专利名称：：氰生成系统和另一种氧化诱导系统用于治疗肿瘤的协同效应的制作方法氰生成系统和另一种氧化诱导系统用于治疗胂瘤的协同效应本发明涉及能够杀死肿瘤细胞的组合物和方法，包括在氰生成与氧化应激诱导系统之间建立的协同活性。现有技术发展水平亚麻苦普酶-亚麻苦普系统是基于使用编码p-葡萄糖苷酶的植物来源(亚麻苦苷酶，/")的基因，p-葡萄糖苷酶能够转变无害的亚麻苦苷底物(lin，2-羟基-异丁腈-p-D-吡喃葡萄糖苷)以产生丙酮合氰化氩和葡萄糖(Cort6s等人1998，Hughes等人，1992;Cort6s等人，2002)。丙酮合氰化氢在pH超过6和温度大于30匸时是不稳定的，自发地转变为丙酮和氰化物(Selmar,等人，1987)。可以通过逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒，MLV，衍生物)、腺病毒载体(例如，Ad5衍生物)或非病毒载体(质粒转染)将亚麻苦苷酶基因引入到靶细胞中。当该基因在哺乳动物细胞中表达时，亚麻苦苷酶被转运到细胞外，在那里它与其亚麻苦苷底物相遇，并产生氰化物(Cort6s等人，2002)。氰化物具有通过细胞膜自由扩散的能力(Wisler等人，1991)，不仅会影响产生亚麻苦苷酶的细胞，而且会影响周围的细胞，因此，该系统伴随着增强治疗潜能的并行效果。氰化物具有结合并使细胞色素C氧化酶灭活的能力，它阻断了氧化磷酸化的电子传递链，消极地影响线粒体的呼吸功能。这在线粒体中增加了活性氧类别(ROS)的产生，而同时阻断了三磷酸腺苷(ATP)形式通过氧化磷酸化产生能量。通过阻断氧化磷酸化而使ATP的细胞内水平迅速降低诱导细胞通过坏死而死亡。但是，该阻断导致的氧化应激是有限的，因此在本发明中，该疗法与催化葡萄糖转变为葡糖酸的葡萄糖氧化酶(GO)的局部治疗联合，产生过氧化氲01202)。H202的增加促进了活性氧类别(ROS)的产生，它们的过量会对肺瘤细胞具有不利影响。迄今为止，有不同的文献描述了亚麻苦苷酶/亚麻苦苷系统在基因治疗中的应用。此外，也描述了葡萄糖氧化酶的细胞毒效应，并且存在针对基于酶-抗体缀合物的恶性肿瘤的联合治疗。其中一种酶是葡萄糖氧化酶，另一种是过氧化物酶。但是，基于现有描述和知识，并且在下文的描述中可以看出，本发明的技术是基于下列事实这两种系统/1in和G0的组合并没有在以前描述过。基于所述协同活性，当葡萄糖氧化酶系统与亚麻苦苷酶/亚麻苦苷系统联合使用时，由于在肿瘤细胞中达到的氧化应激水平显著增加，使亚麻苦苷酶/亚麻苦苷系统的治疗功效增强。因此，在本发明的一个方面，使用栽体将亚麻苦苷酶基因和葡萄糖氧化酶引入到肿瘤细胞中。这样就在肿瘤细胞周围的区域产生了两个系统，一种是氰生成系统，另一种是氧化应激诱导系统，它们通过协同作用，将会通过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡而导致胂瘤细胞的早期死亡。这两种系统/"/lin和G0的组合产生了一种明显的协同反应，一方面由于阻断氰化物导致的氧化磷酸化，另一方面由于葡萄糖氧化酶产生的&02,而产生了R0S。因此，由于氧化应激是一种细胞死亡启动信号，因此它可以用作治疗癌症的策略。该技术的重要性是基于下列事实这两种系统的组合远超过当这两种系统单独起作用时通过简单叠加的应答所观测到的效果，在产生氧化应激方面产生了显著的协同作用。与仅通过7"/lin系统或仅通过加入G0治疗时在所述细胞中观测到的死亡相比，将这两种系统组合在肿瘤细胞死亡方面显示出明显的时间提前。该组合还会导致将死亡类型由坏死转变为胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡，但是是通过与目前已知的机制不同的机制，因为它不依赖于AIF和PARP(聚[ADP-核糖]聚合酶)。本发明还提供了关于包括葡萄糖氧化酶系统的几种可能性。此夕卜，葡萄糖氧化酶基因可以通过病毒或非病毒载体引入到胂瘤细胞中。另-结合的重组蛋白接种纯化的酶。最传统的疗法，例如化学疗法和放射疗法都是失败的，因为肿瘤细胞会蓄积很多突变，使得它们耐受所述治疗，特别是耐受通过胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡促进死亡的那些治疗，例如对应于胱天蛋白酶，p53的基因中的突变等等。因此必须开发新的疗法，它们能够克服肺瘤细胞后天获得的耐受性，这些疗法例如是产生一种胱天蛋白酶非依赖性死亡的系统，诸如本发明所述的系统。细胞中/"/lin/G0联合治疗系统导致氧化应激出人意料地增加，这是一种能够导致线粒体快速断裂的策略，可促进前细胞凋亡因子释放，该因子集中于通过胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡过程诱导细胞死亡。该系统消除了肿瘤细胞耐死亡的可能的已知机制。此外，由于本发明的一个方面是基于腺病毒的局部注射，因此本发明允许感染活跃地分裂以及绝大多数是休眠的肿瘤细胞。这也包括感染肿瘤干细胞，据信肿瘤干细胞是肿瘤诱发物，与转移和复发有关，是由于癌症而死亡的主要原因。此外，由于氰化物和过氧化物主要是在细胞外产生的，本发明会补偿较低比率的体内感染。同样，通过影响产生亚麻苦苷酶的细胞及其周围的细胞，其防止任何肿瘤细胞逃免疗法。发明描述发明简述本发明的第一个方面涉及一种能够通过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡导致肿瘤细胞死亡的系统，包舍a)组合在单个组合物中的氰生成系统和氧化应激诱导系统，其中氰生成系统包含通过亚麻苦苷酶对亚麻苦苷所发挥的酶活性，氧化应激诱导系统包含通过葡萄糖氧化酶所发挥的氧化活性，(下文作单个组合物)或b)存在于独立组合物的氰生成系统和氧化应激诱导系统，其中氰生成系统包含通过亚麻苦苷酶对亚麻苦苷所发挥的酶活性，氧化应激诱导系统包含通过葡萄糖氧化酶所发挥的氧化活性(下文作本发明的组合物)。在本发明中，单个组合物应当理解为至少包含氰生成系统和氧化应激系统作为必要成分(以载体、蛋白或其他的形式)并且能够通过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡导致肿瘤细胞死亡的组合物。在本发明中，本发明的组合物应当理解为至少两种组合物，其中它们中的至少一种包含氰生成系统作为必要成分(以栽体、蛋白或其他的形式)，另一种包含氧化应激系统作为必要成分(以载体、蛋白或其他的形式)，它们的组合通过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡导致肿瘤细胞死亡。在本发明中，当未明确提及单个组合物或本发明的组合物时，是指本发明的组合物。在本发明一个优选的方面，本发明的组合物的氰生成系统包含亚麻苦苷酶-亚麻苦苷系统，即通过亚麻苦苷酶对亚麻苦苷所发挥的酶活性，其中亚麻苦苷作为反应的底物发挥作用。在本发明的另一个方面，本发明的组合物的氧化应激诱导系统包含葡萄糖氧化酶的活性，即通过葡萄糖氧化酶对葡萄糖所发挥的氧化活性，其中葡萄糖作为底物。在本发明的第二个方面，本发明的组合物的氰生成系统包含亚麻苦苷酶-亚麻苦苷系统，并且本发明的组合物的氧化应激诱导系统包含葡萄糖氧化酶。在本发明的第三个方面，本发明的组合物包含组合在单个病毒或非病毒栽体中的亚麻苦苷酶基因和葡萄糖氧化酶基因。在本发明的第四个方面，本发明的组合物包含在独立的病毒或非病毒载体中的亚麻苦苷酶基因和葡萄糖氧化酶基因。在本发明的第五个方面，本发明的组合物包含引入到病毒或非病毒载体中的亚麻苦苷酶基因，和纯化的葡萄糖氧化酶蛋白或所述蛋白的类似物、片段或衍生物。在一个优选的方面，本发明的组合物包含引入到病毒或非病毒栽体中的葡萄糖氧化酶基因，和纯化的亚麻苦苷酶蛋白或所述蛋白的类似物、片段或衍生物.在本发明一个更优选的实施方案中，本发明的组合物包含葡萄糖氧化酶蛋白和亚麻苦苷酶蛋白或所述蛋白的类似物、片段或衍生物。在本发明一个优选的方面，本发明的组合物包含纯化的葡萄糖氧化酶蛋白和/或纯化的亚麻苦苷酶蛋白以及所述蛋白的类似物、片段或衍生物和释放所述蛋白的控释系统。在本发明一个更优选的方面，本发明的组合物包含与针对肿瘤抗原的抗体结合的纯化的葡萄糖氧化酶重组蛋白和/或纯化的亚麻苦苷酶重组蛋白以及所述蛋白的类似物、片段或衍生物。本发明的第六个方面包含能够过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡导致胂瘤细胞死亡的病毒或非病毒栽体，包含氰生成系统和氧化应激诱导系统。本发明一个优选的方面包含能够过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡导致肿瘤细胞死亡的病毒或非病毒栽体，包含在单个载体中的亚麻苦苷酶和葡萄糖氧化酶基因或其任意的天然或基因工程的修饰物的组合。在本发明的另一个方面，它包含至少两种病毒或非病毒载体，所述载体包含在独立载体中的亚麻苦苷酶和葡萄糖氧化酶基因或其天然或基因工程的修饰物，该组合物能够通过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡导致肿瘤细胞死亡。本发明的另一个方面包含腺病毒和/或逆转录病毒载体，其包含亚麻苦苷酶和/或葡萄糖氧化酶基因。在本发明的第七个方面，它包括本发明的一种/多种载体在制备治疗癌症的药物组合物中的应用。在本发明一个优选的方面，它涉及在治疗中使用的本发明的組合物。在本发明一个更优选的方面，它涉及本发明的组合物在制备治疗癌症的药物組合物中的应用。在本发明的另一个实施方案中，它涉及任意前述的药物组合物和药学可接受的栽体。在本发明的笫八个方面，它包括但不限于用于治疗乳癌、肺癌、头和颈癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、黑素瘤、骨肉瘤、腺癌、白血病或成胶质细胞瘤的药物组合物。本发明的第九个方面包括能够通过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡导致肿瘤细胞死亡的体外或体内方法，包括下述两种系统的组合氰生成系统和氧化应激诱导系统。在本发明一个优选的方面，本发明的方法的氰生成系统包含亚麻苦苷酶-亚麻苦普系统。在一个更优选的方面，本发明的方法的氧化应激诱导系统包含葡萄糖氧化酶的活性。在本发明一个更优选的方面，本发明的方法的氧化应激诱导系统包含葡萄糖氧化酶的活性，本发明的方法的氰生成系统包含亚麻苦普酶-亚麻苦苷系统。在本发明的另一个方面，本发明的任意组合物可以用于本发明的方法的实施方案。在本发明一个优选的方面，本发明的任意药物组合物或载体可以用于本发明的方法的实施方案。在本发明中，亚麻苦苷酶或葡萄糖氧化酶蛋白的类似物、衍生物或片段应当理解为能够产生本发明所要求的协同效应的那些。在本申请的说明书和权利要求中，词语"包含"及其变形并不意味着排除根据说明书对于本领域技术人员将是显而易见的本发明的其他方面。仅通过说明来提供实施方案、实施例和下列附图的详细解释，但并不意味着限制本发明。附图描述附图1显示的是具有通过质粒pdsRed2-mito转染的红线粒体和通过To-Pro-3染色的蓝核的细胞的共焦显微镜图像。所示的图像代表未治疗的对照细胞(A)、在开始治疗后48小时(B)和72小时(C)用亚麻苦苷(500ng/ml)治疗的细胞、用葡萄糖氧化酶(5mEU/ml)(D)治疗的细胞和在在开始治疗后24小时(E和F)或48小时(G)葡萄糖氧化酶(5mEU/ml)和亚麻苦苷(500ng/ml)的联合治疗物治疗的细胞的线粒体模式。附图2(A)和2(B)显示的是依赖于W&W/"细胞的线粒体活性的细胞存活/死亡的分析。所示的是用亚麻苦苷(A)和用亚麻苦苷和5mEU/ml的葡萄糖氧化酶(B)治疗的细胞随着时间的存活率。附图2(C)和2(D)显示的是当在治疗中加入抗氧化剂(10mMNAC)时的细胞存活。附图3(A)显示了细胞内ATP水平降低的研究。在用亚麻苦苷(500pg/ml)和/或葡萄糖氧化酶(5mEU/ml)治疗的W&W/"细胞中完成了随着时间的评估。这些值显示了每个点的两种独立的样品相对于未治疗的细胞获得的值的相对光单位的百分比的平均值土标准差。附图2(B)显示了细胞外过氧化氢的产生。附图4显示了在W&WJ/s细胞中，使用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭标记，通过流式细胞仪测定的系统的死亡类型的特征。附图5显示了在W&W/"细胞中通过免疫荧光进行的AIF定位研究。用To-Pro-3标记细胞核。用5mEU/ml的葡萄糖氧化酶(A)或葡萄糖氧化酶和500pg/ml的亚麻苦苷(B)治疗细胞。附图6显示了通过腺病毒(adeno7is)转染患者的外植细胞的研究。在用腺病毒感染的患者细胞GB-LP-1(A)、GB-LP-2(B)、GB-LP-3(C)、GB-LP-4(D)、GB-LP-5(E)和GB-RC-1(F)中，通过免疫荧光检测亚麻苦苷酶。在500ng/ml的亚麻苦苷存在或不存在下，以不同的多重性感染(MOI)，通过用腺病毒感染的GB-LP-1细胞的MTT进行存活率的研究(G)。在500pg/ml的亚麻苦苷存在下在以不同的MOS感染的Hg/ml的GB-LP-1细胞中氰化物的产生(H)。这些图(G和H)描述的是三种独立样品的平均值土标准差。附图7显示的是在免疫缺陷小鼠中该系统治疗作用的研究。将W&W7"细胞(A-H)或W&W细胞(I和J)接种到小鼠的两个侧腹部，其中一面用0.1mg/g(A),0.25mg/g(B)和0.35mg/g的亚麻苦苷(C)治疗;或者用0.1mEU/ml的G0和0.1mg/g(D)，0.25mg/g(E)和0.35mg/g的亚麻苦苷(F)的联合疗法治疗。用0.25mg/g的lin和O.1mEU/ml的G0(G)治疗W&W/i's肿瘤的功效的研究和该组一只动物的代表性图像(H)。用0.25mg/g的lin和0.1mEU/ml的GO治疗使用腺病毒的小鼠的联合疗法的研究(I)和该组一只动物的代表性图像(J)。这些图显示的是在4只小鼠(A、C、E和F)，6只小鼠(B和D)，8只小鼠(G)和IO只小鼠(I)中单位为mi^的体积随着时间的平均值土标准差。发明详述在其他方面，本发明涉及用于治疗肿瘤细胞的组合物和方法，包括在两个系统氰生成系统和氧化应激诱导系统之间建立的协同活性。该氰生成系统包含通过亚麻苦苷酶对亚麻苦苷所发挥的酶活性，其中亚麻苦苷作为反应的底物发挥作用。氧化应激诱导系统包含通过葡萄糖氧化酶对葡萄糖所发挥的氧化活性，其中葡萄糖作为底物起作用。为了研究作为由所要求保护的系统的活性导致的氧化应激的结果而发生的线粒体动力学的研究，用质粒pdsRed2-mito(Clontech)稳定转染W&W/"细胞，其中该质粒包含由线粒体的转运信号肽载有的一种红色荧光蛋白质的基因。这就允许通过荧光显微镜术观察用亚麻苦苷和葡萄糖氧化酶治疗的细胞的线粒体。因此可以证实，未治疗的细胞显示出丝状线粒体模式(附图1A)，而在用亚麻苦苷治疗的细胞中此细胞间质被破坏，获得点模式(附图1B和1C)。在用亚麻苦苷治疗后48小时开始观察到该效果(附图1B)，在72小时后变得更显著，观察到片段发生轻微的膨胀(附图1C),在大多数线粒体中，只用葡萄糖氧化酶治疗不能导致任何的结构改变(附图1D)。但是当用亚麻苦苷和葡萄糖氧化酶联合治疗时，在24小时后观察到膨胀的线粒体的点模式(附图1E)，其中观察到较高百分比的细胞具有细胞凋亡的碎片核形态特征(附图1F)。在48小时后，一些保持与底物粘附的细胞显示出线粒体的显著膨胀(附图1G)。通过MTT(基于评价活细胞由四唑盐生成甲膽晶形)进行的细胞存活的分析表明，在亚麻苦苷的治疗中，细胞在48小时后的存活率与亚麻苦苷的浓度成比例地轻微降低(附图2A)。但是，直至96小时才观察到存活率的剧烈降低，并且仅实在高浓度的亚麻苦苷(200到500pg/ml)下发生。当进行亚麻苦苷和葡萄糖氧化酶的联合治疗时，在高浓度的亚麻苦苷(500jLig/ml)下，细胞存活率在24小时后开始降低，在48小时后，存活率实际上是O(附图2B)。这表明，联合治疗促进了约48小时的细胞死亡，增强了系统的攻击性，而攻击性会转变为更大的治疗功效。亚麻苦苷酶/亚麻苦苷/葡萄糖氧化酶的成功是由于下列事实这两种系统的组合物导致了对氧化应激产生的协同作用。为了证实这种假设，当在培养基中加入有效的抗氧化剂一10mMN-乙酰半胱氨酸(NAC)时观察治疗中的细胞行为，尽管在其他浓度下也能观测到相同的效果。通过MTT可以在细胞存活率分析中观察到，尽管加入NAC不会导致对亚麻苦苷酶/亚麻苦苷治疗的任何效果(附图2C)，但在7"/lin/G0组合的情况中，的确会发生对死亡的显著抑制(附图2D)。在死亡方面，用膜联蛋白V-FITC/碘化丙锭得到了类似的结果(附图4，表3)。当发生线粒体的电子传递链的阻断时，ATP形式的细胞外能量水平降低，这是因为电子传递链是细胞获得能量的主要来源。当分析细胞内的ATP水平时，观察到加入葡萄糖氧化酶导致了6小时后ATP中度和短暂性的降低(附图3A)，并在24小时后完全緩解，此后水平与对照细胞相同。该效果是由于下列事实在短时间内发生了葡萄糖氧化酶导致的H202最大产生，这是因为细胞具有将过氧化物去毒化的能力以及由于血浆蛋白不会随着时间而激活葡萄糖氧化酶。加入亚麻苦苷导致了ATP的逐步和快速的降低，由于所产生的氰化物在细胞色素C水平上阻断了线粒体的呼吸，在48小时后会完全消除ATP。在这两种治疗联合时，观察到由于葡萄糖氧化酶产生过氧化物，在6小时后ATP水平开始降低，在12小时后ATP水平降低到平行于用亚麻苦苷治疗的水平，尽管由于这两种治疗的协同作用，该水平在某种程度上更低。这些结果表明，由于亚麻苦苷而在72到96小时发生的死亡和由于亚麻苦苷和葡萄糖氧化酶的组合而在24到48小时发生的死亡是由不依赖于能量的机制引发的，因为在这些时间段ATP水平非常低。在本发明中进一步研究了在联合治疗中细胞外产生的H202水平(附图3B)。为此，分析在0.5mg/ml的亚麻苦苷治疗中，在5mEU/ml的葡萄糖氧化酶存在下或在两种治疗的组合中在W&W7/s细胞的细胞培养基中48小时后存在的&02的量，尽管使用其他浓度也得到了阳性结果。观察到，用亚麻苦苷或用葡萄糖氧化酶治疗不会导致细胞外H202浓度相对于对照组(约20pM)发生显著变化，而这两种治疗的组合使过氧化物产生出现了协同性的增加，细胞外水平达到65.9nM。该数据证实了下列假设联合治疗的成功是在于对氧化应激产生的协同作用。此外，联合的h、/lin/GO系统出人意料地改变了死亡的方式，由氰化物(/〃/lin)的坏死特性改变为ATP非依赖性细胞凋亡，在约48小时后进一步促进了细胞死亡，因此，该治疗更为有效。由于大多数细胞凋亡机制例如形成凋亡体都是ATP-依赖性的，因此重要的是确定在该模型中与死亡有关的蛋白质。首先分析所涉及的胱天蛋白酶，为此通过流式细胞仪来分析细胞死亡，在泛-胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-fmk(100pM)存在下，用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭标记(表4和附图4)。观察到胱天蛋白酶的抑制作用不会导致对/"/lin/GO联合治疗的任何影响，因此结论是，这种细胞凋亡是胱天蛋白酶非依赖性的。UV(12.5J/m2)辐射会导致细胞由于胱天冬酶-依赖性细胞凋亡而典型地死亡，使用这种细胞作为对照。通过DNA含量的分析(表1)和通过膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭标记(附图4)证实了，加入Z-VAD-fmk(lOOpM)导致对UV-辐射诱导的细胞凋亡的完全抑制。然后研究了在联合系统中PARP-1(聚[ADP-核糖]聚合酶)蛋白所起的作用。该蛋白的意义在于破坏核中的DNA，在其被激活后，它转移到其中它激活细胞凋亡蛋白例如AIF的线粒体中(Hong，等人，2004)。该途径是ROS产生的细胞凋亡的可能途径中的一种。一种特异性PARP抑制剂，1，5-异喹啉二醇(DIQ)(表5)用于研究在本发明的联合系统中该蛋白所起的作用。观察到，7h/lin/G0导致的细胞凋亡不是由AIF的激活途径介导的，所述途径依赖于PARP,因为DIQ不能抑制它。但是，AIF的激活不是由PARP-1非依赖性机制所导致的(Cregan，2004)。AIF是一种存在于线粒体上的蛋白质，当激活时它转移到核中，并在其中激活细胞凋亡。使用用该疗法治疗的W&W/h细胞的AIF的特异性抗体，通过免疫荧光分析AIF的可能的转移。观察到，用G0治疗的对照细胞显示了典型的线粒体AIF模式(附图5A)，当用亚麻苦苷和G0治疗时(附图5B)，发生线粒体细丝的断裂，但是AIF仍然保留在线粒体中而没有转移到核中。这表明，/"/Un/G0系统导致的细胞凋亡不依赖于AIF介导的细胞死亡。通过流式细胞仪平行进行膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭测定。当在48小时加入5mEU/ml的葡萄糖氧化酶和联合治疗物(5mEU/ml的G0和500pg/ml的亚麻苦苷)，分析系统的死亡模式，然后分析未治疗的对照细胞和在96小时用500ng/ml的亚麻苦苷培养的细胞。此外，将另一組细胞置于同样条件下，除了加入10mM的N-乙酰半胱氨酸(NAC)。随后在100nMofZ-VAD-fmk不存在或存在的条件下，在48小时研究用联合治疗物治疗的细胞，然后研究在相同条件下用UV照射治疗的对照细胞。最后，在300^M的1，5-异喹啉二醇(DIQ)不存在或存在的条件下，在48小时显示用联合治疗物治疗的细胞，观察到当抑制PARP-1时死亡的模式并未改变(附图4)。基于这些结果，可以断定发生hV/lin/G0联合治疗引发的死亡是由于胱天蛋白酶-、PARP-l-和AIF非依赖性的细胞凋亡的机制。评价在患者的6种成胶质细胞瘤获得的外植体中亚麻苦苷酶/亚麻苦苷系统的适用性，以研究在患者中使用本发明的疗法的可能性。首先，研究这些外植体对于通过栽有亚麻苦苷酶基因的腺病毒感染的敏感性。为此，用腺病毒感染这些培养基，用亚麻苦苷酶特异性抗体通过免疫荧光分析亚麻苦苷酶的表达(附图6A-F)。证实了腺病毒有效地感染了5/6的外植体，发生了亚麻苦苷非常活跃的表达，甚至在实际上100%的感染细胞中导致以100的多重性感染(MOI)在细胞中产生了丝状聚集物。仅有一种外植体(GB-LP-5，附图6E)显示了小于5M的细胞死亡，它以M0I:100表达。这是因为，这些细胞显示了腺病毒受体一CARCAR(柯萨奇病毒-腺病毒受体)的较低表达。还分析了在一种外植体(GB-LP-1)中/"/lin治疗的行为。用腺病毒(M0I:0，1，12，100和500)感染这些细胞，研究在加入500ng/ml亚麻苦苷(分别见附图6G和6H)后的存活率和氰化物的产生。腺病毒有效地感染了这些细胞，使得甚至在非常低的多重性感染(MOI:l)下它们对于亚麻苦苷的治疗也非常敏感。此外，甚至在非常高的多重性感染(MOI:100和500)下，通过载体也未检测到毒性。在重量约20克的Swiss小鼠中评价葡萄糖氧化酶的毒性，通过腹膜和静脉灌注不同量的纯净酶。给予l到0.5EU/g动物重量的剂量在给药后的前24小时显示出致死效应。但是，每日剂量在0.25到0.1EU/g重量没有显示出有害作用。这允许在该型动物中确定联合治疗中GO的最佳剂量范围。此外，在重量为20克的免疫缺陷(棵)小鼠中评价亚麻苦苷的剂量范围，用稳定表达亚麻苦苷酶(W&W/Z;)的W&W肿瘤细胞接种。当肿瘤大小达到约50mm3时，用不同浓度(O.5;0.35;0.25或0.10mglin/g动物重量)的亚麻苦苷瘤内给予每日剂量来治疗小鼠。0.1mglin/g的剂量没有显示出治疗效果(n-4)(附图7A)，但是与未治疗的肿瘤相比，在治疗IO天后，0.25mglin/g的剂量显著降低了所治疗肿瘤的生长(p=0.05;n-6)(附图7B)。亚麻苦苷剂量的增加不仅会改善治疗效果，而且也会在用0.35mglin/g的每日剂量治疗后第5天导致3/4的动物死亡(附图7C)，在用0.5mglin/g治疗后第4和5天导致所有动物死亡。为了在细胞培养基中通过增加氧化应激改善这些结果，引入O.1EU/g的葡萄糖氧化酶并用亚麻苦苷治疗。在所有情况中，结果都显著改善(附图7D-7F)，甚至在高剂量的亚麻苦普(O.35mgUn/g,附图7F)下降低了毒性。每日用0.25mglin和0.1EUG0/g治疗获得了最佳的治疗效果，其中在治疗后第8天治疗和未治疗肿瘤之间的差异变得显著(附图7E;p-0.05;n-6)，尽管用其他浓度的葡萄糖氧化酶也获得了药学阳性结果。这些结果确认了，所述协同活性达到了增强亚麻苦苷酶/亚麻苦苷系统治疗功效的目的，因此是更为有效的药理学系统。完成本发明的另一种途径是在引入到免疫缺陷小鼠的W&W肿瘤细胞中使用载有亚麻苦苷酶基因的腺病毒(adeno/")。将106个细胞皮下接种到小鼠的两个侧腹部(n-18)。部分动物(n-8)接受表达亚麻苦香酶的職W7/s细胞，而其他(n-10)则接种W&W细胞，仅当肿瘤细胞发展时，用腺病毒将其局部感染。在治疗开始时在最大肿瘤(约50鹏3)中每日用0.25mglin和0.1EUG0/g治疗用W&W7"接种的动物(附图7G和7H)。用10"U的腺病毒感染的治疗周期显现W&W肿瘤的动物，然后用0.25niglin和0.1EUG0/g进行2日治疗(附图71和7J)。每两日评价肿瘤的发展。结果表明，在肿瘤表达亚麻苦苷酶基因(附图7G)的肿瘤的情况下治疗第7天后和在腺病毒感染的情况中治疗第11天(附图71)后，治疗和未治疗肿瘤之间存在显著的差异(p-O.05)，这表明用腺病毒治疗的有效性。在引入到免疫缺陷的小鼠的側腹部和狗的成胶质细胞瘤中分析该系统。通过趋实性过程将成胶质细胞瘤细胞植入到狗的脑中，产生肿瘤，用所要求保护的方法治疗。在本发明中使用质粒、逆转录病毒和腺病毒载体作为将亚麻苦苷酶植物基因引入到肿瘤细胞中的手段。当所述基因处于其所表达的癌细胞中时，合成了亚麻苦苷酶。亚麻苦苷酶自然分泌到细胞外，在此与它的亚麻苦苷底物相遇，并通过注射方法将亚麻苦苷引入到细胞中来催化反应，亚麻苦苷分解成为葡萄糖和丙酮合氰化氢，丙酮合氰化氢自发形成两种化合物丙酮和氰化物，后者导致肿瘤细胞的死亡。但是，实现通过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡导致胂瘤细胞死亡的另一种途径包含氰生成系统和氧化应激诱导系统，该途径也落在本发明的范围内。此外，在本发明的详述和表中使用的Lin和GO的剂量仅仅施用于解释说明的目的，并用以确认本发明的可能性和功效；此外，其他治疗有效剂量也形成的本发明范围的一部分。本发明的实施方案的实施例实施例1.实施本发明的一个方面的主要步骤验证在Wodinsky&Waker细胞系中治疗的功效，进行体外培养，通过瘤内注射腺病毒栽体和亚麻苦苷的方法引入亚麻苦苷酶基因。实施例2.获得稳定表达亚麻苦苷酶的细胞系用具有CMV(588bp)启动子的质粒pILE(6.9Kb)转染W&W犬成胶质细胞瘤细胞(Wodinsky等人，1969)，然后将基因内含子和多克隆区克隆成基因epc/"(载有人红细胞生成素输出的细胞外信号的亚麻苦苷酶)(1625bp)，然后是IRES(568bp)和基因/7"(对嘌呤霉素耐受)(602bp)和SV40的多腺苷酸化信号。根据商业公司的指示使用阳离子脂类、LipofectaminePlus(InvUrogene)来转染。使用2|ig的DM，12pi的Lipofectamine和8pi的试剂Plus。然后通过用1pg/ml的嘌呤霉素选择来获得亚麻苦苷酶的稳定表达的种子，称作W&W/2V，可以用于剩下的表达。实施例3.DNA含量分析将2-5xl()5个W&W7"细胞种入25cm2的烧瓶中。在24小时后，用亚麻苦苷(500ng/ml)和葡萄糖氧化酶(5mEU/ml)处理它们。在过去的每个分析所指定的时间后，收集细胞，并用PBS洗涤2次。将细胞沉淀物在4t:下再悬浮于300pl的PBS中。然后通过在搅拌和4匸下緩慢加入无水乙醇将它们固定。在超过24小时后，用补充了1%牛血清白蛋白的PBS洗涤细胞，以最终浓度20ng/ml加入碘化丙锭，将它在室温下培养1小时。通过具有CellQuest程序的FACSCalibur(DBBiosciences)流式细胞器来进行数据的釆集和分析。实施例4.用腺病毒感染将1()5个细胞(W&W和患者外植体)植入到具有平侧面和螺帽的试管中，或者将5xl()4个细胞植入到24-孔板的盖玻片中，同时以不同的感染复数(M0I:0;0.2;1;10;100或500)用腺病毒(Crucel1)感染。对于植入试管中的细胞，当适合时在加入0.5mg/ml的亚麻苦苷24小时后更换培养基。在加入亚麻苦苷后96小时，用MTT进行细胞生存力测定。在感染后48小时，将植入到载玻片中的细胞进行免疫荧光分析以检测亚麻苦苷酶。实施例5.在治疗期间线粒体的结构修饰的分析为了研究治疗期间线粒体的结构修饰，用包含红色荧光蛋白的质粒pDsRed2-mito(Clontech，BDBioscience)转染W&W和W&W/i's细胞，其中红色荧光蛋白仅在线粒体中表达。与前述部分类似地进行转染，并通过对新霉素(分别为0.75和1.5mg/ml)的抗性来选择克隆体。将蛋白体的稳定表达克隆体中的细胞植入到多孔板的盖玻片上(2.5x104)，并用亚麻苦苷(50，200或500|ig/ml)和葡萄糖氧化酶(5mEU/ml)治疗。在每个试验的适当培养时间(24，48或72小时)过后，用4%低聚甲醛固定细胞。用1/500稀释的To-Pro-3(MolecularProbes)将细胞核染色30分钟。用配有AxiovertS100TV(Zeiss)倒置显微镜的Radiance2000(BioRad)共焦系统观察微粒体的结构改变，在混合的红色和蓝色过滤器中以0.2pm的距离取3个相邻的平面。实施例6.通过MTT进行细胞生存力分析通过使用四唑盐来确定作为指示细胞生存力的线粒体的酶活性。在该测定中，植入105个细胞/试管(具有平坦侧面和螺旋帽以防HCN排出的培养试管；Nunc)或用石蜡封闭的104个细胞/孔的24孔板。在培养24小时后，加入每个实验所必需的补充有各种浓度的亚麻苦苷(50到500ng/ml)和葡萄糖氧化酶(5mEU/ml)的新鲜培养基。在所使用的分析中，培养基补充有N-乙酰半胱氨酸(IOmM)，1,5-异喹啉二醇(300pM)或Z-VAD-fmk(lOOpM)。在每个实验规定的时间(12到96小时)后，除去培养基，加入含有200ng/ml的MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-联苯四唑溴)的新鲜培养基。在培养1.5小时后，除去培养基，加入3ml(用于试管)或lml(用于24孔板)的二甲亚砜以溶解甲肼。IO分钟后，在540nm处确定样品的吸光度。MTT是溶解于水性介质中的四唑盐(黄色)，其是在甲膽中通过线粒体脱氩酶转变而成的，甲膊在水性介质中是不可溶解的化合物(紫色)。实施例7.免疫荧光将细胞植入到24孔板的盖玻片上，根据每个实验的要求进行处理。在每个分析适当的培养时间后，将细胞在室温下用4%低聚甲醇固定30分钟或在-20t:下用甲醇固定10分钟。然后用补充有tritonX-100或0.1%十二烷基疏酸钠(SDS)将样品透化处理10分钟，并通过用含O.1%tritonX-100和1%牛血清白蛋白的PBS，或含0.01%SDS和10%胎牛血清的PBS培养30分钟来阻断。随后在室温下用第一抗体将它们培养45分钟或在4C下培养过夜。所使用的抗体是抗-亚麻苦苷酶(1/200,由MonicaHughes供应)和抗-AIF(1/50，CellSignalingTechnology),所使用的第二抗体是结合荧光素的抗-兔IgG(l/50，AmershamPharmaciaBiotech)。随后将细胞核染色,用To-Pro-3(MolecularProbes)的1/500稀释液培养30分钟。样品用PBS洗涤2次，用蒸镭H20洗涤1次，用Mowiol-DABC0或PolongGoldAntifade(Invitrogen)封固基固定在载玻片上。实施例8.细胞外过氣化物浓度的确定将待分析的样品在1ml的0.1M磷酸盐緩冲液pH7.4中稀释。然后加入3.7EU/ml的过氧化物酶(Sigma-Aldrich，St.Louis,USA)2和0.1mg/ml的邻联二茴香胺(Sigma-Aldrich，St.Louis,USA)。在室温下将样品培养30分钟，并确定在436nm处的吸光度。通过用浓度增加的H202在标准线中获得的数据的内插法来获得H202的浓度。实施例9.ATP的测定将105个W&W/"细胞植入到具有螺帽和平侧面的试管(Nunc)中。在24小时后，更换培养基，当适当时加入亚麻苦苷(500pg/ml)和葡萄糖氧化酶(5mEU/ml)。在4，8，12，24，48或72小时后，离心分离细胞，并才艮据ATPBioluminescenceAssayKitCLSII(RocheAppliedScience)的说明书进行处理。用Monolight2010光度计(AnalyticalLuminescenceLaboratory,SanDiego)分析发光，并用相对光单位(RLU)来表示。实施例10.通过流式细胞仪(膜联蛋白V-FITC/IP)分析死亡的类型将1(T个W&W7ii细胞植入到具有螺帽和平侧面的试管中(Nunc)。在24小时后，在指定情况下加入不同量的亚麻苦苷(50，200或500Hg/ml)和葡萄糖氧化酶(5mEU/ml)。在适当的测定中，培养基补充有N-乙酰半胱氨酸(IOmM)，1，5-异会啉二醇(300pM)或Z-VAD-fmk(100juM)。在每个分析确定的时间(30，48,72或96小时)后，细胞沉淀下来，用磷酸盐緩冲盐水(PBS)洗涤，并受胰蛋白酶作用。将它们以"00rpm离心分离5分钟，首先用PBS洗涤细胞沉淀物，然后用结合緩冲液(O.1MHepes/NaOHpH7.4，1.4MNaCl和25mMCaCl2)洗涤。细胞再次沉淀，并再悬浮于补充有5pl的膜联蛋白V-FITC和2.5^g/ml的^化丙锭的100的结合緩沖液中。将样品在黑暗中培养15分钟。通过具有CellQuest程序的FACSCalibur流式细胞仪(DBBiosciences)进行数据的采集和分析。认为最初的细胞凋亡性细胞是那些仅对膜联蛋白V-FITC显示阳性标记的那些细胞，然后当它们对膜联蛋白-V-FITC和碘化丙锭都显示阳性染色时会发生细胞凋亡或坏死。实施例ll.获得患者成胶质细胞瘤外植体的原代培养基在处理前，在4t:下将来自试验动物的肿瘤的活組织检查物保存在具有20%SFT的MEM培养基中。在无菌条件下将样品切成约1mm3的块。加入补充有胶原酶(106EU/ml)、0.1MHEPES緩冲液pH7.4、两性霉素(0.5ng/ml)和DNA酶(0.02%)的20%SFT的MEM，并在室温下培养16小时。然后倾析除去未消化的较大片段，通过离心分离收集细胞。将细胞植入到具有20%SFT的MEM中，直至形成培养基。当形成培养基时，在数个步骤后，用含有10°/。SFT的DMEM替换培养基。实施例12.在免疫缺陷小鼠的肿瘤细胞的异种移植模型中的治疗使用重量约20克、2个月大的免疫缺陷的(棵品系)的棵鼠。将l-2xl(T个细胞(W&W或W&W/Z力皮下植入到小鼠的两个侧腹部，包括用体积为50pi的含O.1。/4葡萄糖的完全PBS(补充有钾离子和镁离子)注射。用刻度器测定肿瘤的大小(pi7i/6x高度x宽度x长度)。如前所述，将l-2xl06W&W7/s细胞植入一大组的小鼠(n-8)中。当肿瘤平均大小达到30-50ffln^时，每日用0.25mg的亚麻苦苷和0.1EU的葡萄糖氧化酶/g动物重量治疗一侧的肿瘤。当未治疗的肿瘤大小达到约2000mm3，处死动物，并认为是治疗的结束。通过斯氏t检验对数据进行统计分析，认为显著性水平是5%。对于用载有亚麻苦苷酶基因的腺病毒治疗，当接种W&W细胞的小鼠(n-10)的肿瘤达到30-50%的大小时，在一侧给予治疗周期。在该周期的第1天，接种10"U的腺病毒，用注射器将它们完全分布于整个肿瘤上。在24小时时，用补充有0.1EU/g的葡萄糖氧化酶的0.25mg/g的亚麻苦普施用，进行2天的治疗。重复该周期，直至未治疗的肿瘤的大小达到约2000mm3。处死动物，并认为是治疗的结束。通过斯氏t检验对数据进行统计分析，认为显著性水平是5%。表l.用碘化丙锭标记，通过流式细胞仪对DM含量的研究<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>权利要求1.一种能够通过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡而导致肿瘤细胞死亡的系统，包含氰生成系统和氧化应激诱导系统。2.根据权利要求1的能够通过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡而导致肿瘤细胞死亡的系统，包含a.组合在单个组合物中的氰生成系统和氧化应激诱导系统，或b.存在于独立组合物中的氰生成系统和氧化应激诱导系统。3.根据权利要求2的系统，其中所述氰生成系统包含亚麻苦苷酶-亚麻苦苷系统。4.根据权利要求2的系统，其中所述氧化应激诱导系统包含葡萄糖氧化酶的活性。5.根据权利要求2的系统，其中所述氰生成系统包含亚麻苦苷酶-亚麻苦苷系统，其中所述氧化应激诱导系统包含葡萄糖氧化酶的活性。6.根据权利要求2的系统，包含组合在单个病毒或非病毒载体中的亚麻苦苷酶基因和葡萄糖氧化酶基因。7.根据权利要求2的系统，包含在独立的病毒或非病毒栽体中的亚麻苦苷酶基因和葡萄糖氧化酶基因。8.根据权利要求2.a的组合物，包含引入到病毒或非病毒载体中的亚麻苦苷酶基因，和纯化的葡萄糖氧化酶蛋白或所述蛋白的类似物、片段或衍生物。9.根据权利要求2.b的组合物，包含引入到病毒或非病毒载体中的亚麻苦苷酶基因，和纯化的葡萄糖氧化酶蛋白或所述蛋白的类似物、片段或衍生物。10.根据权利要求2.a的组合物，包含引入到病毒或非病毒载体中的葡萄糖氧化酶基因，和纯化的亚麻苦苷酶蛋白或所述蛋白的类似物、片段或衍生物。11.根据权利要求2.b的组合物，包含引入到病毒或非病毒栽体中的葡萄糖氧化酶基因，和纯化的亚麻苦苷酶蛋白或所述蛋白的类似物、片段或衍生物。12.根据权利要求2.a的组合物，包含纯化的葡萄糖氧化酶蛋白和纯化的亚麻苦苷酶蛋白或所述蛋白的类似物、片段或衍生物。13.根据权利要求2.b的组合物，包含纯化的葡萄糖氧化酶蛋白和纯化的亚麻苦苷酶蛋白或所述蛋白的类似物、片段或衍生物。14.在治疗中使用的根据权利要求2-13任一项的组合物。15.根据权利要求2-13任一项的组合物在制备治疗肿瘤的药物组合物中的应用。16.根据权利要求14-15任一项的药物组合物和药学可接受的栽体。17.根据权利要求14-15任一项的药物组合物，还包含控释系统。18.—种药物组合物，包含根据权利要求8-13任一项的组合物，其中所述蛋白的任一种或两种与针对肿瘤抗原的抗体结合。19.根据权利要求16-18任一项的药物组合物，用于治疗乳癌。20.根据权利要求16-18任一项的药物组合物，用于治疗肺癌。21.根据权利要求16-18任一项的药物组合物，用于治疗头和颈癌。22.根据权利要求16-18任一项的药物组合物，用于治疗胰腺癌。23.根据权利要求16-18任一项的药物组合物，用于治疗前列腺癌。24.根据权利要求16-18任一项的药物组合物，用于治疗结肠癌。25.根据权利要求16-18任一项的药物组合物，用于治疗黑素瘤。26.根据权利要求16-18任一项的药物组合物，用于治疗骨肉瘤。27.根据权利要求16-18任一项的药物组合物，用于治疗腺癌。28.根据权利要求16-18任一项的药物组合物，用于治疗白血病。29.根据权利要求16-18任一项的药物组合物，用于治疗成胶质细胞瘤。30.—种通过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡导致肿瘤细胞死亡的体外方法，包括氰生成系统和氧化应激诱导系统的组合。31.根据权利要求29的方法，其中所述氰生成系统包含亚麻苦苷酶-亚麻苦苷系统。32.根据权利要求29的方法，其中所述氧化应激诱导系统包含葡萄糖氧化酶的活性。33.根据权利要求29的方法，其中所述氧化应激诱导系统包含葡萄糖氧化酶的活性并且氰生成系统包含亚麻苦苷酶-亚麻苦苷系统。34.根据权利要求29-32任一项的方法，其中使用包含亚麻苦苷酶和/或葡萄糖氧化酶基因的一种/多种栽体。35.根据权利要求29-32任一项的方法，其中使用纯化的亚麻苦苷酶和/或葡萄糖氧化酶蛋白或所述蛋白的衍生物、类似物或片段中的任何物质。36.根据前一权利要求的方法，其中所述蛋白的任一种或两种蛋白被插入到控释系统中。37.根据权利要求34-35任一项的方法，其中所述蛋白的任一种或两种蛋白与肿瘤抗原的特异性抗体结合。全文摘要本发明涉及一种能够通过激活胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡而杀死肿瘤细胞的系统，包含I.组合在单个组合物中的该氰生成系统和氧化应激诱导系统，其中该氰生成系统包含通过亚麻苦苷酶对亚麻苦苷所发挥的酶活性，该氧化应激诱导系统包含葡萄糖氧化酶的氧化活性，或II.存在于独立组合物中的氰生成系统和氧化应激诱导系统，其中该氰生成系统包含通过亚麻苦苷酶对亚麻苦苷所发挥的酶活性，该氧化应激诱导系统包含通过葡萄糖氧化酶发挥的氧化活性。文档编号C12N9/24GK101395268SQ200680053290公开日2009年3月25日申请日期2006年12月22日优先权日2005年12月23日发明者M·伊兹奎尔多罗尤,R·加吉尼,V·加西亚-艾斯库德罗巴尔拉斯申请人:马德里自治大学