专利名称：：一种具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及核苷酸,具体涉及一种具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸及其应用。技术背景MicroRNA(简称miRNA)是存在于真核生物中的一类长度约为22nt的非编码小分子RNA，参与基因转录后水平调控，呈现出组织特异性或发育阶段特异性表达特征。MicroRNA基因存在于基因组的基因间隔区或内含子中，通过与靶mRNA序列的3'非翻译区或编码区以碱基互补配对的方式来执行对耙mRNA的转录翻译抑制的功能，从而调控基因的表达。随着生物信息学的迅猛发展和基因克隆技术的不断改进，已经在生物体内发现了大量的miRNA，并且建立了miRNA数据库(http:〃丽.sanger.ac.uk),其中包括了人类已经发现的533个miRNA。miRNA能够通过两种不同的机制指导RISC下调目的基因的表达mRNA剪切和翻译抑制。miRNA与其靶基因的互补程度决定了它以何种机制沉默耙基因。一旦miRNA组装进入效应复合物RISC,当其与耙mRNA几乎完全互补时就指导mRNA特异性切割，引发靶mRNA的降解；当互补程度较低时就指导mRNA翻译抑制。反义技术(antisensetechnology)是一种根据碱基互补原理，用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片段(或其化学修饰产物)，阻断从基因到蛋白质的信息流，以达到抑制或阻断基因表达的目的。反义核酸主要指反义RNA、反义DNA(AS0DN)以及核酶，反义技术是一种新的药物开发方式，利用这一技术研制的药物称反义药物，通常指反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide)。
发明内容本发明的目的之一是提供一种具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸，本发明所提供的具有抗白血病作用的microRNA反义寡核苷酸，包含如下所示的序列SEQN0.2s5'-actcaccg織gcgttgaatgtt-3'。所述的具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸可以经过不同的化学修饰，如甲氧修饰、硫代修饰。本发明的另一目的是提供这种具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸在制备治疗白血病药物中的应用。所述的应用是将所述的核苷酸按本领域常用的方法制成各种制剂。本发明所述的具有抗白血病作用的miR-18la反义寡核苷酸的序列是根据白血病细胞K562中的miR-181a序列设计的反义寡核苷酸序列(Antisense-microRNAs-oligonucleotides，AM0)。所以相对应地，5'actcaccgacagcgttgaatgtt-3,在本发明中称为■-miR-181a。本发明所述的具有抗白血病作用的microRNA反义寡核苷酸能够有效地抑制白血病细胞中的miR-21和miR-181a这两种基因的表达，促进白血病细胞凋亡，从而能够有效地治疗白血病。并且抑制效果呈现明显的量效关系，经实验证明，AM0浓度为0.6Pmol/L时对白血病细胞生长的抑制效果为最佳。图1为不同浓度AM0对白血病细胞K562的生长抑制作用(72h)图。图2至图5为AMO(0.6umol/L)作用于白血病细胞K56224h对细胞周期的影响图(其中p2:subG1;P3:G。/G1;P4:S;P5:G2/M，图2为随机对照组，图3为空白对照组，图4为AM0-miR-181a组，图5为AM0-miR-21组)。图6至图9为AMO(0.6ixmol/U作用于白血病细胞K56248h对细胞周期的影响图(其中p2:subG"P3:G。/G"P4:S;P5:G2/M，图6为AM0-miR-21组，图7为AM0-miR-181a组，图8为空白对照组，图9为随机对照组)。图10为同时间AM0对白血病细胞K562的生长抑制作用(0.6umol/L)图。具体实施方式实施例l本发明的反义寡核苷酸(以下简称AMO)的制得白血病细胞K562的miR-21序列为5'-uagcuuaucagacugauguugac-3'(23bp);泳图上不仅能看到清晰的基因组DNA，而且还有一条清晰、分子量约0.75kb的质粒带(图1)。通过VersaDocImagingSystem3000凝胶成像系统(Bio-Rad,USA)的QuantityOne软件分析表明，在节旋蓝细菌裂解液CTAB及第一次沉淀后的DNA溶解液中加入适量的蛋白酶K，可将质粒的提取率提高近3倍，从而电泳条带清晰、能满足后续研究现需。同时，为满足节旋蓝细菌质粒的测序、结构与功能等后续研究需要，有必要对其作进一步富集与纯化。我们试用了一些常用的纯化与回收试剂盒，但纯度和回收率等均不理想。经反复试验与改进，我们建立了一种将凝胶冻融与高速离心等技术相结合的方法，即凝胶冻融-高速离心纯化法。用此法纯化的质粒(图1)，电泳条带的单一，说明纯度高；形状与位置不发生变化，说明分子结构完整；用凝胶成像系统对纯化前后质粒电泳条带作检测分析表明，回收效率高达90%以上。本发明的显著优点本发明所建立的节旋蓝细菌质粒分离与纯化方法与常规方法相比，具有操作简便、得率高、质量好、结构完整等特点。图1为利用不同提取方法提得节旋蓝细菌品系Ap-2mz总DNA的电泳图，其中M为标准分子量1表示CTAB-蛋白酶K法；2表示CTAB法；3表示SDS法；图2为从节旋蓝细菌品系Ap-2mz中纯化的质粒的电泳图；其中M为标准分子量l表示纯化的质粒；图3为利用CTAB-蛋白酶K法从被试节旋蓝细菌品系Ap-JS10m中提取的总DNA和纯化的质粒的电泳图，其中M为标准分子量1表示总DNA;2表示纯化的质粒。具体实施方式本发明的详细技术方案可以通过以下步骤实施1、选用材料为公知的节旋蓝细菌品系Ap-2mz、Ap-JS10m(浙江大学原子核农业科学研究所生物资源与分子工程实验室也有保存)。2、试剂和仪器琼脂糖、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、SDS(十二垸基磺酸钠)、微孔离心柱(SK131/132柱)为上海生工生物工程公司产品；蛋白酶K为Merck公司产品；RNaseA均为日本TaKaRa公司产品；其它试剂均为分析纯。凝胶电泳分析系统为美国Amersham公司产品；凝胶成像分析系统为美国Bio-Rad公司产品。3、节旋蓝细菌质粒的分离提取(1)取约250mg新鲜藻泥或冰冻保存的藻泥(或冰冻保存的干燥藻粉约15mg)于灭菌的5ml离心管中，先用液氮对样品冻融处理35次后，加入2ml预热至65'C的CTAB提碘化丙啶(PI)Sigma公司美国2.试剂配制2.1Lipofectamine2000:4。C保存。2.2Antisense-microRNAs-oligonucleotides(AMO):设计实施例1中所述的针对白血病细胞K562中miR-21和miR-181a的反义寡核苷酸序列AMO-miR-21和AMO-miR-181a:序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，PAGE纯化，于-20。C保存。用无血清的RPMI-1640培养基溶解配制成100uniol/L储存溶液，置-20。C备用，用时稀释成所需的使用浓度。2.3含酚红RPMI-1640培养基RPMI-1640干粉(10.4g/包)，用三蒸水溶解，加入碳酸氢钠2.0g，HEPES5.0g,磁力搅拌仪充分搅拌，定容至IOOOmL，过滤除菌，分装，4。C保存。2.4RPMI-1640液体培养基过滤除菌，分装。2.5新生牛血清56°C、30min灭活，分装于25mL小瓶中，-20°C保存。配制新鲜RPMI-1640液时，每180mL培养液加入血清20mL，使最终细胞培养液中血清的体积分数为10%。2.60.2%台盼蓝工作液称取0.2g台盼蓝粉，用100mLPBS(pH7.2)溶解。2.7■酶配制成IOmg/mL的储存液，_20°0保存，使用时配制成工作液浓度。2.8碘化丙锭(PI)染液称取20ug碘化丙啶，加入1000mL生理盐水，即20ug/L浓度，分装，4°C避光保存。3主要仪器3.1DL-2型台式低速离心机(北京医用离心机厂)3.2C02培养箱(ThermoForma,美国)3.3超净工作台(苏州净化设备厂)3.4微量加样器(0.5-10uL，1-20uL，10-100uL,50-200uL，200-1000iiL,Eppendorf，德国)3.5DS-IB倒置显微镜(重庆光学仪器厂)3.6NeubauerImproved细胞计数板(CarlRothGmbH&Co.KG，德国)3.7流式细胞仪(Elite,Coulter公司，美国)4实验方法(1)细胞培养白血病细胞K562用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基于37°C、体积分数为5%0)2培养箱，饱和湿度条件下培养，0.25%的胰酶常规消化传代，2-3天传代一次。实验选用对数生长期、0.2%台盼蓝拒染率〉95%的细胞接种于培养板，加入LipofectamineTM2000-AM0反义核酸，每组药物均设3个复孔。(2)Lipofectamine2000与AMO复合物的配制单独的AM0-miR对细胞的转染效率不高，需要一种合适的转染载体介导才能提高AM0-miR的作用效果使之进入细胞发挥更好的作用效果。我们采用Lipofectamine2000来作为转染载体。Lipofectamine2000与AMO按质量比为2.5:1配制，即取所需AMO量，计算所需Lipofectamine2000的量，分别用无血清培养液配制，将Lipofectamine2000缓慢加入AMO中，充分混匀，室温静置30min,即得Lipofectamine2000-AMO复合物。取对数生长期白血病细胞K562，用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为5X10、ells/mL接种于96孔培养板，每孔100uL(每孔5000个细胞)，加入药物后终体积为150pL。实验分为4组AMO-miR-21组、AMO-miR-181a组、随机对照组组、空白对照组Lipofectamine2000与AMO的质量比为2.5:1，白血病细胞株K562每组AM0终浓度均分别为0.1umol/L、0.2umol/L、0.3nmol/L、0.6umol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的Lipofectamine2000，置37°C,体积分数为5%C02培养箱转染6h，加入含血清培养基分别培养24h、48h、72h。选AMO终浓度均为0.6umol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的LipofectamineTM2000，置37。C,体积分数为5%C02培养箱分别培养72h。(3)PI单染流式细胞仪检测经AMO作用后，K562细胞周期及亚二倍体峰百分率变化情况取对数生长期白血病细胞K562用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1.2X105Cells/mL，接种于24孔培养板，各组均设四复孔。加入无血清含AM0的RPMI-1640培养液后，每孔终体积500pL，置孵箱转染6h后，每孔加入500uL含20%血清RPMI-1640培养液继续培养。共设4组AMO-miR-181a、AM0-miR-21组、随机对照组和空白对照组。Lipofectamine2000与AMO的质量比为2.5:1，每组AM0终浓度为0.6umol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的Lipofectamine2000，分别培养24h、48h、72h,倒置显微镜下观察后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，预冷PBS洗涤3次后，用70%(v/v)乙醇于4°C固定过夜。上机前用预冷PBS洗涤3次后，加入碘化丙锭染色液(含RNA酶)，终浓度50"g/mL，避光染色30min，流式细胞仪分析细胞DNA含量的变化，每个样本随机分析5000个细胞,得到各组细胞亚二倍体峰百分率和各组细胞生长周期比例。(4)统计学分析所有数据采用均数土标准差(i土s)表示，使用统计软件SPSS11.5，各组均数比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)。尸<0.05表示差异有统计学(5)实验结果实验发现，对于白血病细胞K562，AMO-miR-21和AMO-miR-181a在浓度为0.2uM时即发挥了抑制作用；0.3umol/L，0.6umol/L时抑制效果更明显，最佳作用浓度为0.6umol/L，呈现出明显的量效关系。终浓度0.6umol/L的AMO-miR-21和AMO-miR-181a转染白血病细胞K56272h时，与随机对照组相比较，对细胞生长产生明显的抑制作用，且随着作用时间的增加，其抑制效果逐渐增强(如图l所示)。终浓度为0.6umol/L的AMO作用于白血病细胞K562，AMO-miR-21和AMO-miR-181a在培养48h时开始对细胞的生长出现抑制作用，且随着作用时间的增加，其抑制效果逐渐增强。72h时作用效果十分明显，有明显的时效关系(如图1O所示)。流式细胞仪分析各组DNA含量的细胞周期分析图中，P2峰代表亚二倍体峰，代表DNA含量不足二倍体的细胞，用来估计凋亡细胞的比例;P3峰代表处于G。/G期的细胞，P4峰代表处于S期的细胞，P5峰代表处于G2/M期的细胞。AMO转染白血病细胞K56224h、48h、72h后(AMO终浓度为0.6nmol/L)，与随机对照组相比，AMO-miR-21组和AMO-miR-181a组凋亡峰十分明显，有显著的统计学差异(尸〈0.05)(见表1)，细胞周期中各时期所占细胞周期的比例如表2所表lAMO(0.6umol/L)作用于白血病细胞K562不同时间亚二倍体峰所占细胞周期的<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*与随机对照组相比较，p<0.05表2AMO(0.6Pmol/L)作用于白血病细胞K562不同时间对细胞周期的影响(％:牙士<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>，n=3〉<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>AMO-miR-21组19.68±1.01*49.39±2.6523.55±1.258.12±0.46AMO-miR-181a组22.39±U6*51.27±2.7020.96±U15.11±0.2748h空白对照组32.01±1.6749.12±2.6323.65±1.267.99±0.45随机对照组33.27±1.7650.61±2.6819.87±1.015.68±0.31AMO-miR-21组44.39±2.30*47.64±2.5215.58±0.814.33±0.26AMO-miR-181a组38.62±2.01*46.59*2.4715.01±0.783.39±0.1972h空白对照组18.52±0.9440.01±2.1221.31±1.096.57±0.37随机对照组24.03±1.2340.24±2.1318.38±0.986.34±0.36AMO-miR-21组32.33±1.68*38.16±2.0214.65±0.782.67±0.14AMO隱miR-181a组35.17±1.83*34.61±1.8918.13±0.988.04±0.45从上述结果可以看出AMO-miR-21与AMO-miR-181a可以有效促进白血病细胞K562的凋亡，从而抑制白血病细胞的生长。SEQUENCELISTING〈110〉暨南大学<120〉一种具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸及其应用〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉22〈212〉DNA<213>AMO-miR-21序列<400〉1tcaacatcagtctgataageta22<210〉2〈211>23<212>DNA〈213〉AMO-miR-181a序列〈400〉2actcaccgacagcgttgaatgtt2权利要求1、一种具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸，其特征是，包含如下所示碱基序列5′-actcaccgacagcgttgaatgtt-3′。2、根据权利要求1所述的具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸，其特征是，所述反义寡核苷酸经过化学修饰。3、根据权利要求2所述的具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸，其特征是，所述的反义寡核酸经过硫代修饰。4、根据权利要求2所述的具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸，其特征是，所述的反义寡核酸经过甲氧修饰。5、权利要求14任意一项所述的具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸在制备治疗白血病药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸及其应用，本发明所述的具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸，包含如下所示碱基序列5′-actcaccgacagcgttgaatgtt-3′。本发明所述的具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸能够有效地抑制白血病细胞K562中的miR-21和miR-181a这两种基因的表达，促进白血病细胞凋亡，从而能够有效地治疗白血病。并且对白血病细胞K562的抑制效果呈现明显的量效关系。文档编号C12N15/11GK101215561SQ20071003281公开日2008年7月9日申请日期2007年12月26日优先权日2007年12月26日发明者兰菲菲,誉刘,嘉费申请人:暨南大学