专利名称：一种天然aflp接头制备的方法
技术领域：
本发明是采用基因工程方法，利用引入酶切位点构建重组载体，由质粒天然扩繁接头，最后制作出用于AFLP实验的接头。
背景技术：
近十年来，大量的分子标记技术用于分子生物学的研究，如基因组分析、基因克隆、品种鉴定、外源基因导入。最早用来做图的分子标记技术是RFLP，目前已构建了大批的RFLP图谱。但是，RFLP技术比较费时，难以分析大量的DNA，而且遗传图饱和度低，分子标记间距离比较大，不利于定位克隆。
1990年以来，发展了RAPD、DAF、AP-PCR技术，这些方法主要根据PCR技术，用随机引物扩增DNA，在不需要知道DNA序列情况下，产生DNA片段的指纹模式，这些方法最大的缺点是它们对反应条件非常敏感，重复性差，因而限制了其应用。
近年来，发展了一种新的DNA指纹技术，叫做AFLP技术(Amplified fragmentlength polymorphisms)。这种技术是由Zabeau发现，并由Vos发展起来。AFLP技术是一种选择性扩增限制性片段的方法，这种方法由于结合了RFLP和PCR的优点，具有比RAPD更大的优越性。自从AFLP技术问世以来，已广泛用于基因鉴定、基因作图、基因表达等方面，该方法有着广阔的应用前景。
AFLP技术是一项新的分子标记技术，其原理是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后把接头DNA与酶切的基因组DNA片段进行连接，再把接头序列作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。这项技术包括三个步骤1.DNA被限制性内切酶切割，然后与AFLP聚核苷酸接头(adaptor)连接；2.利用PCR方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的限制性片段，经过多次循环，可使目的序列扩增到0.5～1μg；3.利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段。利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下，可在一次单个反应中检测到大量的片段。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记。所以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。
本申请人的CN200410065679.制备DNA接头的方法，公开了选择有一个多克隆位点的长度100bp-100K常用质粒，以此质粒为模板设计引物，通过突变PCR方法构建突变质粒，在ScaII和多克隆位点之间的片段引入新的酶切位点分别构建两种突变质粒或在质粒中引入新的多克隆位点和单酶切位点SacII，得到突变质粒pGAT4，导入细菌扩增，最后酶切分离得到目的接头。但AFLP技术中仍需要新的接头及合成方法。
引物和接头合成是AFLP技术中重要的步骤，AFLP技术成功的关键所在就是接头能否与酶切产物进行很好的连接，AFLP是一个技术性很强的操作，其中接头的制作与连接是实验能否取得成功的关键因素，引物和接头的改进是AFLP较RAPD、RFLP最主要的变革。目前引物和接头多采用化学合成法，原理是人工合成两个20-30bp的寡核苷酸，寡核苷酸大部分序列是完全匹配的，然后把两个寡核苷酸在90多度的高温下变性后再降低温度退火变性，匹配的区域可以形成双链结构，末段不匹配的区域就成为一个酶的粘性末段，其特点是合成迅速，可以大量制备，但是其也有明显的缺点，就是变性退火后的产物是一个混杂的分子，虽然大部分的寡核苷酸都成为双链，但是仍然存在大量的寡核苷酸单链片段，影响到接下来的与基因组酶切产物的连接，连接效率不高。为此，我们采用基因工程手段，利用细菌天然扩增AFLP所用的接头，是对化学人工合成接头的一个很好的弥补。
发明内容
本发明目的是应用现代基因工程方法解决现有的化学合成法制作AFLP的接头连接效率低，接头的纯化困难以及两个接头不能完全等量连接的问题。
本发明的目的还在于通过选取目标接头序列，用PCR扩增引入酶切位点的方法，构建重组质粒包含AFLP接头核心序列，同时为使串联多拷贝接头稳定，在核心序列两边连上不同侧翼序列，通过质粒扩增天然接头，最后酶切得出接头，该接头天然纯净，两个接头等量，完全双链，是一种简便、高效、适用范围广泛的接头制备方法。
本发明的目的是这样实现的，制备AFLP接头的方法，首先选择质粒DNA作为载体，利用两个互补的DNA作为引物，且这两个引物序列中有AFLP需要的酶切位点EcoR I/Mse I、Apa I/Taq I酶切位点或其他的酶切位，通过PCR方法，扩增出具有酶切位点EcoR I和Mse I、Apa I和Taq I的接头核心区域序列，把核心区域序列连入pGEM-T载体，同时在核心区域序列的两翼加上不同的Genome DNA片段各构建成接头单元序列，然后把不同的接头单元序列通过pBluescript KS载体串联起来，构建为含有多拷贝接头DNA的载体，再导入大肠杆菌内天然扩增接头，最后利用EcoRI和Mse I、Apa I和Taq I酶切出接头序列，得到两个等摩尔量的AFLP天然接头DNA。
本发明所述选取的两个互补的DNA引物，这个引物序列构成接头的核心序列，且这段序列符合引物设计的要求，不含二级结构，这两个引物互为引物和模板，利用PCR技术扩增片段，把这个接头核心片段克隆连接到T载体。
本发明在质粒载体上引入AFLP中使用的酶切位点的序列，在核心区域侧翼加上不同的Genome DNA片段，这样每个单元序列都是核心区域相同，侧翼序列不同。把接头序列通过不同的酶串联起来，成为多拷贝接头，且引入了不同侧翼序列，使载体更稳定，最后用这两个酶切DNA片段后，就成为两个天然的接头。引入AFLP实验中所使用的EcoR I/Mse I、Apa I/Taq I酶切位点或其他的酶切位点，从而制备AFLP所使用的接头或者其他的双链DNA接头。
采用PCR扩增的方法用引物扩增出接头的核心区域，然后把这个含有接头序列的核心片段连到一个载体上构建成一个重组的载体，在核心区域两翼连上不同的片段成为不同的单元，再用基因工程方法把不同的单元串联起来，然后让载体在大肠杆菌里大量的天然繁殖，最后提取重组质粒后用相应的酶切质粒，即可得到等摩尔量的两个含有不同酶切位点的接头。
本发明提出了一种天然AFLP接头制备的方法，系采用PCR扩增的方法，用引物扩增出接头核心序列，同时为使串联多拷贝接头稳定，在核心序列两边连上不同侧翼序列，通过质粒扩繁天然接头，最后酶切得出接头，该接头天然纯净，两个接头等量，完全双链，是一种简便、高效、适用范围广泛的接头制备方法。
图1是本发明的流程示意图1制备AFLP接头通过PCR方法，扩增出具有酶切位点EcoR I和Mse I的接头核心区域序列，把核心区域序列连入pGEM-T载体的示意2是本发明的流程示意图2在核心区域序列的两翼加上不同的基因(Genome)DNA片段各构建成一个接头单元序列，然后把不同的接头单元序列通过pBluescriptKS载体串联起来，构建为含有多拷贝接头DNA的载扩增，酶切出接头序列的示意图。
具体实施例方式
1.首先选择两段互补的单琏引物DNA序列，各60-70bp，互补的序列中含有接头核心序列和AFLP所需要的两种内切酶，如最常用的酶EcoR I和Mse I，单链DNA互为引物和模板进行PCR扩增，扩增后的片段连入T载体中，得载体pGT-L然后测序验证序列的正确性。
2.用Spe I和Pst I酶切水稻基因组DNA，割胶回收100bp左右的片段，同样的用Nco I和Sac II酶切水稻基因组DNA，割胶回收100bp左右的片段。
3.用Spe I和Pst I酶切pGT-L载体，回收大片段后与2中的相应100bp小片段进行连接，挑选不同的克隆进行测序验证，选择插入序列不含任何酶切位点的克隆，得pGT-L-C载体。
4.对不同的pGT-L-C载体进行Nco I和Sac II酶切，分别回收载体大片段，再与同样酶切水稻基因组回收的DNA进行连接，挑选不同的克隆(pGT-L-2C)进行测序，选择核心区域的两翼序列是不同片段的克隆进行下一步的构建。(图1)5.用引物和酶切手段使不同的单元序列末段加上同样的酶切位点，如图所示，共五种酶被用于这个构建，分别是Xho I、Kpn I、BamH I、Apa I、Sac I，这样就得到五个只有含有不同粘性末段和不同侧翼序列的单元片段。
6.对pBluescript Ks载体进行Xho I酶切，碱性磷酸酶进行去磷酸化处理，然后与Xho I的粘性末段的单元片段进行连接，筛选重组子pGT-L-C-1A，对重组子再进行酶切，重复以上步骤，即依次采用Kpn I、BamH I、Apa I和Sac I酶切，碱性磷酸酶进行去磷酸化处理重组子，依次把五个不同单元片段都连入载体中，得到重组载体pB1-L-2C-5A。
7.这样五个拷贝接头的单元片段就已经构建在同一载体中了，利用大肠杆菌的天然扩增来大量繁殖含有多拷贝接头的重组载体，提取含有接头的天然质粒，用PvuII酶切出整个串联的接头序列1.8Kb左右，割胶回收DNA片段。
8.用Sph I和EcoR1与Mse I酶切这个串联接头序列，则各接头之间分开，所需要的EcoR1与Mse I粘性末段显露，然后用酶切纯化试剂盒纯化酶切后的片段，侧混杂的小于50bp的小片段都被去除，得到的是150bp左右的等摩尔的两个接头的混合物。(图2)
权利要求
1.天然AFLP接头的制备方法，其特征是首先选择质粒作为载体，利用两个互补的DNA作为引物，且这两个引物序列中有AFLP需要的酶切位点EcoR I/Mse I、Apa I/Taq I酶切位点或其他的酶切位点，通过PCR方法，扩增出具有酶切位点EcoRI和Mse I、Apa I和Taq I的接头核心区域序列，把核心区域序列连入pGEM-T载体，同时在核心区域序列的两翼加上不同的基因DNA片段各构建成一个接头单元序列，然后把不同的接头单元序列通过pBluescript KS载体串联起来，构建为含有多拷贝接头DNA的载体，再导入大肠杆菌内天然扩增接头，最后利用EcoR I和Mse I、Apa I和Taq I酶切出接头序列，得到两个等摩尔量的AFLP接头DNA。
2.根据权利要求1所述的天然AFLP接头的制备方法，其特征是选取的两个互补的DNA引物，引物序列构成接头的核心序列，这两个引物互为引物和模板，利用PCR技术扩增片段，把这个接头核心片段克隆连接到T载体。
3.根据权利要求1所述的天然AFLP接头的制备方法，其特征是选取两段互补的单琏DNA序列，各60-70bp，互补的序列中含有接头核心序列和AFLP所需要的两种内切酶，如最常用的酶EcoR I和Mse I，单链DNA互为引物和模板进行PCR扩增，扩增后的片段连入载体中。
4.根据权利要求1所述的天然AFLP接头的制备方法，其特征是选择Genome DNA为模板，用Spe I和Pst I酶切Genome DNA，割胶回收100bp左右的片段，同样的用NcoI和Sac II酶切Genome DNA，割胶回收100bp左右的片段；用Spe I和Pst I酶切pGT-L载体，回收大片段后与Nco I和Sac II酶切Genome DNA回收的100bp小片段进行连接，选择插入序列不含任何酶切位点的克隆，得pGT-L-C载体。
5.根据权利要求4所述的天然AFLP接头的制备方法，其特征是对不同的pGT-L-C载体进行Nco I和Sac II酶切，分别回收载体大片段，再与同样Nco I和Sac II酶切水稻基因组回收的DNA进行连接，挑选不同的克隆(pGT-L-2C)进行测序，选择核心区域的两翼序列是不同片段的克隆，进行下一步的构建。
6.根据权利要求5所述的天然AFLP接头的制备方法，其特征是对用引物和酶切手段使不同的单元序列末段加上不同的酶切位点，共5种酶被用于这个构建，分别是Xho I、Kpn I、BamH I、Apa I、Sac I，这样就得到五个只有含有不同粘性末段和不同侧翼序列的单元片段。
7.根据权利要求6所述的天然AFLP接头的制备方法，其特征是对pBluescriptKs载体进行Xho I酶切，碱性磷酸酶进行去磷酸化处理，然后与Xho I的粘性末段的单元片段进行连接，筛选重组子，对重组子再进行酶切，重复以上步骤，直到把五个不同单元片段都连入载体中，得到重组载体。
8.根据权利要求7所述的天然AFLP接头的制备方法，其特征是利用大肠杆菌天然繁殖含有接头的质粒，5个拷贝接头的单元片段就已经构建在同一载体中了，提取大肠杆菌中天然的质粒，用Pvu II酶切出整个串联的接头序列，割胶回收DNA片段。
9.根据权利要求8所述的天然AFLP接头的制备方法，其特征是用Sph I和EcoR1与Mse I酶切串联接头序列，则各接头之间分开，所需要的EcoR1与Mse I粘性末段显露，然后用酶切纯化试剂盒纯化酶切后的片段，侧混杂的小于50bp的小片段都被去除，得到的是150bp左右的等摩尔的两个接头的混合物。
全文摘要
天然AFLP接头的方法制备，选择质粒作为载体，利用两个互补的DNA作为引物，且这两个引物序列中有AFLP需要的酶切位点EcoR I/Mse I、Apa I/Taq I酶切位点或其他的酶切位点，通过PCR方法，扩增出具有酶切位点EcoR I和Mse I、Apa I和Taq I的接头核心区域序列，把核心区域序列连入pGEM－T载体，同时在核心区域序列的两翼加上不同的基因DNA片段各构建成一个接头单元序列，然后把不同的接头单元序列通过pBluescript KS载体串联起来，构建为含有多拷贝接头DNA的载体，再导入大肠杆菌内天然扩增接头，最后利用EcoR I和Mse I、Apa I和TaqI酶切出接头序列，得到AFLP接头DNA。
文档编号C12N15/66GK101037685SQ200710020069
公开日2007年9月19日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者田大成, 江海洋, 唐萍 申请人:南京大学