专利名称：一种提高植物氮素营养利用率的专用载体与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种提高植物氮素营养利用率的 专用载体的构建及其应用。
背景技术：
氮是植物重要的营养元素，植物吸收的氮素形态主要有无机态氮(硝态氮和 铵态氮)和有机态氮(如尿素、各种氨基酸等)。虽然各种形态氮吸收利用的形式 是不同的，但进入植物体后都要经过谷氨酸或谷氨酰胺的转氨作用形成不同的 氨基酸，进而最终合成蛋白质。氮素的吸收和同化与植物的很多生理过程(如光
合作用、光呼吸等)、产量和品质紧密相关(刘文国，范学科，马安良.2002.植 物体对氮吸收和同化过程的研究进展.杨凌职业技术学院学报.1(2) :17-19)。 氮是植物生长的限速因子，植物如果缺乏氮营养，不仅蛋白质、核酸、磷脂等 物质的合成受阻；而且植物生长矮小，分枝、分蘖很少，叶片小而薄，花果少 而易脱落。缺氮还会影响叶绿素的合成，使枝叶变黄，叶片早衰甚至干枯，从 而导致作物生长不良，产量降低。因此所有农作物的生长都需要施用无机氮肥。 植物从环境中获得的氮大都是以无机盐形式存在(主要是硝酸盐和铵盐)，植物 无法直接利用这些无机盐形式的氮，必须将其转化成有机态的氮或有机氮化合 物才能被植物利用。氮同化过程是植物的基本生理过程之一。其主要途径是经 过硝酸盐还原为铵后直接参与氨基酸的合成与转化，接着进行蛋白质合成，最 后经过蛋白质的修饰、分类、转运及储存等过程成为植物有机体的组成部分。 此外，氮同化过程还与植物的碳代谢等相互协调，共同成为植物生命活动的基 本过程(Song JM， Tian JC， Zhao SJ. 1998. Relationship between photosynthetic carbon and nitrogen metabolism in plants and its regulation, /7a/7t尸力y57W 6b顺"/7. 34:230-238)。
氮素又是世界农业生产中消耗量和浪费量最大的元素之一。氮肥通常是在 高温高压下生产的，需要消耗大量能源(煤炭、石油等)；而农业生产中施用的 氮肥只有30%左右可以被农作物吸收，其余大部分进入地下水，造成水体和环 境污染。此外，长期施用化肥还造成土壤板结，严重影响农业的可持续生产。 随着人口数量激增、能源危机、环境污染等世界性难题的加剧，如何提高植物 的氮素利用效率成为当前植物营养学的研究热点。Clark等(Clark RB， Duncan RR. 1991. Improvement of plant mineral nutrition through breeding.尸j'e7t/ Crapyfes. 27:219-24)指出人类在通过施用化肥改变土壤环境满足植物需要 方面取得了巨大成绩，但这种途径并不是最实用和经济的办法，可以运用遗传 学方法提高植物对土壤环境逆境的适应性。这种办法不仅可以降低生产成本、 减少环境污染，而且对动物和人类的健康有益。可见选育出耐瘠薄或具有高氮 素利用效率的新品种用于农业生产势在必行。
Dof (DNA binding with one finger)蛋白是植物所特有的一类转录因子， 在果蝇、美丽线虫和酿酒酵母的基因组中尚未发现有A/基因的存在(Riechmann 几，Heard J， Martin G， Reuber L， Jiang C， Keddie J， Adam L， Pineda 0, Ratcliffe 0J， Samaha RR， Creelman R， Pilgrim M， Broun P， Zhang JZ， Ghandehari D， Sherman BK， Yu G. 2000. Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes. ■ 6bie/ ce. 290:2105-2110)。它含有一个独特的富含Cys残基的单锌指保守结构域命名为 Dof结构域(Yanagisawa S. 1995. A novel DNA binding domain that may form a single zinc finger motif.爆h.c 23:3403-3410)。目前，已
在多种单子叶植物和双子叶植物中发现了 Dof蛋白，研究表明它们在高等植物 的基因表达调控中起重要作用(郭晓芳，严海燕.2005.植物中的Dof蛋白和Dof 转录因子家族.植物生理学通讯.41 (4) :419-423)。 Dof蛋白通常包含两个主要 的结构域N末端保守的DNA结合结构域和位于C末端的调控结构域。在这两个 结构域之间通常还有一个Ser骨架，可能作为分子绞链连接这两个结构域 (Yanagisawa S. 2002. The Dof family of plant transcription factors. Zre/7&尸hM5b丄7(12) :555-560)。 N末端的Dof结构域由52个氨基酸组成， 并且高度保守。在此结构域中CX2CX21CX2C基序形成一个单锌指结构，Zn"可与 单锌指结构中4个Cys残基共价结合。而C末端转录调控结构域的氨基酸序列 较为多变，不具保守性。
在多种植物的基因启动子区都发现有Dof蛋白结合元件，这表明Dof蛋白 有多种功能，参与植物多种生命活动的调控。玉米Dofl是一系列光应答基因如 C4植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC) 基因的调控元件(Yanagisawa S. 2000. Dofl and Dof2 transcription factors are associated with expression of multiple genes involved in carbon metabolism in maize.尸Z3/2f / 21:281-288) 。 Dof蛋白还参与调控植物激素 应答基因的表达，如烟草的Dof蛋白NtBBFl在顶端分生组织和微管组织中是生 长素诱导表达的植物癌基因rolB的激活因子(Isabel-LaMoneda I， Diaz I， Martinez M， Mena M， Carbonero P. 2003. SAD: a new DOF protein from barley that activates transcription of a cathepsin B—like thiol protease gene in the aleurone of germinating seeds, 尸7朋t 乂 33(2): 329-340)。
碳代谢和氮代谢之间存在紧密的联系，植物对氮素的利用不仅需要氮元素， 而且需要大量由碳代谢产生的碳骨架a -酮戊二酸(a -0G)。因而调节植物碳骨 架的产生过程可能也是一种改善植物氮吸收的潜在途径。对于由碳水化合物代
谢产生a—酮戊二酸的途径来说，丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)和磷酸烯 醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是两个关键酶。 而Dof 1转录因子是丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因等一系列与有机 酸合成相关基因表达的激活剂，Dof蛋白的这种特定调控功能，为采用基因工程 改良农产品品质和植物生长特性提供了可能。
随着现代遗传学的发展，通过基因操作的方法来改良作物的农艺性状是提 高植物产量的新途径。通过在植物中过量或异位表达植物氮素同化或氮素同化 过程中的相关酶，不仅可以提高植物对氮素营养的利用率和植物的产量，而且 还可以降低作物生产成本，减轻氮肥对环境的污染。玉米Dofl是碳骨架合成中 的关键调控因子，Yanagisawa利用CaMV35S启动子和玉米PPDK的启动子组成融 合启动子(35SC4PPDK)构建了一个玉米Zto/7基因的植物表达载体，利用该载体 转化拟南芥UraZuVo; w's tAs力'朋a， ecotype Columbia)，试验结果说明在拟 南芥中过量表达玉米Zfo/7基因可增强与碳骨架合成有关酶的表达，还可以提高 一些氨基酸的含量；另外，转"0/7基因的拟南芥植株中氮含量提高30%，改善 拟南芥在低氮条件下的生长(Yanagisawa S， Akiyama A， Kisaka H， Uchimiya H， Miwa T. 2004. Metabolic engineering with Dofl transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation and growth under low_nitrogen conditions. Proc Natl Acad Sci USA. 2004， 101 (20):7833—7838)。 1，5 二 磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表达量最大的蛋白质，这种蛋白质的含 量占植物细胞中可溶性蛋白的40-50%。 Rubisco的小亚基(rbcS)由细胞核基 因编码，控制rbcS基因表达的启动子为光诱导型启动子(PrbcS)， PrbcS的作 用有很强的组织特异性，需要光信号的诱导，在茎中有低水平的表达，在叶片 中的表达最强。用报告基因的研究结果表明在叶片中PrbcS的活性比CaMV35S 的高3-4倍，因此PrbcS是一种很强的光诱导型启动子(Jefferson等，1987; EMBO， 6:3901-3907)，在科研工作中PrbcS常被用来实现目的基因在叶片中的高 水平表达。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种提高植物氮素营养利用率的专用载体。
本发明所提供的用于提高植物氮素营养利用率的载体，是具有光诱导型启 动子和转录因子"o/7基因的植物表达载体。
上述载体中的"o/7基因来源于拟南芥C4raZ j'flbpw's tAsh'a/7a， ecotype Columbia)，其"o/7基因的GenBank登录号为AB017564。
上述载体中的Z o/7基因的上游添加的光诱导型启动子为Rubisco小亚基的 启动子。
用于构建本发明的专用载体的出发载体为pPZP221 (由Hajdukiewicz等构
建并提供，Hajdukiewicz et al， 1994， PMB， 25:984-),也可选用其它农杆菌 双元载体，如CAMBIA公司的pCAMBIA载体系列及其衍生载体。
本发明提供的专用载体用于提高植物氮素营养利用效率，将上述载体通过 农杆菌介导转化植物，获得氮素营养利用效率提高的转基因植物。其植物包括 单子叶和双子叶植物都适用，如烟草、水稻、大豆、小麦等。
试验结果说明在低氮营养条件下转基因烟草株高是对照烟草(未转基因的 野生型)的1. 1-1. 7倍;鲜重是对照烟草的1. 05-1. 3倍;干重是对照的1. 06-1. 3 倍。在低氮营养条件下，转基因烟草的丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 的活性分别是对照的5 15倍和1. 5 3. 2倍。
本发明的专用载体特别能提高植物(如烟草)在低氮营养条件下对氮素营养 的利用效率，可显著促进植物的生长，因而为植物品种改良提供了一条新途径。
本发明的专用载体由下述方法构建而成
一、 Zto/7基因的扩增和TA克隆
1、 从GenBank中査找拟南芥Zb/7基因的全长基因序列，并设计序列如下 的一对引物
dAl: 5， -CACCATGGATCTGACGTCAGC-3 ， (21 nt)
dA2: 5' -TCTAGATCAATTCTTCTCCATTCTGTTC-3' (28 nt)
5，端引物dAl，末端加CACC特征序列，并由此形成vVco[酶切位点；3'端
引物dA2，末端加酶切位点；以拟南芥第一链cDNA为模板扩增，得到Zfe/7
的全长cDNA;
2、 回收并纯化Zfe/7全长基因片段，并将其连接到pMD18-T (宝生物工程有 限公司(大连)，TaKaRa)载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA ，通过酶切检测获 得重组质粒pMD-Zfe/7;
二、 构建中间载体pUC118-PrbcS-承T
用Sphl把pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等构建并提供，Sugita et al.， 1987， MGG， 209: 247-256)中的rbcS-3C切除，并使载体自连接形成 pUC118-PrbcS-T，通过点突变技术在叶绿体定位序列的起始密码子附近引入 Ncol位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T;
三、 重组质粒pUC118-PrbcS-"o/7的构建
将PrbcS启动子连接到基因的5'端，用厥ol和Wal双酶切pMD-Z o/7 和pUC118-PrbcS_*T，并回收纯化Zfe/7基因片段以及载体大片段pUC118-PrbcS， 然后连接、转化、抽提质粒进行PCR扩增检测和酶切检测，获得重组质粒 pUC118-PrbcS-Zfe/7;
四、 植物表达载体pPZP211-PrbcS-Z o/7的构建
用历V dIII和J&I双酶切pUC118-PrbcS-Zfe/7和pPZP221 (由Hajdukiewicz等构建并提供，Hajdukiewicz et al， 1994， PMB， 25:984-)，回收纯化小片段 PrbcS-Zfe/7和大片段pPZP221，然后连接转化，挑选单克隆并抽提质粒，进行 PCR检测和酶切检测，获得重组的植物表达载体pPZP221-PrbcS-Zb/7。
在上述载体中，"o/7基因的上游添加有光诱导型启动子PrbcS。本发明使 用的光诱导型启动子(PrbcS)是从番茄的基因组中分离出来的rbcS-3C的启动 子，是一个由历'/7dlII切割产生的1.7 kb的DNA片断，已经亚克隆于pUC118 中(Sugitaet al. ， 1987， MGG， 209: 247-256),该亚克隆的质粒载体名称为 pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C。为了使"o/7基因表达后的产物能定位在叶片细胞质 中，本发明用限制性内切酶Sphl将pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切 割出来，然后用连接酶重新连接不含rbcS-3C的载体DNA片断，产生一个中间 载体pUC118-PrbcS-T，然后利用一对互补引物(图l)，通过点突变技在 pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入NcoI位点产生中间载体 pUC118-PrbcS-*T。
图l:中间载体 11(:118- 1"&3-*11的构建
用Sphl把pUC118-PrbcS-T-rbcS3C中的rbcS3C切除，并使载体自连接形成 pUC118-PrbcS-T，通过点突变技术在叶绿体定位序列的起始密码子附近引入 Ncol位点。
图2: pPZP221-PrbcS-Zto/7植物表达载体构建策略示意图。 图3:通过RT-PCR扩增得到Zfe/7基因Cdna
(A)拟南芥总RNA; (B)拟南芥RNA的RT-PCR。 M，入DNA/历/ din digest Marker。 1 3， Zto/7基因的PCR产物。 图4:重组质粒pMD-"o/7的检测
(A)电泳检测。M，正对照(分子量为3. 0 kb的质粒)；1-2，重组质粒pMD-"o/V 的DNA; (B)酶切检测。M， DNA Marker (DL2000); 1-3，用勘I和餘ol双酶 重组质粒pMD-"o/7。
图5:重组质粒pUC118-PrbcS-Zfe/7的检测
(A)酶切检测。M， DL2000 DNA Marker; 1-2，用Z6al和#coI酶切 pUC118-PrbcS-Zfe/7重组质粒；(B) PCR检测。M， DL2000 DNA Marker; 1 3， 以pUC118-PrbcS-Zfe/7为模板扩增的PCR产物。
图6:重组质粒pPZP221-PrbcS-Zfe/V的检测
(A) PCR检测。M， DNA Marker; 1 2，以pPZP221-PrbcS-Z^/7重组质粒 为模板扩增的PCR产物；(B)酶切检测。M， DNA Marker; 1 2，用历/ dl11和 酶切pPZP221-PrbcS-A /重组质粒。
图7:携带重组质粒pPZP221-PrbcS-Zto/7农杆菌的PCR检测 M， DNA Marker; 1 5，以pPZP221-PrbcS-Z^/Y重组质粒转化的农杆菌菌 落为模板扩增的PCR产物；+,正对照。
图8: "o/7基因在转基因烟草中的插入情况的检测
M， DNA marker; P，阳性对照；DR1， DR3， DR5， DR6， DR7:转"az7基因 的烟草株系；CK:负对照(未转基因的野生型烟草)。 图9: Zfe/7基因在转基因烟草中的转录水平的检测
M， DNA marker; P，阳性对照；DR1， DR3， DR5， DR6， DR7，转"。/7基因
的烟草株系；CK，负对照。
图10:转pPZP221-PrbcS-"o/7烟草PK酶活性测定
CK，负对照；DR1、 DR3、 DR5、 DR6、 DR7，转基因烟草株系。
图11:转pPZP221-PrbcS-Z o/7烟草PEPC酶活性测定
CK，负对照；DR1、 DR3、 DR5、 DR6、 DR7，转基因烟草株系。
图12:转基因烟草在低氮(A)和中氮(B)营养条件下的生长检测
CK，负对照;DR1、 DR3、 DR5、 DR6、 DR7，转基因烟草株系。
图13:转基因烟草在低氮(lmM)、中氮(5mM)、高氮(10mM)营养条件下生长
的株高测定
CK,负对照；DR1、 DR5、 DR6、 DR7，转基因烟草株系。
图14:转基因烟草在低氮(lmM)、中氮(5mM)、高氮(10mM)营养条件下生长 的生物量(鲜重、干重)测定
CK，负对照；DR1、 DR5、 DR6、 DR7，转基因烟草株系。
图15:转基因烟草幼苗(T2)在低氮(A)、中氮(B)、高氮(C)MS培养基上的生 长情况
CK，野生型烟草(WT-221); DR1、 DR5、 DR6、 DR7:转基因烟草株系。 图16:转基因烟草幼苗(T2)在低氮(lmM)、中氮(5mM)、高氮(10mM)MS培养
基上生长的株高测定
CK:野生型烟草(WT-221); DR1、 DR5、 DR6、 DR7:转基因烟草株系。 图17:转基因烟草幼苗(T2)在低氮(lmM)、中氮(5mM)、高氮(10mM)MS培养
基上生长的生物量(鲜重、干重)测定
CK，负对照；DR1、 DR5、 DR6、 DR7，转基因烟草株系。
图18:转基因烟草幼苗(T2)在低氮(lmM) MS培养基上生长的叶绿素含量测
定
CK，负对照;DR1、 DR5、 DR6、 DR7，转基因烟草株系。
具体实施例方式
试剂与仪器
试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基 因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转 录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连，TaKaRa)产品，质粒 提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂盒 购自invitrogen公司。其余试剂均为国产分析纯。
仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。 所有引物序列均在宝生物公司(大连)合成。本发明实施例中所用方法如 无特别说明均为常规方法。
实施例1、中间载体pUC118-PrbcS-T的构建 用质粒抽提试剂盒(博大泰克)纯化(按试剂盒说明书操作) pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C，用限制性内切酶SphI (Fermentas)将 pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等构建并提供，Sugitaetal.， 1987， MGG， 209: 247-256)中的rbcS-3C切割出来，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体 pUC118-PrbcS-T和rbcS-3C片段，回收4. 6 kb的载体pUC118-PrbcS-T，然后 用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接(按试剂盒说明书操作)不含rbcS-3C 的载体DNA片断，产生一个中间载体pUC118-PrbcS-T (图1)，用连接反应混 合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5ci，天根生化科技)，把转化 好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp, 100pg/ml)的平板上，于37°C过夜培 养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒，用Sphl进 行酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生一条4. 6kb条带，选 出连接成功的质粒载体pUC118-PrbcS-T，重新转化大肠杆菌DH5 a ，挑单个菌 落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。
实施例2、利用点突变技术在中间载体pUC118-PrbcS-T中引入Ncol位点 以纯化质粒pUC118-Prbcs-T为模板，根据叶绿体定位序列设计一对用于点 突变的互补引物(NcoI5和Nco13，图1)，委托TaKaRa合成。在点突变反应混 合液中加入25ng的纯化质粒pUC118-PrbcS-T作为模板，同时加入125ng的点 突变引物NcoI5和Nco13、 l]uldNTP (2.5 mM) ， 5|il的10XK0D反应Buffer和 lpl的K0D聚合酶(日本东洋纺)，加双蒸水使反应终体积为50pl。在PCR仪 上于95。C加热30秒，然后按照95。C、 30秒，55。C、 1分钟，68。C、 10分钟的 程序进行15个循环的反应，最后在68。C延长反应10分钟，合成含突变位点的 子链。反应完成后把反应混合液置于冰上冷却2分钟，向反应混合液加入lpl 的限制性内切酶Dpn I (10U/nl)和51的Dpn I反应缓冲液，于37°C保温1 小时，降解不含突变位点的母链。用反应混合液转化高效率(108)的大肠杆菌 感受态细胞(DH5a，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素 (Amp， 100lag/ml)的平板上，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落 中提取质粒，用NcoI (Fermentas)进行酶切检测，突变成功的质粒可被Ncol
切开并在琼脂糖凝胶电泳图上产生一条4. 6kb的条带,选出突变成功的质粒载体 PUC118-PrbcS-*T，重新转化大肠杆菌DH5 ct ，挑单个菌落进行液体培养，用试 剂盒纯化质粒。在pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入Ncol位 点后，为构建由启动子PrbcS控制，表达的目的蛋白定位在叶片细胞质中的目
的基因的植物表达载体奠定基础。
实施例3、专用载体pPZP221-PrbcS-"o/7的构建
专用载体pPZP221-PrbcS-Zfe/V的构建策略如图2所示，首选从GenBank中 査找拟南芥Z^/7的全长基因序列，并设计一对特异引物，以拟南芥第一链cDNA 为模板扩增得到化/7的全长cDNA，回收并纯化Zto/7全长基因片段，将其连接 到pMD18-T (宝生物工程有限公司(大连)，TaKaRa)载体上获得pMD-Zfe/7。用Ncol 和Xbal双酶切pMD-Dof 1和PUC118_PrbcS-*T，回收纯化基因片段以及载 体大片段pUC118-PrbcS，然后连接、获得重组质粒pUC118-PrbcS-Zfe/7。用 HindIII和Xbal双酶切pUC118-PrbcS-"o/7和pPZP221，回收纯化小片段PrbcS-化/7和大片段pPZP221，然后连接，获得重组载体pPZP221-PrbcS-"o/7，它含 有启动子PrbcS，其后紧接Zb/7基因。具体实施过程如下 一、"o/Y的cDNA扩增及TA克隆 从GenBank中查找拟南芥/fe/7的全长基因序列，并设计一对引物，序
列如下
dAl: 5， -CACCATGGATCTGACGTCAGC-3， (21 nt)
dA2: 5， -TCTAGATCMTTCTTCTCCATTCTGTTC-3， (28 nt)
5'端引物dAl，末端加CACC特征序列，并由此形成tVcoI醇切位点；3'端 引物dA2，末端加J&I酶切位点。
用TRIzoL Reagent (InvitrogerO从拟南芥(Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia)幼苗中提取总RNA，取植物嫩叶约0. lg，加入lml的TRIzoL 提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡 混匀，离心15min (12000rpm)，转移上清液至新管，加入0. 5ml异丙醇，混匀 室温放置10min, 4。C离心10min (12000rpm)，弃上清，沉淀用75X乙醇lml 清洗，4。C离心5min (7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20^1焦 碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit (TaKaRa)进行cDNA的合成，取植物总RNA约0. l|xg-5ng, oligo (dT) 50ng， lOmM dNTPmixlpl，用DEPC处理水补足至10iLi1,混匀后，短暂离心将之收集于管底， 置于65。C加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9pl (5Xreaction buffer 化l， 25rnM MgC12 4(il， 0. 1M DTT 2^1， RNA酶抑制剂l|til)，将上述混合物混匀， 短暂离心将之收集于管底，25t:保温2min，加入M-MuLV Reverse Transcriptase,将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25。C保温20min，
然后42。C保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用化/7基因上下游特异性 引物dAl和dA2作PCR，扩增得到Zfe/7的全长cDNA 0. 6kb (图3)。回收并纯化 Zfe/7全长基因片段，并将其连接到pMD18-T(宝生物工程有限公司(大连)，TaKaRa) 载体上，转化大肠杆菌感受态DH5 a (天根生化科技)，采用碱裂解法提取质粒 DNA，经1X琼脂糖凝胶电泳(图4A)，选取大小和理论值相符的重组质粒做进一 步的双酶切检测。根据阳性重组质粒pMD-Zfe/7载体两端的多克隆位点，用NcoI 和Xbal双酶切重组质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重 组质粒pMD-Dof 1含有0. 6kb左右的DNA插入片段(图4B),经序列分析证明是拟 南芥Zfe/7全长基因的cDNA。
二、重组质粒pUC118-PrbcS-"o/7的构建
为了将PrbcS启动子连接到化/7基因的5，端，用Ncol和Xbal双酶切 pMD-Dof 1和pUC118-PrbcS-*T (该载体为PrbcS启动子的供体)，回收纯化0. 6kb 的化/7基因cDNA片段以及载体大片段pUC118-PrbcS(约4. 2kb)，然后用宝生 物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接"o/7基因cDNA片段以及载体大片段 pUC118-PrbcS、用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5 a ，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp， 100|Lig/ml) 的平板上，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒进行 PCR和酶切鉴定。以重组质粒为模板用"o/7基因的上下游引物dAl和dA2进行 PCR扩增，PCR产物的理论长度为0.6kb。 PCR产物经1X琼脂糖凝胶电泳，结果 显示扩增产物的分子量为0. 6kb，实际大小与理论值相符合，表明已经将"o/7 基因正确插入到含有光诱导启动子PrbcS的载体上(图5B)。接着对PCR分析为 阳性的重组质粒进行酶切检测，连接正确的重组质粒经和酶切应该 得到一条0. 6kb左右的小片段和一条4. 6kb的大片段，酶切产物经1%琼脂糖凝 胶电泳检测，结果和理论相符(图5A),由此获得正确连接的重组质粒 pUC118-PrbcS-"o/7。
三、PPZP221-PrbcS-Zto/7的构建
用历'/7din和Z&I双酶切pUC118-PrbcS-Zfe/V和pPZP221 (Hajdukiewicz 等构建并提供，Hajdukiewicz et al， 1994， PMB， 25:984-)，回收纯化目的片 段PrbcS-"。/7 (约2. lkb)和pPZP221载体大片段(长度约为9.0kb)，然后用 宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接连接目的片段PrbcS-Zfe/7和pPZP221载体 大片段，用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5ct， 天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe， 50ug/ml)的平板 上，于37。C过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提 取质粒，然后进行PCR和酶切检测。PCR检测采用Zfe/7基因的上下游引物dAl 和dA2， PCR产物的理论长度为0. 6kb。 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析显示其片段大小分别与理论预测值相符(图6A)。这表明PrbcS-Zto/7片断已经正确插 入到植物表达载体pPZP221中。再用HindIII和XbaI进行酶切检测，如果插入 方向是正确的，酶切产物会出现长度约为2. lkb的小片段。琼脂糖凝胶电泳检 测结果显示酶切产物小片段的大小与理论推测相吻合(图6B)，由此获得含有 "0/7基因、能提高植物氮素营养利用率的专用载体pPZP221-PrbcS-Zfe/7，该载 体带有启动子PrbcS，其后紧接Zfe/7基因。
实施例4、用专用载体pPZP221-PrbcS-Zfe/7转化农杆菌
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将构建好的专用载体 pPZP221-PrbcS-"o/7转入农杆菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壮观霉素的平板
上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加 入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电 转化仪(BI0-RAD)滑槽中，用lmm的电击杯和200欧姆，2. 5kV/0. 2cm的参数进行 电击，电击后立即取出电转化杯,迅速加入0. 5mlS0C培养基,混匀，转移到1. 5ml 的离心管中；28°C， 200rpm摇床培养3 —5h;室温下，7500rpm离心lmin，弃 大部分上清，保留lOOjil将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe， 50pg/ml) 的LB固体培养基上，28"C培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取农杆菌菌落放 入20nl ddH20中，98'C处理15分钟后取出10|iil农杆菌裂解液作为PCR反应的 模板。用Dofl基因上下游特异性引物作PCR检测，转化成功的菌落均能扩增出 0. 6kb的Dof 1基因条带(图7)，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
实施例5、用专用载体pPZP221-PrbcS-Zb/Y转化烟草
挑取携带有pPZP221-PrbcS-Zfe/7质粒的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培 养基中(含Spe， 100pg/ml)， 180卬m， 28。C培养24h,待菌液OD600至1. 0左 右，离心10min (3000rpm)，沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮， 离心10min (3000rpm)，沉淀菌体。重复以上操作2 3次。最后加入一定体积 的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD600值为0. 5。制备烟草(A7coth朋 ^Aac^ cv. Xanth)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通 过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片 切成小片叶盘，在制备好的农杆菌菌液中浸染15—20min，用无菌吸水纸吸干后， 平铺于愈伤组织诱导培养基MS1 (MS+NAA02. lug/ml+BAP0.02|ug/ml)上黑暗共 培养2天，将外植体转移至含庆大霉素(100|Lig/ml)的芽诱导培养基MS4
(MS+NM0.53ng/ml+BAP0.5(xg/ml)上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有 芽生成后，转入含庆大霉素(100^ig/ml)的MS培养基上进行根的诱导。通过庆大 霉素筛选一共获得25个独立的转基因株系，接着对Zfe/V基因在这些转基因植 株中的转录水平进行分析。
实施例6、 Zfe/7基因在转基因烟草中的插入情况及转录水平检测
为了确认通过庆大霉素筛选的转基因烟草株系确实含有我们导入的目的基
因的cDNA片段，我们用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先 采用CTAB法提取植物基因组称取植物叶片100mg左右置于1. 5ml离心管中， 加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900^1预热到65°C的2 XCTAB缓冲液
(Tris-HC1 pH 7.5 100我EDTA 20 mM， NaCl 1.4 M， CTAB 2%), 65。C度水浴加 热20分钟后取出冷却；加入500jul氯仿一异戊醇混合液(24: l)摇匀，4'C离 心10min (7500rpm)后转移上清至1. 5ml EP管；再次加入500iul氯仿一异戊 醇混合液(24: 1)摇匀，4。C离心10min (7500rpm);取出上清置于新的EP管 中，加入1/10体积3M pH5. 2醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4。C离心20min
(12000rpm);弃上清，用75%乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲 液溶解并降解RNA。以植物基因组DNA为模板，用Zfe/7基因的上下游引物dAl 和dA2作PCR检测，PCR产物的理论长度为0.6kb，成功转入目的基因的植株均 能扩增出0.6kb的条带(图8)，经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。
为了考察目的基因在转基因烟草株系中的转录情况，从转基因植物中抽取 总RNA，反转绿成cDNA后用于RT-PCR分析，检测Dof 1基因在转基因植物中的 转录水平。采用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取RNA，取植物嫩叶约0, lg， 加入lml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加 入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min (12000rpm)，转移上清液至新管，加入 0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min， 4。C离心10min (12000rpm)，弃上清，沉 淀用75X乙醇lml清洗，4。C离心5min (7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自 然晾干，用20ul焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。使用Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，取植物总RNA约0. l|ug-5|iig， oligo(dT) 50ng， lOmM dNTP mix lpl,用DEPC处理水补足至10|il，混匀后，短暂离心将之 收集于管底，置于65。C加热5min，冰浴10min,加入反应混合物9^1(5 X reaction buffer 4^il, 25mM MgC12 4^1， 0. 1M DTT 2fil， RNA酶抑制剂l|il)，将上述混 合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25"C保温2min，加入lpl M-MuLV Reverse Transcriptase,将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25'C保温20min， 然后42。C保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用"o/7基因的上下游引物 dAl和dA2作RT-PCR分析，考察转基因烟草中是否有目的基因的转录物。结果 证明大部分转基因烟草植株均有目的基因的转录物(图9)。
实施例7、转基因烟草中丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性分析 选取经RT-PCR分析表明有目的基因的转录物的转基因烟草植株测定丙酮酸
激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性。从烟草叶片中抽提可溶性蛋白，取lg 烟草叶片，加l ml蛋白抽提液[100 mM Tris-HCl (pH 7. 5); 10% (V/V)甘油； lOmM巯基乙醇；lraMPMSF; 5% (W/V) PVP]研磨，转移至EP管中，13000 r/min
离心25min (4 °C)。将上清移到新的EP管中，用Bradford方法测定植物上清
中的蛋白质浓度。
一、 丙酮酸激酶(PK)酶的活性测定
丙酮酸激酶的活性测定按Yanagisawa等(PNAS， 2004, 101:7833-7873)的方 法测定，其原理为丙酮酸激酶可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)产生丙酮酸 (PYU)和NADH，产物在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成乳酸(LA)和NAD+。因此通 过监测反应体系中NADH的减少量可测得PK的酶活性。
测定PK酶活性的反应体系为0. 11 M Tris-HCl (pH 7. 5) ， 0. 11 M MgC12， 0. 11 M KC1, 1. 67 niM ADP (现配)，0. 043 M PEP (现配)，40 U/ml LDH (现配)， 0.2mMNADH (现配)，在反应体系中加入100吗烟草蛋白样品。25t:反应3min 后，在紫外分光光度仪上测定波长为340nm的0D值。取180 s和120 s时0D340 的差值为酶活性数据。
二、 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的活性测定 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的测定按Yanagisawa等
(PNAS， 2004， 101:7833-7873)的方法进行，其原理为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)产生草酰乙酸(OAA)和NADH，产物在苹果酸脱 氢酶(MDH)的作用下生成苹果酸(Malate)和NAD+，通过监测反应体系中NADH的 减少量，可以测得PEPC的酶活性。
测定PEPC酶活性的反应体系为50 Mm Tris-HCl (pH 7.5)， 5 mM PEP， 10 mM KHC03， 10 mM MgS04， 0. 1 mM NADH， 1. 0 IU MDH，在反应体系中加入100 Hg烟草蛋白样品，接着加入5 mM PEP 30 pl。室温反应2 min后测定波长为 340nm的0D值。取180s和120s时0D340的差值为酶活性数据。
测试结果表明转基因烟草丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶活性分 别是对照烟草的5 15倍(图10)和1. 5 3. 2倍(图11)。
实施例8、转基因烟草在低、中、高氮营养条件下生长的株高和生物量检测
选出大小基本一致的转基因烟草幼苗，移栽到珍珠岩蛭石比例为3:1的 基质中，在温室内进行盆栽试验。分别施用1 niM/L氮元素(低氮营养条件)、5 mM/L 氮元素(中氮营养条件)和IO mM/L氮元素(高氮营养条件)的营养液，第一个月 每周每盆植物施用营养液一次，每次50ml。第二个月每周每盆植物施用营养液 二次，每次50ml直至烟草开花期，测定其株高和生物重(鲜重和干重)。
在低氮营养条件转基因烟草和对照植物(CK)的株高都较小，但转基因烟 草的生长明显比对照植物好(图12A)。在中氮营养条件转基因烟草的生长优势 与对照植物(CK)相比尤为明显(图12B)。对烟草株高的测定结果表明，在低 氮营养条件下，转基因烟草的植株平均高度为对照烟草株高的1. 3倍(图13);
在中氮营养条件下，转基因烟草的植株平均高度为对照烟草株高的1. 7倍(图
13);在高氮营养条件下，转基因烟草的植株平均高度为对照烟草株高的1. 1倍
(图13)。
对烟草生物量的测定结果表明，在低氮营养条件下，转基因烟草植株的平
均鲜重和干重为对照烟草的1. 3倍；在中氮营养条件下，转基因烟草植株的平
均鲜重和干重分别为对照烟草的1.1倍和1.2倍；在高氮营养条件下，转基因
烟草植株的平均鲜重和干重分别为对照烟草的1. 05倍和1. 06倍(图14)。 实施例9、转基因烟草在低、中、高氮培养基上生长的株高和生物量检测 把转基因烟草的Tl代种子播种与加有庆大霉素(100)tig/ml)的MS固体培 养基上，待种子发芽15天后，选取大小均匀一致的转基因烟草小苗，分别转移 到1 mM/L氮元素(低氮营养条件)、5 mM/L氮元素(中氮营养条件)和10 raM/L氮 元素(高氮营养条件)的MS培养基，生长36天后测定生长效果。
转基因烟草小苗在低氮、中氮和高氮营养MS培养基上生长36天后的情况 如图15所示。在低氮培养基上转基因烟草小苗的生长普遍比对照烟草好(图 15A),在中氮培养基上，转基因烟草小苗也表现有这种生长优势(图15B)，但 是在高氮培养基上这种生长优势不明显(图15C)。对转基因烟草小苗株高的测 定结果(图16)表明，在低氮、中氮和高氮MS培养基上生长36天后转基因烟 草小苗的平均株高分别是对照烟草的1. 63、 1. 38和1. 17倍。
我们还测定了转基因烟草小苗的鲜重和干重，实验结果如图17所示。在低 氮、中氮和高氮MS培养基上生长36天后，转基因烟草小苗的平均鲜重分别是 对照烟草的1.94、 L31和1.28倍，平均干重分别是对照烟草的1.62、 1. 32和 1. 32倍。
实施例IO、转基因烟草在低、中、高氮营养MS培养基上生长的叶绿素含量
叶绿素含量的测定原理为叶绿素a和叶绿素b在645 nm和663 nm波长处 有最大吸收值，且两吸收曲线相交于652nm波长处。因此测定提取液在645 nm、 663 nm、 652 rnn波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶 绿素b和总叶绿素的含量。
取烟草小苗的叶片或其它绿色组织，去除中脉剪碎。称取剪碎的样品1 g， 放入研钵中，加少量碳酸钙粉及0.5ml95X乙醇，研磨成匀浆，再加入0.8ml 95%乙醇，继续研磨至组织变白。静置3 5min。 12000 rpm离心15 min后取 上清液，测量其在645 nm、 663 nm、 652 nm波长下的吸光值。根据如下的经验 公式，分别计算各样品中叶绿素a、 b和总叶绿素的含量。
<formula>formula see original document page 16</formula>上述公式式中，A:该波长下测得的吸收值；V:加入乙醇的体积；W:称取 植物组织的重量。
提取烟草小苗的叶绿素，分别测定各样品在665、 652和645 nm波长处的
吸收值，并代入经验公式计算。最终我们得到烟草小苗的叶绿素含量，结果见 图18所示。转基因烟草小苗的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的平均含量分别 是对照烟草的2. 08、 2. 54和2. 18倍。
权利要求
1、一种用于提高植物氮素营养利用率的载体，是具有光诱导型启动子和转录因子Dof1基因的植物表达载体。
2、 根据权利要求l所述的载体，其特征在于所述的Dof1基因来源于拟南芥。
3、 根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述来源于拟南芥的Dof1 基因的GenBankBO 17564。
4、 根据权利要求1或2或3所述的载体，其特征在于所述的Dof1基因 的上游添加的光诱导型启动子为Rubisco小亚基的启动子。
5、 根据权利要求4所述的载体，其特征在于用于构建所述植物表达载体 的出发载体为pPZP221。
6、 根据权利要求5所述的载体，其特征在于所述的载体为 pPZP221-PrbcS-Dof1。
7、 根据权利要求l所述载体的应用，其特征在于用该载体转化植物，可 得到氮素营养利用率提高的转基因植株。
8、 根据权利要求7所述的植物，其特征在于所述的植物为烟草。
全文摘要
本发明公开了一种提高植物氮素营养利用率的专用载体与应用。该载体含有拟南芥转录因子Dof1基因，Dof1基因的上游为Rubisco小亚基的光诱导型启动子。用本发明获得的专用载体转化的烟草，在低、中、高氮营养条件下进行盆栽试验，结果说明在低氮营养条件下转基因烟草株高是对照烟草的1.1～1.7倍；鲜重是对照烟草的1.05～1.3倍；干重是对照的1.06～1.3倍。在低氮营养条件下，转基因烟草的丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性分别是对照的5～15倍和1.5～3.2倍。可见在光诱导型启动子的控制下，Dof1基因的过量表达能提高转基因烟草在低氮营养条件下的氮素利用效率，促进转基因烟草的生长。本发明的专用载体能提高植物的氮素利用效率，在植物品种的遗传改良中有很大的应用潜力。
文档编号C12N15/82GK101205543SQ20071006640
公开日2008年6月25日 申请日期2007年11月30日 优先权日2007年11月30日
发明者刘迪秋, 李昆志, 潘丽峰, 玥 赵, 艳 赵, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学