专利名称：单子叶植物中油的提高的制作方法
单子叶植物中油的提高
背景技术：
本申请根据35 U.S.C. 119 (e)要求2005年5月26日提交的临时申请 U.S. Serial No. 60/684,809的优先权，通过引用将该申请合并在此。
1. 发明领域
本发明涉及通过磷酸果糖激酶的过量表达提高作物植物种子中的 油水平。
2. 相关的技术
果糖_6-磷酸(F-6-P)向果糖-l,6-二磷酸(F-1,6-BP)的转化由磷酸 果糖激酶(PFK)催化。ATP依赖性的PFK在大多数有机体和组织中催化 这个步骤，这种酶长期与糖酵解流的调节有关。实际上在许多系统中， 包括植物中，变构酶ATP-PFK和丙酮酸激酶(PK)的组合调节被认为是 对于调节糖酵解起主要作用的。在植物中，ATP-PFK位于质体和胞质液 中。通常地，这些不同的细胞位置中存在的酶具有不同的动力学性质。 除了 ATP-PFK酶之外，存在着涉及这两种代谢物的相互转变的两种其他 的酶焦磷酸盐依赖性PFK (PPI-PFK),其催化F-6-P和F-l,6-BP的无机 焦磷酸依赖性的可逆相互转换，以及果糖-l，6-二磷酸酶，其催化葡糖异 生作用的逆反应。
Doehlert等人(1988 )发现，PFK在玉米的胚(embryos,高油组织) 中比在胚乳(低油组织)中更丰富。在涉及籽粒不同部分内碳水化合物 代谢的酶的丰度分布调查中，这些工作者发现，PFK活性与那些沉积了 最多油的籽粒区域相关。存在大量的证据证明PFK在调节糖酵解流中的 重要性(例如，Plaxton， 1996)。虽然已经产生了某些包含异源磷酸果 糖激酶基因的转基因植物(例如，美国专利7,012，171; Burrell " a/., 1994; Thomas W a/., 1997; WO 99/67392; Wood W , 1999; Wood e/ , 2002),使用PFK来提高单子叶植物植抹和种子中的含油量还未被报道。
为了在发育的单子叶植物种子中产生更高的油水平，这些组织需要 转化更多的新进碳(主要为蔗糖)成为甘油三酯(TAG)而不是淀粉。 这表明更多的己糖需要通过糖酵解而降解以产生丙酮酸和乙酰CoA作为 脂肪酸合成的底物。发明概述
本发明涉及/7#基因的过量表达，具有提高的糖酵解流和因而提高的 底物供应的预期效果，在例如单子叶植物种子的组织中产生更高的油水
平。更具体i也，这:^步及来自纟田菌Z^"o6(3cz7/ws Je/Z^ewcA"亚种Z w/gancw5 的ATP依赖性/#基因在单子叶植物种子中的过量表达。
本发明提供了产生在其种子中具有提高的油的单子叶植物的方法， 包括步骤种植转化的单子叶植物来产生种子，所述单子叶植物包含可 操作连接到种子-增强启动子的编码磷酸果糖激酶的核酸序列，除非所述 种子-增强启动子是胚-增强启动子，所述种子-增强启动子还任选地可操 作连接到编码质体转运肽的核酸序列，从而与缺乏所述核酸序列的同基 因植物的种子相比所述种子的油含量提高。
本发明提供了产生在其种子中具有提高的油的单子叶植物的方法， 包括步骤种植转化的单子叶植物来产生种子，所述单子叶植物包含可 操作连接到种子-增强启动子的、不是SEQIDNO: 9或13的编码磷酸果 糖激酶的核酸序列，除非所述种子-增强启动子是胚-增强启动子，所述 种子-增强启动子还任选地可操作连接到编码质体转运肽的核酸序列，从 而与缺乏所述核酸序列的同基因植物的种子相比所述种子的油含量提 南。
在一个实施方式中，所述方法包括产生单子叶植物，其中所述编码 磷酸果糖激酶的核酸序列选自以下构成的组
a) 包含SEQIDNO: l或ll的核酸序列，和
b) 编码SEQIDNO: 2或12的核酸序列。
在另一个实施方式中，所述植物进一步包含可操作连接到种子-增强 启动子的、编码丙酮酸激酶的笫二核酸序列。在这个实施方式的一种版 本中，所述编码丙酮酸激酶的第二核酸序列选自以下构成的组
a) 包含SEQIDNO: 3的核酸序列，和
b) 编码SEQIDNO: 4的核酸序列。
在各种实施方式中，所述单子叶植物选自由玉米(ZeamajAS、)、稻 米((9，a s""va )、 大麦(//o^/ewm vw/g"re )、 粟(尸amcw/w脂7wceww )、 ,擎、麦(5^c<a/e cerea/e ) 、 '■!、麦(7>"zcw/77 aeWzvww )禾口高梁(Sorg/zwm 6zco/or)构成的组。在各种实施方式中，所述启动子选自由胚-增强启动子、胚乳-增强 启动子以及胚-和胚乳-增强启动子构成的组。
本发明还提供了转化的植物细胞、转化的植物和子代、种子、油和 粗粉。另外，本发明提供了动物飼料和人类食品成分以及生产油的方法。
序列的简要说明
SEQ ID NO: 1歹寸出了编石马来自丄"cto6acz〃2^ ^fe/Z^ewchz m/ . Z)w/ganc^的-岸酸果糖激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 2歹寸出了来自Z"cfoZ>ac7.〃i <ie/Z)/-ewh々'm/ . 6w/gancw 的磷酸果糖激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 3歹'J出了编》马来自 Z"c,oZ)""〃m de/力rewch'z m/ . Zm/gancz^的丙酮酸激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 4歹寸出了来自丄actoZ ac/〃ws fife/Z)rewchz' 6w/g<2ncws 的丙酮酸激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 5-8列出了核酸引物。
SEQ ID NO: 9歹'j出了编石马来自Sc/"ray"cc/2"row_ycw ;wwZ^的石粦酸 果糖激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 10歹U出了来自5"c/nzo^cc/zarawycw 的石舞酸果 糖激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 11歹ll出了编石马来自尸ra/ z'om6"c e〃.wm /rew<iew/^/c/2〃' 的磷酸果糖激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 12歹'j出了来自/Vop/om力a"e"wm /rewc/e"rez'c/2h的石寿 酸果糖激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 13列出了编码来自i^c/zenc/n" co"的石寿酸果糖激酶的 核酸序列。
SEQ ID NO: 14列出了来自Es，c/^r c/"a co/z的石舞酸果糖激酶的多肽序列。
附图的简要说明
以下附图形成了本说明书的部分，被包括在内以进一步说明本发明 的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并结合在此呈现的特定实施 方式的详细i兌明，可以更好地理解本发明。附
图1 显示了分离自丄a"oZ ""〃z^ t/e/^e
h'/亚种6w/g"〃'cw5 ATCC菌抹11842的;^基因的编码序列(SEQIDNO: 1)与公开的/ #基 因序列(EMBL登记号弁—X71403 )的比对。
附图2 描绘了质粒pMON72008。
附图3 描绘了质粒pMON79823 。
附图4 描绘了质粒pMON79824。
附图5 描绘了质粒pMON79827。
附图6 描绘了质粒pMON72028 。
附图7 描绘了质粒pMON79832。
附图8 描绘了质粒pMON81470。
附图9 描绘了质粒pMON72029 。
附图10 描绘了质粒pMON83 715 。
说明性实施方式的说明
提供了以下定义作为对理解本发明的帮助。用语"DNA序列"、"核 酸序列"、"核酸分子"和"核酸片段"是指包含核苷酸的有序排列的物理结 构。DNA片段、序列或核苷酸序列可以含有在大核苷酸分子、载体等等 之内。此外，在这些序列中核酸的有序排列可以以序列表、附图、表格、 电子媒体等等的形式描绘。
用语"编码序列"、"编码区"、"结构序列"和"结构核酸序列"是指其 中核苷酸以各自形成密码子的 一 系列三联体排列的DNA序列、核酸序 列、核酸分子的全部或片段。每个密码子编码特定的氨基酸。因而，编 码序列、编码区、结构序列和结构核酸序列编码形成蛋白、多肽或肽序 列的一系列氨基酸。编码序列、编码区、结构序列和结构核酸序列可以 含有在大的核酸分子、载体等等之内。此外，在这些序列中核苷酸的有 序排列可以以序列表、附图、表格、电子媒体等等的形式描绘。
术语"cDNA"是指互补于并来自mRNA的双链DNA。
"表达"是指 一种过程，基因的编码信息通过它被转变为在细胞中存 在并运作的结构。表达的基因包括被转录成RNA、然后被翻译成蛋白质 的那些，以及被转录成RNA但不翻译成蛋白质的那些(例如，转运RNA 和核糖体RNA)。
如在此使用的，"基因"是指表达特定蛋白质的核酸片段，包括在编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调节序列。"天 然基因"是指在自然中存在具有其自身的调节序列的基因。"嵌合基因" 是指任何基因，其不是天然基因，包含在自然中不在一起存在的调节和 编码序列。因而，嵌合基因可以包含来自不同来源的调节序列和编码序 列，或来自相同来源但以不同于自然中存在的方式排列的调节序列和编 码序列。"内源基因"是指在有机体的基因组中在其自然位置的天然基 因。"外源基因"或"转基因"是指通过转化过程导入到基因组中的基因。
转基因包括通过转化过程导入的基因组DNA (例如，与其活性启动子连 接的基因组DNA)。
"异源"是指来自不同来源的两种或多种核酸或蛋白序列之间的关 系。例如，如果这样的组合不是自然中通常存在的，启动子对于编码序 列是异源的。此外，如果在特定的细胞或有机体中不会天然发生，特定 的核酸序列对于它所插入的细胞或有机体可以是"异源的"。
"序列同源性"是指在两个或更多核酸或氨基酸序列之间就位置同 一性的百分比而言的相似性水平。术语同源性还用于指出在不同的核酸 或蛋白之间的相似功能性质的概念。
"杂交"是指当两个核酸链具有充分的序列互补性时核酸的第 一链 与第二链经由氬键碱基配对结合的能力。如在此使用的，如果核酸分子 显示出完全的互补性，则称核酸分子是另一个核酸分子的"互补物"。如 此处使用的，当一个分子的每一个核普酸与另一个分子的核苦酸互补 时，称为分子显示出"完全的互补性"。因而，当它们的相互杂交具有足 够的稳定性以允许它们在合适的条件下保持相互的退火时，称两个核酸 链具有充分的互补性。
促进DNA杂交的合适的严格条件是，例如，6.0x氯化钠/柠檬酸钠 (SSC)在约45。C,随后2.0xSSC在20-25。C洗涤，是本领域技术人员公 知的。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格的约2.0xSSC、 50°C 到高度严格的约0.2xSSC、 65°C。此外，洗涤步骤中的温度可以从在室 温下约22。C的低严格条件提高到约65温度的高严格条件。温度和盐度都 可以变化，或者温度或盐浓度之一可以保持恒定，从而核酸将与在此提 供的一种或多种多核苷酸分子在中度严格条件下特异性杂交，所述多核 苦酸分子例如在SEQ IDNO: 1、 3或11中列出的、或其互补物，所述中 度严格条件例如约2.0x SSC和约65 °C 。用语"分离的"意指已经从其自然环境移除，不考虑它的最终分布。 例如，"分离"自稻米的核酸序列，例如通过从稻米细胞克隆，当被插入 到玉米细胞的基因组时保持了 "分离的"。
用语"可操作连接"是指两种或多种核酸区域或核酸序列的空间排 列，从而它们发挥它们相互的合适效果。例如，启动子区域可以相对于 核酸序列放置，从而所述核酸序列的转录^^皮所述启动子区域指导。该启 动子区域和该核酸序列是"可操作连接的"。
术语"磷酸果糖激酶"是指能够将果糖-6-磷酸(F-6-P)转化成果糖
-1,6-二磷酸(F-1,6-BP)的酶。这包括来自国际生物化学联合会和分子 生物学酶术语分类EC 2.7.1.ll和EC 2.7.1.90的酶。
术语"丙酮酸激酶"是指能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成丙酮酸的酶。
这包括来自国际生物化学联合会和分子生物学酶术语分类2.7丄40的酶。 术语"质体"是指藻类和植物细胞的自我复制性细胞质细胞器，例如
叶绿体或色质体。"转运肽"是指蛋白的N-末端的氨基酸序列，其将所述
多肽从它在胞质液中的合成耙向质体，并促进它通过质体膜的转位。在
多肽进入质体之后，转运肽从所述多肽上裂解。
"上游"和"下游"是对于核苷酸序列的位置以及编码序列的转录或翻
译方向所使用的位置术语，其通常在5'到3'方向上进行。
术语"启动子"或"启动子区域"是指核酸序列，通常存在于编码序列
的上游(5'),其能够指导核酸序列成为RNA分子的转录。启动子或启
动子区域一般提供了 RNA聚合酶的识别位点以及适当的转录起始所必
需的其他因素。如在此期待的，启动子或启动子区域包括通过插入或删
除调节区、使启动子经历随机或定点诱变等等所衍生的启动子变体。启
动子的活性或强度可以通过就它产生的RNA数量、或在细胞或组织中积
累的蛋白质数量，相对于类似测量的第二启动子来定量。
用语"3'非编码序列"是指位于编码序列的下游的核苦酸序列，包括
多聚腺苷酸识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号
其他序列。这些通常被成为3'非翻译区域或3'-UTR。多腺苷酸化信号通
常以影响多聚腺苷酸l殳向mRNA前体的3'末端的添加为特征。不同的3'
非编码序列的作用由Ingelbrecht等(1989 )例证。
"翻译前导区序列"或"5'非翻译区"或"5'UTR"都是指位于基因的启
动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。5'-UTR存在于完整加工的翻i奪起始序列的mRNA上游。5'-UTR可以影响向mRNA的主要转录的加工、 mRNA稳定性或翻译效力。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner and Foster, 1995 )。
"RNA转录产物"是指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录产生的产 物。当RNA转录产物是DNA序列的理想互补拷贝时，它^L称为原始转录 产物。来自原始转录产物的转录后加工的RNA序列被称为成熟RNA。"信 使RNA" (mRNA)是指没有内含子并且可以被细胞翻译成多肽的RNA。
"重组载体"是指任何试剂，通过它或在它之中，目标核酸被扩增、 表达或保存，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体或线性单 链的、环形单链的、线性双链的、或环形双链的DNA或RNA核苦酸序列。 重组载体可以被合成，或来自于任何来源，并能够基因组整合或自主复 制。
"调节序列"是指位于编码序列或内含子的上游(5')、之中或下游 (3')的核苷酸序列，它的存在或缺乏影响所述编码序列的转录和表达。 "基本上同源的"是指在序列上至少约90%相同的两个序列，如通过例如 DNAStar ( Madison, WI)中的CLUSTAL W算法所测量的。
"基本上纯的"是指从在其天然状态中通常与其相关的基本上所有 其他分子在分离的分子。更优选的，基本上纯的分子是在制品中存在的 优势种。基本上纯的分子可以是大于约60%地没有、优选的约75%地没 有、更优选的约90%地没有、以及最优选的约95。/。地没有天然混合物中 存在的其他分子(不包括溶剂)。用语"基本上纯的"不意图涵盖以它们 的天然状态存在的分子。优选的，本发明的核酸分子和多肽是基本上纯 的。
术语"转化"是指核酸导入接受者宿主中。术语"宿主"是指细菌细胞、 真菌、动物或动物细胞、植物或种子、或任何植物部分或组织，包括植 物细胞、原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、幼苗、胚和花粉。
如在此使用的，"转基因植物"是具有被稳定导入其基因组，例如核 或质体基因组中的外源核酸的植物。
术语"同基因的"作为具有或缺乏转基因的植物或植物系之间的比 较性术语，是指除了所讨论的转基因之外植物或抹系具有相同或相似的
遗传背景。例如，代表来自亲本F2群体的表型相似或相同选集的所谓的姐妹系被认为是"同基因的"。当使用未转化的亲本作为回交亲本、使稳 定的转化植物的子代与未转化的亲本株系杂交或回交，同时针对型(通 过分子标记物分析的基因型，或通过田间观察的表型，或两种)和转基 因来选择时，产生的转基因林系被认为是与其未转化的亲本系是高度 "同基因的"。
术语"种子"、"籽粒"和"谷粒"被理解为在含义上是等价。术语籽粒 通常用于描述玉米或稻米植物的种子。在所有植物中，种子是由种皮、 胚、糊粉和胚乳组成的成熟的胚珠。
编码磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的核酸
本发明提供了，尤其是，使用编码磷酸果糖激酶(国际生物化学联
合会和分子生物学酶术语分类EC 2.7.1.ll和EC 2.7.1.90;更具体地，SEQ ID NO: l和ll )以及丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40;更具体地，SEQ ID NO: 3)的核酸分子的方法。
在一个实施方式中，这些核酸分子在本发明的上下文中被用于改变 单子叶植物种子中的油含量。
这些核酸分子可以使用cDNA、 mRNA或基因组DNA作为模板和合 适的寡核苷酸引物根据标准PCRTM扩增技术来扩增。做为选择，它们可 以使用标准的合成技术，例如自动化的DNA合成仪来合成。
如果希望，编码磷酸果糖激酶或丙酮酸激酶的核酸的序列可以被修 改而不改变表达的蛋白质的最终氨基酸序列，使得所述序列在植物宿主 中更易于表达。编码序列可以是人工的DNA。如在此使用的人工DNA 是指非天然发生的DNA多核普酸分子。人工DNA分子可以通过各种方法 来设计，例如，基于取代笫一多核苷酸的密码子来产生等效物的本领域 中已知的方法，乃至改进的、第二代人工多核苦酸，其中这种新的人工 多核苷酸对于转基因植物中增强的表达是有用的。设计方面通常采用密 码子利用率表，该表格通过编选分离自植物、植物型、科或属的编码序 列集合中密码子出现频率来产生。其他设计方案包括降低多腺苷酸化信 号、内含子剪接位点、或序列的长的AT或GC延伸的出现(美国专利
法从人工DNA产生。表达载体和盒
植物表达载体可以包含与上述核酸分子可操作连接的天然的或非 天然的启动子。启动子的选择，例如，可被描述为强表达、弱表达、可 诱导表达、组织增强表达(即，在组织中特异地或优先地表达)、器官 增强表达(即，在器官中特异地或优先地表达)和发育增强表达(即， 在发育的特定阶段特异地或优先地表达)的启动子，在本领域技术人员 的能力范围内。类似地，如上所述的核酸分子与启动子的组合也在本领
域技术人员能力范围内(参见，例如Sambrook Wa/., 1989)。
在本发明的一个实施方式中，上述核酸分子与种子-增强启动子可操 作连接，引起足以提高单子叶植物种子中的油的表达。本发明的启动子 一般包括，但不限于，在细菌、噬菌体或植物细胞中起作用的启动子。 用于细菌表达的有用启动子有lacZ、 Sp6、 T7、 T5或五.co/z glgC启动子。 对于植物细胞有用的启动子包括球蛋白启动子L (参见，例如Belanger and Kriz( 1991 )、 gamma zein Z27启^力子(参见，例^口Lopes " a/. 0995 )、 L3oleosin启动子(美国专利No. 6,433,252 )、大麦PER1启动子(Stacey "a/. ( 1996) 、 CaMV35S启动子(Odell " a/. H985 ) ) 、 CaMV 19S (Lawtone/"/" 1987 )、歸(Ebert " a/" 1987 )、Adh( Walker "《1987)、 蔗糖合酶(Yang " "/., 1990 )、肌动蛋白(Wang " a/" 1992 )、 c"M Sullivan 1989 ) 、 PEPCase启动子(Hudspeth " a/., 1989),或与R基因复 合物相关的那些启动子(Chandler" a/. ， 1989 )。玄参花叶病毒(FMV) 启动子(Richms"a/., 1987) 、 arcelm、番茄E8、 patatin、遍在蛋白、 mannopine合成酶(mas)和微管蛋白启动子是有用启动子的其他实例。 在玉米中表达的启动子包括来自编码玉米蛋白(zeins)的基因的启 动子，玉米蛋白是在玉米胚乳中发现的一组储存蛋白质。玉米蛋白基因 的基因组克隆已经被分离(Pedersen W 1982 )和Russell "a/., 1997)， 可以使用来自这些克隆包括15kD、 16kD、 19kD、 22kD和27kD基因的启 动子。已知在玉米中和在其他植物中起作用的其他种子表达增强启动子 包括以下基因的启动子,"cy(微粒结合的淀粉合酶)、份W/e和S/^朋fe" 2 ( ADP葡萄糖焦磷酸化酶)、幼r丽fe" 1 (蔗糖合酶)、分支酶I和II、 淀粉合成酶、脱支酶、oleosms、谷蛋白和Betll (基础胚乳转移层)。 本领域技术人员已知的在本发明的实践中有用的其他启动子也是本发 明预期的。此外，转录增强子或增强子的复制物可以用于提高来自特定启动子
的表达。这种增强子的实例包括但不限于Adh内含子l (Callis W a/., 1987 )、稻米肌动蛋白内含子(McElroy " "/.， 1991;美国专利No. 5,641，876)、蔗糖合酶内含子(Vasile"/" 1989)、玉米HSP70内含子 (也称为Zm.DnaK )(美国专利No.5,424,412 Brown, " )、 TMV omega 元件(Gallieef"/" 1999)、 CaMV 35S增强子(美国专利Nos.5,359,142 & 5,196,525, McPherson " )或章鱼碱合成酶增强子(美国专利No. 5,290，924, Last W a/.)。由于转录起始位点和编码序列的起点之间的DNA 序列，即，非翻译前导序列可以影响基因表达，人们也可以希望采用特 定的前导序列。可以采用本领域技术人员可获得的任何前导序列。优选 的前导序列指导连接的基因的最佳表达水平，例如，通过提高或维持 mRNA稳定性和/或通过防止不适当的翻译起始(Joshi, 1987)。这种序
列的选择处于本领域技术人员的处理能力之内。来自特别是在玉米、稻 米和单子叶植物中高度表达的基因的序列是期待的。
本发明的表达盒还将包括靠近所述盒的3'末端的序列，其充当信号 来终止异源核酸的转录，并指导产生的mRNA的多聚腺苷酸化。这些通 常被成为3'非翻译区域或3'-UTR。可以充当转录终止信号的某些3'元件包 4舌来自jgra6a"enwm wme/a"e似的月因月旨石咸合成酶基因的那些(Bevan " "/., 1983 )、 napm 3，非翻译区域(Kndl " 1991 )或球蛋白3'非翻 译区域(Belanger肌d Kriz, 1991 )或来自玉米蛋白基因，例如Z27的元 件(L叩es Wa/.， 1995 )。本领域已知的其他3'调节元件也可以用于本发 明的载体中。
本发明的表达载体也可以包括与异源核酸序列融合的编码转运肽 的序列。叶绿体转运肽(CTP)被工程化来融合到蛋白的N-末端以指导 蛋白进入植物叶绿体。许多叶绿体本地化蛋白作为前体从核基因中表 达，并通过在输入过程中被除去的叶绿体转运肽被靶向到叶绿体。其他 这样的叶绿体蛋白的实例包括核酮糖-1 , 5-二磷酸羧化酶的小亚基 (SSU)、铁氧化还原蛋白、铁氧化还原蛋白氧化还原酶、光收获复合 物蛋白I和蛋白II，和石危氧还蛋白F。净争别；也，可以^吏用^Vzco""wa/^Z^c'wm 核酮糖l，5-二磷酸羧化酶小亚基chor叩last转运肽(SSU-CTP ) ( Mazur, W a/., 1985 )。已经在体内和体外证明了通过使用与CTP的蛋白融合物， 非叶绿体蛋白可以被耙向叶绿体，并且CTP序列足以将蛋白草巴向叶绿体。适合的叶绿体转运肽，例如爿ra6^fo戸w Aa/w朋EPSPS CTP ( Klee W 1987 )和尸咖腹EPSPS CTP ( della-Cioppa " "/., 1986 )的掺入 已经证明了在转基因植物中将异源EPSPS蛋白序列靶向叶绿体。
本发明进一步提供了包含上述核酸分子的载体。如上所述的核酸分 子可以被克隆到任何适合的载体中，并可以用于转化或转染任何适合的 宿主。载体的选择和构建它们的方法是本领i4熟知的，在4支术文献中一 般地描述了 (一般参见，"Recombinant DNA Part D" ( 1987))。所述 载体将优选地包含调节序列，例如转录和翻译起始密码子以及终止密码 子，其特异于载体将要导入其中的宿主类型，视情况地并考虑该载体是 DNA还是RNA。
可以制备环形或线形的载体构建体，含有连接到在原核或真核宿主 细胞中有功能的复制系统的如上所述的完整核酸序列或其部分。复制系 统可以来自ColEl、 2m^质粒、X喧菌体，fl丝状噬菌体、土i裏杆菌物种 (例长口, A. tumefaciens禾口A. rhizogenes )等等。
除了复制系统和插入的核酸序列之外，所述构建体可以包括容许选 择转化或转染的宿主的一种或多种标记基因。标记基因包括抗生抗性， 例如，对抗生素、重金属、除草剂等等的抗性，在营养缺陷宿主中的补 足来提供原养，等等。
本发明提供了包含上述核酸分子、任选的以载体形式的核酸分子的 宿主细J包。适合的宿主包括:才直物、细菌和酵母细胞，包括五sc/ze/7'c/na
cerevwzae，禾口A^w;-c^/7on2 cnxwa。
co/z國宿主包4舌TB隱1 、 TG-2、 DH5ot、 XL-Blue MRF， ( Stratagene, La Jolla, CA ) 、 SA2821、 Y1090和TG02。植 物细胞包括单子叶植物，包括但不限于玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、 粟、高粱和稻米的细胞。
多肽
本发明提供了有上述核酸分子编码的磷酸果糖激酶，以及在某些情 况下，丙酮酸激酶。所述多肽优选的包含氨基末端和羧基末端。所述多 肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸，或D-与L-氨基酸的混合物。
对天然氨基酸序列产生变体多肽的改变可以通过本领域普通技术 人员已知的各种方法来进行。例如，通过在合成时改变核酸分子的序列可以方便地将氨基酸替换引入所述多肽中。通过将包含修饰的序列的合 成寡核苷酸连接到表达载体中，也可以引入位点特异性突变。作为选择，
可以使用寡核苷酸指导的、位点特异性诱变步骤，例如在Walder " a/. (1986) ;Bauer""/. ( 1985 );和美国专利Nos.4,518，584和4,737,462中公开的。
在本领域普通技术人员能力范围内的是选择合成的和天然发生的 氨基酸，其作为对任何特定的天然发生氨基酸的保守性或中性替换。普 通技术人员理想地将考虑进行任何特定氨基酸替换的环境，还考虑侧链 的疏水性或极性、侧链的一般大小、在生理条件下具有酸性或碱性的侧 链的pK值。例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸通常适合相互替换，更通常 地是精氨酸和组氨酸。本领域已知的是，这是因为所有三个氨基酸都具 有碱性侧链，而赖氨酸和精氨酸的侧链的pK值相互之间比组氨酸(约6 ) 更接近(约10和12)。类似地，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异 亮氨酸通过适当地相互取代，条件是甘氨酸通常不适合替代该组的其他 成员。这是因为当掺入到多肽中时这些氨基酸的每一个都是相对疏水性 的，但是甘氨酸缺乏a碳容许了旋转的phi和psi角(在a碳周围)有这样 大的构象自由度，从而甘氨酸残基可能触发在其他氨基酸相互替换时通 常不发生的构象或二级结构中的改变。通常适合相互替换的其他氨基酸 组包括但不限于，由谷氨酸和天冬氨酸构成的组；由苯丙氨酸、酪氨酸 和色氨酸构成的组；以及由丝氨酸、苏氨酸和任选的酪氨酸构成的组。 另外，普通技术人员可以容易地分类合成氨基酸和天然发生的氨基酸。
如果期望，所述多肽可以被修饰，例如，通过糖基化、酰胺化、羧 化作用或磷酸化，或通过加酸盐、酰胺、酯、特别是C-末端酯以及本发 明的多肽的N-酰基衍生物的生成。通过根据本领域已知的方法与其他部 分形成共价或非共价复合物，所述多肽还可以被修饰来产生蛋白衍生 物。共价结合的复合物可以通过将化学部分连接到多肽包含的氨基酸的 侧链的功能基团上，或连接到N-或C-末端来制备。理想地，这种修饰和 结合不会有害地影响多肽(和其变体)的活性。虽然这种修饰和结合可 能具有更大或更小的活性，所述活性期望地不是消极的，并且是未改变 的多肽的特征。
所述多肽(和片段、变体和融合蛋白)可以通过多种常规技术的任 何一种来制备。所述多肽可以是从天然发生的来源或从重组来源分离的或基本上纯化的。例如，对于重组蛋白来说，编码期望的蛋白质的DNA
片段可以使用公知的分子遗传技术(参见，例如，Mamatis"a/., 1989) 和在此处的"实施例"中引用的其他参考文献)亚克隆到合适的载体中。 片段可以被转录，蛋白随后在体外翻译。也可以采用商业上可获得的试 剂盒(例如,由Clontech, Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, IL; Invitrogen等等生产的)。任选的可以在核酸的操作中采用聚合酶链 式反应。
这种多肽也可以根据本领域已知的方法使用自动化肽合成仪来合 成。作为选择，所述多肽(和片段、变体和融合蛋白)可以使用本领域 普通技术人员公知的标准肽合成技术(例如，如Bodanszky, 1984中概述 的)来合成。特别地，所述多肽可以使用固相合成的步骤来合成(参见， 例如，Memfield, 1963; Barany "a/., 1987;和美国专利No. 5,424,398)。 如果期望，这可以使用自动化肽合成仪来进行。t-丁氧基羧基(t-BOC) 或9-药曱氧羰基(Fmoc)氨基酸保护基团的去除以及蛋白从树脂上的分 离可以伴随着例如在降低的温度下的酸处理。含多肽的混合物任何可以 被提取，例如，使用二乙醚，来除去非肽有机化合物，合成的蛋白质可 以从树脂粉未中提取(例如，使用约25% w/v乙酸)。在多肽的合成之 后，任选地可以进行进一步的纯化(例如，使用HPLC)来消除任何不 完整的蛋白质、多肽、肽或游离氨基酸。氨基酸和/或HPLC分析可以对 合成的多肽进行来验证其身份。对于根据本发明的其他应用，优选的是 产生所述多肽来作为更大的融合蛋白的部分，通过化学结合，或通过本 领域已知的遗传学方法。就此来说，本发明还提供了包含所述多肽(或 其片段)或其变体以及具有任何期望的性质或效应物功能的一种或多种 其他多肽/蛋白的融合蛋白。
对于特定蛋白质的生产和鉴定的分析是基于各种物理-化学的、结构 的、功能的性质，或蛋白质的其他性质。独特的物理-化学或结构性质容 许通过电泳步骤，例如天然或变性凝胶电泳或等电聚焦，或者通过层析 技术，例如离子交换或凝胶排阻层析来分离和鉴定。单独蛋白质的独特 结构提供了使用特异性抗体来以例如ELISA分析的形式检测它们存在的 机会。方法的组合可以用于实现更高的特异性，例如Western印迹，其中 抗体被用于定位已经通过电泳技术分离的单独基因产物。其他技术可以 用于确切地确认目标产物的身份，例如通过纯化后的氨基酸测序来评估。虽然这些是最常见的，但也可以使用其他步骤。
分析过程可以通过蛋白质的功能来鉴定蛋白质的表达，特别是当表 达的蛋白质是能够催化涉及特定底物和产物的化学反应的酶时。例如，
在植物提取物中，这些反应可以通过物理和/或化学过程通过提供和测定 反应的底物损失和产物生成来测量。
磷酸果糖激酶或丙酮酸激酶的活性可以使用这种分析在体外测量。
这种分析的实例包括LeBras "a/. ( 1991 )和LeBras "a/. ( 1993 )。代谢
放射示踪研究可以测量体内不同产物库的产生。在这种研究中，向完整 的组织提供放射性标记的前体，监视前体被代谢时放射性标记的结局。
在很多情况下，基因产物的表达通过评估其表达的表型结果来确 定。这种评估可以仅仅是视觉观察，或可以包括分析。这种分析可以采 取许多形式，例如，分析植物的化学成分、形态学或生理性质方面的改 变。通过表达编码酶或储存蛋白质的基因，或通过改变淀粉数量的酶， 可以改变化学组成，所述储存蛋白质改变氨基酸组成并且这种改变可以 通过氨基酸分析来检测，所述淀粉数量可以通过近红外反射光谱来分 析。形态改变可以包括更大的身材或更厚的茎杆。
本发明的核酸分子、载体和多肽可以用于农业方法和各种筛选分析 中。例如，核酸分子可以用于在宿主细胞中经由载体表达磷酸果糖激酶， 用于检测生物样品中编码磷酸果糖激酶的mRNA,用于经由Southern印 迹来检测编码磷酸果糖激酶的基因中的遗传改变，用于抑制磷酸果糖激 酶，或用于增量调节磷酸果糖激酶。所述多肽可以用于在植物中补偿磷 酸果糖激酶的缺失，或补偿具有降低的活性或无活性的突变磷酸果糖激 酶的存在，或用于在植物中处理磷酸果糖激酶的过多的底物水平，不管 是直接还是间接的。做为选择，所述多肽可以用于根据调节它们活性的 能力来筛选试剂。抗体可以用于才全测和分离相应的多肽，以及降4氐这种 多 肽在体内的可用性。
方法
技术领域：
本发明提供了与具有相似遗传背景的未转化植物的种子相比，提高 单子叶植物种子中的油的方法。在一个实施方式中，所述提高油的方法 包括种植转化的单子叶植物来产生种子的步骤，所述单子叶植物具有可 操作连接到种子-增强启动子的、不是SEQIDNO: 9或13的编码磷酸果糖激酶的核酸序列，除非所述种子-增强启动子是胚-增强启动子，所述 种子-增强启动子任选地可操作连接到编码质体转运肽的核酸序列。
在另 一个实施方式中，所述提高油的方法包括向单子叶植物的细胞
中导入选自由以下构成的组、编码磷酸果糖激酶的核酸序列
a) 包含SEQIDNO: l或ll的核酸序列，和
b) 编码SEQIDNO: 2或12的核酸序列。
在另一个实施方式中，所述提高油的方法包括用可操作连接到种子 -增强启动子、编码丙酮酸激酶的第二核酸序列转化所述植物的进一步的 步骤。在又一个实施方式中，所述提高油的方法包括向植物中导入选自 由以下构成的组、编码丙酮酸激酶的第二核酸序列的进一步的步骤
a) 包含SEQIDNO: 3的核酸序列，和
b) 编码SEQIDNO: 4的核酸序列。
在各种实施方式中，所述单子叶才直物选自由玉米(Z^wa，)、稻 米((9r_yz<3 )、 大麦(//oniewm vw/g"re )、 粟(尸a n'cwm wz'/^aceww )、
,繁、麦(5"ec'"/e cerea/e ) 、 'J、麦(7>#z.cwm aeWz.vww )禾口高梁(5V 厂g/zww ^'co/or)构成的组。
在各种实施方式中，所述启动子选自由胚-增强启动子、胚乳-增强 启动子以及胚-和胚乳-增强启动子构成的组。
植物转化
在本发明的一个实施方式中，产生表达期望的蛋白质的转基因植 物。向植物细胞中导入编码期望的蛋白质的期望的多核苦酸序列的各种 方法是本领域已知的，包括(l)物理方法，例如显微注射、电穿孔和 微粒介导的递送(biolistics或基因枪技术)；(2)病毒介导的递送；和 (3) 土壤杆菌介导的转化。
植物细胞转化的最常用的方法是土壤杆菌介导的DNA转移过程，以 及biolistics或微注射微粒轰击介导的过程。 一般地，核转化是期望的， 但当专门地转化质体，例如叶绿体或淀粉体是期望的时，可以利用期望 的多核苷酸的微粒介导的递送来转化植物质体。
土壤杆菌介导的转化通过使用属于土壤杆菌属的遗传工程化的土 ^裏纟田菌来实王见。带有Ti或Ri质4立的jgn9/6(3"erzwm ^we/"cz.e似,口 爿gra^cfe〃wm /7nzoge"M的许多野生型和解除的菌4朱可以用于才直物的基因转移。经由称为"T-DNA"的特定DNA的转移来进行向许多植物品种中 的基因转移，所述特定DNA可以被遗传工程化来携带任何期望的DNA 片段，如在例如Bidney等的美国专利6,265,638中进一步详细描述的，通 过引用将其公开内容合并在此。
土壤杆菌介导的植物的遗传转化涉及几个步骤。第一步，其中强毒 土壤杆菌和植物细胞首先相互接触， 一般称为"接种"。接种优选地伴随 着某些对 一 些植物细胞的损伤方法，其释放活化土壤杆菌中的致病因子 的植物细万包成分，例如coumaryl醇类、sinapinate (其^皮还原为乙酰丁香 酮)、芥子醇和松柏醇。在接种之后，允许土壤杆菌和植物细胞/组织在 适合生长和T-DNA转移的条件下 一起生长几小时到几天或更久的 一段 时间。这个步骤称为"共培养"。在共培养和T-DNA递送之后，用杀细菌 或抑细菌试剂处理植物细胞来杀死保持与外植体接触的和/或在含有外 植体的器亚中的土壤杆菌。如果在缺乏任何选择性试剂的情况下进行这 个步骤，以促进转基因植物细胞相对于非转基因植物细胞的优势生长， 则这一般称为"延迟"步骤。如果在存在偏爱转基因植物细胞的选择压力 的情况下进行这个步骤，则它被称为"选择"步骤。当使用"延迟"时，一 般跟随着一个或多个"选择"步骤。
对于微粒轰击(美国专利No. 5,550,318 (Adams " );美国专利No. 5,538,880 (Lundqmst et. al.)、美国专利No. 5,610,042 ( Chang W a/.); 和PCTV^开WO 95/06128 ( Adams a a/.);通过完全引用将它们每一个特 别地合并在此)，用核酸包一皮微粒子，并通过推力递送到细胞中。示范 性的颗粒包括由鴒、賴和优选的金组成的那些。
通过加速将DN A递送到植物细胞中的方法的说明性实施方式是 Biolistics颗粒递送系统(BioRad, Hercules, CA ),其可以用于将包被有 DNA或细胞的颗粒通过筛子，例如不锈钢筛或Nytex筛推进到用悬浮液 中培养的单子叶植物细胞覆盖的过滤器表面上。
微粒轰击技术是广泛可用的，可以用于转化实际上任何植物物种。 已经通过微粒轰击转化的物种的实例包括单子叶植物物种，例如玉米 (国际公开NO. WO 95/06128 (Adams "q/.))、大麦、小麦(美国专 利NO. 5,563,055 ( Townsend W a/.),通过完全引用合并在此)、稻米、 燕麦、黑麦、甘蔗和高粱；以及许多双子叶植物，包括烟草、大豆(美 国专利NO. 5，322,783( Tomes)，通过完全引用合并在此)、葵花、花生、棉花、番茄和一般的豆荚(美国专利No. 5,563,055 (Townsend" a/.),通过完全引用合并在此)。
为了对转化的植物细胞进行选择或记分而不考虑转化方法，被导入 细胞中的DNA含有基因，其在可再生的植物组织中起作用来产生为植物 组织赋予对其他有毒化合物的抗性的化合物。用作可选择、可筛选或可 记分标记物的目标基因将包括但不限于P-葡糖醛酸酶(GUS)、绿色荧 光蛋白(GFP)、荧光素酶(LUX)、抗生素或除草剂耐受性基因。抗 生素抗性基因的实例包括青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博来霉 素)；氨甲蝶呤(和三曱氧千二氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素和四环素。 编码涉及除草剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子是本领域已知的，包括 但不限于关于草甘膦耐受性的美国专利No. 5,627，061 (Barry, " W.)、 美国专利No 5,633,435 (Barry, " )和美国专利No 6,040,497 ( Spencer,
)中描述的编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的多核 苷酸分子和美国专利No. 5,094，945 ( Comai)中描述的aroA;关于溴苯 腈耐受性的美国专利No. 4,810,648 ( Duerrschnabel " a/.)中描述的编码 溴苯腈水解酶(Bxn )的多核苷酸分子；关于达草灭耐受性的在Misawa " a/. ( 1993 )和Misawa W a/. ( 1994)中描述的编码八氲番茄红素脱饱和 酶(crtl)的多核苷酸分子；以及各自提供了草铵膦和双丙氨膦耐受性 的Wohlleben ef a/. ( 1988 )中描述的PAT基因和DeBlock " a/. ( 1987) 中描述的bar基因。
来自各自转化的外植体的植物的再生、发育和培养是本领域中充分 记载了的。这种再生和生长过程一般包括选择转化的细胞和培养那些个 体化的细胞的步骤，从一般的胚胎发育阶段到生根的植物苗阶段。类似 地再生转基因胚和种子。然后将产生的转基因的生根的芽种植到合适的 植物生长培养基，例如土壤中。在对选择性试剂的暴露下幸存的细胞， 或在筛选分析中记分为阳性的细胞，可以在支持植物再生的培养基中培 养。在转移到温室或生长箱发育成熟之前，将发育的植物苗转移到少土 的植物生长混合物中，并锻炼得耐寒。
本发明可以4吏用任何可转化的细胞或组织。在此使用的可转化是指 细胞或组织能够进一步增殖来产生植物。本领域技术人员认识到，许多 植物细胞或组织是可转化的，其中在外源DNA的插入和合适的培养条件 之后，植物细胞或组织可以形成分化的植物。适合于这些目的的组织可以包括但不限于不成熟的胚、鳞片组织、悬浮细胞培养物、不成熟的花 序、芽分生组织、结节外植体、愈伤组织、胚轴组织、子叶、根和叶。
以上引述的Tomes "'783专利描述了 一种方法，用细胞分裂素处理、 随后孵育 一段时期，足以允许子叶节组织中的未分化细胞分化成分生组 织细胞，并允许细胞进入发育的G1和分裂期之间的阶段，声称其改善了 转化的敏感性。
可以使用任何适合的植物培养基。适合的培养基包括但不限于，基 于MS的培养基(Murashige and Skoog, 1962 )或基于N6的培养基(Chu " a/., 1975 ),补充有植物生长调节剂，包括但不限于发育素、细胞分裂 素、ABA和赤霉素。本领域技术人员熟悉组织培养基的变化，当适当地 补充时，其支持了植物组织生长和发育，并适合于植物转化和再生。这 些组织培养基可以作为商业产品购买，或常规地制备或修改。本领域技 术人员知道，用于转化和再生的培养基和培养基添加剂例如营养物和生 长调节剂，以及其他培养条件，例如孵育期间的光强度、pH值和孵育温 度，可以根据特定的目标品种来优化。
在表达盒被稳定地掺入到转基因植物中并被确认是可操作的之后， 它可以通过有性杂交导入到相同其他植物或另 一种有性相容的物种中。
取决于要杂交的物种，可以使用许多标准育种技术的任一种。
种子、粗粉、油以及包含种子、粗粉和油的产品
本发明还提供了超过约1000、更优选的约20，000、再更优选的约 40,000个种子的容器，其中超过约10%、更优选的约25%、更优选的约 50%、再更优选的约75%，或更优选的约90%的种子是来自本发明的植 物的种子。
本发明还提供了超过约10kg、更优选的约25kg、再更优选的约50kg 种子的容器，其中超过约10%、更优选的约25%、更优选的约50%、再 更优选的约75%,或更优选的约90%的种子是来自本发明的植物的种子。
饲料、粗粉或油产品。为这个目的的特别优选的植物部分是收获的谷粒， 但可以收获其他植物部分并用于干草或青贮料。在一个实施方式中，所 述饲冲+、粗粉或油产品一皮配制用于反刍动物。在这种配方中，本发明所 允许的谷粒和粗粉中提高的油含量提供了 "旁路脂肪"，其为产犊后的奶 牛提供提高的热量摄入是特別有用的，具有降低的酸毒症风险。产生祠料、粗粉和油产品的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利
4,957，748; 5,100,679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005，076; 6,146,669;和 6,156,227。本发明的谷粒或粗4分可以与其他谷粒或粗4分混合。在一个实
构成了任何产品的粗粉成分按体积或按重量的大于约0.5%、约1%、约 5%、约10%、约25%、约50%、约75%或约90%。在另一个实施方式中， 所述粗粉产品可以被混合，并且可以构成混合物按体积的大于约10%、 约25%、约35%、约50%或约75%。
根据本发明产生的玉米油和/或玉米粉可以与各种其他成分组合。包 括在产品中的特定成分将根据产品的最终用途来确定。示范性的产品包 括动物飼料、化学^f务饰的原料、可生物降解的塑料、混合的食物产品、 食用油、烹调油、润滑剂、生物柴油、快餐食品、化妆品和发酵加工原 料。包括在此描述的粗粉的产品还包括完全或部分完全的猪、家禽和牛 飼料，宠物饲料和人类食物产品，例如挤压的快餐食品、面包、食物结 合试剂、水产业饲料、可发酵的混合物、食品添加剂、运动饮料、营养 食物条、多维生素体积仅为、膳食饮料和谷类食物。
所述玉米粉任选地经历分离淀粉和蛋白质成分的常规方法。这种方 法包括，例如，干磨、湿磨、高压泵、或低温过程。这些和其他适合的 步骤在Watson ( 1987)中公开，其公开内容通过引用合并在此。
本发明的其他单子叶植物谷粒，包括小麦、大麦、高粱和稻米可以 类似地加工或碾磨来产生本领域公知的饲料、粉、淀粉、粗粉、糖浆、 谷物产品和发酵饮料。
在以下实施例的上下文中进一步描述了本发明。这些实施例用来进 一步例示本发明，而不是意图限制本发明的范围。
实施例
本领域技术人员将理解本发明提供的方法和组合物的许多益处。以 下实施例被包括进来以说明本发明的实施方式。本领域的技术人员应当 理解，在根据本发明人公开的当前技术的实施例中所公开的技术在本发 明的实践中良好地运作。然而，本领域的技术人员根据当前公开的内容 应当理解，可以在公开的具体方案中进行许多变化，在不背离本发明的 精神和范围的情况下仍获得相似的或类似的结果。在此引证的所有参考文献通过引用合并在此，达到它们补充、解释、提供背景、或教导在此 采用的方法、技术或组合物的程度。
实施例1
丄a"oZ)"cz〃船<ie//>rewcA7'/亚种6w/gan'cws的和pyA:基因的克隆 ^acfo6acz7/ws t/e/6/-ewch/ swZ 乎6w/g"/7'cw《(ATCC菌林11842 )获自 ATCC ( Manassas, VA ),在ATCC 416肉汤中生长。丄.t/e/Z^ewch', w^/ . Zw/g"ncw5 /^基因从裂解的培养物等分量中PCRTM扩增为967 bp产物， 使用5'引物(〇ligo.#—17166) (SEQIDNO: 5 )来引入/#开放阅读框
(ORF)上游的AycI克隆位点,用3'引物(01igo. #_ 17167) (SEQIDNO: 6)来引入紧靠ORF下游的幼/I克隆位点。类似地，户:^:基因从裂解的培 养物等分量中PCRTM扩增为1777bp产物，使用5'引物(Ohgo.#—17168)
(SEQ ID NO: 7)来引入紧靠p， ORF上游的AcI克隆位点，用3'引物
(01igo.#—17169) (SEQIDNO: 8 )来引入ORF下游的幼/I克隆位点。 通过Topo TA克隆(Invitrogen, Carlsbad, CA )将/^和; j^ PCR产物各
自克隆到pCR2.l中。使用早先描述的寡聚物通过PCRTM根据适合的插 入物筛选克隆。对于/#或/^:基因为PCR阳性的克隆通过限制性分析才全 查来确认通过PCRTM导入的侧翼克隆位点的存在，然后测序。附图l显示 了分离自丄a"o6ac/〃船fife/^ewch'z亚种Zw/g(3r/cw《ATCC菌4朱11842的/ # 基因的编码序列(SEQIDNO: 1)与公开的/^基因序列(EMBL登记号 #— X71403 )的比对。在以上获得的序列和7>开的序列之间存在一个差 异；公开的序列在编码残基261处具有A,而如上所述分离的基因在该位 置是G。预测的PFK蛋白序列(例如，SEQIDNO: 2)的比对揭示了它 力']是沖目同的。还获4寻了Z""o6"c/〃w5 t/e/Z^ewc/h '亚种6w/g"〃cz^ / >^基因
(SEQIDNO: 3)的DNA序列，与公开的序列(EMBL登记号l X71403 ) 是相同的。因而预测的蛋白序列(SEQ ID NO: 4)与爿^开的预测PYK 蛋白序列是相同的。 表l
Oligo. # 17166 5' AGGCGCGCCACCATGAAACGGATTGGT 3'(SEQ ID NO:5) Oligo # 17167 5' CGCCTGCAGGCTATCTTGATAAATCTG 3'(SEQ ID NO:6) Oligo. # 17168 5' AGGCGCGCCACCATGAAAAAAACAAAG 3'(SEQ ID NO:7) Oligo. # 17169 5' CGCCTGCAGGTTACAGGTTTGAAAC 3，(SEQ ID NO:8)实施例2 胚-靶向的转化载体的构建
pMON72008
将实施例1中描述的967 bp AcI/幼/1 基因克隆到E co/zA4grc 6<3"erziW2 /^me/"c/ews 二元#争载体pMON71055中6々玉米L3 oleosm启动子(P-Zm丄3)和稻米肌动蛋白内含子(I-Os.Act)序列的 v^cl/5^83871位点下游，来形成pMON72004。类似地，将实施例l中描 述的1777 bp/7#基因克隆到￡. co"". aw7e/ac,era二元转化载体 pMON71055中的P-Zm丄3和I-Os.Act序列的AvcI/5^8387I位点下游，来 形成pMON72005 。通过从含有盒的pMON72004分离7165 bp 尸mel/ZMI片段，使用Pfu聚合酶平端化该片段，然后克隆该平端化的片 段到pMON72005的位点中，来制备双基因构建体 (pMON72008)。最终的构建体pMON72008 (附图2)通过限制性分析 和DNA测序来确认。
pMON79823
来自pMON72004的3616 bp尸md/A7)al被用于替换来自胚芽表达载 体pMON71273的2145 bp尸weIAYS"I片段，来产生pMON79823 (附图
3) ,含有由具有I-Os.Act的P-Zm丄3驱动的/^基因。
pMON79824
来自pMON72005的4426 bp尸mel/X^I被用于替换来自胚芽表达载 体pMON71274的2145 bp尸wel/X^I片段，来产生pMON79824 (附图
4) ,含有由具有I-Os.Act的P-Zm丄4驱动的/7)^基因。
pMON79827
来自pMON79824的6809尸附d/KspI片段蜂皮用于替换来自 pMON79823的2358 bp Smal/Kspl片段，来产生pMON79827 (附图5 ), 含有/tA和/ ;^基因，各自由具有I-Os.Act的P-Zm丄3驱动。
实施例3胚乳耙向载体的构建
pMON72028
将以上实施例1中描述的967 bp AcI/幼/1 /7#基因克隆到 pMON68203中的Zea wa， Z27启动子(P-Zm.Z27 )和Z wa，Hsp70内含 子(I-Zm.DnaK)序列的^^1/&683871位点下游，来产生pMON72012。 类似地，将以上实施例1中描述的1777 bp A^cI/幼/1 ; ;^基因克隆到 pMON68203中的P-Zm.Z27和I-Zm.DnaK序列的^^1/&683871位点下游， 来产生pMON72013。通过从pMON72012分离含有/ ,表达盒的3256 bp PweL^coRI片段、用Pfu聚合酶平端化该片段、并将它克隆到pMON72013 的尸wel位点中(附图5)来得到pMON72015,制备用于/#和/ #基因的 共表达的载体。为了改善j.化we/"c,era转化期间/ ,々 3^载体的稳定性， 通过用pMON72021的5496 bp尸wd/五coRI载体主干片段替换
量，产生最终的双基因转化载体pMON72028 (附图6) 。 ^ ' ^
pMON79832:
将以上实施例l中描述的973 bp A^I/&e8387I /#基因克隆到 pMON71274中的P-Zm.Z27和I-Zm.DnaK序列的^^1201/&6 83871位点下 游，来产生pMON79832 (附图7),含有由具有I-Zm.DnaK的P-Zm.Z27
驱动的/#基因。
pMON81470:
将以上实施例1中描述的1783 bp M^I/&e8387I ; )^基因克隆到 pMON71274中P-Zm.Z27和I-Zm.DnaK序列下游的7VortZ&e8387I位点中。 产生的载体的/ >^基因盒然后使用Ad/^yi剪切，并连接到以上描述的 pMON79832的M/wI/Sr/I位点中来产生pMON81470 (附图8)，含有/ #和 ;^A基因，各自由具有I-Zm.DnaK的P-Zm.Z27驱动。
pMON72029
^1夺含有与来自pMON72006的/7A基因融合的A^coOtma to6"cwm小 亚基chor叩last转运肽(SSU-CTP )的]199 bp JwI/&e8387I DNA片段 克隆到pMON68203的A cI/&e8387I位点中来形成pMON72017。类似地，将含有与来自pMON72007的p，基因融合的M tak^'ww SSU-CTP 的2041 bp」^I/&、e8387I片段克隆到pMON68203的』^I/&e8387I位点 来形成pMON72019。通过从pMON72017分离含有/#表达盒的3204 bp 尸wd/EcoRIDNA片段、用Pfu聚合酶平端化该DNA片段、并将它克隆 到pMON72019的位点中来得到pMON72020,制备用于p#和户3;^ 基因的共表达的载体。为了改善JgraZ ac&nww w附e/a"e朋4争1匕期间这 种双基因载体的稳定性，通过用pMON72021的5496bp 尸附d/五coRI载体主干片段替换pMON72020的7135 bp尸weIAEcoRI载体 主干片段，来降低重复元件的数量，产生最终的双基因转化载体 pMON72029 (附图9 )。
pMO簡715
含有融合到/ #基因的jVzco"""" 小亚基choroplast專争运肽
(SSU-CTP )的来自pMON72017的1.2 kb A^I/&e8387I DNA片段被克隆 到草甘膦选捧质粒pMON93102的AAort/&e8387I位点中ZM Z27启动 子(P-Zm.Z27)和Z w""Hsp70内含子(I-Zm.DnaK)的下游，来产生 pMON83715 (附图IO)。
实施例4 玉米的转化
Elite玉米系(Com States Hybrid Serv., LLC, Des Momes, IA ) #皮用于 与本发明相关的转化。这些包括LH59 (用pMON72008、 pMON72028、 pMON72029转化的)、LH172 (用pMON72008、 pMON72028 )转化的， 和LH244 (用pMON79823、 pMON79824、 pMON79827、 pMON79832、 pMON81470转化的)。除了pMON72029之外对于所有的构建体通过 Jgro/)ac/en.i做 fwwe/n似介导的'化来获《寻净争"f匕的夕卜才直体, pMON72029通过微粒轰击获得。从转化的组织再生植物。然后对温室生 长的植物分析目标基因表达水平以及油和蛋白质水平。
实施例5
胚乳表达的胞质液耙向PFK和PK构建体的分析
pMON72028设计构建体pMON72028来产生在胚乳中胞质液輩巴向的; A和/7，基 因表达。来自第一代的成熟籽粒通过PCRTM分析/ ,和/^A转基因。通过 单籽粒NMR和PCRtm分析了 67个事件。64个事件对于/ #转基因是PCR 阳性的，这些中的7个对于/ ^转基因也是阳性的。含有这两个基因的两 个事件展现了 PCR阳性的籽粒，与PCR阴性籽粒相比在整体籽粒油水平 上其是统计学上更高的(0.73%的最大提高，P=0.05)。
对于两个转基因都是阳性的7个事件被种植在田地中。NIT (近红外 透光率)油分析揭示了，对于3个事件，对于来自分离的卡那霉素阳性 和阴性抽穗的集中籽粒来说，在平均总体籽粒油％上存在显著差异。这 些事件，62221、 71907和73131，在阳性抽穗中在油水平上分别具有统 计学上显著的提高(1.2%、 0.8%、 0.5%， P-0.05)。在已知含有两个转 基因的其余4个事件中油水平提高，但是在P-0.05处提高不是显著的。
含有/ ，和/ )^转基因的构建体pMON72028的五个事件和它们的阴 性分离种被杂交成两种不同的测试物。第 一测试物是常规的硬杆自交， 第二种是具有更高油表型的硬杆测试物(7.5%的本身油)。Fl杂交种子 在设计中种植在6个位置，所述设计通过一 系列的雄性不育杂交产生了 带有转基因的系与无转基因系的分离。在每个位置，项目被不同地随机 化。手工从每个地块的中性收集六个抽穗，脱壳，通过近红外透光率 (NIT)分析籽粒的油、蛋白质和淀粉。在两个测试这中，在所有5个事 件中油百分比从+0.5%提高到+ 1.1% (p<0.005 )。
pMON79832, Fl
对来自LH244中的26个pMON79832事件的Fl籽粒的NMR油分析揭 示了 ，来自所测试的26个事件中的9个p, PCR阳性籽粒在总体籽粒油o/0 上显著更高(PK).05),最大提高为0.95%。 一同考虑所有的事件，students t-测验揭示了PCR阳性籽粒的平均籽粒油。/。 (3.85%)显著高于(0.19%) (PO.0001 ) PCR阴性籽粒的平均值(3.66%)。对解剖的胚乳组织的分 析揭示了，来自8个事件的PCR阳性籽粒比阴性籽粒具有显著(P=0.05) 更高的胚乳油％ (最大提高为0.48%) , 7个事件在mg/籽粒基础上具有 显著(P=0.05)更高的总胚乳油(最大提高为0.48mg/籽粒)，尽管总胚 乳干重显著地(P=0.05)降低(平均降低8mg/籽粒，最大降低41mg/籽 粒)。pMO應470,Fl
对来自LH244中的20个pMON79832事件的Fl籽粒的NMR油分析揭 示了 ，来自所测试的20个事件中的9个/# PCR阳性籽粒在总体籽粒油0/。 上显著更高(P-0.05)，最大提高为1.1%。 一同考虑所有的事件，students t-测验揭示了PCR阳性籽粒的平均籽粒油。/。 (4.47%)显著高于(0.4%, PO.0001 ) PCR阴性籽粒的平均值(4.07%)。对解剖的胚乳组织的分析 揭示了，来自9个事件的PCR阳性籽粒比阴性籽粒具有显著(P=0.05)更 高的胚乳油％ (平均提高0.3%,最大提高为0.62%) ， 6个事件在mg/籽 粒基础上具有显著更高的总胚乳油(平均提高，0.28mg/籽粒；最大提高， 0.48mg/籽粒)(P=0.05 )，尽管总胚乳干重显著地降低(平均降低30 mg/ 籽粒)(P-0.05)。比较这些数据和来自; #单独构建体(pMON79832 ) 的数据，看起来双基因构建体pMON81470的油差异的量更大，存在着高 频率的事件具有油水平的提高。
实施例6
胚乳表达的质体靶向构建体的分析
设计构建体pMON72029来产生在玉米胚乳中质体靶向的/ #和/ >^ 基因表达。在含有pMON72029的转基因植物和非转基因LH59之间进行 正反杂交，从62个独立的事件中收获成熟籽粒。
单独的籽粒分析揭示了 ，在通过PCR发现含有两个转基因的13个事 件中的9个中，平均胚乳油浓度显著提高(平均提高为0.94%，最大提高 为1.7%, P-0.05)。仅含有/^A基因的3个事件都没有提高的胚乳油。/。。 就整体籽粒油％而言，含有两个转基因的13个事件中的IO个具有显著 (P=0.05)提高的整体籽粒油％ (平均提高1.75。/。，最大提高2.9%)。就 油/籽粒的绝对数量而言，具有两个转基因的13个事件中的4个具有显著 提高的油/籽粒毫克数(平均提高为1.5mg/籽粒，最大提高为2.5mg/籽粒)。
实施例7
胚芽表达的力包质液靶向PFK和PK构建体的分析 pMON79823,Fl
在来自pMON79823的20个事件的解剖的/ #基因PCR阳性和负电F1籽粒中油水平的NMR分析揭示了 ，所分析的20个事件的7个具有阳性籽 粒中显著(P-0.05)更高的胚芽油(germ oil)% (平均才是高为1.7%,最大 提高为5.8%)。并且，在阳性籽粒中7个事件具有显著(P-0.05)更高 的胚乳油％ (平均提高为0.14%,最大提高为0.34%),其中4个是具有 胚芽油％提高的相同事件。
pMON79824, Fl
来自pMON79824的24个事件的pj^基因PCR阳性和阴性F1籽粒的 NMR油分析揭示了，在除了l个事件的所有事件中胚芽油％是不变的， 类似地，在除了1个事件的所有事件中整体籽粒油％是不变的。具有改变 的油水平的事件的l/24的频率没有超过随机变化所预期的。因而，看起 来在这些条件下单独的pyA转基因不影响油水平。
pMON79827, Fl
首先根据/#转基因筛选/ A/; j^事件。在来自pMON79827的24个事 件的/#基因PCR阳性和阴性F1籽粒的NMR油分析揭示了 ， 20个事件中的 IO个具有显著(PK).05)提高的胚芽油％ (平均提高为2.23%,最大提高 为5.39%)。并且，尽管启动子是胚芽-增强的，在20个事件中的5个中 胚乳油％提高了。
pMON72008
在良种变体LH172中转化构建体pMON72008。通过来自32个事件的 解剖成熟胚芽组织的NMR分析所测定的平均胚芽油％的students t-测验 比较揭示了 ，在所有事件中所有的/^A基因PCR阳性籽粒的平均值高于阴 性籽粒的平均值达2.59 %的绝对值，这种差异是统计学上显著的 (p-0.05)。所见的最大提高是3.5%。在所有事件中/^基因PCR阳性籽 粒的总籽粒油%的平均值(2.89% )稍微低于阴性籽粒的平均值(3.01 % ), 而这种差异在P-0.05处不是显著的。
虽然转基因的表达通过在胚芽组织中优先地表达的L3 oleosm启动 子指导，在所有的事件中与阴性籽粒比较，对于/7,基因PCR阳性籽粒存 在着小的但是统计学上显著的平均胚乳油％提高(平均提高0.07%,最 大提高0.24%)。通过Western印迹分析测试蛋白质表达以及通过酶分析，进行了来自 pMON72008事件的发育籽粒中;^和p，基因的转基因表达分析。Western 印迹分析揭示了，所有30个/^基因PCR阳性事件被发现表达PK蛋白，而 30个中的29个被发现表达PFK蛋白。与PFK蛋白相比，PK蛋白总是以更 高的水平表达。酶活性结果与Western印迹蛋白表达结果很好地相符。 PK活性的提高大于PFK活性的提高，与蛋白表达结果相符。
实施例8
表达尸ro/ /o"^)(3c/^riw/ 2 ^^W(ie"rCc/z〃石岸卧臾果4唐;敫酵^;
转化载体的构建
他种^特异性构建体。对于胚乳细胞胞浆表达，扩增了尸./rez^e;ezcln》; 基因(Genbank登记号存—M67447) ( SEQ ID NO: 11)，并在设计用于玉 米转化的载体中克隆到玉米玉米蛋白Z27启动子的下游，任选地跟随玉米 DnaK内含子作为增强子。对于胚乳plastidial表达，扩增了尸./rewfifew^c/n7 p,基因(SEQIDNO: 11),并在设计用于玉米转化的载体中克隆到玉米 玉米蛋白Z27启动子的下游，随后是与/^基因融合的M taMcwwSSUCTP。 对于胚芽细胞胞浆表达，扩增了尸./rew^ewezc/z";#基因(SEQ ID NO: 11 )， 并在设计用于玉米转化的载体中克隆到大麦PER1启动子的下游，任选地跟 随玉米DnaK内含子作为增强子。对于所有的构建体，通过转化获得转化的 外植体。从转化的组织再生植物。然后对温室生长的植物分析目标基因表 达水平以及油和蛋白质水平。
氺 承 承
在此7〉开和在此要求权利的所有组合物和方法可以才艮据当前的公 开来制造和#丸行而不需过度的实验。虽然已经就上述说明性实施方式而 言描述了本发明的组合物和方法，对于本领域技术人员显而易见的是，
变体、变化、 <务饰和改变可以:故应用于在此描述的组合物、方法，和方 法的步骤和步骤的顺序中，而不背离本发明的真实概念、精神和范围。 更具体地，显而易见的是，可以用化学上和生理学上都相关的某些试剂 替换在此描述的试剂，而达到相同的或相似的结果。对于本领域的技术 人员显而易见的是所有这种相似的替换和修改都认为处在由附随的权 利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。参考文献
以下参考文件通过引用特别地合并在此，达到提供示范性程序或对 在此阐述的那些补充的其他细节的程度。
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权利要求
1. 一种产生在其种子中具有提高的油的单子叶植物的方法，包括向所述植物中导入编码磷酸果糖激酶的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到种子-增强启动子，从而与缺乏所述核酸序列的同基因植物的种子相比，所述种子的油含量被提高。
2. 权利要求1的方法，其中所述编码磷酸果糖激酶的多核苷酸包含 不同于SEQIDNO: 9或SEQ ID NO: 13的序列。
3. 权利要求l的方法，其中除非所述种子-增强启动子是胚-增强启 动子时，所述编码磷酸果糖激酶的多核苷酸可操作地连接到编码质体转 运肽的多核苷酸。
4. 权利要求l的方法，其中所述多核苷酸包含选自以下构成的组的 核酸序列(a)SEQIDNO: 1或SEQ ID NO: ll的核酸序列，和(b )编码SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 12的多肽序列的核酸序列。
5. ;f又利要求4的方法，其中所述多核苷酸包含在约0.2xSSC和65°C 的高度严格条件下与(a)或(b)的序列或其互补物杂交的核酸序列。
6. 权利要求4的方法，其中所述植物进一步包含与种子-增强启动子 可操作连接的、编码丙酮酸激酶的多核苷酸。
7. 权利要求6的方法，其中所述编码丙酮酸激酶的多核苷酸包含选 自以下构成的组的核酸序列(a)包含SEQIDNO: 3的序列的核酸序列；和 (b )编码SEQ ID NO: 4的多肽序列的核酸序列。
8. 权利要求7的方法，其中所述多核苷酸包含在约0.2xSSC和65。C 的高度严格条件下与(a)或(b)的序列或其互补物杂交的核酸序列。
9. 权利要求l的方法，其中所述植物是选自由玉米(Zeam"，)、 稻米 (CV_yz<3 sWv(2 )、 大麦 (//oniewm vw/gare )、 粟 (Pamcwm wz/^3C'ew附)、，繁麦(iSecfl/e cerea/e ) 、 d、麦(7V"zcwm aesfzvww )禾口高 粱(Sorg/zww 6,co/or )构成的纟且的单子叶才直物。
10. 权利要求l的方法，其中所述启动子选自由胚-增强启动子、胚 乳-增强启动子以及胚-和胚乳-增强启动子构成的组。
11. 一种单子叶植物，包含与种子-增强启动子可操作连接的编码磷酸果糖激酶的多核苷酸。
12. 权利要求11的植物，其中所述编码磷酸果糖激酶的多核苦酸包含不同于SEQIDNO: 9或SEQIDNO: 13的序列。
13. 权利要求ll的植物，其中除非所述种子-增强启动子是胚-增强 启动子时，所述编码磷酸果糖激酶的多核苷酸连接到编码质体转运肽的 多核苷酸。
14. 一种单子叶植物细胞，包含与种子-增强启动子可操作连接的编 码磷酸果糖激酶的多核苦酸。
15. 从权利要求ll的植物产生的种子，包含根据权利要求7的编码磷 酸果糖激酶的多核苷酸。
16. 从权利要求15的种子产生的粗粉，包含根据权利要求ll的编码 磷酸果糖激酶的多核苷酸。
17. 从权利要求15的种子产生的动物饲料组合物，包含根据权利要 求11的编码磷酸果糖激酶的多核苷酸。
18. 从权利要求15的种子产生的人类食物组合物，包含根据权利要 求11的编码磷酸果糖激酶的多核苷酸。
19. 一种动物饲料组合物，包含权利要求16的粗粉，所述粗粉包含 根据权利要求ll的编码磷酸果糖激酶的多核苷酸。
20. —种生产单子叶植物油的方法，包括步骤a) 种植转化的单子叶植物来产生种子，所述单子叶植物包含与种 子-增强启动子可操作连接的编码磷酸果糖激酶的多核苷酸；和b) 加工所述种子来获得所述油。
21. 权利要求20的方法，其中所述编码磷酸果糖激酶的多核苷酸包 含不同与SEQIDNO: 9或SEQIDNO: 13的序列。
22. 权利要求20的方法，其中除非所述种子-增强启动子是胚-增强 启动子时，所述编码磷酸果糖激酶的多核苷酸连接到编码质体转运肽的 多核苷酸。
全文摘要
提供了通过过量表达编码磷酸果糖激酶的核酸提高糖酵解流来产生在它们的种子中具有更高油水平的作物植物的方法。本发明可以进一步包括过量表达编码丙酮酸激酶的核酸，来改变用磷酸果糖激酶，或磷酸果糖激酶以及丙酮酸激酶转基因转化的植物种子、单子叶植物细胞和植物中的油含量。
文档编号C12N15/54GK101442903SQ200680027543
公开日2009年5月27日 申请日期2006年5月25日 优先权日2005年5月26日
发明者D·克, D·瓦尔 申请人:孟山都技术有限公司