改善植物耐旱性、氮利用效率和产量的制作方法

改善植物耐旱性、氮利用效率和产量的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于修饰植物中乙烯敏感性的多核苷酸和相关多肽。在缺水和低氮环境中，乙烯不敏感转基因玉米植物产生比非转基因植物更高的谷粒产量。通过转基因在所需组织和器官，或特定植物发育期中的受控表达，改变乙烯感知和信号转导，从而建立了在非生物胁迫下产量更佳的转基因植物。
【专利说明】改善植物耐旱性、氮利用效率和产量

【技术领域】
[0001] 本发明总体上涉及分子生物学领域。
[0002] 置量
[0003] 许多植物的驯化已与产量显著增加相关。自然群体中发生的大多数表型变异是连 续的并通过多种基因影响来实现。对造成驯化植物中产量显著不同的特定基因的鉴别已成 为农业研究的重要焦点。
[0004] 乙烯（C2H4)是影响植物中的多个发育过程和适应性反应，例如发芽、花和叶衰老、 果实成熟、叶或果实脱落、根结瘤、程序性细胞死亡以及反应胁迫和病原体攻击的气态植物 激素。另外的乙烯影响包括水生植物的茎延伸、根中气室（通气组织）的发育、叶偏上弯 曲、茎和苗膨大（与发育迟缓相关）、枯萎中的雌性特征、某些物种中的果实生长、黄化苗中 的顶端弯钩闭合、根毛形成、凤梨科（Bromeliaceae)的开花、黄化苗的横生以及基因表达 (如，聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶等）的增加。这些效应有时 受到生物和非生物作用，如其他植物激素、其他生理信号和环境的影响。
[0005] 乙烯通过成熟果实释放，还通过大多数植物组织，如对胁迫（如，干旱、拥挤、病原 体攻击、温度胁迫、创伤等）作出反应以及在成熟和衰老器官中产生。遗传筛选鉴别了十几 个涉及植物中乙烯反应的基因。
[0006] 乙烯由确定的途径从甲硫氨酸产生，该途径涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM或Ado Met)转化为环状氨基酸1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC)，该转化由ACC合酶推进。然后通 过ACC氧化酶的作用由ACC的氧化产生乙烯。或者，ACC可通过ACC脱氨酶的作用转化为 α-酮丁酸和氨气。
[0007] 植物激素乙烯调节植物生长和发育以及植物中的生物和非生物胁迫反应。此处示 出的实验活动显示ARGOS基因的异位表达赋予植物乙烯不敏感性。与具有正常乙烯敏感性 的非转基因植物相比，乙烯不敏感性玉米植物在缺水和低氮环境下产生更高的谷粒产量。 通过ARGOS转基因在所需组织和器官，或特定植物发育期中的受控表达，通过设计改变乙 烯感知和信号转导，从而建立了在非生物胁迫下产量更佳的转基因植物。


【发明内容】

[0008] 通过本发明体现的方法包括：调节植物中的乙烯敏感性的方法，其包括：向植物 细胞中引入包含编码跨膜蛋白质的多核苷酸的重组构建体，所述跨膜蛋白质包含具有序列 PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的富脯氨酸基序，其中富脯氨酸结构域位于第一跨膜序列和第二 跨膜序列之间，所述多核苷酸有效连接至启动子；以及表达所述多核苷酸以调节所述植物 中的乙烯敏感性水平，同样其中富脯氨酸基序（PRM)序列包括原始PRM(SEQ ID N0:88)或 变体 PRM(SEQ ID NO :102)。
[0009] 另外该方法其中：植物选自：玉米、大豆、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水 稻、大麦、小米、花生、甘蔗、芒草、禾本科、可可、亚麻荠、番薯和茄属；乙烯敏感性减少；所 述构建体为过表达构建体；所述构建体包含SEQ ID N0 :88或SEQ ID N0 :102。
[0010] 另一个实施例包括调节植物中的乙烯敏感性的方法，其包括：向植物细胞中引入 包含编码TPT结构域的多核苷酸的核苷酸构建体，所述TPT结构域与TM1SEQ ID N0 :90或 TM2SEQ ID N0:91具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸有效连接至启动子，所述TPT 结构域还包括前述脯氨酸基序，以及将所述植物在干旱或低氮条件下种植；其中植物选自： 玉米、大豆、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米、花生、甘蔗、禾本科、可 可、亚麻荠、番薯和茄属，来自单子叶植物，来自玉米。
[0011] 实施例还包括由前述方法产生的植物，包括：其中在与未经转化的植物进行比较 时，该植物具有降低的乙烯敏感性；其中该植物具有降低的对非生物胁迫的敏感性；其中 该植物具有降低的对干旱胁迫的敏感性；其中该植物具有降低的对拥挤胁迫的敏感性；其 中该植物具有降低的对淹水胁迫的敏感性。
[0012] 另外的实施例包括分离的蛋白质，其包含：来自SEQ ID N0 :89的多肽的至少20个 连续氨基酸的多肽；SEQ ID N0:89的多肽；与SEQ ID N0:89的多肽具有至少80%序列同 一性且与其具有共同的至少一个线性表位的多肽，其中所述序列同一性使用BLAST2. 0在 默认参数下测定；以及至少一个如前述实施例中所述的多肽。
[0013] 本发明的实施例包括：编码具有乙烯调控活性且具有SEQ ID N0 :89的序列的蛋 白质的分离的多核苷酸序列，以及具有乙烯调控活性且具有SEQ ID N0 :89的序列的多肽。
[0014] 提供了 ARGOS基因在植物中异位表达以影响植物的乙烯敏感性的方法。ZmARGOS 构建体显示出改善的耐旱性、氮利用效率以及降低的植物的乙烯敏感性。
[0015] 提供了用于控制植物生长以增加植物在胁迫下的产量的组合物和方法。所述组合 物包括来自玉米、大豆、拟南芥、水稻和高粱的ARG0S序列。本发明的组合物包含选自SEQ ID N0 :1-37、40-91和96的氨基酸序列和核苷酸序列及其变体和片段。
[0016] 编码ARG0S序列的多核苷酸在DNA构建体中提供以便在所关注的植物中表达。还 提供了包含本发明的序列的表达盒、植物、植物细胞、植物部分和种子。在具体的实施例中， 该多核苷酸有效连接到组成型启动子。
[0017] 提供了调节植物或植物部分中ARG0S序列水平的方法。所述方法包括将包含本发 明ARG0S序列的异源多核苷酸引入到植物或植物部分中。ARG0S多肽的水平可被提高或降 低。此类方法可用于增加植物的产量；在一个实施例中，该方法用于增加谷类的谷粒产量。
[0018] 增加作物产量的方法，该方法包括表达包含多核苷酸的重组构建体，所述多核苷 酸编码包含具有序列PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的富脯氨酸基序的跨膜蛋白质，其中富脯氨 酸结构域位于第一跨膜序列和第二跨膜序列之间，所述多核苷酸有效连接至启动子；以及 增加作物的产量，其中所述产量在低于正常氮水平下增加。在一个实施例中，较低氮水平与 正常氮水平相比少约10%至约40%。在一个实施例中，较低氮水平减少至与正常氮水平相 比少约50%。在一个实施例中，所施用的氮水平在植物的后生殖期减少。在一个实施例中， 作物是玉米并且是杂交玉米。
[0019] 改善玉米植物的农艺参数的方法，该方法包括表达包含多核苷酸的重组构建体， 所述多核苷酸编码包含具有序列PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的富脯氨酸基序的跨膜蛋白质， 其中富脯氨酸结构域位于第一跨膜序列和第二跨膜序列之间，所述多核苷酸有效连接至启 动子；以及改善至少一个选自根生长、苗生物量、根生物量、籽粒数、穗大小以及干旱胁迫的 农艺参数。
[0020] 玉米植物的标记辅助选择的方法，所述玉米植物表现出改变的内源基因表达模 式，该方法包括获得在编码跨膜蛋白质的多核苷酸的基因组区域中包含等位变异的玉米植 物，所述跨膜蛋白质包含具有序列PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的富脯氨酸基序，其中多核苷 酸的表达与不具有变异的对照玉米植物相比增加；选择包含变异的玉米植物；以及通过标 记辅助选择方法建立包含变异的玉米植物的群体。在一个实施例中，变异存在于基因组区 域的调控区。在一个实施例中，变异存在于多核苷酸的编码区。在一个实施例中，变异存在 于基因组区域的非编码区。在一个实施例中，多核苷酸的表达在不同的遗传背景下差别性 增加。

【专利附图】

【附图说明】
[0021] 图1 :示出来自各种植物物种的本发明ARGOS多肽之间关系的系统树图：玉米、水 稻、大豆、高粱和拟南芥。
[0022] 图2 :具有鉴定保守区的玉米、水稻、大豆、高粱和拟南芥多肽序列的比对。蛋白质 具有C-端附近的非常保守的富脯氨酸区。N-端通常是有差异的。蛋白质很短，在58至146 个氨基酸的范围内，平均110个氨基酸。
[0023] 图3 :ZmARG0Sl、2和3与AtARGOSl和4的比对，其共有区和保守置换突出显示。
[0024] 图4 :ARG0S8转化到近交系。从T1近交系田间观察结果收集数据。（A)代表性穗、 (C)穗长度、（B)植株高度、（D)茎杆直径测量。
[0025] 图 5 :ZmARG0Sl(SEQ ID NO :2)与 ZmARG0S8(SEQ ID NO :44)的序列比对。
[0026] 图6 :ZmARG0Sl和ZmARG0S8的预测蛋白结构。
[0027] 图7 :在幼苗期3倍氮浓度下ZmARG0S8对植物生物量积累的影响。*表示与非转 基因无效植物具有统计学显著差异，其中P < 0. 05。
[0028] 图8 :转基因 ZmARG0S8在多个位置试验中的田间谷粒产量。含*事件表示与非转 基因无效植物具有统计学显著差异，其中P < 0. 1。
[0029] 图9 :在2mM硝酸浓度下ZmARG0S8对植物和穗生长的影响。*表示与非转基因无 效植物具有统计学显著差异，其中P < 0. 05。
[0030] 图10 :在6. 5mM硝酸浓度下ZmARG0S8对植物和穗生长的影响。*表示与非转基因 无效植物具有统计学显著差异，其中P < 〇. 05。
[0031] 图11 :ZmARG0Sl过表达对玉米植物中乙烯生物合成和反应、含TPT结构域跨膜 ARGOS蛋白的结构以及玉米中ARGOS基因表达的激素调节的影响。
[0032] (A)Ubi :ZmARG0Sl玉米转基因植物中乙烯产量的增加。分析近交系PHWWE的V7植 物的两个最上方围绕叶。经过20小时的时间收集乙烯，随后使用气相色谱测量。转基因植 物（TR)和野生型分离群体（WT)中的乙烯产量根据组织鲜重计算。确定六次重复的平均值 土标准偏差。显示了三个转基因事件（E1、E2和E3)。
[0033] ?)在存在0(上）、25(中）或100以]?(下）乙烯前体40：的情况下在黑暗中发芽 的ZmARGOSl转基因植物（TR)和野生型分离群体（WT)的五天龄玉米幼苗。显示了一个代 表性事件。
[0034] (C)玉米ARG0S蛋白和拟南芥同源物结构的示意性图示。玉米ZmARGOSl中的 TPT结构域由两个预测跨膜螺旋（TM1，aa79-101 ;TM2, aall〇-134)和富脯氨酸基序（PRM， aal02PPLPPPPS109)(上）组成。跨膜螺旋（TM1和TM2)、连接环（富脯氨酸基序，PRM)以 及膜中N-和C-端序列的预测取向在下图中示出。
[0035] (0)211^1?031和211^1?038基因表达通过激素处理诱导。给玉米￥3幼苗喷洒5(^皿 八〇：、5(^1484、2(^1细胞分裂素（^6-苄基氨基嘌呤）、10(^1茉莉酸（从）和1(^皿 IAA。收集2和4小时的叶组织用于RNA提取。溴化乙锭染色的凝胶作为加样对照示出。
[0036] 图12 :ARG0S基因的序列比对显示了草物种之间家族成员和同源物中的保守区。 保守区鉴别为 LX1X2LPLX3LPPLX4X5PP(SEQ ID N0 :86)，其中 XI = L、V、I ;X2 = L、V、I、F ; X3 = V、L、A ;X4 = P、Q、S ;X5 = P、A。
[0037] 图13 :ZmARG0Sl的过表达赋予拟南芥乙烯不敏感性
[0038] (A)在存在或不存在乙烯前体ACC(10 μ Μ)的情况下发芽的3天龄黑暗生长幼苗的 比较。显示了野生型Col-0 (WT)代表性幼苗、载体对照和ZmARGOSl转基因植物。
[0039] (B)在存在10、50或lOOppm气态乙烯的情况下发芽的3天龄黄化幼苗的比较。
[0040] (C)在24°C光照（16小时照明，强度大约120mE m-2S-l)和23°C黑暗（8小时）的 生长室中生长的ZmARGOSl转基因植物（右）和载体对照（左）。
[0041] 上图，种植16天后（DAP)的植物显示出转基因植物中的较小莲座；下图，39-DAP 植物显示出延迟开花和叶衰老表型。
[0042] (D)在与（A)中相同的条件下生长的ZmARGOSl转基因（右上）和载体对照植物 (左上）的花序。转基因植物显示出寿命延长和花被器官保留。ZmARGOSl转基因植物的花 瓣和萼片保持饱满（右下），而在载体对照植物（左下）中，花序上的相同位置花的花被器 官脱落。
[0043] 图14 :ZmARG0Sl过表达对拟南芥中etol-Ι突变体表型的影响。
[0044] (A)过表达ZmARGOSl的三天龄黄化etol-Ι幼苗（右）缺乏etol-Ι突变体（左） 的组成型乙烯反应表型。
[0045] (B)光照生长的etol-Ι突变体植物（右）、过表达ZmARGOSl的etol-Ι植物（左） 和载体对照（中）的形态。
[0046] 图15 :在过表达ZmARGOSl的拟南芥中乙烯产量的增加和乙烯诱导基因表达的减 少。
[0047] (A)在种植20天后在光照下生长的ZmARGOSl转基因事件（El、E2和E3)、载体对 照（Vec)和野生型Col-0 (WT)莲座叶中的乙烯产量。经过22小时的时间收集乙烯，随后使 用气相色谱测量。乙烯产量根据组织鲜重计算。误差线为标准偏差（η = 4)。
[0048] (Β)过表达ZmARGOSl的转基因植物中乙烯反应基因表达的下调。总RNA从3周龄 植物的莲座叶中提取。三个ZmARGOSl事件（E1、E2和E3)和载体对照（Vec)的RNA印迹分 析使用10 μ gRNA/道进行，用乙烯诱导基因 EBF2和AtERF5检测。溴化乙锭染色的凝胶在 底部作为加样对照示出。
[0049] 图16 :玉米ARG0S1在ctrl-1突变体背景中的过表达。
[0050] (A)过表达ZmARGOSl或载体对照的ctrl-Ι突变体植物的三天龄黄化幼苗在不存 在外源乙烯的情况下显示出三倍反应。
[0051] (B)过表达ZmARGOSl或载体对照的三十天龄ctrl-Ι突变体植物显示出组成型乙 烯反应表型。
[0052] 图17 :玉米和拟南芥含TPT结构域的跨膜ARGOS蛋白的过表达赋予降低的乙烯敏 感性。
[0053] (A)过表达玉米ZmARG0Sl、ZmARG0S9、ZmARG0S8和ZmARG0S7以及拟南芥同源基因 AtARG0S3和AtARG0S4的3天龄黄化幼苗中乙烯敏感性降低的表型。幼苗在存在10 μ M ACC 的情况下生长。显示了代表性转基因 Τ1幼苗。
[0054] (Β)拟南芥AtARG0S2的过表达降低乙烯敏感性。四个随机选择转基因事件 (E1-E4)和野生型Col-O(WT)的T3幼苗在存在0、1.0和2. 5μΜ ACC的情况下在黑暗中生 长3天。显示了 20株幼苗的下胚轴和根的相对长度平均值。在0μ M ACC下的下胚轴和根 长度设定为100%。星号表示WT和转基因植物之间存在统计学显著差异，其中Ρ< 0.01 (t 检验）。误差线为标准偏差（η = 20)。
[0055] 图18 :转基因拟南芥中截短和突变ZmARGOSl的功能分析。
[0056] (A) ZmARGOSl变体的示意图。ZmARGOSl的N-和C-端序列截短分别生成 TR-nl (aa31-144)、n2 (aa62-144)和 n3 (aa92-144)以及 TR-cl (aal-134)、c2 (aal-124)和 c3(aal-114)。TR-nc(aa62-134)的N-和C-端序列截短。TMlm包含第一跨膜结构域（TM1) 中的P83D和A84D的氨基酸置换。TM2m携带第二跨膜结构域（TM2)中的L120D、L121D和 L122D突变。L104D表示富脯氨酸基序（PRM)中L104D的单个氨基酸置换。
[0057] (B)在存在10 μ M ACC的情况下过表达ZmARGOSl和截短和突变ZmARGOSl的野生 型对照和转基因拟南芥的3天龄黄化幼苗的下胚轴和根长度的测量值。示出了 12-20株T1 苗/构建体的平均值土SD。
[0058] 图19 :ZmARG0Sl中富脯氨酸基序的单个氨基酸置换分析。
[0059] 玉米ZmARGOSl基因的富脯氨酸基序（aal02PPLPPPPS109)中的八个氨基酸的每个 被天冬氨酸置换。在拟南芥中突变ZmARGOSl变体和野生型ZmARGOSl在CaMV35S启动子的 控制下过表达。根据黄色荧光蛋白标记基因的表达针对每个构建体随机选择二十五个T1 种子。在存在10 μ M ACC的情况下使用黄化幼苗测定乙烯反应。野生型Col-Ο植物（WT) 作为对照。示出了代表性幼苗。
[0060] 图20 :ZmARG0Sl蛋白在内质网和高尔基体膜中的定位。
[0061] (A)过表达带FLAG-HA表位标签的ZmARGOSl (ZmARGOSl)和无标签ZmARGOSl对照 (CK)的拟南芥细胞级分的蛋白质印迹分析。将总（T)匀浆超离心，以分离可溶性（S)和微 粒体膜（M)级分。蛋白质印迹分析用抗FLAG抗体进行。
[0062] (B)表达带AcGFP标签的ZmARGOSl的稳定转基因拟南芥的代表性下胚轴细胞的落 射荧光显微术显示出与内质网和高尔基体膜相关的绿色荧光。
[0063] (C)含内质网标记的带AcGFP标签的ZmARGOSl在瞬时转化的洋葱表皮细胞中的共 定位。
[0064] (D)含高尔基体标记的AcGFP标记ZmARGOSl在瞬时转化的洋葱表皮细胞中的共定 位。
[0065] 图21 :来自多个物种的ARG0S多肽序列的比对鉴定保守跨膜片段。信息标记如 下：
[0066] ID = SEQ ID，但草物种按照表1被标识为argos#
[0067] St =比对序列组中的序列起始编号，
[0068] Ed =比对序列组中的序列结束编号，
[0069] TMH1/2 =跨膜片段，
[0070] Ident/TMH1，2 =同一性比率。
[0071] 利用Clustalw产生比对图谱形式的与ZmARG0S8(SEQ ID NO :44)的比对。同一性 计算是与ZmARG0S8作为比较。
[0072] 图22 :在2mM硝酸浓度下ZmARG0S8转基因对植物生长的影响。
[0073] 使三个UBI :ZmARG0S8转基因事件以及无效对照在10升罐中生长，在田间用2mM 硝酸处理。对八株植物/事件取样，并收集以鲜重（g)计的苗和根生物量。（A) V7期的平 均苗（上）和根生物量（下）；(B) R3期的平均苗（上）和根生物量（下）。星号表示显著 性，p < 0· 05。
[0074] 图23 :在干旱胁迫下ZmARG0S8的过表达增加玉米产量。该图描述了 10个独立事 件的相对于非转基因对照的产量增加，单位为蒲式耳/英亩。
[0075] 发明详沭
[0076] -直存在对调节植物中乙烯敏感性和乙烯反应通路，以对植物发育或胁迫反应进 行操纵的需要。
[0077] 本发明涉及用于调节改善植物中的产量和/或胁迫耐受性的基因的鉴定、表征和 操纵。产量和/或胁迫耐性的改善可通过调节乙烯敏感性实现。
[0078] 本发明包括改变作物例如玉米的遗传组成，使得此类作物可具有更高产量和/或 使其更能耐受胁迫条件的方法。此类公开的用途是通过乙烯敏感性调节和/或乙烯反应调 节同时增加产量和改善胁迫耐受性。
[0079] 乙烯反应的调节包括但不限于：拥挤耐受性、结实和发育、在紧实土壤中生长、淹 水耐受性、成熟和衰老、耐旱性和抗病性。本发明提供引起植物中的乙烯敏感性或乙烯反应 的各种改变的方法和组合物，所述植物在正常或胁迫条件下产生改善的农学性能。本发明 所公开的植物与对照植物相比具有改变的乙烯敏感性。在一些植物中，改变的乙烯敏感性 涉及营养组织、生殖组织、或营养组织和生殖组织。本发明的植物可具有至少一种如下表 型，包括但不限于：与未转化的植物相比在拥挤耐受性、结实和发育、在紧实土壤中生长、淹 水耐受性、耐旱性、成熟和衰老以及抗病性方面的差异。
[0080] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普 通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本 领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。以 下内容以举例说明的方式给出，而非意在限制本发明的范围。
[0081] 借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员 将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，这些公开内容 不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在本文末尾所附权利要 求的范围内。虽然本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用而不出于限 制目的。
[0082] 除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物 学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。这类技 术在文献中有完全的解释。参见例如Langenheim and Thimann，BOTANY :PLANT BIOLOGY AND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS，John Wiley (1982) (Langenheim 和 Thimann，《植物 学：植物生物学及其与人类事务的关系》，约翰威立出版社，1982年）；CELL⑶LTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS，vol. 1，Vasil，ed. (1984)(《植物细胞培养与体细胞 遗传学》，第 1 卷，Vasil 编辑，1984 年）；Stanier，et al.，THE MICROBIAL W0RLD，5thed.， Prentice-Hall (1986) (Stanier等人，《微生物世界》，第5版，普伦蒂斯?霍尔出版社， 1986 年）；Dhringra and Sinclair，BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS，CRC Press (1985) (Dhringra和Sinclair,《植物病理学基本方法》，CRC出版社，1985年）；Maniatis，et al.， MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL(1982)(Maniatis 等人，《分子克隆实验指南》， 1982 年）；DNA CLONING，vols. I and II，Glover，ed. (1985)(《DNA 克隆》，第 I 卷和 II 卷， Glover 编辑，I985 年）；0LIG0NUCLE0TIDE SYNTHESIS，Gait，ed. (1984)(《寡核苷酸合成》， Gait 编辑，1984 年）；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION，Hames and Higgins，eds. (1984)(《核 酸杂交》，Hames 和 Higgins 编辑，1984 年）和丛书 METHODS IN ENZYMOLOGY，Colowick and Kaplan，eds，Academic Press，Inc. , San Diego，CA (《酶学方法》，Colowick 和 Kaplan 编 辑，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥）。
[0083] 单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5'到3'的 方向从左向右书写；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左向右书写。数值范围包括限定 该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB 生化命名委员会（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号 表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本 说明书整体进行更完整的定义。
[0084] 在描述本发明时，将采用下面的术语，并且旨在如下文所指出的进行定义。
[0085] 所谓"微生物"意指任何微生物（包括真核微生物和原核微生物），如真菌、酵母、 细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。
[0086] 所谓"扩增"意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构 建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应（PCR) 系统、连接酶链式反应（LCR)系统、基于核酸序列的扩增（安大略省米西索加市加拿大基 因公司（Cangene，Mississauga, Ontario))、〇-β复制酶系统、基于转录的扩增系统（TAS) 和链置换扩增（SDA)。参见例如 DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY PRINCIPLES AND APPLICATIONS,Persing,et al. ,eds. ,American Society for Microbiology,Washington, DC(1993)(《诊断分子微生物学：原理和应用》，Persing等人编辑，《美国微生物学会》，华盛 顿，1993年）。扩增的产物称为扩增子。
[0087] 术语"保守修饰的变体"同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序 列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于 遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、 GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该 密码子变更为所描述的相应密码子的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为 "沉默变异"，代表保守修饰变异的一种。编码多肽的本文每种核酸序列还描述了该核酸的 每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子（除了 AUG，它通常是 甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是微球菌（Micrococcus rubens)，对于它来说GTG是甲 硫氨酸密码子（Ishizuka，et al.，（1993) J. Gen. Microbiol. 139 :425-32 (Ishizuka 等人， 1993年，《普通微生物学杂志》，第139卷，第425-432页））可进行修饰以产生功能上相同的 分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并 以引用的方式并入本文。
[0088] 对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列作出的会改 变、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各个置换、缺失或添加， 在该变更导致氨基酸为化学类似的氨基酸所置换时，为"保守修饰的变体"。因而，还可变 更选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个 变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例 如，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白质对于其天然底物的至少30%、 40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %，优选60-90 %。提供功能上相似的氨基酸的保守置换 表是本领域所熟知的。
[0089] 下面的六个组各含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：
[0090] 1)丙氨酸（A)、丝氨酸（S)、苏氨酸⑴；
[0091] 2)天冬氨酸（D)、谷氨酸（E);
[0092] 3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q);
[0093] 4)精氨酸（R)、赖氨酸⑷；
[0094] 5)异亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、甲硫氨酸（M)、缴氨酸（V);以及
[0095] 6)苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W)。
[0096] 还可参见 Creighton，PROTEINS，W. H. Freeman and Co. (1984) (Creighton，《蛋白 质》，弗里曼公司，1984年）。
[0097] 本文所用的"基本上由......组成"意指在如下情况下目标多核苷酸可包括额外 的序列：该额外的序列在严格杂交条件下不会选择性地杂交至与该多核苷酸相同的cDNA， 且该杂交条件包括在〇. IX SSC和0. 1 %十二烷基硫酸钠中在65 °C下进行的洗涤步骤。 [0098] 就指定的核酸而言，所谓"编码"意指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质 的核酸可在该核酸的翻译区内包含非翻译序列（例如内含子），或可缺少这种居间的非翻 译序列（例如，如在cDNA中）。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常， 氨基酸序列由核酸利用"通用"遗传密码来编码。然而，可使用如在某些植物、动物和真菌线 粒体、细菌山羊支原体（Mycoplasma capricolum) (Yamao，et al.，（1985)Proc. Natl. Acad. Sci.USA82 :2306-9(Yamao等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第2306-2309 页）），或纤毛虫大核（ciliate Macronucleus)中存在的通用密码的变体，当用这些生物体 表达该核酸时。
[0099] 当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密 码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表 达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量 偏好性，因为这些偏好性已被证实不同（Murray，et al.，（1989)Nucleic AcidsRes. 17: 477-98 (Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页），将其以引用的方式并 入本文）。因而，具体氨基酸的玉米偏好密码子可由来自玉米的已知基因序列得出。关于来 自玉米植物的28种基因的玉米密码子使用在Murray等人（出处同上）的表4中列出。
[0100] 如本文所用，针对核酸的"异源"为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同 物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行了实质性 修饰的核酸。例如，有效连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物 种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了实质性的修 饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对 其天然形式进行了实质性的修饰。
[0101] 所谓"宿主细胞"意指含有载体并且支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。 宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌（E. coli)，或真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物 或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，包括但不限于玉 米、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉油菜、大麦、小米和番茄。特别优选的 单子叶宿主细胞是玉米宿主细胞。
[0102] 术语"杂交复合体"包括指由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核 酸结构。
[0103] 在将核酸插入细胞的语境中，术语"引入"意指"转染"或"转化"或"转导"，包括 指核酸掺入进真核或原核细胞中，其中该核酸可掺入进细胞的基因组（例如染色体、质粒、 质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达（例如，转染的mRNA)。
[0104] 术语"分离的"指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其 天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。分离的物质任选包含未 发现在其天然环境中与其一起的物质。如本文所定义，"分离的"核酸也称为"异源"核酸。 除非另有规定，否则术语"ARGOS核酸"意指包含编码ARGOS多肽的多核苷酸（"ARGOS多核 苷酸"）的核酸。
[0105] 如本文所用，"核酸"包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合 物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其 以与天然存在的核苷酸（例如肽核酸）相似的方式杂交至单链核酸。
[0106] 所谓"核酸文库"意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且实质上代表指定生 物体的基因组的整个被转录的部分。示例性的核酸文库如基因组文库和cDNA文库的构建 在标准的分子生物学参考书有教导，如Berger and Kimmel，⑶IDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES (Berger 和 Kimmel，《分子克隆技术指南》），选自丛书 METHODS IN ENZYM0L0GY， vol. 152, Academic Press，Inc.，San Diego, CA (1987)(《酶学方法》，第 152 卷，学术出版社， 加利福尼亚州圣地亚哥，1987 年）；Sambrook，et al.，MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，2nded.，vols. 1-3(1989) (Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，第1-3卷， 1989 年）；以及 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY，Ausubel，etal.，eds，Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley&Sons，Inc. (1994Supplement)(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑， 选自《实验室指南》，格林出版联合公司与约翰威立父子出版公司的合资公司）。
[0107] 如本文所用，"有效连接"包括指第一序列（如启动子）和第二序列之间的功能性 连接，其中启动子序列起始或介导对应第二序列的DNA的转录。一般来讲，有效连接意指被 连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相 同的阅读框内。
[0108] 如本文所用，术语"植物"包括指整个植物、植物器官（例如叶、茎、根等）、种子 和植物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生 组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物 种类通常与适用于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包 括以下属的种：南瓜属（Cucurbita)、蔷薇属（Rosa)、葡萄属（Vitis)、胡桃属（Juglans)、 草莓属（Fragaria)、百脉根属（Lotus)、苜猜属（Medicago)、驴食草属（Onobrychis)、三 叶草属（Trifolium)、胡芦巴属（Trigonella)、紅豆属（Vigna)、柑桔属（Citrus)、亚麻 属（Linum)、老鹳草属（Geranium)、木薯属（Manihot)、胡萝卜属（Daucus)、拟南芥属（拟 南芥）、芸苔属（Brassica)、萝卜属（Raphanus)、白芥属（Sinapis)、颠爺属（Atropa)、辣 椒属（Capsicum)、曼陀罗属（Datura)、天仙子属（Hyoscyamus)、番爺属（Lycopersicon)、 烟草属（Nicotiana)、爺属（爺属）、碧冬爺属（Petunia)、毛地黄属（Digitalis)、马珠草 属（Majorana)、菊苣属（Ciahorium)、向日葵属（Helianthus)、莴苣属（Lactuca)、雀麦 属（Bromus)、天门冬属（Asparagus)、金鱼草属（Antirrhinum)、萱草属（Heterocallis)、 Nemesis、天竺葵属（Pelargonium)、黍属（Panteum)、狼尾草属（Pennisetum)、毛茛属 (Ranunculus)、千里光属（Senecio)、蛾蝶花属（Salpiglossis)、黄瓜属（Cucumis)、布洛 华丽属（Browaalia)、大豆属（Glycine)、豌豆属（Pisum)、菜豆属（Phaseolus)、黑麦草 属（Lolium)、稻属（Oryza)、燕麦属（Avena)、大麦属（Hordeum)、黑麦属（Secale)、葱属 (Allium)和小麦属（Triticum)。特别优选的植物是玉米（Zea mays)。
[0109] 如本文所用，"产量"包括指收获时针对谷粒水分（通常是15% )进行了调整后的 每英亩谷类作物的蒲式耳数。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的经调整的测试重 量确定为针对收获时的谷粒水分水平进行了调整的重量，单位磅/蒲式耳。
[0110] 如本文所用，"多核苷酸"包括指脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，所 述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质：在严格杂交条件下其所杂交的核苷 酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻译成与天然存在 的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因 的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括指指定的序列及其互补序列。因 而，为了稳定性或为了其他原因对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在本文所意指 的"多核苷酸"。此外，包含稀有碱基（如次黄嘌呤核苷）或修饰碱基（如三苯甲基化的碱 基）（仅举两个例子）的DNA或RNA是多核苷酸（如该术语在本文所用的）。应当理解，已 对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。本 文所用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这类经化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，以及 病毒和细胞（包括特别是简单细胞和复杂细胞）特征性的DNA和RNA的化学形式。
[0111] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这 些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物 的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0112] 本文所用的"启动子"包括指DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋 白质的识别和结合以起始转录的区域。"植物启动子"是能够引发在植物细胞中的转录的启 动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基 因的细菌获得的那些启动子，所述细菌如农杆菌（Agrobacterium)或根瘤菌（Rhizobium)。 例子为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转 录的启动子。这种启动子被称为"组织偏好的"。"细胞类型"特异性启动子主要驱动在一 个或多个器官中某些细胞类型中的表达，例如根或叶中的维管细胞。"诱导型"或"调控型" 启动子是处于环境控制下的启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件的例 子包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程 中驱动表达的启动子。组织偏好的、细胞类型特异性的、发育调节的和诱导型的启动子构成 了"非组成型"启动子类别。"组成型"启动子是在大多数环境条件下活跃的启动子。
[0113] 术语"ARGOS多肽"指一条或多条氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源 物、等位基因或前体（例如原前蛋白或前蛋白）。"ARGOS蛋白"包括ARGOS多肽。除非另有 规定，否则术语"ARGOS核酸"意指包含编码ARGOS多肽的多核苷酸（"ARGOS多核苷酸"） 的核酸。
[0114] 如本文所用，"重组的"包括指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者 源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然（非重组）形式的细 胞内的相同形式存在的基因，或因为蓄意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本 不表达的天然基因。本文所用的术语"重组的"不涵盖通过天然发生的事件（例如自发突 变、天然转化/转导/转座）进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干 预的情况下发生的那些。
[0115] 本文所用的"重组表达盒"是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产 生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、 线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达 盒部分还包含待转录的核酸和启动子。
[0116] 术语"残基"或"氨基酸残基"或"氨基酸"在本文中可互换使用，指掺入进蛋白质、 多肽或肽（统称"蛋白质"）中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外进行 限制，否则可涵盖可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸已知类似 物。
[0117] 应当理解，本领域的技术人员将会知道，本发明不仅仅涵盖特定的示例性序列。在 给定位点产生化学等同的氨基酸，但不影响编码多肽的功能特性的核酸片段变化是本领域 熟知的。例如，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可被编码另一个疏水性较小的残基例如甘氨酸， 或疏水性较大的残基例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子置换。类似地，还可预期一个 带负电的残基置换为另一个，例如天冬氨酸置换为谷氨酸，或一个带正电的残基置换为另 一个，例如赖氨酸置换为精氨酸的变化产生功能等同的产物。还可预期使多肽分子的N-端 和C-端部分改变的核苷酸变化不会改变多肽的活性。每个所推荐的改变均在本领域的常 规技术内，正如确定编码产物的生物活性的保留。
[0118] 本发明的蛋白质也可以是包含这样氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列包含选 自表1中列出的SEQ ID N0的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、置换、插入和/或 添加。置换可以是保守的，意指某氨基酸残基被另一个具有类似物理和化学特性的残基替 代。保守置换的非限制性例子包括含脂族基团氨基酸残基例如Ile、Val、Leu或Ala之间的 替代，以及极性残基之间的替代，例如Lys-Arg、Glu-Asp或Gln-Asn替代。
[0119] 来源于氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的蛋白质可在编码其野生型蛋白质 的DNA受到例如已知的定点诱变时制备（参见例如Nucleic Acid Researchl0(20): 6487-6500 (1982)(《核酸研究》，第10卷，第20期，第6487-6500页，1982年），该文献全文 据此以引用方式并入）。如本文所用，术语"一个或多个氨基酸"旨在意指可通过定点诱变 缺失、置换、插入和/或添加的氨基酸的可能数量。
[0120] 定点诱变可以例如如下使用与待突变的单链噬菌体DNA互补，不同的是具有特定 错配（即，所需突变）的合成寡核苷酸引物实现。也就是说，上述合成寡核苷酸用作引起互 补链通过噬菌体合成的引物，然后所得的双链DNA用于转化宿主细胞。将转化细胞培养物 置于琼脂上，从而允许噬菌斑从含噬菌体的单个细胞形成。因此，理论上，50%的新菌落包 含突变为单链的噬菌体，而其余50 %具有原始序列。在允许与具有上述所需突变的DNA完 全相同的DNA杂交，但不与具有原始链的DNA杂交的温度下，允许所得的噬菌斑与通过激酶 处理标记的合成探针杂交。随后，拾取与探针杂交的噬菌斑并培养以收集其DNA。
[0121] 允许生物活性肽例如酶的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸缺失、置换、插入和/ 或添加，同时保持其活性的技术包括上述定点诱变，以及其他技术，例如用诱变剂处理基因 的那些，以及其中基因选择性裂解以移除、置换、插入或添加所选的一个或多个核苷酸然后 连接的那些。
[0122] 本发明的蛋白质也可以是包含这样的核苷酸序列的核酸编码的蛋白质，其包含选 自表1中列出的SEQ ID N0的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的缺失、置换、插入和/或 添加。核苷酸缺失、置换、插入和/或添加可通过定点诱变或上述其他技术实现。
[0123] 本发明的蛋白质也可以是包含这样的核苷酸序列的核酸编码的蛋白质，其在严格 条件下与选自表1中列出的SEQ ID N0的核苷酸序列的互补链杂交。
[0124] 术语"在严格条件下"意指两个序列在中等或高度严格条件下杂交。更具体地 讲，本领域的普通技术人员可以例如根据DNA的长度轻松地确定中等严格条件。基本 条件在 Sambrook, et al. , Molecular Cloning ：ALaboratory Manual, third edition, chapters6and7, Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001 (Sambrook 等人，《分子克隆 实验指南》，第三版，第6和7章，冷泉港实验室出版社，2001年）中示出，并且包括使用硝化 纤维过滤器的预洗涤溶液5xSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)，约50%甲酰胺、2xSSC至 6xSSC、约40-50°C的杂交条件（或其他类似杂交溶液，例如Stark溶液，约50%甲酰胺、约 42°C )以及例如约40-60°C、0. 5-6xSSC、0. 1 % SDS的洗涤条件。优选地，中等严格条件包括 在约50°C和6xSSC下杂交（和洗涤）。本领域的技术人员也可以例如根据DNA的长度轻松 地确定高度严格条件。
[0125] 一般来讲，此类条件包括与中等严格条件相比，在较高温度和/或较低盐浓度下 杂交和/或洗涤（例如在约65°C，6xSSC至0. 2xSSC，优选地6xSSC，更优选地2xSSC，最优选 地0. 2xSSC下杂交）。例如，高度严格条件可包括如上所定义的杂交，并且在大约65-68°C、 0. 2xSSC、0. 1%SDS下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中SSPE(lxSSPE为0. 15M NaCl、10mM NaH2P04 和 1. 25mM EDTA，pH7. 4)可代替 SSC(lxSSC 为 0. 15M NaCl 和 15mM 柠檬酸钠）；在 杂交完成后进行洗漆15分钟。
[0126] 使用商购获得的杂交试剂盒也是可能的，其不使用放射性物质作为探针。具体例 子包括用ECL直接标记和检测系统（安玛西亚公司（Amersham))杂交。严格条件包括例如 使用包括在试剂盒中的杂交缓冲液在42°C下杂交4小时，该缓冲液补充有5% (w/v)阻断 试剂和0. 5M NaCl，并且在0. 4% SDS、0. 5xSSC中55°C下洗涤20分钟两次，在2xSSC中室温 下洗涤5分钟一次。
[0127] 术语"选择性杂交"包括指在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交 的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高（例如，至少2倍于背景），并且基本上排 除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40 %的序列同一性，优选60-90 %的 序列同一'丨生，最优选1〇〇%的序列同一'I"生（即互补性）。
[0128] 术语"严格条件"或"严格杂交条件"包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与 其他序列杂交的程度可检测地更高（例如，至少2倍于背景）的条件。严格条件是序列依 赖性的，并且将在不同环境下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针 可最高达100%互补的靶序列（同源探测）。或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一 些错配，从而检测到较低程度的相似性（异源探测）。优选地，探针长为大约500个核苷酸， 但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
[0129] 如本文所用，"转基因植物"包括指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般 来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多 核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。"转基因" 在本文中用来包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、 组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进 行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。本文所用的术语"转基因"不涵盖通过常规 植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或 自发突变之类的自然发生事件导致的基因组（染色体基因组或染色体外基因组）的改变。
[0130] 如本文所用，"载体"包括指用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。 载体常常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。
[0131] 以下术语用于说明两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a) "参 考序列"、（b) "比较窗口"、（c) "序列同一性"、（d) "序列同一性百分比"和（e) "实质上相 同"。
[0132] 如本文所用，"参考序列"是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指 定序列的子集或全部；例如全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
[0133] 如本文所用，"比较窗口 "意指包括指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该 比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列（不包含添加或缺失）可包含添加或缺失 (即空位），以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸， 任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中 纳入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
[0134] 将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。局部同源性算 法（BESTFIT)(Smith and Waterman,(1981)Adv.Appl.Math2 :482(Smith 和 Waterman,1981 年，《应用数学进展》，第2卷，第482页））可以对用于比较的序列进行最佳比对；Needleman and Wunsch, (1970)J. 1\1〇1.13;[01.48:443-53(他6(1161]^11和￥11118(311，1970 年，《分子生物 学杂志》，第48卷，第443-453页）的同源性比对算法（GAP);相似性搜索方法（Tfasta 和 Fasta) (Pearson and Lipman，（1988) Proc. Natl. Acad. Sci.USA85 :2444 (Pearson 和 Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页））；这些算法的计算机化实施 包括，但不限于：加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司（Intelligenetics，Mountain View，California)的PC/Gene程序中的CLUSTAL，威斯康星遗传学软件包（Wisconsin GeneticsSoftware Package?:)第8版（可得自遗传学计算机组，GCX}?:程序，加利福尼 亚州圣地亚哥 Accelrys 公司（Genetics Computer Group，GCG'、programs，Accelrys， Inc.，San Diego, CA))中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA。CLUSTAL 程序由如下 文献详细说明：Higginsh and Sharp，（1988)Gene73:237_44(Higgins 和 Sharp，1988 年， 《基因》，第 7 卷，第 237_244 页）；Higgins and Sharp，（l989)CABIOS5:l5l_3(Higgins 和 Sharp, 1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页）；Corpet，et al.， (1988) Nucleic Acids Res. 16 :10881-90 (Corpet 等人，1988 年，《核酸研究》，第 16 卷，第 10881-10890 页）；Huang,et al·, (1992)Computer Applications in the Biosciences8: 155-65 (Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页）以及 Pearsonet al·，（1994)Meth. Mol. Biol. 24 :307-31 (Pearson 等人，1994 年，《分子生物学方 法》，第24卷，第307-331页）。用于多个序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp (Feng and Doolittle，（1987) J. Mol. Evol·，25 :351-60 (Feng 和 Doolittle，1987 年，《分子进 化学杂志》，第 25 卷，第 351-360 页），其类似于 Higgins and Sharp，（1989)CABI0S5: 151-53 (Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页） 中描述的方法，将文献以引用的方式并入本文。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程 序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷 酸查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白质查询序列针对蛋白质数 据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白质查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；以及 TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Chapterl9, Ausubel, et al. , eds., Greene Publishing and Wiley_Interscience，New York(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第19章 ，Ausubel 等人编辑，格林出版和威利-英特科学出版公司，纽约，1995年）。
[0135] GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上）的算法来寻找两个完整序列的比对，该 比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大 数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和 空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择 大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚 分。威斯康星遗传学软件包（Wisconsin Genetics Software Package^ )第10版中的默 认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自 0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、30、40、50 或更大。
[0136] GAP给出具有最佳比对的家族中的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其 他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。 品质是为了比对序列而最大化的度量（metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同 一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应 于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值）时，评定为 相似性。威斯康星遗传学软件包（Wisconsin Genetics Software Package1' )第10版中 所用的评分矩阵为 BL0SUM62(参见 Henikoff and Henikoff，（1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA89 :10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915 页））。
[0137] 除非另外指明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2. 0程 序包，采用默认参数获得的值（Altschul，et al.，（1997)Nucleic Acids Res. 25 : 3389-402 (Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页）。
[0138] 如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白质可以随机序列建模。然 而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种 或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的 其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单 独使用或联合使用 SEG(Wooten and Federhen，（1993)Comput.Chem. 17 :149-63 (Wooten 和 Federhen，1993 年，《计算化学》，第 17 卷，第 149-163 页））和 XNU (Claverie and States, (1993) Comput. Chem. 17 :191-201 (Claverie 和 States，1993 年，《计算化学》，第 17 卷，第 191-201页））低复杂性过滤程序。
[0139] 在两条核酸或多肽序列的情形中，本文所用的"序列同一性"或"同一性"是指当在 指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分 数针对蛋白质使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基 酸残基由具有相似化学性质（例如电荷或疏水性）的其他氨基酸残基置换，因此不会改变 分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的 保守性质。差别在于这种保守置换的序列被说成具有"序列相似性"或"相似性"。作出这 个调节的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不 是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守 置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据Meyers and Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4 :ll_17(Meyers 和 Miller，1988 年，《计算机在生物科学中的 应用》，第4卷，第11-17页）的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE (美国加利 福尼亚州山景城 Intelligenetics 公司(Intelligenetics, Mountain View, California, USA))中所实现的。
[0140] 本文所用的"序列同一性百分数"意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序 列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列（不包含添加或缺 失）相比包含添加或缺失（即空位），以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的： 确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数 目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序 列同一性百分数。
[0141] 术语多核苷酸序列的"实质上相同"意指利用所描述的比对程序之一采用标准参 数与参考序列比较时，多核苷酸包含具有50-100%之间的序列同一性，优选至少50%的序 列同一'I"生，优选至少60 %的序列同一'丨生，优选至少70 %，更优选至少80 %，更优选至少90 % 且最优选至少95%序列同一性的序列。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨 基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相 应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指55-100%之间的序列同一 性，优选至少55 %，优选至少60 %，更优选至少70 %、80 %、90 %，最优选至少95 %。
[0142] 在肽的情形中，术语"实质相同"指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有 55-100%之间的序列同一性；优选与参考序列具有至少55%的序列同一性，优选60%，优 选70%，更优选80%，最优选至少90 %或95 %的序列同一性。优选地，利用Needleman和 mmsch(出处同上）的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是实质上相同的指示是，一 种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别 仅在于保守置换的话，则这两种肽实质上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守 变化时，如果抗体识别的表位实质上相同，则它们实质上相同。"实质上相似的"肽共有如上 所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。
[0143] 本发明公开了 ARGOS多核苷酸和多肽。本发明的新型核苷酸和蛋白质具有表明它 们调控细胞数量并因而在植物发育中起重要作用的表达模式。该多核苷酸在多种植物组织 中表达。该多核苷酸和多肽因而提供了操纵植物发育来改变种子和营养组织发育、时间安 排或组成的机会。这可用于产生不育植物、无种子植物或具有改变的胚乳组成的植物。
[0144] 核酸
[0145] 本发明特别提供包括ARGOS多核苷酸在内的RNA、DNA及它们的类似物和/或嵌合 体的分离的核酸。
[0146] 本发明还包括为在不同生物体中表达而经优化的多核苷酸。例如，对于多核苷酸 在玉米植物中的表达，可变更该序列以解决特定的密码子偏好性和改变GC含量，如根据 Murray等人（出处同上）所述。关于来自玉米植物的28种基因的玉米密码子使用在Murray 等人（出处同上）的表4中列出。
[0147] 本发明的ARGOS核酸包括分离的ARGOS多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0148] (a)编码ARGOS多肽及其经保守修饰的和多态性的变体的多核苷酸；
[0149] (b)与（a)或（b)的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；
[0150] (c) (a)或（b)的多核苷酸的互补序列。
[0151] 下面的表1列出了本文公开的多核苷酸和多肽的具体成份
[0152] 表 1·
[0153]

【权利要求】
1. 一种调节植物中乙烯敏感性的方法，包括： a. 在植物细胞中引入包含编码跨膜蛋白质的多核苷酸的重组构建体，所述跨膜蛋白质 包含具有序列PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的脯氨酸富含基序，其中所述脯氨酸富含结构域位 于第一跨膜序列与第二跨膜序列之间，所述多核苷酸可操作地连接至启动子；以及 b. 表达所述多核苷酸以调节所述植物中的乙烯敏感性的水平。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述脯氨酸富含基序（PRM)序列包括： a. 原始 PRM(SEQ ID N0:88)，或 b. 变体 PRM(SEQ ID N0:102)。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、高粱、卡诺拉油菜、小 麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米、花生、甘蔗、芒草、禾本科、可可、亚麻荠、番薯和茄属。
4. 一种调节植物中乙烯敏感性的方法，包括： a. 在植物细胞中引入包含编码TPT结构域的多核苷酸的核苷酸构建体，所述TPT结构 域与TM1SEQ ID N0:90或TM2SEQ ID N0:91具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸可操 作地连接至启动子，所述TPT结构域还包括根据权利要求2中所述的脯氨酸基序；以及 b. 将所述植物种植在干旱或低氮条件下。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、高粱、卡诺拉油菜、小 麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米、花生、甘蔗、禾本科、可可、亚麻荠、番薯和茄属。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述植物细胞来自玉米。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述乙烯敏感性降低。
9. 根据权利要求1所述的方法,其中所述构建体为过表达构建体。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述构建体包含SEQ ID NO :88或SEQ ID NO: 102。
11. 一种根据权利要求1所述的方法产生的转基因植物。
12. 根据权利要求1所述的转基因植物，其中当与未转化的植物相比时，所述植物具有 降低的乙烯敏感性。
13. 根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述植物具有降低的对非生物胁迫的敏 感性。
14. 根据权利要求11所述的转基因植物，其中所述植物具有降低的对干旱胁迫的敏感 性。
15. 根据权利要求11所述的转基因植物，其中所述植物具有降低的对拥挤胁迫的敏感 性。
16. 根据权利要求11所述的转基因植物，其中所述植物具有降低的对淹水胁迫的敏感 性。
17. -种分离蛋白质，其包含选自下列的成员： a. 来自SEQ ID NO :89的多肽的至少20个连续氨基酸的多肽； b. SEQ ID NO :89 的多肽； c. 与SEQ ID NO :89的多肽具有至少80%序列同一性且与其具有共同的至少一个线性 表位的多肽，其中所述序列同一性使用BLAST2. 0在默认参数下测定；以及 d.根据权利要求1所述的成员所编码的至少一个多肽。
18. -种分离的多核苷酸序列，其编码具有乙烯调控活性且具有SEQ ID NO :89的序列 的蛋白质。
19. 一种具有乙烯调控活性且具有SEQ ID NO :89的所述序列的多肽。
20. -种增加作物植物的产量的方法，所述方法包括 a. 表达包含编码跨膜蛋白质的多核苷酸的重组构建体，所述跨膜蛋白质包含具有序列 PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的脯氨酸富含基序，其中所述脯氨酸富含结构域位于第一跨膜序 列和第二跨膜序列之间，所述多核苷酸可操作地连接至启动子；以及 b. 增加所述作物的所述产量，其中所述产量在低于正常氮水平下增加。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述较低氮水平与正常氮水平相比少约10%至 约 40%。
22. 根据权利要求20所述的方法，其中所述作物是玉米。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述玉米是杂交玉米。
24. -种改善玉米植物的农艺参数的方法，所述方法包括 a. 表达包含编码跨膜蛋白质的多核苷酸的重组构建体，所述跨膜蛋白质包含具有序列 PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的脯氨酸富含基序，其中脯氨酸富含结构域位于第一跨膜序列和 第二跨膜序列之间，所述多核苷酸可操作地连接至启动子；以及 b. 改善至少一个选自根生长、苗生物量、根生物量、籽粒数、穗大小和干旱胁迫的农艺 参数。
25. 根据权利要求22所述的方法，其中所述农艺参数在低氮水平下改善。
26. -种玉米植物的标记辅助选择的方法，所述玉米植物表现出改变的内源基因表达 模式，所述方法包括： a. 获得在编码跨膜蛋白质的多核苷酸的基因组区域中包含等位变异的玉米植物，所述 跨膜蛋白质包含具有序列PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的脯氨酸富含基序，其中所述多核苷酸 的表达与不具有所述变异的对照玉米植物相比增加； b. 选择包含所述变异的所述玉米植物；以及 c. 通过标记辅助选择方法建立包含所述变异的玉米植物的群体。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述变异存在于所述基因组区的所述调控区。
28. 根据权利要求26所述的方法，其中所述变异存在于所述多核苷酸的所述编码区。
29. 根据权利要求26所述的方法，其中所述变异存在于所述基因组区的所述非编码 区。
30. 根据权利要求26所述的方法，其中所述多核苷酸的所述表达在不同遗传背景下差 别性地增加。
【文档编号】C12N15/82GK104093842SQ201280053864
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年10月29日 优先权日:2011年10月31日
【发明者】R.L.阿奇巴德, 郭梅, R.古普塔, M.鲁佩, K.舍尔林, 史金瑞, C.R.西蒙斯, 王海音, 武璟瑞 申请人:先锋国际良种公司