专利名称：：确定氨甲喋呤有效剂量的方法
技术领域：
：本发明涉及确定氨甲喋呤的有效剂量的方法，氨曱喋呤是风湿性关节炎患者的治疗风湿药剂。另外，本发明还涉及用于治疗风湿性关节炎的方法，其中，用于每一个体的氨甲喋呤的剂量通过使用确定氨甲喋呤剂量的方法来确定。
背景技术：
：氨曱喋呤为作为用于风湿性关节炎的治疗剂的最常用的有效药剂之一(参见，例如，非专利文献l)。已知该氨曱喋呤不仅能够临时抑制疼痛，而且能够抑制由风湿性关节炎引起的关节损伤而改善风湿性关节炎的预后(参见，例如，非专利文献2)。然而，用于抑制风湿性关节炎的氨曱喋呤的必需剂量依赖于每一个体而显著地变化。例如，对一些患者来说氨曱喋呤以2mg/周给药产生足够的效果，但是对其他患者来说氨曱喋呤以15mg/周给药不能产生足够的效果。认为对于不能获得足够效果的患者，必须以15mg/周的最大剂量尽快增加氨曱喋呤的剂量，同时考虑副作用等(参见，例如，非专利文献l)。因此，对于从治疗开始已进行足够长时间治疗的患者，氨曱喋呤的剂量反映了对于该患者的氨甲喋呤的个人有效剂量。易于荻得氨甲喋呤效果的患者趋于最终具有低的氨甲喋呤剂量，难以获得氨甲喋呤效果的患者趋于最终具有高氨甲喋呤剂量。然而，事先难以知道对于每一患者的氨曱喋呤有效剂量。最近显示，对于每一患者的氨曱喋呤有效剂量与亚曱基四氢叶酸还原酶或5，10-亚曱基四氢叶酸还原酶，缩写为MTHFR,EC1.5.1.20的基因之间有关。换言之，据报道存在于MTHFR基因的第七个外显子上的A1298C多态性(参见例如非专利文献4)与用于风湿性关节炎的氨曱喋呤剂量有关(参见例如非专利文献3)。该报道表明已进行了群组研究(cohortstudy),其中已调查了99个在开始给药后已给药氨曱喋呤至少3个月的患有风湿性关节炎的患者的氨曱喋呤最终剂量。另夕卜，他们研究了在那些患者中在MTHFR基因中A1298C的基因型和氨曱喋呤最终剂量之间的关系。该报道表明，其中给药超过5mg的氨曱喋呤的比例在68个各自具有A/A基因型的个体(第一组)中比在31个各自具有除A/A基因型之外的任何基因型(A/C和C/C，第二组)的个体中高，前者和后者的比例为1.78。换言之，该报道表明，各自具有A/A基因型的患有风湿性关节炎的患者最终以超过5mg/周的氨曱喋呤给药的可能性是具有其它基因型的患者的1.78倍。然而，尽管该非专利文献3报道各自具有A/A基因型的患者易于以高剂量的氨曱喋呤给药，但是，没有研究在A/C或C/C基因型的每一者与氨曱喋呤的剂量之间的关系。因此，在风湿性关节炎的治疗中，还没有能够预先把握对于每一患者的氨甲喋呤有效剂量的高4青度确定方法以确定该剂量。[非专利文献l]AmericanCollegeofRheumatologySubcommitteeonRheumatoidArthritisGuidelines.Guidelinesforthemanagementofrheumatoidarthritis:2002Update.ArthritisRheum.2002;46(2):328-46[非专利文献2]ChoiHK,HernanMA，SeegerJD，RobinsJM，WolfeF.Methotrexateandmortalityinpatientswithrheumatoidarthritis:aprospectivestudy.Lancet.2002;359(9313):1173-7[非专利文南史3]UranoW，TaniguchiA,YamanakaH,TanakaE，NakajimaH,MatsudaY,AkamaH，KitamuraY,KamataniN.Polymorphismsinthemethylenetetrahydrofolatereductasegenewereassociatedwithboththeefficacyandthetoxicityofmethotrexateusedforthetreatmentofrheumatoidarthritis,asevidencedbysinglelocusandhaplotypeanalyses.Pharmacogenetics.2002;12(3):183-90[非专利文献4]vanderPutNM，GabreelsF，StevensEM,SmeitinkJA,TrijbelsFJ，EskesTK,vandenHeuvelLP,BlomHJ.Asecondcommonmutationinthemethylenetetrahydrofolatereductasegene:anadditionalriskfactorforneural-tubedefectsAmJHumGenet.1998;62(5):1044-51。
发明内容本发明要解决的问题本发明的目的是提供在治疗风湿性关节炎中用于把握对于每一患者的氨甲喋呤有效剂量的检测方法。本发明的另一目的是提供其中确定对于每一个体的氨曱喋呤剂量的用于治疗风湿性关节炎的方法。解决问题的手段本发明的发明人为解决上述问题进行了深入研究。结果，发明人发现对于每一患者的氨曱喋呤的有效剂量可以通过检查患有风湿性关节炎的每一个体患者中在MTHFR基因上的A1298C多态性来确定。特别地，发明人检查了A1298C多态性属于三种基因型中的那一种，并发现能够确定高氨曱喋呤有效剂量的可能性在具有C/C基因型(仅C等位基因)的患者中较低，在具有A/C基因型的患者中中等，在具有A/A基因型的患者中较高(仅A等位基因)。由此，获得在风湿性关节炎的治疗中确定对于每一患者的氨曱喋呤剂量的方法，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下(1)至(4)项。(1)在患有风湿性关节炎的患者中确定氨曱喋呤的有效剂量的检测方法，其包括检查在患者的MTHFR基因上的A1298C多态性属于三种类型A/A、A/C或C/C的哪一种。(2)通过检查在患者的MTHFR基因上的A1298C多态性属于三种类型A/A、A/C或C/C的哪一种，来确定对于每一个体患者的氨甲喋呤的有效剂量的方法。(3)根据上述(2)项的方法，其包括判断高有效剂量的可能性在具有仅C等位基因的C/C基因型的患者中低，在具有A/C基因型的患者中中等，及在具有仅A等位基因的A/A的患者中高。(4)使用根据上述(2)或(3)项的方法，来确定对于每一个体的氨曱喋呤剂量的用于治疗风湿性关节炎的方法。发明效果将本发明的方法用于实验室检测等能够确定在每一治疗中开始给药时对于每一患者的剂量，和确定在效果不足的情况下对于每一患者应该增加的剂量。该方法能够防止氨曱喋呤的过量给药，减少患者机体的负担，并减少医药费用。另外，与传统方法相比，本方法能够使患有风湿性关节炎的每一患者更早地用有效剂量进行治疗，并能够防止风湿性关节炎的发展。[图l]为示出在MTHFR基因上的A1298C多态性的基因型与在开始给药12个月后最终剂量的氨甲喋呤(超过6mg/周)的个体的比率之间的关系的图(实施例)。[图2]为示出在MTHFR基因上的A1298C多态性的基因型与在开始给药]2个月后最终剂量的氨曱喋呤(超过6mg/周)的个体的比率之间的关系的图(比较例)。具体实施方式根据本发明的术语"患有风湿性关节炎的患者"意指由医生诊断为风湿性关节炎并使用氨曱喋呤作为治疗剂的患者。包括任何患有风湿性关节炎的患者例如患有风湿性关节炎的患者。根据本发明的术语"氨甲喋呤的有效剂量"意指其中氨曱喋呤在患有风湿性关节炎的个体患者中显示效果的剂量。氨曱喋呤的效果通过以下事实判断在单个患者中，症状例如关节疼痛、肿胀等通过给药氨曱喋呤而减轻。在一般的治疗中给药2mg/周的氨曱喋呤。然而，在患者不能获得足够效果的情况中，给药6mg/周以上。考虑到以上事实，作为在本发明中的氨曱喋呤的有效剂量，将低于6mg/周的剂量定义为低剂量，将6mg/周以上的剂量定义为高剂量。注意，通常，使用2mg药片和2.5mg药片作为用于氨曱喋呤的药片。由于在本发明的实施例中使用2mg药片，因此将确定低剂量和高剂量的标准设定在6mg。另一方面，在非专利文献3中使用2.5mg药片的情况下，将5mg设定为标准。该事实表明，标准依赖于所使用的药片变化。根据本发明的术语"用于确定氨曱喋呤的有效剂量的检测方法，，意指用于检查对于个体患者的氨曱喋呤的有效剂量是否属于低剂量或高剂量的方法。在本发明中，通过检查在个体患者中MTHFR基因中的A1298C多态性属于三种类型A/A、A/C或C/C中的哪一种，能够根据该患者的基因型而判断该个体患者属于低剂量或高剂量的那一种剂量的可能性。可判断，本发明的有效剂量高的可能性在MTHFR基因中的A1298C多态性中具有C/C基因型(仅C等位基因)的患者中低，在具有A/C基因型的患者中中等，在具有A/A基因型(仅A等位基因)的患者中高。由于个体的基因型是永久的，因此对于被检查的个体来说一次检查是终生有效的。因此，对于其基因型通过本发明的方法检查的患者，能够基于从检查基因型获得的信息永久确定氨曱喋呤有效剂量。尽管认为氨曱喋呤的作用机理是通过叶酸的降低引起的，但是摘自非专利文献4中的下表1表明，MTHFR的酶活性以A/A〉A/C〉C/C的顺序下降，而血清中叶酸的浓度没有不同。[表l]在各自具有MTHFR中A1298C基因型的个体中(在A/A为100%的情况中)酶活性及血清中叶酸浓度的比较(摘自非专利文献4)基因型A/AA/CC/C酶活性100%83.2%61.1%血清中的叶酸浓度(nmol/L)12.6±5.512.5±4,513.5±4.2如上所示，显示出每一基因型的酶活性降低，但是未显示叶酸浓度降低。因此，根本不能认为A1298C基因多态性与氨曱喋呤有效剂量之间有关。例如，显示出与A1298C基因型相比，MTHFR的酶活性更多地依赖于在MTHFR中的C677T多态性基因型而变化，该C677T多态性同样与叶酸浓度的不同相关(非专利文献4)。然而，C677T基因型和氨曱喋呤有效剂量之间无关(非专利文献3的表5)。如上所述，在酶活性、物质浓度和药物有效性之间的关系中存在大的隔阂。仅有基于患者的实际给药获得的结果的判断才有意义，这是医学领域的常识。例如，最近医学判断的有效性基于循证医学(Evidence-basedmedicine(EBM))是全球医学领域的常识。在EBM中，仅采纳通过对人类的药物实际给药而获得的结果。如果医学实践仅基于关于患者中的酶和物质浓度而判断，则认为有问题。因此，即使依赖于A1298C多态性的MTHFR酶活性存在不同，该事实与氨曱喋呤有效剂量之间存在直接关系的假定也不能成为有根据的科学假定。根据本发明，"检查属于在MTHFR基因中的A1298C多态性的三种类型A/A、A/C或C/C中的哪一种的方法，，包括通过其能够精确检查在个体患者中存在于MTHFR基因中的第七个外显子上的A1298C基因型的任何方法。例如，该基因型也可以通过使用DNA测序仪或聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法来检查。当将PCR-RFLP方法用于#r查时，该方法可以如下进行。首先，将从个体患者获得的DNA与各自具有序列表中示于SEQIDNO:1中的核普酸序列和示于SEQIDNO:2中的核苷酸序列的两个合成DNA混合。将含有必需化合物的溶液加入该混合物中以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增包括MTHFR基因中的A1298C多态性的基因区域。然后，通过限制性酶Fnu4I将所扩增的DNA切断，并将该DNA进行电泳以才全查该DNA是否被切断。结果，可知该DNA具有基因型A/A、A/C或C/C的哪一种。在本发明中"确定对于每一个体的氨曱喋呤剂量的用于治疗风湿性关节炎的方法"意指以下方法，在该方法中，对于每一患者的氨甲喋呤剂量通过使用本发明的检测方法等作为实验室检测来确定，在每一治疗中确定开始给药时的氨曱喋呤剂量，并在效果不足的情况中确定对于每一患者应该增加多少剂量。以下，将通过实施例更详细地描述本发明，但本发明不限于该实施例。实施例<对象>目标患者为157名(M/F-24/133)东京女子医科大学风湿病学院医院(InstituteofRheumatologyTokyoWomen'sMedicalUniversityHospital)护理的患有风湿性关节炎的患者。所以这些患者不同于在非专利文献3中检查的患者。对这157名患有风湿性关节炎的患者的MTHFR基因中的A1298C基因型和开始给药12个月后给患者的氨甲喋呤剂量进行检查。<基因组DNA扩增反应〉从每一患有风湿性关节炎的患者的外周血中的白细胞中提取基因组DNA。从该基因组DNA,通过PCR扩增包括MTHFR基因中的A1298C的DNA区域。将序列表中的示于SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物用于该扩增。该DNA扩增反应在总体积为50pl的体系中进行，其含有5pl的10xPCRBuffer(AppliedBiosystem,Japan)、0.5jxl(=2.5U)的AmpliTaqGold(AppliedBiosystem,Japan)、5.0[il的8mMdNTP(每一dNTP为200pM)和l^il的各自为10pmole的引物(每一引物0.2(iM)。PCR条件包括95。C变性10分钟，各自在95。C30秒、在65。C30秒和在72。C60秒的反应总共34个循环，及最终在72。C延伸7分钟。<基因型的确定>通过PCR扩增的产物由限制性酶Fnu4I切断，并进行电泳以检查其是否被切断。由此确定在每一患者中的基因型(A/A、A/C、C/C)。<统计学处理>集团中的等位基因和基因型通过使用用于统计学分析的Fisher's精确才企测和x2才企测(Chi-sequaretest)来比车支，将Excel用作统计学软件。〈MTHFR基因中A1298C基因型与氨曱喋呤有效剂量之间关系的研究>表2示出了在所有患有风湿性关节炎的对象患者中，基因型与氨曱喋呤有效剂量之间的关系。表2中每一格中的人数以整数值示出。表2示出了在所有患有风湿性关节炎的对象患者中，MTHFR中A1298C多态性基因型与氨甲喋呤剂量之间关系。在本实施例中，将氨曱喋呤给药开始12个月后超过6mg/周的剂量定义为高剂量，否则定义为低剂量。基于MTHFR中A1298C多态性基因型将个体分类成A/A、A/C和C/C，并总结基因型和高剂量之间的关系。如图1和表2中所示，高剂量氨曱喋呤的比率以基因型中A/A〉A/OC/C的顺序变化。换言之，其示出与具有C/C基因型(仅C等位基因)的个体相比，具有包括A等位基因的基因型的个体具有急剧升高的需要高剂量的危险。具有A/A基因型的患者需要高氨甲喋呤剂量的可能性为49%。与此相比，具有A/C基因型的患者和具有C/C基因型的患者的可能性分别为28%和13%(表2和图1)。在A/A和A/C之间的差别为1.7(风险比率，P<0.05),在A/A和C/C之间的差别为3.8(风险比率，P<0.05)。[表2]A1298C与开始给药12个月后MTX最终剂量超过6mg/周的比率之间的关系(15人)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*1.72(95%置信区间1.04至2.84),P<0.05**3.88(95%置4言区间0.61至24.6),PO.05[比4交例]〈MTHFR基因中A1298C的A/A基因型与其它基因型的区别，和A/A基因型与氨甲喋呤有效剂量之间的关系以及其他基因型与氨曱喋呤有效剂量之间的关系的研究>表3示出在所有患有风湿性关节炎的对象患者中，A1298C的A/A基因型与氨曱喋呤有效剂量之间的关系以及其他基因型(A/C和C/C)与氨曱喋呤有效剂量之间的关系。在表3的每一格中的人数以整数值表示。表3和图2显示了在所有患有风湿性关节炎的对象患者中，MTHFR中A1298C多态性的A/A基因型与剂量之间的关系，以及其他基因型(A/C和C/C)与剂量之间的关系。在本比较例中，将开始将氨曱喋呤给药12个月后，超过6mg/周剂量定义为高剂量，否则定义为低剂量。将MTHFR中A1298C多态性的基因型分类为A/A和其他基因型，并总结基因型和高剂量之间的关系。如图2中所示，将49%各自具有A1298C的A/A基因型的个体分类为高剂量。与此相比，26%各自具有A1298C的A/C基因型或C/C基因型的个体分类为高剂量。换言之，向其给药超过6mg/周的氨曱喋呤的具有A/A基因型的个体的比率是具有任何其它基因型的个体的比率的1.87倍。如果将超过6mg/周的剂量认为是危险的，危险比率为1.87(95%置信区间，1.14至3.06),并且评价无关性的Pearson'sx^全测显示P<0.01。该结果基本与专利文献3的表5中的结果相同。[表3]MTHFR中A1298C多态性的基因型与高剂量之间的关系基因型A/AA/C+C/C总计高剂量501464低剂量534093总计10354157高剂量的比率0.485*0.259}0.408*风险比率1.87(95%置信区间1.14至3.06),PO.05通过比较图l和图2显示，具有A/A基因型的个体以高剂量给药的可能性相同(49%),但是具有A/C基因型的个体以高剂量给药的可能性从26%增加至28%,具有C/C基因型的个体以高剂量给药的可能性从26%下降至13%。换言之，其表明，具有C/C基因型的个体需要高剂量的可能性降低至约一半。因此，本发明首先证实，在具有C/C基因型(仅C等位基因)的个体中，低氨曱喋呤有效剂量的可能性高于A/C基因型。以上结果表明，本发明的检查方法可以提供遗传学检测方法，通过该方法可以精确地测定对于每一患者的可能性。[工业应用性]通过使用本发明的检测方法和治疗方法，能够确定对于每一患者的开始时的治疗剂量，并且确定在药物的效果不足的情况下，对于每一患者应该增加多少剂量。这些方法能够防止氨曱喋呤的过量给药，能够减少患者机体的负担，并且降低医药花费。权利要求1.一种在患有风湿性关节炎的患者中确定氨甲喋呤的有效剂量的检测方法，其包括检查在患者的亚甲基四氢叶酸还原酶基因，即MTHFR基因上的A1298C多态性属于三种类型A/A、A/C或C/C的哪一种。2.—种通过检查在患者的亚曱基四氢叶酸还原酶基因，即MTHFR基因上的A1298C多态性属于三种类型A/A、A/C或C/C的哪一种来确定对于每一患者氨曱喋呤的有效剂量的方法。3.根据权利要求2所述的方法，其包括判断高有效剂量的可能性在具有C/C基因型(仅C等位基因)的患者中低，在具有A/C基因型的患者中中等，及在具有A/A基因型(仅A等位基因)的患者中高。4.一种用于治疗风湿性关节炎的方法，其包括使用根据权利要求2或3所述的方法来确定对于每一个体的氨曱喋呤剂量。全文摘要[课题]提供在每一患者中确定氨甲喋呤的有效剂量的检测方法，和用于治疗风湿性关节炎的方法。[解决问题的手段]公开了用于确定在患有风湿性关节炎的患者中MTHFR基因上的A1298C多态性的方法。该方法能够用于确定在每一患者中的氨甲喋呤的有效剂量。还公开了在每一患者中治疗风湿性关节炎的方法。文档编号C12Q1/68GK101263231SQ20068003351公开日2008年9月10日申请日期2006年9月8日优先权日2005年9月12日发明者谷口敦夫,镰谷直之申请人:StaGen株式会社