离和纯化，然后将分离纯化的菌种逐个接种到含邻硝基酚的新鲜的无机盐培养基中，恒温28-30℃摇床培养，通过检测培养基中邻硝基酚的降低以及亚硝酸根离子的产生，筛选邻硝基酚降解菌。
3.根据权利要求1所述的一种降解邻硝基酚的产碱杆菌菌株，其特征在于菌落是淡黄色，光滑，边缘整齐，菌体呈球杆状，革兰氏染色阴性。
全文摘要
本发明公开了一种降解邻硝基酚的产碱杆菌菌株及制备方法，产碱杆菌为Alcaligenes sp.，CCTCC No.M206121。其制备步骤是首先是配制无机盐培养基，成分为磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化钙、硫酸铜、硫酸锌和双蒸水，调pH值高压灭菌；其次是菌种的富集，从污泥中取样，将土样与无机盐培养基配制成悬浮液，将悬浮液以一定体积接种量接种到含邻硝基酚的新鲜无机盐培养基中，恒温，摇床培养，获富集培养物；第三是将富集培养物在LB固体培养基中分离和纯化。本发明方法易行，在一定时间内降解邻硝基酚，降解率达99％。
文档编号C12R1/05GK101016522SQ200610125308
公开日2007年8月15日 申请日期2006年12月5日 优先权日2006年12月5日
发明者周宁一, 肖毅, 刘虹, 王淑君 申请人:中国科学院武汉病毒研究所