专利名称：在氮限制条件下具有改变的农学特性的植物以及涉及编码lnt1多肽及其同源物的基因的 ...的制作方法
技术领域：
本发明领域涉及植物育种和遗传学，具体地讲涉及植物中可用的赋予氮利用效率 和/或氮限制条件耐受性的重组DNA构建体。
背景技术：
世界范围内非生物胁迫显著地限制了作物产量。据评估这些因素累积地造成平均 70%的农业产量减少。植物是固着的，必须适应它们周边的主要环境条件。这已经导致它 们发展出基因调控、形态发生和代谢的高可塑性。适应和防御机制策略涉及激活编码对适 应或防御不同胁迫重要的蛋白。植物氮吸收在它们的生长中起到重要作用(Gallais等人，J. Exp. Bot. 55(396) 295-306(2004))。植物从环境中的无机氮合成氨基酸。因此，氮肥已经成为提高栽培植物如 玉米和大豆的产量有力工具。为了避免硝酸盐污染并保持足够的利润率，如今农民期望减 少氮肥的使用。如果能提高植物的氮同化能力，然后就能期望植物生长和产量的提高。概 括地讲，具有更好的氮利用效率(NUE)的植物品种是所期望的。可利用激活标记来鉴定能影响性状的基因。已经在模型植物拟南芥属中使用该方 法(Weigel等人，Plant Physiol. 122 1003-1013 (2000))。插入转录增强子元件能够显著 激活和/或提高附近内源基因的表达。这种方法可以用于鉴定特定性状(例如植物的氮利 用效率)的受关注的基因，当所述基因经转基因进入生物中时可改变该性状。发明概述本发明包括在一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体 包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽 的氨基酸序列基于 ClustalV 比对方法在与 SEQ ID NO 18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、 或37进行比较时具有至少50 %的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA 构建体的对照植物进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。在另一个实施方案中，增加植物的氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重 组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种 调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、 30、32、33、34、或37进行比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至 少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其 中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与不包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出增加的氮胁迫耐受性；并且任选地，(C)获得源自该转基因植物的子代 植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体，并且在与不包含该DNA构建 体的对照植物比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。在另一个实施方案中，评价植物的氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重 组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种 调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、 30、32、33、34、或37进行比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至 少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其 中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与不 包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性；以及任选地，(d)获得源自 该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及任 选地，(e)评价该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫 耐受性。在另一个实施方案中，评价植物的氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重 组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种 调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、 30、32、33、34、或37进行比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至 少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其 中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；(c)获取来源于转基因植物的子代 植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)评价该转子代植 物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性；在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何方法，其中所述植物是玉米植物 或大豆植物。在另一个实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含 (a)编码LNTl或LNTl样多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比 对方法在与SEQ ID NO :26、28或30中的其中一个进行比较时，具有至少90%或95%的序 列同一性，或(b)所述核苷酸序列的全长互补序列，其中所述全长互补序列和所述核苷酸 序列由相同数目的核苷酸组成并且是100%互补的。所述多肽可包含SEQ ID N0:26、28或 30的氨基酸序列。所述核苷酸序列可包含SEQ ID NO 25、27或29的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明任何分离的多核苷酸的重组DNA构 建体，所述分离的多核苷酸可操作地连接至至少一个调控序列，并且本发明涉及包含所述 重组DNA构建体的细胞、植物、和种子。在另一个实施方案中，本发明包括包含本发明的任何分离的多核苷酸的载体。在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明任何重组DNA构建体的细胞、植物 或种子。所述细胞可为真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或者可为原核细胞，例如细 菌。附图简述和序列表根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描 述和附图以及序列表形成本申请的一部分。
图1示出pHSbarENDs2活化标记构建体的图谱，该构建体用于制备拟南芥属种群 (SEQ ID NO 1)ο图2 示出载体pD0NR Zeo(SEQ ID NO :2)、GATE\￥AY 供体载体的图谱。attPl 位点位于核苷酸570-801 ；attP2位点位于核苷酸2754-2985 (互补链)。图3示出载体pD0NR 221 (SEQ ID NO 3)、0八丁￡\￥八丫@供体载体的图谱』《卩1 位点位于核苷酸570-801 ；attP2位点位于核苷酸2754-2985 (互补链)。图4示出载体pBC-yell0W(SEQ ID NO 4)的图谱，该载体是用于构建拟南芥属表 达载体的目的载体。attRl位点位于核苷酸11276-11399(互补链)；attR2位点位于核苷 酸9695-9819 (互补链)。图5示出载体PHP27840 (SEQ ID NO 5)的图谱，该载体是用于构建大豆表达载体 的目的载体。attRl位点位于核苷酸7310-7434 ；attR2位点位于核苷酸8890-9014。图6示出载体PHP23236(SEQ ID NO 6)的图谱，它是用于构建Gaspe Flint来源 的玉米品系的表达载体的目的载体。attRl位点位于核苷酸2006-2130 ；attR2位点位于核 苷酸 2899-3023。图7示出载体PHP10523 (SEQ ID NO :7)的图谱，该载体是存在于农杆菌菌 株 LBA4404 中的质粒 DNA(Komari 等人，Plant J. 10 165-174(1996) ；NCBI 通用标识符 59797027)。图8示出载体PHP23235(SEQ ID NO 8)的图谱，它是用于构建目的载体PHP23236 的载体。图 9 示出载体 PHP20234(SEQ ID NO 9)的图谱。图10示出目的载体PHP22655(SEQ ID NO 10)的图谱。图11示出用于筛选的五个品系(标记为1至5-每个品系有十一个个体)，加上野 生型对照品系Cl (九个个体)的典型网格图案。图12示出通过图像分析测定的若干个不同硝酸钾浓度对植物颜色的效应。绿色 区(色调50至66)对氮剂量的响应证明该区可被用于指示氮同化作用。图13为实施例18中用于半水栽玉米生长的培养基。图14是列出实施例18中与不同硝酸盐浓度对Gaspe Flint衍生的玉米系生长和 发育的影响相关的数据的图表。图15A-15C示出拟南芥LNTl多肽(SEQ ID NO 32)的全长氨基酸序列与SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、33、34、和 37 的 LNTl 同源物的多重比对。图16示出图15A-15C中显示的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值的 图表。图17A-E示出用PHP30116转化的单个Gaspe Flint来源的玉米品系的评估。图18示出用PHP30116转化的单个Gaspe Flint来源的玉米品系的综合评估。本文附带的序列描述和序列表遵循在37C. F. R. § 1.821-1.825的专利申请公 布中列出的核苷酸和/或氨基酸序列规则。序列表包含遵循IUPAC-IUBMB标准的单字 母符号表示的核苷酸序列和三字母表示的氨基酸，该标准如Nucleic Acids Res. 13 3021-3030(1985)和 Biochemical J. 219(2) :345_373 (1984)所述，其引入本文以供参考。 用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的规定。
表1列出了本文所述的某些多肽、包含编码多肽全部或其主要部分的核酸片段的 cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的对应标识符(SEQ ID NO:)。^ 1耐低氮蛋白(LNT)
权利要求
1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至 少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸 序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、或 37 进 行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体 的对照植物进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。
2.权利要求1的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
3.增加植物的氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有氨基酸序列的多肽，所述 氨基酸序列基于 ClustalV 比对方法在与 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、或 37进行比较时具有至少50%的序列同一性；以及(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物 进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。
4.权利要求3的方法，所述方法还包括(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的 氮胁迫耐受性。
5.评价植物的氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有氨基酸序列的多肽，所述 氨基酸序列基于 ClustalV 比对方法在与 SEQ ID NO 18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、或 37进行比较时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价所述转基因植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮 胁迫耐受性。
6.权利要求5的方法，所述方法还包括(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体；以及(e)评价所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁 迫耐受性。
7.评价植物的氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有氨基酸序列的多肽，所述 氨基酸序列基于 ClustalV 比对方法在与 SEQ ID NO 18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、或 37进行比较时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(C)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组 DNA构建体；以及(d)评价所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁 迫耐受性。
8.权利要求3的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
9.权利要求4的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
10.权利要求5的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
11.权利要求6的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
12.权利要求7的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
13.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含(a)编码LNTl或LNTl样多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :26、28或30进行比较时具有至少90%的序列同一性， 所述ClustalV比对方法的成对比对默认参数为KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5，和 DIAGONALS SAVED = 5，或(b)(a)的核苷酸序列的全长互补序列。
14.权利要求13的多核苷酸，其中所述多肽具有的氨基酸序列基于采用成对比对默认 参数的Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :26、28或30进行比较时具有至少95%的序列 同一性。
15.权利要求13的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO :26、28、或30。
16.权利要求13的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO :25、27、或29。
17.包含权利要求13的多核苷酸的载体。
18.重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一种调控序列可操作地连接的权 利要求13的分离的多核苷酸。
19.包含权利要求18的重组DNA构建体的细胞，其中所述细胞选自细菌细胞、酵母细胞 和昆虫细胞以及植物细胞。
20.包含权利要求18的重组DNA构建体的植物或种子。
全文摘要
本发明公开了尤其可用于在氮限制条件下改变植物农学特性的分离的多核苷酸和多肽以及重组DNA构建体，包含这些重组DNA构建体的组合物(如植物或种子)、以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接在植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码LNT1多肽。
文档编号C12N15/82GK102105590SQ200980126532
公开日2011年6月22日 申请日期2009年7月8日 优先权日2008年7月8日
发明者D·卢塞尔, H·萨凯, M·奥克曼, S·M·艾伦, S·V·廷盖, S·卢克 申请人:先锋国际良种公司, 纳幕尔杜邦公司