杂交检测方法

专利名称：杂交检测方法
技术领域：
本发明属于才全测杂交的技术领域。更详细地说，涉及在使 探针核酸链与靶核酸链之间进行杂交之后，对反应场的温度条件等进行操作，从而提高杂交检测时的S/N比的杂交检测方法等。
背景技术：
近年来，'以DNA芯片或DNA孩i列阵(下面，在本申请中称 为"DNA芯片")为首的杂交检测技术的实用化正不断推进。 DNA芯片是将多种类、多数量的DNA探针集成并固定在底板表 面形成的。通过^f吏用DNA芯片，检测DNA芯片底板表面的探针 核酸链与从组织/细胞等提取的靶核酸链的杂交，可以彻底地解 析细胞/组织等中的基因表达等。通常，使用DNA芯片的杂交检测按照如下的步骤进行。首 先，将试样核酸供给到例如固定有探针核酸链的反应场中。然 后，使固定在反应场中的探针核酸链与试样核酸中的耙核酸链 进行杂交。接着，将嵌入剂等供给到反应场中，通过萸光强度 等检测杂交。另夕卜，作为现有文献，例如日本特开2003 - 300号公报中， 记载了如下的石威基序列测定或核酸定量方法，其将DNA芯片的 相同序列的方向以垂直方向固定，并在垂直方向设有温度梯度； 日本特开2001 - 255328号公净艮中记载了 一种杂交反应检测方 法，其包含升高生物芯片的温度的同时检测每个点的杂交反应 的步骤。探针核酸链不仅与具有与该探针核酸链正常互补链的耙核酸链进行杂交，还同与探针核酸链的部分碱基序列具有同源性的核酸进行杂交(错误杂交，mis-hybridization),并能在反 应场中生成错配双链核酸。来自该错配双链核酸的检测信号(例 如，荧光)成为噪音(背景噪音)。因此，在例如定量检测靶核 酸链时，存在着杂交的检测精度未必充分的技术问题。另外，使用与双链核酸特异性结合的嵌入剂检测杂交时， 其结合在反应场内存在的单链核酸的一部分中形成的自身环化 结构上，或者非特异性地吸附在单链核酸上，因此，在杂交检 测时存在着产生噪音荧光(背景噪音荧光)的技术问题。因此，本发明的主要目的在于提高杂交检测时的S/N比， 提高杂交检测精度。发明内容本发明人为了实现提高杂交检测时的S/N比，即提高对检 测有用的正常检测信号(S)与对检测没有用的噪音信号(背 景噪音信号，N)的比，进行了深入研究，新发现在进行杂交 后，通过采用适当地进行反应场的温度操作的工序等，可以有 效地提高前述S/N比，从而完成了以下发明。首先，本发明提供一种杂交检测方法，其在使探针核酸链 与靼核酸链之间进行杂交之后，进行升温处理工序，该工序中 使进行该杂交的反应场的温度高于规定温度，由此提高杂交检 测时的S/N比。另夕卜，"升温处理，，是指将现有的温度条件变为更 高的温度条件。前述升温处理工序的方法和手H并不进行狭义的限制，例 如，通过对前述核酸链所在的反应场进行加热或进行高温溶液 置换(将反应场的溶液置换为更高温度的溶液)来进行。另外， 在该升温处理工序中，进行杂交后，将前述反应场的温度设定为高于错误杂交结果所得到的错配双链核酸的解链温度(T m )并且低于完全匹配双链核酸的Tm的温度，由此<吏该错配双链核 酸选择性地解离。本发明中，在前述反应场的每个点(用于滴加样品溶液等 的地方)固定有不同序列的前述探针核酸链的情况下，前述升 温处理工序可以基于前述探针核酸链与前述乾核酸链的T m,在 前述每个点独立i也进4亍。或者，在前述升温处理中，可以通过加大前述杂交的反应 平衡常数与前述错误杂交的反应平衡常数之差，使前述杂交的 结果所得到的错配双链核酸更加选择性地解离。另外，在前述 升温处理中，使前述反应场的温度瞬间上升到前述规定温度也 是有用的手段。这是因为，通过瞬间的温度上升，可以使错配 双链核酸相对于完全匹配双链核酸更加选^奪性地解离。接着，在本发明的杂交检测方法中，并不狭义地限定其检 测方法，例如，可以采用使预先标记有荧光染料的靶核酸链与 探针核酸链杂交，从而检测来自前述荧光染料的荧光的第一检 测方法，此外，更加适宜的是使用吸附或结合在双链核酸上的 嵌入剂来检测杂交的第二检测方法。第一检测方法中，通过适当地进行上述升温处理，使错配 双链核酸选择性地解离后，通过从反应场洗涤除去不需要的輩巴 核酸，可以减少噪音荧光。使用嵌入剂的第二检测方法中，通 过适当地进行上述升温处理，使反应场中存在的错配双链核酸 选择性地解离，由此可以减少由吸附或结合在该错配双链核酸 上的嵌入剂所发出的噪音荧光。另外，特别是在使用嵌入剂的第二检测方法中，期望至少 进行如下工序核酸供给工序，其向保持或固定有探针核酸链 的反应场供给耙核酸链；第一升溫处理，其将前述反应场的温度升高；嵌入剂供给工序，其向前述反应场供给嵌入剂；第二 升温处理，其将前述反应场的温度再次升高；杂交检测工序， 其通过前述嵌入剂^r测杂交。特别是在前述第二升温处理工序中，进行以下(1)、 (2) 任意一种或两种(1 )将吸附到存在于反应场中的单链核酸上 的嵌入剂，从该单链解离；(2)将存在于反应场中的单链核酸 所形成的自身环化结构解开。接着，在本发明中，通过在适当的阶段实施对成为杂交场 的反应场施加电场的工序，可以得到有助于提高S /N比的理想 的结果。例如，在进4于杂交的阶段，对前述反应场施加电场。通过 由该电场施加所获得的电动力学作用(例如介电泳、电泳)，可 以使靶核酸链移动到探针核酸链的附近，因此可以促进杂交。电场施加也可用于促进错配双链核酸链的解离。例如，在 进行上述升温处理的工序中或在其前后的工序中，通过对前述 反应场施加适当的电场，使该反应场中存在的错配双链核酸选 择性地解离，其结果，在该反应场中可以选择性地维持完全匹 配双链核酸(由正常杂交得到的无错配部位的正常双链核酸) 的双链状态。另外，通过电场施加，可以4吏存在于反应场中的#:针核酸 链附近的核酸链浓度更高，因此通过升温处理工序使不需要的 错配双链核酸选一奪性地解离时，通过由电场施加^^强化的浓度 梯度，解离的单《连核酸易于从溶液中探针核酸链附近向更远的 区域扩散，其结果，还可期待难以再形成错配双链核酸的效果。另外，本发明中，杂交检测中使用的探针核酸链被固定在 前述反应场中的情况下，在上述升温处理后，可以基于通过与 该探针核酸链杂交所得到的完全匹配双条件设定，溶液洗涤该反应场。该溶液洗涤是对于将通过升温处理和电场施加等而由错 配双链核酸解离(是产生噪音的原因)产生的单链核酸在检测 阶段前从反应场预先除去有用的工序。进而，该溶液洗涤工序可以在对升温处理后的反应场进行 电场施加之后进^亍，并且，可以反复进行多次该电场施加工序 和溶液洗涤工序。通过电场施加，可在存在于反应场中的完全 匹配双链核酸与错配双链核酸中仅将后者错配双链核酸选择'性 地解离，并通过溶液洗涤将由错配双链核酸解离产生的单链核 酸从反应场中除去。反复进行数次该工序的话，可以进一步进 行错配双链核酸的解离。其结果，在反应场中，留下完全匹配 双链核酸和探针核酸链，该探针核酸链是曾形成错配双链核酸 的单方的互补链(被固定的)。下面，对本发明涉及的技术用语进行说明。"反应场"包含全部可以成为杂交反应的场的区域和空间。 "探针核酸链"是指存在于前述反应场中、并起到用于检测 与该核酸链杂交的目标核酸的探针(传感器)的作用的核酸链， 其以游离状态存在于反应场中，或者其一端被固定于底板、珠子、纤维体等的表面而存在。代表性的核酸探针有例如DNA探 针等寡聚核苷酸或多聚核苷酸。"靶核酸链"是具有如下序列的核酸其序列与探针核酸链 的碱基序列具有完全互补性；检测杂交时，被滴加或供给到反 应场中。另外，"试样核酸"是在检测杂交时被滴加或供给到反 应场中的核酸，包括含有靶核酸链和不含耙核酸链两种情况。"核酸链"是指。票呤或嘧啶碱基与糖进行糖苷键合后的核 苷的磷酸酯的聚合物(核苷酸链)；广泛包括含有探针DNA的 寡聚核苷酸、多聚核苷酸、噤呤核苷酸与嘧啶核苷酸聚合形成的DNA (全长或其片段)、通过逆转录获得的cDNA ( cDNA揮: 针)、RNA等。"杂交"是核酸(核苷酸链)间形成互补结合的反应，广泛 包括DNA-DNA、 DNA-RNA、 RNA - RNA间的互补结合等。"错误杂交"是指在具有错配的碱基间(不适当的碱基间)互补 结合的部位的状态下形成双链的反应。"完全匹配双《连核酸"是通过(正常)杂交形成的双链核酸， "错配双链核酸"是通过错误杂交形成的具有错配部位的双链核酸。"解链温度(Tm)"是melting temperature,是核酸间的互 补结合(杂交)解离的温度。"自身环化结构"是构成单链或双链的部分核酸链中，形 成环状而突出的结构部分，其包括含有互补石威基对部分和没有 互补碱基对部分两者。"S/N比，，是指对检测有用的正常检测信号(S)与对检测没 有用的噪音信号(背景噪音信号，N)的比，该比值越大，检 测精度越高。"噪音"是指在杂交检测中，成为背景噪音的检测信号(例 如，荧光强度)。另外，在本发明中，例如相对于特异性地结合 在杂交结果所得到的互补链部分的嵌入剂所产生的正常荧光， 将非特异性地结合在前述互补链部分以外的核酸部位的嵌入剂所产生的荧光称为噪音荧光。"嵌入剂，，是具有特异性地结合或吸附在双链核酸的互补 结合部位而产生荧光的性质的物质，是用于检测杂交的物质。 可以列举出例如POPO- 1、 TOTO- 3、 SYBR(注册商标)Greenl 等。另外，这些嵌入剂除了结合或吸附在正常的(完全匹配) 的互补链部分以外，根据情况，有时也非特异性地结合或吸附在错配双链核酸的互补链部位、自身环化结构部位、游离状态 或固定化状态的单链核酸、双链核酸的剩余的单链部位等，并 产生噪音荧光。根据本发明，可以提高杂交检测时的S/N比，提高杂交的 检测精度。


图l是示意地示出本发明的杂交检测方法中的荧光检测的 基本原理的一个例子的图。图2是示意地示出本发明的杂交检测方法的基本原理的其 他例子的图。图3是本发明的杂交检测方法的第1方法例子的工序流程图。图4是本发明的杂交检测方法的第2方法例子的工序流程图。图5是在杂交工序中可以利用的附加工序的示意图。图6是对本发明的杂交检测方法的例子进行示意的工序图。图7是示出对完全匹配核酸与错配核酸分別进行升温处理时的荧光强度的图。图8是示出对完全匹配核酸与错配核酸分别进行升温处理时的荧光强度的图。图9是示出荧光强度的温度特性的图。图IO是示出基于图9的值而获得的荧光强度的S/N比的图。 图1 l是示出模拟模型的示意图。图12是使完全匹配核酸或错配核酸在65 °C下杂交后，升温 到8(TC时的模拟结果。图13是示出在完全匹配时或错配时，温度变化与杂交量的关系、以及此时扩散层的杂交浓度的变化的模拟结果。图14是示意地示出通过模拟所得到的杂交反应的行为的图。图15是示出实施例5的实验结果的图(图面代用图表)。 图16是示意地示出应用于电场施加实验的底板结构的图。 图17是示出实施例6的实验结果的图(图面代用图表)。 图18是示出实施例7的实验结果的图(图面代用图表)。
具体实施方式
下面，参考附图，对本发明的杂交检测方法的实施方式的 例子进行说明。首先，图l是示意地示出本发明的杂交检测方法中荧光检 测的基本原理的一个例子的图。在该图l中示出如下的状态其一个末端被固定在符号S所 表示的表面(例如底板、珠子、纤维状物等)的状态的探针核 酸链la与被导入到该纟笨针核酸链la所存在的反应场R的靶核酸 链lb之间进行杂交形成互补链(双链核酸)。另外，本发明中，用于固定探针核酸链la的末端可以为3' 末端、5'末端任意一个(未特别地图示)。另外，该探针核酸链 1 a在不进行例如后面叙述的溶液洗涤工序等的情况下，不限定 为以被固定的状态使用的形态，可以以使纟笨4十核酸链la在反应 场R内游离的状态而^吏用。下面，图l中的符号I表示特异性地结合在由杂交获得的前 述互补链部分而产生焚光的性质的嵌入剂。在该荧光检测的例 子中，由未图示的外部光源(例如，规定波长的激光光源)向 反应场R内聚焦照射菱光激发光Q，用公知的光电检测器等光检 测装置D测定嵌入剂I所产生的激发荧光F的强度(荧光量)，由此可以检测杂交。在此，该嵌入剂I由于还与反应场R中游离的单链核酸、形 成互补链的一侧的核酸(例如，比探针核酸链la更长的靶核酸 链lb)的剩余单lt部分、形成自身环化结构的核酸链部分等非 特异性地结合而产生荧光(即，噪音荧光)。本发明的主要目的 在于减少这样的噪音荧光。下面，图2是示意地示出本发明的杂交检测方法的基本原 理的其他例子的图。该图2示出如下的状态其一个末端被固定在符号S所表示 的表面(例如底板、珠子、纤维状物等)的状态的探针核酸链 1 a与被导入到该#罙针核酸链1 a所存在的反应场R的靶核酸链1 c 之间进行杂交，形成互补链(双链核酸)。该耙核酸链lc预先标记(标签)有规定的荧光染料X，由 未图示的外部光源(例如，规定波长的激光光源)向反应场R 内聚焦照射萸光激发光Q,用公知的光电检测器等光检测装置D 测定前述荧光染料X所产生的激发荧光F的强度(荧光量)，由 此可以4全测杂交。下面，参考图3 图7，对本发明的杂交检测方法相关的工 序的多个适宜的例子进行说明。另外，以下的工序例子中，示 出使用了嵌入剂的杂交检测作为代表例子。首先，图3所示的第1方法例子的工序大致分类的话依次包 括杂交、错配双链核酸(略称为错配链)的选择性解离、解离 单链的洗涤除去、供给嵌入剂、荧光检测(杂交检测)。以下， 按工序依次说明。(杂交工序)设想在供给到反应场R中的试样核酸中含有具有与探针核 酸链的碱基序列完全互补的碱基序列部分的靶核酸链、和具有与探针核酸链的碱基序列部分不互补的碱基序列部分的核酸链 的情况，则通过正常的杂交形成完全匹配双链核酸l,并且形成具有错配部位M的错配双链核酸2 (参考图3 )。另外，可以根据目的自由地设计杂交的各种条件。 (错配链的选择性解离工序)前述杂交之后，接着进行错配双链核酸2的选择性解离。即， 不使完全匹配双链核酸l解离，仅使错配双链核酸2解离。该工序是通过例如加热反应场R或用更高温度的緩沖溶液 置换反应场R的溶液而对反应场R的溶液温度环境进行升温处 理。更详细地说，设定为错配双链核酸2的Tm以上且低于完全 匹配双链核酸l的Tm的温度条件。在实施了这样的升温处理的反应场R中，进行错配双链核 酸2的选择性解离，完全匹配双链核酸l则维持其双链状态。在 图3中，符号2a表示形成了错配双链核酸2的探针核酸链(单链)， 符号2b表示从该探针核酸链2a解离的单链核酸(以下称为解离 单链)。另外，前述反应场R的每个点固定有不同序列的前述探针 核酸链的情况下，可以基于前述探针核酸链与前述粑核酸链的 Tm，在前述每个点独立地进行前述升温处理。通过在每个点进 行独立的最佳温度控制，可以抑制每个点的杂交反应量的不均。 作为每个点的局部加热手^:,可以釆用例如帕尔贴(Peltier )、 Pt、 IR激光、感应加热(DC、 AC)、发热电阻器(TFT等)等。在前述升温处理工序中，也可以通过加大杂交反应的平衡 常数与前述错误杂交的反应平衡常数之差，使杂交结果所得到 的错配双链核酸2更选择性地解离。另夕卜，在该工序中，也可以通过对反应场R进行电场施加， 进行错配双链核酸2的选择性解离。更具体而言，选择可以向反应场R提供电动力学作用的电场条件进行电场施加，该电动力学作用使错配双链核酸2进行选择性解离并且可以维持完全匹配双链核酸1的双《连状态。该电场施加工序可以与上述升温处理组合实施。例如，可以不论先后顺序:l也依次进行升温处理工序和电场施加工序，或 同时并行地进行。通过进行电场施加工序使核酸链集中到反应 场R的存在探针核酸链的区域，则试样核酸浓度变得不均一。因此，进行升温处理而解离错配双链核酸2时，通过浓度梯度， 解离单链核酸从:;容液中探针核酸链附近扩散到更远的区域，可以减少再次形成4晉配双链核酸2的概率。另外，从尽量防止离子溶液在临近反应场R的电极(未图 示)的表面电解的观点等出发，电场施加期望为交流电场，更 详细而言，期待选择lkHz 500MHz的任意的电压值。进一步，在该工序中，也可通过向反应场R添加规定的酶， 促进错配双链核酸2的选择性解离(酶处理)。该工序中可以使 用的酶适宜为识别并切断错配双链核酸2的4昔配部位的酶。例如 错配双链核酸2为双链DNA时，可以适当地使用识别其单碱基 错配部位、并选才奪性地切断该错配部位的Endonuclease V。用Endonuclease V等酶切断错配双链核酸2的单碱基错配 部位，则该错配双链核酸2被分割为更短的2条双链部分。结果， Tm值比原先的错配双链核酸2更低，与未被分割的错配双链核 酸2相比，可以在更^氐温度区域解离。此时，以4氐于完全匹配双 链核酸1的Tm值的温度为上限进行升温处理、进行电场施加， 则被分割的错配只又^i核酸解离成单链核酸。 (解离单链的洗涤除去工序)再次基于图3进行说明。下一工序的目的在于，将进行升温 处理、电场施加或这些^t喿作与酶处理的结果游离于反应场R中的单链核酸(参考图3的2b)从反应场R中除去。例如将被精密 设定成对完全匹配双链核酸1的互补链结合没有影响的p H 、温 度、浓度等条件的洗涤用緩沖溶液导入到反应场R中，将该緩 冲溶液连同前述单链核酸清除到反应场R外。另外，在图3的中 央所示的图中，示意地示出由^l晉配双^i核酸2解离的单链核酸2b 被清除到反应场R外的情况。 (嵌入剂供给工序) 接着，向完全匹配双链核酸1和形成过错配双链核酸2的探 针核酸链2a所存在的反应场R中供给嵌入剂I。该嵌入剂I只要是 具有特异性地结合或吸附在双链部位而产生荧光的特性的物质，就没有特别的狭义的限制。另外，当然期望使用对于双链 部位以外的部分尽量不发生非特异性的结合或吸附的嵌入剂I。 (荧光检测工序)将嵌入剂I供给到反应场R,经过规定时间后，由未图示的 外部光源(例如，规定波长的激光光源)向反应场R内聚焦照 射荧光激发光Q,用公知的光电检测器等光检测装置D测定嵌入 剂I所产生的激发荧光F的强度(荧光量)，由此检测杂交。此时，结合或吸附在完全匹配双链核酸1的嵌入剂I i所产生 的荧光Fi是对检测反应场R内的正常杂交有用的荧光。由于在 前一工序中从反应场R中洗涤除去了游离单链核酸2b (或2bp 2b2),因此在本定光检测中，不发生由非特异性地吸附在该游 离单链核酸2b上的嵌入剂产生噪音荧光，因此可以实现S/N比 的提高。但是，在经过上述洗涤除去工序后仍然在反应场R中以单 链状态存在的(被固定化的)探针核酸链2a上，嵌入剂12有可 能非特异性地吸附而产生噪音荧光F2 (参考图3 )。所以，期待 在进行该荧光检测工序的阶段，预先从反应场R中除去探针核酸链2a。下面，对除去探针核酸链2a的适宜的方法进行说明。图4是示出本发明的杂交检测方法的第2方法例子的工序 流程的图。该第2方法例子的工序大致分类的话依次包括杂交、错配 双链核酸(略称为错配链)的选择性解离、解离单链核酸的分 解(消化)、洗涤除去(根据需要进行)、嵌入剂供给、荧光检 测(杂交检测)。以下，按工序依次说明。(杂交工序)/ (错配链的选择性解离工序)关于杂交工序和该工序之后的错配双链核酸的选择性解离 工序，按照与上述第l方法例子(参考图3)完全相同的方法进 行，因此为了避免重复，在此不再赘述。 (解离单链的分解(消化)工序)本工序的目的在于在荧光检测阶段前预先用规定的酶Ej荧光产生的单链核酸分解(消化)至单碱基单位。另外，单链 核酸有时形成自身环化结构，嵌入剂I结合或吸附在该结构部分 时，则产生噪音荧光，从该观点出发，也通过酶E,将单链核酸 分解。另外，在本工序中，成为酶分解对象的单链核酸至少包含 (1)错配双链核酸2在升温处理、电场施加下解离产生的探针 核酸链2a; (2)通过该解离而以游离状态存在的单链核酸2b; (3)经过使用了Endonuclease V等的酶处理后，进行升温处理、 电场施加时产生的单4连核酸；(4)过量地添加到反应场R中而 以游离状态存在的靶核酸链、错配核酸链(未图示)；(5)未参 与杂交的探针核酸链等。另外，"Endonuclease V"是一种识别 DNA双链中的单碱基错配部位并选择性地切断该错配部位的 核酸酶。该工序中可以使用的酶Ei是特异性地分解单链核酸的酶，可以使用例如核酸内切酶、核酸外切酶或T4 DNA聚合酶等。进行本工序的结果是，在反应场R中，单碱基单位的核酸 分子3群与完全匹配双链核酸1共存(参考图4)。另外，在本工 序后，为了慎重起见，可以进行规定条件下的溶液洗涤，将单 链核酸更加确切地从反应场R中除去(参考图4)。 (嵌入剂供给工序/荧光检测工序) 在从反应场R中除去单链核酸的状态下，向存在有完全匹 配双链核酸1的反应场R供给嵌入剂I，经过规定时间后，由未图 示的外部光源(例如，规定波长的激光光源)向反应场R内聚 焦照射荧光激发光Q ，用公知的光电检测器等光检测装置D观'J定 特异性地结合或吸附在完全匹配双链核酸1上的嵌入剂I所产生 的激发荧光F^力强度(荧光量)，由此检测杂交。另外，本发明中，在进行荧光检测前或在进行荧光检测的 阶段，可以进行蛋白质处理，该处理用于使反应场R中存在的 单链核酸所形成的自身环化结构解开，还原到通常的单链状态。 这一处理的作用在于防止嵌入剂I结合或吸附在自身环化结构 部分而产生噪音荧光并降低S/N比。此时适用的蛋白质发挥解 开单链核酸所形成的自身环化结构而还原到通常的单链状态的 作用。例如，可以采用单链DNA结合蛋白质(single-strand DNA binding protein、以下称为SSB)。该SSB为DNA复制中必不可少 的蛋白质，其发挥解离自身环化结构的作用，结果，通过将嵌 入剂I从该自身环化结构部分释放到反应场R,可以使其荧光(噪 音荧光)消失。图5是示出在本发明的杂交检测方法中，在杂交工序阶段 可以采用的附加方法的概念的图。首先，实施该方法的目的在于，通过提高杂交效率，使反 应场R中的杂交量增加，进而提高荧光检测阶段的检测灵敏度。图5所示的方法中，在进行杂交的阶段，对反应场R施加交 流电场等电场。通过适当条件的电场施加而获得的电动力学作用(例如，介电泳、电泳)使靶核酸链lb向^:针核酸链la的附 近移动，可以促进杂交。例如，可以利用反应场R中的介电泳。另外，"介电泳"是 在电场不一样的场中，分子向电场强的方向驱动的现象。施加 交流电压时，随着施加的电压的极性的反转，极化的极性也反 转，因此，与直流情况相同地可荻得驱动效果。特别是，在高 频交流电场中，与场强的时间平均值的平方的梯度成比例地对 偶极子作用力使其发生泳动。例如，已知核酸分子在液相中受 到电场的作用时则伸长或移动。其原理被认为是通过构成骨架 的磷酸离子(负电荷)与其周围的水离子化而成的氢原子(正 电荷)形成了离子云，由于施加高频率高电压，这些负电荷和 正电荷产生的极化矢量(偶极子)整体上朝向一个方向，其结 果表现为伸长，另外，当施加不均一电场时，向着电力线集中 的部^f立移动 (Seiichi Suzuki ， Takeshi Yamanashi，Shin匿ichi Tazawa，Osamu Kurosawa and Masao Washizu:"Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy，，，IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34，No. 1 ,P75-83(1998))。接着，图6是本发明的杂交检测方法的第3方法例子的工序 流程图。该图6所示的杂交检测方法具有核酸供给工序(符号P1 )， 其将试样核酸供给到保持或固定有探针核酸链的反应场R;电 场施加工序(符号P2),其向反应场施加电场；第一升溫处理工序(符号P3),其升高反应场的温度；嵌入剂供给工序(符号P4)，其将嵌入剂供给到反应场；第二升温处理工序(符号 P5)，其再次升高反应场的温度；杂交检测工序(符号P6),其 检测杂交；进而，具有数据修正工序(符号P7),其基于此前 荻得的杂交检测数据，修正杂交检测数据。另外，本发明并不 狭义地限定于全套实施这些全部工序的情况。即根据目的，将 几个工序适当地组合而4企测杂交的情况也包含在本发明内。 核酸供给工序(符号P1 )如前所述，该工序P1为将试样核酸滴加或供给到保持或固 定有探针核酸链的反应场中的工序。例如，将规定量的试样， 由喷嘴等自动处理且连续地供给到形成于DNA芯片底板表面 上的各个孔(即反应场)中。电场施加工序(符号P2)该工序是对反应场R施加电场，使靶核酸链移动到探针核 酸链附近的工序(参考图5)。该工序为任意的工序。通过该工 序，可以促进杂交，因此可以提高杂交的检测精度。第一升温处理工序(符号P3)该工序是如下工序例如在低于靶核酸链的解链温度T m 的第一温度下，进行前述杂交，直至达到该温度下的反应平衡 状态，然后通过设定为第二温度，该温度高于错误杂交所形成 的错配双链核酸的解4连温度(Tm)并且低于完全匹配双链核酸 的Tm,从而使错配双链核酸选择性地解离。由此，可以减少错 误杂交相对于杂交的相对的量，提高杂交的检测精度。另外， 该第一升温处理工序(符号P3)中的部分工序或全部工序可以 与电场施加工序(符号P2)并行进行。嵌入剂供给工序(符号P4)该工序是将嵌入剂I供给到反应场的工序。嵌入剂I只要是与双链核酸特异性地结合即可，其种类并没有特别地限制。通 过使用嵌入剂I,可以通过荧光强度来测定杂交，因此，具有可 以定量测定的优点。第二升温处理工序(符号P5)该工序是如下工序通过使反应场R的温度高于规定温度， 从嵌入剂I吸附的状态的单链核酸中使嵌入剂I解离，或者使与 嵌入剂结合的(单链核酸的)自身环化结构部位解离。由此， 在使用嵌入剂检测杂交的情况下，可以减少荧光噪音(背景噪 音)，因此可以提高杂交检测时的S/N比、 -提高杂交的检测精度。杂交检测工序(符号P6)该工序如上所述，是通过荧光强度等检测核酸探针与靶核 酸的杂交的工序。数据修正工序(符号P7)该工序是基于此前获得的杂交检测数据，修正杂交检测数 据的工序。例如每次测定中，预先获得升温处理前和升温处理 后的荧光强度，基于该测定数据，计算S/N比的提高程度(修 正系数)。并使用该修正系数，修正杂交4全测数据。由此，可以 更加提高杂交的检测精度。实施例1在实施例1中，调查通过在杂交后进行高温处理步骤是否 可以减少错误杂交、提高杂交的S/N比。实验步骤的概要如下。首先制作实-验中使用的底板。洗涤切断为lcm见方的硅底 板，通过臭氧处理、双氧水处理将表面清洁并羟基化后，在120。C 下加热干燥30分钟。然后，以相对于甲苯的体积比为2%，向甲 苯中加入氨基丙基硅烷，制备溶液，将洗涤后的底板在50。C下 浸入该溶液中3 0分钟，使硅表面的羟基与氨基丙基硅烷反应， 并用曱苯和水洗涤。然后将100mg琥珀酸酐溶于10ml二甲基曱酰胺中，制备溶液，将底板浸渍在该溶液中，在50。C下进行2 小时酰胺化反应，使氨基丙基石圭烷与琥珀酸反应，并洗涤底板。然后，将DNA寡聚物固定在底板表面。将具有氨基末端的 DNA寡聚物(序列号l )溶解在纯水中(浓度10pM)，然后滴加 在底板表面(lmm点)，在加湿下，使DNA寡聚物的氨基与底 板表面的琥珀酸在80。C下反应l小时，固定DNA寡聚物。然后，测定固定在底板表面的探针核酸链和试样核酸中的 耙核酸链的杂交。试样核酸使用具有与探针核酸链的全部碱基 序列互补的序列的核酸(完全匹配核酸，序列号2)和具有与探 针核酸链的部分石咸基序列互补的序列的核酸(^"配核酸，序列 号3)。将试样核酸溶解在Hepes buffer中，制备为lnM,将10fxl 该溶液盛放到底板表面，在加湿下，在65。C进行4小时杂交。杂 交反应后，进行80。C、 5分钟的高温处理，添加作为嵌入剂的 SYBR Green I ( Molecular Probes公司生产，以下相同)，照射 450nm的激发光，测定底板的荧光。另外，在对照区，杂交反 应后不进行80。C、 5分钟的高温处理，添加嵌入剂，用显微镜观 察底板的焚光。结果示于图7。图中，纵轴表示荧光强度(相对值)，最左 边的柱状图为使用完全匹配核酸而未进行升温处理就测定荧光 强度的情况，左数第二个柱状图为使用完全匹配核酸进行升温 处理后测定荧光强度的情况，左数第三个柱状图为使用错配核 酸而未进行升温处理就测定荧光强度的情况，左数第四个柱状 图为使用错配核酸进行升温处理后测定荧光强度的情况，最右 边的柱状图为未加入试样核酸而未进行升温处理就测定荧光强 度的情况(空白，blank )。如图7所示，在完全匹配核酸的情况下，未进行升温处理 的情况与进行升温处理的情况的荧光比为1.2: 1.1,即使进行升温处理，荧光强度也没有大的下降。另一方面，在错配核酸 的情况下，未进行升温处理的情况与进行升温处理的情况的荧光比为l.l: 0.5，通过进行升温处理，荧光强度大大降低。所以，以上的结果表示，通过在杂交后进行升温处理，可 以减少错误杂交的才全测，大幅度改善完全匹配核酸与错配核酸 的荧光比。即，本实验的结果表示，通过减少错误杂交的检测， 可以提高杂交检测时的S/N比、提高杂交的检测精度。 实施例2在实施例2中，与实施例l同样，调查通过在杂交后进行 升温处理步骤是否可以减少错误杂交、提高杂交的S/N比。另 外，该实验中，通过〗吏荧光染料Cy3结合在试样核酸上，测定 杂交检测时的荧光强度。实验步骤的;f既要如下。首先，将抗生物素蛋白固定在底板表面。在室温下，将jean silicon (注册商标，东洋钢板林式会社生产)浸入到300fil (100mg/l、 HEPES buffer)抗生物素蛋白溶液中30分钟，固定 抗生物素蛋白，用HEPES Tween Buffer洗涤5分钟，用HEPES Buffer进行三次緩冲液置换。然后进行探针固定。预先将DNA寡聚物进行生物素处理， 制备探针固定溶液，然后在室温下，将底板浸入到300pl (500nM、 HEPES Buffer)探针固定溶液中60分钟，通过抗生 物素蛋白-生物素结合将DNA寡聚物固定，用HEPES Tween Buffer洗涤5分钟，用HEPES Buffer进行三次緩冲液置换。然后，测定固定在底板表面的探针核酸链与试样核酸中的 靶核酸链的杂交。试样核酸使用具有与探针核酸链的全部碱基 序列互补的序列的核酸(30mer，完全匹配核酸)和具有除3个 碱基外都与探针核酸链的碱基序列互补的序列的核酸(30mer,错配核酸)。将试样核酸溶解在HEPES buffer中，制备成50nM， 使荧光染料Cy3结合后，向培养板孔中分注该试样核酸溶液各 300|liL。然后，将底板浸入该试样核酸溶液中，在杂交炉中， 55。C下孵3小时进行杂交，杂交反应后，用HEPES Tween Buffer 洗涤5分钟，用HEPES Buffer进行三次緩沖液置换。接着，杂交 反应后，在80。C进行5分钟的高温处理，然后将底板放在荧光显 微镜下，测定荧光强度。另外，在对照中，杂交反应后不进行 高温处理来测定荧光强度。结果示于图8。图中，纵轴表示荧光强度，左侧的图表表 示未进行升温处理的情况，右侧的图表表示进行升温处理的情 况，"PM，，表示使用完全匹配核酸作为试样核酸的情况，"MM3" 表示使用只有3个碱基序列不互补的错配核酸的情况。如图8所示，未进行升温处理的情况下，完全匹配核酸时 的荧光强度与错配核酸时的荧光强度的比率(荧光比， MM3/PM)为0.82,与此相反，进行升温处理时的荧光比为0.03。 即，通过杂交后进行升温处理，荧光强度的S/N比改善25倍以 上。所以，以上的结果与实施例l同样表明，通过在杂交后进 行升温处理，可以减少错误杂交的检测，可大幅度地改善完全 匹配核酸与错配核酸的荧光比。即，本实验结果表明通过减少 错误杂交的检测，可以提高杂交检测时的S/N比、提高杂交的 检测精度。实施例3实施例3调查通过在添加与双链核酸结合的嵌入剂后进行 升温处理步骤，是否可以减少荧光噪音(背景噪音)，提高杂交 的S/N比。实验步骤的概要如下。向杂交緩冲液中，力卩入150nMDNA寡聚物(探针核酸链)、150nM与该DNA寡聚物互补或非互补的 DNA寡聚物(輩巴核酸、和非靶试样核酸)、嵌入剂(SYBR(注册 商标)GreenI),配制溶液。然后，将该溶液在95 。C加热5分钟， 将核酸变性为单链后，迅速冷却到4。C。然后，在25。C下进行1 分钟孵育后，检测嵌入剂产生的荧光强度。并且，使温度各上 升rc，在各个温度下进行l分钟孵育后，同样地检测嵌入剂产 生的焚光强度。另外，本实验中使用的杂交緩沖液的组成为 100mM HEPES ( pH7.7 )、 20mM MgCl2。另夕卜，本实验中分别 使用具有序列号4的序列的DNA作为探针核酸《连，具有序列号5 的序列的DNA作为靶核酸链，具有序列号6的序列的DNA作为 非耙试样核酸。结果示于图9和图10。图9是表示荧光强度的温度特性的 图，图10是表示基于图9的值而获得的荧光强度的S/N比的图。 在图9中，横轴表示测定温度，纵轴表示荧光强度(信号强度)。 另外，该图中"M.M"描绘使用了非靶试样核酸时的荧光强度， "P.M，，描绘使用了靶核酸链时的荧光强度，"blank"描绘未加入 试样核酸时的荧光强度(对照)。图10中，横轴表示测定温度， 纵轴表示S/N比。如图IO所示，加入与探针核酸链非互补的核酸(非靶试样 核酸)的情况下，超过55t:左右时，荧光强度减弱到与blank相 同的程度。可以推测，非靶试样核酸不与探针核酸链杂交，因 此是荧光噪音。即，可以推测，这些核酸由于形成自身环化而 与嵌入剂结合或者非特异性地与嵌入剂吸附，因而检测到荧光 强度。所以，该实验结果强烈表明，使用嵌入剂检测杂交时， 通过在供给嵌入剂后在55。C以上进行升温处理，可以减少荧光噪音(背景噪音)。另外，如图10所示，使用嵌入剂检测杂交时，58。C左右S/N比最大。随着测定温度的上升，探针核酸链与耙核酸链的杂交 也渐渐解离，因此，温度过高，S/N比也降低。所以，本实验 结果表明，使用嵌入剂检测杂交时，通过进行升温处理，并使测定温度为58。C左右，可以提高S/N比，提高杂交的检测精度。 实施例4实施例4中，对通过进行升温处理，错误杂交的核酸是否 从探针核酸解离进行模拟。图ll为表示模拟模型的示意图。该模拟中使用如下的模 型作为扩散层Cn，在底板S上层叠n个高度(Height of layer) L的单位计算单元，在其上存在本体层C。。假定探针核酸链P存在于底板S的表面上，并假定杂交反应 在与底板S相接的扩散层Cn中进行。假定扩散层Cn中的靶核酸 链的移动近似于图中上侧的公式，扩散层中的杂交反应CP的反 应速率服从图中下侧的公式。实际计算中，将扩散层Cn的高度(厚度)L设为10nm,层 数n设为IOOO层，将底板表面的杂交反应CP的反应场的面积 (Area) S设为10mm2,将探针核酸链的密度(Probe cone. ) P 设为lxl0"/mm2。反应场的液体量(Total Volume) W为5[iL, 不论完全匹配核酸、错配核酸哪种情况，靶核酸链的浓度 (Target cone. ) C均为lnM。 扩散系数(diffusion constant) D 为lx109。该计算中使用的温度为65。C和80。C。杂交反应CP的反应速率在使用完全匹配核酸链和使用错 配核酸链时基本不变，因此，由现有文献"Biochem.32 ( 1993 ) 3095"中记载的活化能(Ea+ = 112kcal/mol )和频度因数(InA =163 )计算杂交反应CP的反应速度。从使用最近邻法计算的 平衡常数(kinetic constant)和杂交反应CP的反应速率计算逆 反应速率。通过最近邻法计算得到的使用完全匹配核酸时的熵、焓分别为AS- - 632.2cal/mol、 AH = - 231200cal/mol，使用错 配核酸时的熵、焓分另'J为AS = - 534cal/mol 、 AH = -198000cal/mol。图12是表示在65。C下使完全匹配核酸或错配核酸杂交后， 升温到80。C时的模拟结果的图。纵轴表示底板上杂交的核酸的 浓度(mol/m3),横轴表示时间(秒)。图12中，用圆点描绘的 曲线为使用完全匹配核酸时的模拟结果，用三角形描绘的曲线 为使用错配核酸时的模拟结果。如图12所示，反应场的温度为65。C时(0~0.01秒)，无论 是使用完全匹配核酸和^"配核酸中哪 一 个，均产生大致相同量 的杂交。另 一方面，使反应场的温度升温至80。C ( O.Ol秒以后)， 杂交的完全匹配核酸的浓度下降较少，与此相反，杂交的错配 核酸的浓度大大减少(参考图12下侧的曲线)。所以，该模拟结果表明通过进行升温处理，杂交的错配核 酸的浓度在非常短的时间内大大减少，另夕卜，表明通过进行升 温处理，只使错配核酸解离。图13为表示使用完全匹配核酸或错配核酸时，温度变化与 杂交量的关系，以及此时扩散层中存在的靶核酸链的浓度变化 的模拟结果。图13中左上部的模拟结果表示使用完全匹配核酸时溫度 变化与杂交量的关系，右上部的模拟结果表示使用错配核酸时 温度变化与杂交量的关系，两模拟结果都是纵轴表示底板上杂 交的核酸的浓度(mol/m3 ),横轴表示时间(秒)，箭形符号部 分表示在该时刻，将反应场变为80。C或65t:。图13中左下部的模拟结果表示在使用完全匹配核酸时，扩 散层中存在的耙核酸链(完全匹配核酸链)的浓度的变化，右 下部的模拟结果表示使用错配核酸时，扩散层中存在的靶核酸链(错配核酸)的浓度的变化。两模拟结果都是纵轴表示靶核酸链的浓度(mol/m3 ),横轴表示时间(秒)，反应场的温度变 化与上述两个模拟结果对应。两模拟结果中，CA[900]或CB[900] 曲线表示距离底板面lpm的位置的靶核酸链的浓度；CA[800] 或CB[800]曲线表示距离底板面2lam的位置的靶核酸链的浓度； CA[700]或CB[70O]曲线表示距离底板面3(xm的位置的靶核酸链 的浓度；CA[600]或CB[600]曲线表示距离底板面4pim的位置的 靼核酸链的浓度；CA[500]或CB[500]曲线表示距离底板面5pm 的位置的靶核酸链的浓度。如图13所示，无论使用完全匹配核酸和错配核酸中的哪一 个，将反应场升温至8(TC时，杂交量均减少(参考上面两个模 拟结果)，并且在扩散层中在接近底板表面的位置，靶核酸的浓 度急剧上升(参考下面两个模拟结果)。使用错配核酸时，升温时杂交量的减少比使用完全匹配核 酸时更加显著，扩散层中靶核酸链的浓度上升也比使用完全匹 配核酸时更剧烈。另夕卜，使用错配核酸时，即使使反应场的温 度恢复到65。C,短时间内杂交量也未能充分地恢复。以上的模拟结果表明，通过进行升温处理，可以提高S/N 比(此时为探针核酸与完全匹配核酸的杂交浓度除以探针核酸 链与错配核酸的杂交浓度的值)，以及，通过进行一次升温处理， 即便其后降低反应场的温度，也可以维持S/N比高的状态。图14是示意地示出由上述模拟获得的杂交反应的行为的图。杂交开始时，完全匹配核酸(参考图14中的符号N)、错 配核酸(参考图14中的符号N2)都以几乎相同的速率进行杂交。 另外，随着杂交的进行，在底板表面形成浓度梯度(参考图14 中左侧的模型)。然后，杂交结束时(达到该温度下的反应平衡状态时)， 完全匹配核酸、错配核酸均与探针核酸链杂交(参考图14中正 中间的模型)。然后，通过进行升温处理，进行变性反应。此时，探针核 酸与错配核酸N2的杂交相较于探针核酸链与完全匹配核酸Ni 的杂交，解离速度大，因此错配核酸N2优先从底板解离而扩散(参考图14中右侧模型)。所以，进行杂交达到规定温度下的反应平衡状态后，通过 进行升温处理，可以减少错误杂交(探针核酸链与错配核酸的杂交)，因此可以改善S/N比。 实施例5本实施例5是从错配碱基数(1 ~ 3 )的角度，验证完美匹 配(完全互补的)双链核酸与错配双链核酸之间对通过升温操 作(高温溶液置换操作)进行的单链解离带来的影响的差异的 实验。首先，如前述，向预先固定有纟笨针DNA ( 30mer)的底板 上加入作为目标的DNA (耙DNA )溶液(溶剂100mM HEPES/200mMNaCl)，以任意温度(具有与探针DNA互补的序 列的DNA的Tm附近，或比该Tm低的温度)进行杂交反应。本实验中使用的靶DNA溶液使用以下的(1 ) ~ (4):(1) 以1: 1混合"具有与探针DNA互补的序列的DNA"与"具有与探 针DNA互补的序列的DNA (序列号4)被荧光染料Cy3修饰的 DNA"的溶液；(2)以l: 1混合"具有与探针DNA互补的序列的 DNA"与"在与探针DNA互补的序列内只有l个碱基错配(序列 号5 )并被荧光染料Cy3修饰的DNA，，的溶液；(3 )以1: l混合"具 有与探针DNA互补的序列的DNA"与"在与纟笨针DNA互补的序 列内只有2个碱基错配(序歹'j号6)并被荧光染料Cy3修饰的DNA"的溶液；(4)以l: 1混合"具有与探针DNA互补的序列的 DNA"与"在与探针DNA互补的序列内只有3个碱基错配(序列 号7)并被荧光染料Cy3纟务饰的DNA"的溶液。上述耙DNA(完全匹配、3种错配)的碱基序列如下面表l 所示。表l〈靶DNA的碱基序列〉序列号45'-d(gacaatgtgtacatcaacatcacctaccac)完全匹配序列号55'-d(gacaatgt旦tacatcaacatcacctaccac)1个碱基错配序列号65'-d(gacaaagt旦tacatcaacatcacctaccac)2个》咸基错配序列号75，-d(gacaatgtgtac力tcaacatgtcctaccac)3个i咸基错配在此，本实施例中所用的具有与探针DNA互补的序列的靼 DNA的Tm为65。C ，杂交的温度为55。C。使用上述各自的溶液 进行杂交反应后，使用温度高于具有与探针DNA互补的序列的 DNA的Tm的Buffer溶液，在短时间内对底板进行溶液置换。 在本实施例5中，使用100mM HEPES/0.5Tween混合溶液作为 置换溶液，在8(TC下进行5分钟置换。图15表示进行杂交反应和高温溶液置换后，测定底板上 Cy3产生的荧光强度的结果。高温溶液置换后，上述溶液(l) 的杂交的荧光强度(互补的探针DNA的杂交量)基本不降低(参 考图15最左边的柱状图)，上述溶液(2)的具有l个碱基错配序 列的耙DNA、上述溶液(3 )的具有2个碱基错配序列的耙DNA、 上述溶液(4)的具有3个碱基错配序列的靶DNA的错误杂交量 大幅度降低。2个碱基错配的错误杂交量相对于正常杂交量，能 够降低90%以上。从以上可知，通过用温度高于Tm的緩沖溶液置换反应场， 可以减少错误杂交量，对杂交反应检测的高精度化是有效的。本实施例6的实-睑-验证了电场施加促进4普配双链核酸的解离。本实验中，如图16所示，在具有电极的底板上进行杂交后，通过施加电场，选择性地使错误杂交解离。首先，向预先固定有探针DNA的电极底板上的反应场中， 加入含有与"表1"的序列号4 (完美匹配)、序列号5 ( —个碱基 错配)对应的輩巴DNA的緩冲溶液(溶剂100mM HEPES/200mM NaCl),以任意温度(具有与探针DNA互补的序列的DNA的Tm 附近，或比该Tm低的温度)进行杂交反应。杂交后，为了除去剩余的耙DNA ，用100mM HEPES/0.5。/。Tween溶液(RT, 5分钟)洗涤。然后向底板上只 加入缓沖溶液(100mM HEPES/200mM NaCl),在电极间施加5 分钟电场。然后，为了除去解离而剩余的DNA，用100mM HEPES/0.5。/oTween溶液(RT, 5分钟)洗涤。由电场施加前后的Cy3荧光强度测定结果，求得来自序列 号4的靶DNA的正常杂交产生的荧光(互补链靶产生的荧光)， 或来自序列号5的靶DNA的错误杂交产生的荧光(l个碱基错配 靶产生的荧光)的剩余率(Residual ratio )。其结果示于图17。如图17所示，例如在电极间以10MHz施加5.5Vpp时，来自 完美匹配的荧光的剩余率未减少，来自1个碱基错配靶的错误杂 交的剩余率减少(约80%)。由此可知，通过电场施加只减少了 错误杂交。当提高施加电压时，来自完美匹配的剩余率也开始 减少，但与l个碱基错配靶的错误杂交的剩余率的差别也加大。 进一步提高施加电压时(9.5Vpp),对被固定的探针也有损害， 不发生杂交，因此不是适当的施加电压值。由以上可知，通过电场施加，可以选才奪性地解离错误杂交， 通过控制施加电压，可以更加选择性地解离错误杂交，由此，可以实现杂交的高精度化。另外，前述电极由铝、金等金属、或ITO(氧化铟锡)等 透明的导体形成，为了防止反应区域中离子溶液导致的电化学反应，尽管没有图示，但有时用由选自Si02、 SiC、 SiN、 SiOC、 SiOF、 Ti02等中的一种材料形成的绝缘层覆盖。另外，前述电 极结构并不限于图16的形态，也可以是相对的电极面积不同的 结构，相对的电极配置为同一平面状的结构等。另外，为了尽 量防止离子溶液在电极界面上的电解，期望前述施加电压为交 流，在本实施例中，用lkHz 500MHz的任意电压值可以获得 与图17同样的效果。在此，作为错误杂交的解离原理，可列举出通过电场施加 产生的Buffer溶液的温度上升效果、通过Buffer溶液中引发的对 流对DNA施加外力的效果、或者通过直接的电场(极化)作用 对DNA施加外力的效果等，由于氢键数少的错误杂交更易于解 离，因此认为任意的电压施加条件下，可以选择性地使错误杂 交解离。另外，本实施例中，期望在利用电场施加的错误杂交解离 工序后，立即进行洗涤。更期望在电场施加中同时进行洗涤工 序，或者洗涤溶液循环常新为好。这是因为，错误杂交即使解离，其恢复反应也非常快，因 此，如不使解离的DNA尽快远离底板表面，将再次发生错误杂 交。或者通过重复电场施加—洗涤—电场施加—洗涤...，也能 够渐渐地减少错误杂交。实施例7通过组合实施例5的高温溶液置换方法和实施例6的电场 施加方法，可以获得更高精度的杂交，因此，本实施例7中进 行其验证实验。首先，在图16所示的电极底板上进行杂交后，进行高温溶 液置换工序、电场施加工序，减少错误杂交。首先，向预先固 定有探针DNA的电极底板上的反应场内，加入含有前述表l所示的各个耙DNA的緩沖溶液(溶剂100mM HEPES/200mM NaCl),以任意温度(具有与探针DNA互补序列的DNA的Tm附 近，或比该Tm低的温度)进行杂交反应，为了除去剩余的DNA, 用100mM HEPES/0.5。/。Tween溶液洗涤5分钟。然后，用80°C的 1 OOmM HEPES/0.5。/。Tween溶液洗涤电极底板5分钟作为高温溶 液置换工序。然后，向电极底板上只力。入緩冲溶液(100mM HEPES/200mM NaCl ),在电极间施加10MHz、 7.5Vpp。此时， 为了除去解离并游离于反应场中的DNA ， 用100mM HEPES/0.5。/。Tween溶液(RT, 5分钟)再次洗涤电极底板。将 测定以上杂交后(洗涤后)、高温洗涤后、电场施加前后的Cy3 荧光强度的结果示于图18。如图18所示，比较各工序后的Cy3荧光强度可知，错误杂 交阶段性地减少。从含有1个碱基错配的靶DNA的错误杂交结 果来看，通过短时间高温溶液置换和电场施加的效果，最终可 以实现90%以上4晉误杂交的减少。由此可知，组合实施例5与实 施例6的各技术，对杂交进一步高精度化是有效的。由以上可以i人为，本实施例7中，在杂交之后，顺次进行 短时间的高温溶液置换和电场施加，但并不限于该顺序，在电 场施加后实施高温溶液置换也可以取得同样的效果。另外，如 实施例6所示，通过加上重复电场施加—洗涤的工序，可以提高 减少错误杂交的效果。工业利用的可能性本发明可以利用在检测杂交的技术中。例如作为提高检测探针核酸链与靶核酸链间的杂交时的S/N比的技术加以利用。
权利要求
1. 一种杂交检测方法，其在使探针核酸链与靶核酸链之间进行杂交之后，进行升温处理工序，使进行该杂交的反应场的温度高于规定温度，从而提高杂交检测时的S/N比。
2. 根据权利要求l所述的杂交检测方法，其特征在于，在 所述升温处理工序中，在进行所述杂交后，将所述反应场的温度设定为高于错误 杂交的结果所得到的错配双链核酸的解链温度(Tm)并且低于 完全匹配双链核S臾的Tm的温度，由此使该错配双链核酸选择性 地解离。
3. 根据权利要求2所述的杂交检测方法，其特征在于，在 所述反应场的每个点固定有不同序列的所述探针核酸链，所述升温处理工序基于所述探针核酸链与所述靶核酸链的 Tm,在所述每个点独立地进行。
4. 根据权利要求l所述的杂交检测方法，其特征在于，在 所述升温处理工序中，通过加大所述杂交的反应平衡常数与所述错误杂交的反应 平衡常数之差，使所述错误杂交的结果所得到的错配双链核酸更加选择性 地解离。
5. 根据权利要求l所述的杂交检测方法，其特征在于，使 所述反应场的温度瞬间上升到所述规定温度。
6. 根据权利要求5所述的杂交检测方法，其特征在于，通 过高温溶液置换， <吏所述反应场的温度瞬间上升至'J所述规定温度。
7. 根据权利要求l所述的杂交检测方法，其特征在于，使 用与双链核酸吸附或结合的嵌入剂检测杂交。
8. 根据权利要求l所述的杂交检测方法，其特征在于，通 过进行所述升温处理而选择性地解离错配双链核酸，从而减少 来自于该错配双链核酸的噪音萸光。
9. 根据权利要求7所述的杂交检测方法，其特征在于，该方法至少包含核酸供给工序，其向保持或固定有探针核酸链的反应场供 给耙核酸链；第一升温处理工序，其将所述反应场的温度升高； 嵌入剂供给工序，其向所述反应场供给嵌入剂； 第二升温处理工序，其将所述反应场的温度再次升高； 杂交检测工序，其通过所述嵌入剂检测杂交。
10. 根据权利要求9所述的杂交检测方法，其特征在于，所 述第二升温处理工序中，进行以下(1 )、 ( 2 )任意一种或两种(1 )将吸附到存在于反应场中的单链核酸上的嵌入剂， 从该单链解离；(2)将存在于反应场中的单链核酸所形成的自身环化结构解开。
11. 根据权利要求l所述的杂交检测方法，其特征在于，在 进行杂交的阶段，对所述反应场施加电场。
12. 根据权利要求l所述的杂交检测方法，其特征在于，在 进行所述升温处理的工序中或在其前后的工序中，对所述反应 场施力口电场。
13. 根据权利要求l所述的杂交检测方法，其特征在于，所 述探针核酸链固定于所述反应场中，在所述升温处理后，溶液洗涤该反应场，以使通过与该探针核酸链杂交所得的 完全匹配双链核酸留在反应场中。
14. 根据权利要求13所述的杂交检测方法，其特征在于， 在对升温处理后的反应场进行电场施加后，进行所述溶液洗涤。
15. 根据权利要求14所述的杂交检测方法，其特征在于，重复数次由所述电场施加和溶液洗涤组成的工序。
全文摘要
本发明的目的在于提高杂交检测时的S/N比、提高杂交的检测精度。提供一种杂交检测方法，在反应场中，使探针核酸链与靶核酸链之间进行杂交之后，进行升温处理，使进行该杂交的前述反应场的温度高于规定的温度，从而提高杂交检测时的S/N比。
文档编号C12N15/09GK101233242SQ20068002738
公开日2008年7月30日 申请日期2006年7月27日 优先权日2005年7月27日
发明者中村亮太, 大森真二, 山下志功, 山本拓郎, 岸井典之, 濑川雄司, 阿部友照 申请人:索尼株式会社