在氮限制条件下具有改变的农学特性的植物以及涉及编码lnt2多肽及其同源物的基因的...的制作方法

专利名称：在氮限制条件下具有改变的农学特性的植物以及涉及编码lnt2多肽及其同源物的基因的 ...的制作方法
技术领域：
本发明领域涉及植物育种和遗传学，具体地讲涉及植物中可用的赋予氮利用效率 和/或氮限制条件耐受性的重组DNA构建体。
背景技术：
世界范围内非生物胁迫显著地限制了作物产量。据评估这些因素累积地造成平均 70%的农业产量减少。植物是固着的，必须适应它们周边的主要环境条件。这已经导致它 们发展出基因调控、形态发生、和代谢的高可塑性。适应和防御机制策略涉及激活编码对适 应或防御不同胁迫重要的蛋白。植物氮吸收在它们的生长中起到重要作用(Gallais等人，J. Exp. Bot. 55(396) 295-306(2004))。植物从环境中的无机氮合成氨基酸。因此，氮肥已经成为提高栽培植物如 玉米和大豆的产量有力工具。为了避免硝酸盐污染并保持足够的利润率，如今农民期望减 少氮肥的使用。如果能提高植物的氮同化能力，然后就能期望植物生长和产量的提高。概 括地说，具有更好的氮利用效率(NUE)的植物品种是所期望的。可利用激活标记来鉴定能影响性状的基因。已经在模型植物拟南芥属中使用该方 法(Weigel等人，Plant Physiol. 122 1003-1013 (2000))。插入转录增强子元件能够显著 激活和/或提高附近内源基因的表达。该方法能被用于鉴定某一性状(例如植物的氮利用 效率)的受关注的基因，当所述基因经转基因进入生物中时能改变该性状。发明概述本发明包括在一个实施方案中，在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建 体包含可操作地连接至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多 肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或32进行 比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的 对照植物进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。在另一个实施方案中，在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构建 体包含(a)可操作地连接至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所 述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32进 行比较时具有至少50%的序列同一性；或(b)抑制DNA构建体，所述构建体包含至少一个调控元件，所述调控元件可操作地 连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于Clustal V比对方法在与SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少50% 的序列同一性，或⑶核酸序列(b)⑴㈧的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因 的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或 部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2或LNT2样多肽，并且其中在与不包含所述重组构 建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。在另一个实施方案中，增加植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组 DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调 控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID N0:18、20、24、26、28、30、或 32进行比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同 一性；(b)在步骤(a)后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其 基因组中包含该重组DNA构建体并且在与不包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出增 加的氮胁迫耐受性；并且任选地，(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植 物在其基因组中包含该重组DNA构建体，并且在与不包含该DNA构建体的对照植物比较时 表现出增加的氮胁迫耐受性。在另一个实施方案中，评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组 DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调 控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID N0:18、20、24、26、28、30、或 32进行比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同 一性；(b)在步骤(a)后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其 基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与不包含该重组DNA构建 体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性；以及任选地，(d)获得源自该转基因植物的子 代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及任选地，(e)评价该子 代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。在另一个实施方案中，评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组 DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调 控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID N0:18、20、24、26、28、30、或 32进行比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同 一性；(b)在步骤(a)后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其 基因组中包含该重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物 在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)评价该转子代植物在与不包含该重组DNA 构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性；在另一个实施方案中，测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将重组 DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调 控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或 32进行比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同 一性；(b)在步骤(a)后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其 基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)确定该转基因植物在与不包含该重组DNA构建 体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变；以及任选地，(d)获得源自该 转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及任选 地，(e)确定所述子代植物任选地在氮限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植 物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。在另一个实施方案中，测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调 控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或 32进行比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同 一性；(b)在步骤(a)后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其 基因组中包含该重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物 在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)确定所述子代植物任选地在氮限制条件下 与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。在另一个实施方案中，确定植物农学特征改变的方法，该方法包括(a)将包含至少一个调控元件的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该 调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分㈧编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少 50%的序列同一性，或(B)核酸序列(b) (i) (A)的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域 所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核 酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2或LNT2样多 肽；(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)确定该转基因植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现 出至少一种农学特性的改变；以及(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含 该抑制DNA构建体；以及任选地，(e)确定所述子代植物任选地在氮限制条件下与不包含所述抑制 DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。在另一个实施方案中，确定植物农学特征改变的方法，该方法包括(a)将包含至少一个调控元件的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该 调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分㈧编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少 50%的序列同一性，或(B)核酸序列(b) (i) (A)的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域 所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核 酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2或LNT2样多 肽；(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植 物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物进行 比较时表现出至少一种农学性状的改变；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)确定该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出 至少一种农学特性的改变。以及任选地，(e)确定所述转基因植物任选地在氮限制条件下与不包含所述重组 DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。在另一个实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)编码 多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列和SEQID NO :18、24、或26的氨基酸序列 基于 Clustal V 比对方法具有至少 85 %、86 %、87 %、88 %、89 %、90 %、91 %、92 %、93 %、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，或(b)所述核苷酸序列的互补 序列，其中所述核苷酸序列及其互补序列包含相同数目的核苷酸并且是100%互补的。在一 个实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO :18、24、或26的氨基酸序列，并且该核苷酸序列包 含SEQ ID NO :17、23、或25的核苷酸序列。附图简沭图表以及序列表根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描 述和附图以及序列表形成本申请的一部分。

图1示出pHSbarENDs2活化标记构建体的图谱，该构建体用于制备拟南芥属种群 (SEQ ID NO 1)ο图 2 示出载体 pDONR Zeo (SEQ ID NO 2)，GATEWAY 供体载体的图谱。attPl 位 点位于核苷酸570-801 ；attP2位点位于核苷酸2754-2985 (互补链)。图 3 示出载体 pDONR 221 (SEQ ID NO 3)，GATEWAY 供体载体的图谱。attPl 位 点位于核苷酸570-801 ；attP2位点位于核苷酸2754-2985 (互补链)。图4示出载体pBC-yell0W(SEQ ID NO 4)的图谱，该载体是用于构建拟南芥属表 达载体的目的载体。attRl位点位于核苷酸11276-11399(互补链)；attR2位点位于核苷 酸9695-9819 (互补链)。图5示出载体PHP27840 (SEQ ID NO 5)的图谱，该载体是用于构建大豆表达载体 的目的载体。attRl位点位于核苷酸7310-7434 ；attR2位点位于核苷酸8890-9014。图6示出载体PHP23236(SEQ ID NO 6)的图谱，该载体是用于构建Gaspe Flint 来源的玉米品系的表达载体的目的载体。attRl位点位于核苷酸2006-2130 ；attR2位点位 于核苷酸2899-3023。图7示出载体PHP10523 (SEQ ID NO :7)的图谱，该载体是存在于农杆菌菌 株 LBA4404 中的质粒 DNA(Komari 等人，Plant J. 10 165-174(1996) ；NCBI 通用标识符 59797027)。图8示出PHP23235(SEQ ID NO 8)的图谱，它是用于构建目的载体PHP23236的载体。图 9 示出载体 PHP20234(SEQ ID NO 9)的图谱。图10示出目的载体PHP22655(SEQ ID NO 10)的图谱。图11示出用于筛选的五个品系(标记为1至5，每个品系有^一个个体)，加上 野生型对照品系Cl (九个个体)的典型网格图案。图12示出通过图像分析测定的若干个不同硝酸钾浓度对植物颜色的效应。绿色区(色调50至66)对氮剂量的响应证明该区能被用于指示氮同化作用。图13为实施例18中用于半水栽玉米生长的培养基。图 14A 禾口 14B 示出拟南芥 LNT2 多肽(SEQ ID NO 28)和 LNT2 同源物(SEQ ID NO 18、20、24、26、30、32、33、和34)的全长氨基酸序列的多重比对。图15示出图14A和14B中显示的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值 的图表。图16示出在氮减少条件下(ImM KNO3)和最佳氮(6. 5mM KNO3)条件下筛选Gaspe Flint来源的玉米品系的结果。评估四个包含PHP29689的事件的多个性状。事件平均值与 分离无效植物的平均值比较。使用P值< 0. 1作为临界值。图17示出在氮减少条件下(ImM KNO3)和最佳氮(6. 5mM KNO3)条件下筛选Gaspe Flint来源的玉米品系的结果。分析中考虑了所有包含PHP29689的事件。将每个变量的构 建体平均值和无效构建体的平均值比较。使用P值0. 1作为临界值。图18示出包含PHP28840的植物在低氮条件下的产量试验。用灰色显示的产量值 代表显著的增加，用黑色显示的产量值代表显著的减少。剩余的值代表非显著的差异。图19示出包含PHP28841的植物在低氮条件下的产量试验。用灰色显示的产量值 代表显著的增加，用黑色显示的产量值代表显著的减少。剩余的值代表非显著的差异。图20示出包含PHP28840的植物在标准氮条件下的产量试验。用灰色显示的产量 值代表显著的增加，用黑色显示的产量值代表显著的减少。剩余的值代表非显著的差异。图21示出包含PHP28841的植物在标准氮条件下的产量试验。用灰色显示的产量 值代表显著的增加，用黑色显示的产量值代表显著的减少。剩余的值代表非显著的差异。图 22 示出包含 PHP28840 (表达盒=lnt2_3)或 PHP28841 (表达盒=lnt2_2)的 植物的NUE幼苗测定结果。序列描述以及相关联的序列表遵循如37 C. F. R. § 1. 821-1. 825中所列出的管理 专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字 母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Res. 13 3021-3030(1985)以及在 Biochemical J. 219(2) :345_373 (1984)中描述，将这两 篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § 1.822中示出的规则。表1列出了本文所述的某些多肽、包含编码多肽全部或其主要部分的核酸片段的 cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的对应标识符(SEQ ID NO:)。^ 1耐低氮蛋白(LNT)
11I ι I 克隆命名 ISEQ ID NO 核苷酸 I■酸I LNT2 样cpglc.pk013.o6:fis j1718I LNT2 样rcaln.pk001.f6:fis |19 I20I LNT2 样I sfllnl.pk002.jl |21 II LNT2 样I sdslf.pk001.k5 |22 ISEQ ID NO :1是pHSbarENDs2激活标记载体(图1)的核苷酸序列。SEQ ID NO 2是pD0NR Zeo构建体的核苷酸序列(图2)。SEQ ID NO 3是pD0NR 221构建体的核苷酸序列(图3)。SEQ ID NO 4是pBC-yellow载体(图4)的核苷酸序列。SEQ ID NO 5是PHP27840载体(图5)的核苷酸序列。SEQ ID NO :6是目的载体PHP23236的核苷酸序列(图6)。SEQ ID NO 7是PHP10523载体(图7)的核苷酸序列。SEQ ID NO 8是PHP23235载体的核苷酸序列(图8)。SEQ ID NO 9是PHP20234载体的核苷酸序列(图9)。SEQ ID NO 10是目的载体PHP22655的核苷酸序列(图10)。SEQ ID NO 11是用于替代在pHSbarENDs2的位点5775处的PacI限制性位点的 多接头核苷酸序列。SEQ ID NO 12是attBl序列的核苷酸序列。SEQ ID NO 13是attB2序列的核苷酸序列。SEQ ID NO 14是入门克隆PHP23112的核苷酸序列。SEQ ID NO 15是实施例5中的正向引物VC062。SEQ ID NO 16是实施例5中的反向引物VC063。SEQ ID NO 17-22 (参见表 1)。SEQ ID NO :23是重叠群的共有核苷酸序列，本文称为PS0415619，它包含 BI316280(NCBI 通用标识号 14990607)、CD401485 (NCBI 通用标识号 31459457)和 sfllnl. pk002. jl(SEQ ID NO :21)。SEQ ID NO :24是由PS0415619(SEQ ID NO 23)编码的多肽的核苷酸序列。SEQ ID NO :25是重叠群的共有核苷酸序列，本文称为PS0415620，它包含 CX548557 (NCBI 通用标识号 57575582)和 sdslf. pkOOl. k5 (SEQID NO 22)。SEQ ID NO 26是由PS0415620 (SEQ ID NO 25)编码的多肽的核苷酸序列。SEQ ID NO 27 是编码拟南芥“unknown 蛋白”(LNT2) (At5g50930 ；NCBI 通用标识 号145359102)的基因的核苷酸序列。SEQ ID NO 28 是拟南芥“unknown 蛋白” (LNT2) (At5g50930 ；NCBI 通用标识号 15241317)的氨基酸序列。SEQ ID NO 29是At5g50930的选择性剪接变体(本文称为“lnt2_2” )的核苷酸序列。
SEQ ID NO :30是由lnt2_2 (SEQ ID NO :29)编码的多肽的氨基酸序列，本文称为 “LNT2-2”。SEQ ID NO :31是At5g50930的第二选择性剪接变体(本文称为“lnt2_3” )的核
苷酸序列。SEQ ID NO :32是由lnt2_3 (SEQ ID NO :29)编码的多肽的氨基酸序列，本文称为 “LNT2-3”。SEQ ID NO :32基于Clustal V比对方法，使用预设参数与EP1033405中的SEQ ID NO :52198进行比对，结果100%相同。SEQ ID NO :33是水稻“unknown蛋白”(NCBI通用标识号38347162)的氨基酸序 列。SEQ ID NO 34是葡萄“假定蛋白” (NCBI通用标识号147791927)的氨基酸序列。SEQ ID NO :35是At5g50930_5，attB正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO :36是At5g50930_3，attB反向引物的核苷酸序列。其它实施方案的具体描述本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本文。如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义， 除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个 细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。如本文所用“氮限制条件”指其中可用氮总量(例如来自硝酸盐、氨、或其它已知氮源的氮)不 足以维持植物的最佳生长和发育的条件。本领域的技术人员将会识别其中总可用氮足以维 持植物最佳生长和发育的条件。本领域的技术人员将会识别什么组成足够量的总可用氮， 什么组成用于向植物提供氮的土壤、培养基和肥料输入。取决于许多因素，氮限制条件将发 生变化，包括但不限于特定的植物和环境条件。“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时 的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养 组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种 子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白 质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏抗性、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、和穗长。“收获指数”指粒重除以总株重。“lnt2” 指拟南芥基因位点 At5g50930(SEQ ID NO :27)。"LNT2”指由 SEQ ID NO: 27编码的蛋白(SEQ ID N0:28)。“Int2-2，，(SEQ ID NO 29)和“ lnt2_3，，(SEQ ID NO 31)是天然存在的 At5g50930 基因的选择性剪接变体。“LNT2-2”(SEQ ID NO 30)和“LNT2-3”(SEQ ID NO 32)指分别 由“ lnt2-2 ”和“ lnt2-3 ”编码的蛋白。“lnt2样”指拟南芥“lnt2”位点At5g50930(SEQ ID NO 28)的来自不同物种的核 苷酸同源物，如玉米和大豆，并且不受限制的包括任何以下核苷酸序列SEQ ID N0:17、19、 23、和 25。“LNT2样”指拟南芥“LNT2” (SEQ ID NO 28)的来自不同物种的蛋白同源物，如玉 米和大豆，并且不受限制的包括任何以下氨基酸序列SEQ ID N0:18、20、24、和26。
本文所用的“选择性剪接变体”指由基因转录的RNA的供选择的替代形式。剪接 变体作为供选择的位点在单个转录RNA分子内或在分开转录的RNA分子之间被剪接的结果 天然发生，并且可导致从相同基因转录的mRNA的若干个不同形式。因此，剪接不同可编码 具有不同氨基酸序列的多肽，它们在生物体内可具有相似功能也可不具有相似功能。“氮胁迫耐受性”是植物的性状，指植物在氮限制条件下存活的能力。植物“提高的氮胁迫耐受性”相对于参照或对照植物进行测量，并意指植物的氮胁 迫耐受性在与参照或对照植物进行比较时提高的任何量或量度。“氮胁迫耐受性植物”是指表现出氮胁迫耐受性的植物。在一个实施方案中氮胁迫 耐受性植物是在氮限制条件下相对于对照植物至少在一种农学特性上表现出提高的植物。“环境条件”指植物生长的条件，例如水的可用性、营养物质(例如氮)的可用性或 者昆虫或病害的存在。“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何 细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的 转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖 通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重 组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组) 改变。“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括 存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子 代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组 织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。“子代”包括植物的任何后续世代。“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。在一个实施方案中， 将异源多核苷酸稳定地整合进基因组内以便该多核苷酸连续传代。异源多核苷酸可单独地 或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。针对序列而言的"异源"意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则 指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，并且指作为单 链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。-核苷酸 (通常以它们的5'-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代“A”为腺苷 酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或 脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶 (C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚 合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类 似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸 序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的 Y羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA(mRNA) ”指无内含子并且可以通过细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以 是单链的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录 的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长 插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自，但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更 多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)， 该序列能得自FIS或重叠群。“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任 何前肽或原肽的多肽。“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原 肽可以是并且不限于细胞内定位信号。“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中 通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸 可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得 分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段 来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸 而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事 件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而 发生的那些。“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重 组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通 常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。“调控序列”和“调控元件”可互换使用，并且指位于编码序列的上游(5'非编码 序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或 者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸 化识别序列。“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否 来源于植物细胞。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可以互换使用，并且指主要但非必须专 一地在一种组织或器官中表达，但是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能 受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核 酸片段进行了可操作地连接。“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。“表型”是指细胞或生物体的可检测的特征。有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”是指“转染”或“转 化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以 整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时 表达(如转染的mRNA)。“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)引入其中的任何细胞。本文所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。“稳定转化”指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦 稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。“瞬时转化”指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基 因表达而没有基因稳定遗传。“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二 倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处 是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该 植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之 一上，则该植物在该基因座处是半合子的。序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定， 这些方法包括但不限于LASERGENE 生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的 Megalign .程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法 (Higgins和Sharp, 1989，CAB I OS. 5 :151_153)采用默认参数(空位罚分=10，空位长度罚 分=10)执行。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的同一性百分比计算的默认 参数为 KTUPLE = 1、空位罚分(GAP PENALTY) = 3、窗口(WINDOW) = 5 禾口 DIAGONALS SAVED =5。而对于核酸，这些参数为KTUPLE = 2，空位罚分=5，窗口 = 4和DIAGONALS SAVED = 4。用Clustal V程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性 百分比”和“趋异度”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以 该方式计算。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中 有更全面的描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniatis, Τ. , Molecular Cloning A Laboratory Manual ；Cold Spring HarborLaboratory Press :Cold Spring Harbor, 1989 (下文称为 “Sambrook” )。现在转向若干个实施方案其它实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、重组DNA构建体、包含这些重组DNA构 建体的组合物(例如植株或种子)以及利用这些重组DNA构建体的方法。其它的分离的多核苷酸和多肽本发明包括如下其它分离的多核苷酸和多肽分离的多核苷酸，包括(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少50%、 51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,
1666%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%, 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性；或(ii)⑴的核酸序列的全长互补序列；其 中(i)的核酸序列的全长互补序列由相同数目的核苷酸组成并且是100%互补的。任一上 述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。多肽可 以是LNT2或LNT2样蛋白。分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或 32 进行比较时具有至少 50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%, 57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%, 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序 列同一性。多肽可以能是LNT2或LNT2样蛋白。分离的多核苷酸，包括(i)基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO 17、19、23、 25、27、29、或 31 进行比较时具有至少 50% ,51 % ,52% ,53% ,54% ,55% ,56% ,57% ,58%, 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100% 的序列同一性的 核酸序列；或(ii) (i)的核酸序列的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本发 明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。所述分离的多核苷酸可以编码LNT2或 LNT2样蛋白。其它重组DNA构建体和抑制DNA构建体在一个方面，本发明包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(如， 在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序 列编码的氨基酸序列基于ClustalV比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进 行比较时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%, 77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,100%的序列同一性，或(ii)⑴核酸序列 的全长互补序列。在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(如， 在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序 列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 17、19、23、25、27、29、或31进行比较时，具有至 少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(ii)⑴核酸序列的全长互补序列。图14A禾口 14B示出以下氨基酸序列的多重比对SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、 32、33、和 34。用 LASERGENE 生物信息计算包(DNASTAR Inc. ,Madison, WI)的 MEGALIGN 程序进行序列多重比对；具体地讲，使用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp (1989) CABI0S. 5 :151-153)，多重比对预设参数为空位罚分=10，空位长度罚分=10，成对比对预 设参数为KTUPLE = 1，空位罚分=3，窗口 = 5以及DIAGONALS SAVED = 5。图15是图14A和14B中显示的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值的 图表。在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(如， 在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码LNT2或LNT2样蛋白。在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。抑制DNA构建体能包含至少一个调控序列(在一个实施方案中是在植物中有功 能的启动子)，该调控序列可操作地连接至(a)以下序列的全部或部分(i)编码多肽的 核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 18、20、24、26、 28、30、或 32 进行比较时，具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%, 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性；或 ( )核酸序列(a) (i)的全长互补序列。或者(b)源自所关注的靶基因的有义链或反义链 的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对 方法，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，并 且其中所述所关注的靶基因编码LNT2或LNT2样蛋白；或(c)以下序列的全部或部分(i) 核酸序列，所述核酸序列基于ClustalV比对方法在与SEQ ID NO 17、19、23、25、27、29、或 31 进行比较时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67% %,9,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %, 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%, 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，或(ii) (c)(i)核酸序列的全长互补序列。在一个实施方案中，该抑制DNA构建体包含共抑制构建 体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制性构建体、茎环抑制性构建体、产生双链RNA的 构建体、RNAi构建体或小RNA构建体(如，siRNA构建体或miRNA构建体)。应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示 例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核 酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码 子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、 亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负 电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电 荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽 分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的 修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。
“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因 “沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本 文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑 制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑 制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不 确定机理并且包括(并且不限于)反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi 的方法以及基于小RNAi的方法。抑制DNA构建体可以包含源自所关注的靶基因的区域并且可以包含所关注的靶 基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可 与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100%相同或者具有少于100%同一性 的同一性(如，具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%, 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 的同一性)。抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并 且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制性构建体、茎-环 抑制性构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi (RNA干扰)构建体和小RNA 构建体，例如siRNA (短干扰RNA)构建体和miRNA (微RNA)构建体。“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RNA转录物。“反义RNA” 指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物 (美国专利号5，107，065)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分，即5'非编码序 列、3'非编码序列、内含子或编码序列互补。“共抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的有义RNA转录物。“有义”RNA 指包括mRNA和在细胞内或体外能被翻译成蛋白质的RNA在内的RNA转录物。此前，已通过 着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具 有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，Plant J.，16 651-659 (1998)；以及 Gura, Nature 404 :804_808 (2000))。另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于 1998年8月20日公开的PCT专利公开WO 98/36083)。此前描述的是“发夹”结构的利用，该结构以互补方向整合mRNA编码序列的全部 或部分，导致已表达的RNA形成潜在的“茎-环”结构(于1999年10月21日公开的PCT 专利公开W099/53050)。在这种情况下，茎由对应相对于启动子以有义或反义方向插入的 相关基因的多核苷酸形成，并且环由一些相关基因的多核苷酸形成，在构建体中该多核苷 酸不具有互补序列。这增加了获得的转基因植物中的共抑制或沉默频率。关于发夹抑制 的综述,参见 Wesley，S. V.等人，2003，Methods inMolecular Biology, Plant Functional Genomics :Methods and Protocols236 :273_286。其中茎由至少30个来自待抑制基因的核苷酸形成而环由任意的核苷酸序列形 成的构建体也已经有效地用于抑制(于1999年12月2日公开的PCT专利公开No. WO 99/61632)。
使用聚-T和聚-A序列产生茎-环结构中的茎已经有所描述(于2002年1月3 日公开的PCT专利公开No. WO 02/00894)。然而另一种变型涉及使用合成的重复序列来促进茎-环结构中的茎的形成。用这 种重组DNA片段产生的转基因生物体已经显示由形成茎环结构的核苷酸片段编码的蛋白 质的水平降低，如于2002年1月3日公开的PCT专利公开WO 02/00904中所述。RNA干扰是指由短干扰性RNA(SiRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默 的过程(Fire等人，Nature 391:806 1998)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉 默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过 程是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所 共有(Fire等人，Trends Genet. 15 358(1999)).这种防止外来基因表达的保护作用可能 是通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应，响应源自病毒感染或源自 转座因子随机整合到宿主基因组内的双链RNA(dsRNA)的生成而进化而来。dsRNA在细胞中 的存在通过还没有完全表征的机制引发了 RNAi反应。细胞中长dsRNA的存在刺激了称为dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer涉及 使dsRNA加工成称为短干扰RNA (siRNA)的短dsRNA片段(Berstein等人，Nature 409:363 2001)。源自dicer活性的短干扰性RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸，并且包含约 19个碱基对双链体(Elbashir等人，Genes Dev. 15 188 (2001)).还有人提出Dicer参与从 保守结构的前体RNA上切下21-和22-核苷酸小分子时序RNA (stRNA)，所述小分子时序RNA 参与翻译控制(Hutvagner等人，2001，Science 293 :834)。RNAi响应还涉及内切核酸酶复 合物，通常称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序 列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补的区域中间发生。此 外，RNA干扰还涉及小RNA(如miRNA)介导的基因沉默，可推定是通过调节染色质结构并由 此防止靶基因序列转录的细胞机制(参见例如Allshire，Science 297 1818-1819 (2002)； Volpe 等人，Science 297 1833-1837 (2002) Jenuwein, Science 297:2215-2218(2002)； 以及Hall等人，Science 297:2232-2237(2002))。这样，本发明的miRNA分子可用于通过 与RNA转录物相互作用或者作为另一种选择通过与特定基因序列相互作用来介导基因沉 默，其中这样的相互作用导致在转录或转录后水平上的基因沉默。已经在多种系统中研究了 RNAi。Fire等人(Nature 391 :806 (1998))首次在秀 丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中观察至Ij RNAi。 Wianny 禾口 Goetz (Nature Cell Biol. 2 70(1999))描述了在小鼠胚胎中由 dsRNA 介导的 RNAi。Hammond 等人(Nature 404 293(2000))描述了在用dsRNA转染的果蝇(Drosophila)细胞中的RNAi。Elbashir等人， (Nature411 494 2001)描述了通过在包括人胚胎肾和HeLa细胞的培养的哺乳动物细胞中 导入合成21-核苷酸RNA的双链体而诱导的RNAi。小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小 RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变 植物基因的基因表达。小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结 合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信 小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。据认为，小RNA和它们的RNA靶标之间的序列互补性有助于确定采用了哪种机制 (RNA裂解或翻译抑制)。据信，优选与它们的靶标互补的siRNA通过RNA裂解起作用。一 些miRNA与它们的靶基因具有完全或几乎完全的互补性，并且对于至少一些这样的miRNA， 已经证实了 RNA裂解。其他miRNA与它们的靶标具有若干错配，并且在翻译水平上明显 抑制了它们的靶标。同样，无需坚持特定的作用机理，出现了这样一种一般规律完全或 几乎完全的互补性引起RNA裂解，而当miRNA/靶标双链体含有许多错配时倾向于翻译抑 制。对于此规律的一个明显例外是植物中微RNA 172(miR172)。miR172的其中一个靶标是 APETALA2 (AP2)，尽管miR172与AP2具有几乎完全的互补性，但其表现出引起AP2的翻译抑 制而不是引起RNA裂解。微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴 定出的非编码 RNA(Lagos-Quintana 等人，Science294 :853_858 2001，Lagos-Quintana 等人，Curr. Biol. 12 :735_739 (2002) ；Lau 等人，Science 294 :858_862 (2001) ；Lee 和 Ambros, Science294 :862_864(2001) ；Llave 等人，Plant Cell 14 1605-1619(2002)； Mourelatos 等人，Genes.偏差(Dev.) 16 :720_728 (2002) ；Park 等人，Curr. Biol. 12 1484-1495(2002) ；Reinhart 等人，Genes.偏差(Dev.) 16 1616-1626 (2002))。它们是由大 小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定 的发夹结构。在动物中，涉及加工miRNA前体的酶称为Dicer，这是一种核糖核酸酶III样蛋 白(Grishok 等人，Cell 106:23-34(2001) ；Hutvagner 等人，Science293 :834_838 (2001)； Ketting 等人，Genes.偏差(Dev.) 15 :2654_2659 (2001))。植物也具有 Dicer-样酶， DCLl (以前称为 CARPELFACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENS0R1)，并且最近的证据表 明，其象Dicer —样也涉及发夹前体的加工以产生成熟miRNA (Park等人，Curr. Biol. 12 1484-1495(2002) ；Reinhart 等人，Genes Dev. 16 1616-1626 (2002)) 此外，最近的研究已 经清楚地表明，至少某些miRNA发夹前体最初是作为较长的聚腺苷酸化转录物存在，并且 在单个转录物中可存在几种不同的miRNA以及相关发夹(Lagos-Quintana等人，Science 294 =853-858(2001) ；Lee 等人，EMBO J. 21 =4663-4670 (2002)) 最近的研究还测定了从 dsRNA产物的miRNA链选择，所述dsRNA产物是通过DICER加工发夹而产生的(Schwartz 等人，Cellll5 =199-208(2003)) ο看起来，经加工的dsRNA的两端的稳定性(即G C对 A U的含量比，和/或错配)影响链选择，具有低稳定性的末端更容易因解旋酶活性而解 旋。低稳定性末端的5'末端链被整合至RISC复合物内，而另一条链被降解。微RNA(miRNA)看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结 合来调节靶基因。就lin-4和let-7而言，靶位点位于靶mRNA的3' UTR中(Lee等 人，Cell 75 843-854(1993) ；Wightman 等人，Cell 75 :855_862 (1993) ；Reinhart 等人， Nature 403 :901_906 (2000) ；Slack 等人，Mol. Cell 5 :659_669 (2000))，并且在 lin-4 和 let-7miRNA与其靶位点之间有几个错配。结合lin_4或let-7miRNA似乎引起由靶miRNA 编码的蛋白的稳态水平的下调，而不影响自身的转录物(Olsen和Ambros，Dev. Biol. 216 671-680(1999))。另一方面，最近有证据表明，在某些情况下，miRNA可以引起靶转录物在 靶位点内特异性RNA裂解，并且该裂解步骤看起来需要miRNA与靶转录物之间具有100% 的互补性(Hutvagner 和 Zamore,Science 297:2056-2060(2002) ；Llave 等人，Plant Cell
2114:1605-1619(2002))。看起来有可能miRNA可进入至少两条靶基因调控途径(1)当靶互 补性< 100%时，蛋白下调；并且(2)当靶互补性是100%时，RNA裂解。进入RNA裂解途径 的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi)期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生 的21-25nt短干扰RNA(siRNA)类似，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类 似或相同的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)内。用生物信息学鉴定miRNA的靶标在动物中没有成功，这可能是因为动物miRNA与 它们的靶标具有低水平的互补性。另一方面，生物信息学方法已经成功地用于预测植物 miRNA 的靴标(Llave 等人，Plant Celll4 1605-1619 (2002) ；Park 等人，Curr. Biol. 12 1484-1495(2002) ；Rhoades 等人，Cell 110 :513_520 (2002))，因此，看起来植物miRNA 与它 们的推定靶标的整体互补性高于动物miRNA。植物miRNA的这些预测靶标中的大部分编码 涉及植物发育模式或细胞分化的转录因子家族的成员。调控序列本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)可能包含至少一个调控序列。调控序列是启动子。多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)中。可以根据 所需结果来选择启动子，并且可以包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特 异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S 或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可以(或可以不)具有多重效应。使用组织特 异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留氮耐受性的能力。在拟南芥中已经 观察到了对干旱和寒冷耐受性的这种类型的效应(Kasuga等人，Nature Biotechnol. 17 287-91(1999))。适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和 在TO 99/43838和美国专利6，072，050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子 (Odell 等人，Nature 313:810-812(1985))；稻肌动蛋白启动子(McElroy 等人，Plant Cell 2 163-171(1990))；泛素启动子(Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 12 :619_632，1989， 以及 Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 18 :675_689 (1992)) ；pEMU (Last 等人，Theor. Appl. Genet. 81 :581_588 (1991)) ；MAS (Velten 等人，EMBO J. 3 2723-2730 (1984)) ；ALS 启动子(美国专利5，659，026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5，608，149、 5，608，144,5, 604，121,5, 569，597,5, 466，785,5, 399，680,5, 268，463,5, 608，142 禾口 6，177,611中公开的那些启动子。在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调 节启动子。另一种组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，该序列调节DNA 序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序 列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可 用于本发明的方法中。可用于本发明的种子或胚芽特异性启动子包括大豆Kimitz胰蛋白酶抑制剂启动 子(Kti3，Jofuku 和 Goldberg，Plant Cell 1 1079-1093 (1989))、马铃薯块莲特异蛋白启动子(patatin 启动子)(马铃薯块莲)(Rocha-Sosa，Μ.等人，EMBO J. 8 :23_29 (1989))、 convicilin启动子、豌豆球蛋白启动子、豆球蛋白启动子(豌豆子叶)(Rerie，W. G.等人， Mol. Gen. Genet. 259 :149_157 (1991) ；Newbigin, E. J.等人，Planta 180 :461_470 (1990)； Higgins, T. J. V.等人，Plant. Mol. Biol. 11 :683_695 (1988))、玉米蛋白启动子(玉米胚 乳)(Schemthaner,J. P.等人，EMBO J. 7 :1249_1255 (1988))、菜豆蛋白启动子(菜豆子叶) (Segupta-Gopalan, C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82 :3320_3324 (1995))、植物血 球凝集素启动子(菜豆子叶)(Voelker，T.等人，EMBO J. 6 :3571_3577 (1987))、B-伴球蛋 白启动子和大豆球蛋白启动子(大豆子叶)(Chen，Z-L等人，EMBO J. 7 :297_302 (1988))、谷 蛋白启动子(大米胚乳)、大麦醇溶蛋白启动子(大麦胚乳)(Marris，C.等人，Plant Mol. Biol. 10 :359-366(1988))、麦谷蛋白启动子和麦醇溶蛋白启动子(小麦胚乳)(Colot,V.等 人，EMBO J. 6 :3559-3564(1987))、和甘薯贮藏蛋白启动子(甘薯块根)(Hattori，T.等人， Plant Mol. Biol. 14 :595_604 (1990))。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子 特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南 芥属和甘蓝型油菜(Brassicanapus)种子中表达脑啡肽的拟南芥2S种子储藏蛋白基因启 动子(Vanderkerckhove 等人，Bio/Technology 7 :L929_932 (1989))、表达荧光素酶的菜豆 凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等人，Plant Sci. 63 :47_57 (1989))，以及表达氯霉素 乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等人，EMBO J. 6 =3559-3564(1987))0可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导 剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的DNA序列。可 诱导的或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如 乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。其它启动子包括如下启动子1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等人，Nature Biotechnol. 17 287-91 (1999)) ；2)大麦启动子B22E ;B22E的表达是发育中的玉米籽粒 巾白勺牛寺胃个生白勺("Primary Structureof a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature AleuroneLayers (在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的 一级结构)，，，Klemsdal 等人，Mol. Gen. Genet. 228 (1/2) :9_16 (1991))；以及 3)玉米启 动子 Zag2 ( "Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homo log of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS (ZAG1-拟南芥属花同 源异形基因AGAMOUS的玉米同系物的鉴定和分子表征)”，Schmidt等人，Plant Cell 5(7) :729_737 (1993) ；“Structuralcharacterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation oftwo pairs of AGAMOUS-Iike MADS-box genes from maize，，， Theissen 等人，Gene 156(2) 155-166 (1995) ；NCBI GenBank Accession X80206))。Zag2 转录物可在授粉前五天至授粉后(“DAP”)七至八天被检测到，并且引导Ciml在发育中的 雌花序心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉 前四至五天至授粉后六至八DAP被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中 的雌小花母系相关的基因的任何启动子。用于调控本发明的核苷酸序列在植物中表达的其它启动子是茎特异性启动子。这 种茎特异性启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登记号EF030816 ；Abrahams等人，Plant Mol. Biol. 27 :513_528 (1995))和 S2B 启动子(GenBank 登录号:EF030817)等等，将这些文献以引用的方式并入本文。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件 组成，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不 同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的 表达。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，一些变型的 DNA片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启 动子通常称为“组成型启动子”。目前不断在发现可用于植物细胞中的不同类型的新启动 子；在 Okamuro，J. K.和 Goldberg，R. B.，Biochem. Plants 15:1-82(1989)的汇编中可找到 许多实例。其它启动子可包括RIP2、mLIP15、ZmCORURabl7、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、 SAM合成酶启动子、泛素启动子、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶启动子、R-等位基因启动 子、维管组织其它启动子S2A (Genbank登录号EF030816)和S2B (Genbank登录号EF030817) 及来自玉米的组成型启动子G0S2。其它启动子包括根启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米 Cyclo启动子(US公布2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米R00TMET2启动子 (W0 2005/063998,公开于 2005 年 7 月 14 日)、CRlBIO 启动子(W0 2006/055487,公开于 2006 年 5 月 26 日)、CRWAQ81 (W0 2005/035770,公开于 2005 年 4 月 21 日)和玉米 ZRP2. 47 启动子(NCBI 登录号 U38790 ；NCBI GI No. 1063664)。本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)也可包括其他调控序列，包括但 不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个其它实施方案中， 本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。内含子序列可以加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆 中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接 内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍(Buchman和Berg，Mol. Cell Biol. 8 4395-4405 (1988) ；Callis 等人，Genes Dev. 1 :1183_1200 (1987))。这种内含 子对基因表达的增强通常在将其设置接近转录单位的5’端时为最大。玉米内含子Adhl-S 内含子1、2和6、Bronze-l内含子的使用是本领域已知的。通常参见The Maize Handbook, 第 116 章，Freeling 和 Walbot (编辑)，Springer，纽约(1994)。如果期望进行多肽表达，则通常希望在多核苷酸编码区的3'-端处包含有多腺 苷酸化区。该多腺苷酸化区可源自天然基因，源自多种其他植物基因或源自T-DNA。要加入 的3'端序列可源自(例如)胭脂碱合成酶或章鱼碱合成酶基因，或作为选择源自另外的植 物基因，或在一个实施方案中是源自任何其他真核基因。“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译前导 序列存在于翻译起始序列的经完全加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初 级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例已经有所描述(Turner，R. and Foster, G. D.，Mol. Biotech. 3 225 (1995)).任何植物都可以选择用来鉴定将用于本发明重组DNA构建体的调控序列和基因。 适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥属植 物、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心 菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无 花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻 子、玉米、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、 棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、大蕉、李 树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南 方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小 麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。用于鉴定调控序列的特别其它植物是 拟南芥属植物、玉米、小麦、大豆和棉。其它组合物本发明的其它组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(包括任何 抑制DNA构建体)(例如上面所讨论的任何一种其它构建体)的植物。其它组合物也包括 任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组 中包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交 而获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系。在一个实施方案中，在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可以自花授 粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生含有新引入的重组DNA构建体(或抑制DNA 构建体)的种子。这些种子可以生长而产生将会表现出改变的农学特性(如，在氮限制条 件下农学特性增加)的植物，或者可以用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可以 生长而产生将会表现出如改变的农学特性的植物。在一个实施方案中，种子是玉米种子。在一个实施方案中，植物是单子叶植物或双子叶植物，是玉米或大豆植物，是玉米 植物，例如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可以是向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜 蓿、棉花、水稻、大麦或黍。在一个实施方案中，重组DNA构建体稳定地整合进植物的基因组中。其它实施方案尤其包括但不限于如下其它实施方案1-8 1.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(在一个实施方案中是玉米或大豆植 物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷 酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、 26、28、30、或 32 进行比较时具有至少 50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%, 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性，并 且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的氮 胁迫耐受性。在一个实施方案中，在与该对照植物比较时，该植物还表现出至少一种农学特 性的改变。2.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(在一个实施方案中是玉米或大豆植 物)，该重组DNA构建体包含(a)可操作地连接至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所 述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32进 行比较时具有至少50%的序列同一性；或
(b)抑制DNA构建体，所述构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地 连接至(i)以下序列的全部或部分㈧编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基 于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少 50%的序列同一性，或(B)核酸序列(b) (i) (A)的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于 Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述 区域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2或 LNT2样多肽，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出至 少一种农学特性的改变。3.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(在一个实施方案中是玉米或大 豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述 多核苷酸编码LNT2或LNT2样多肽，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植 物比较时，所述植物表现出增加的氮胁迫耐受性。在一个实施方案中，在与该对照植物比 较时，该植物还表现出至少一种农学特性的改变。在一个实施方案中，该LNT2多肽来自 拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、里予大豆(Glycine soja)或短绒里予大豆(Glycine tomentella)。4.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(在一个实施方案中是玉米或大豆 植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核 苷酸编码LNT2或LNT2样多肽，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行 比较时，所述植物表现出在氮限制条件下至少一种农学特性的改变。在一个实施方案中，该 LNT2 多肽来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟 豆(Glycine tabacina)、里予大豆(Glycine soja)或短绒里予大豆(Glycine tomentella)。5.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(在一个实施方案中是玉米或大豆植 物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷 酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、 26、28、30、或 32 进行比较时具有至少 50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%, 59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%, 74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%, 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性，并 且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出在氮限制 条件下至少一种农学特性的改变。6.在其基因组中包含抑制DNA构建体的植物(在一个实施方案中是玉米或大豆 植物)，该抑制DNA构建体包含至少一个可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或 反义链的全部或部分的区域的调控元件，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或 部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、 53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%、99%或100%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2或LNT2样多肽， 并且其中在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时，所述植物表现出在氮限 制条件下至少一种农学特性的改变。7.在其基因组中包含抑制DNA构建体的植物(在一个实施方案中是玉米或大豆植 物)，该抑制DNA构建体包含至少一个可操作地连接至以下序列的全部或部分的调控元件 (a)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或 32 进行比较时具有至少 50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%, 57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%, 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序 列同一性；或(b) (a)的核酸序列的全长互补序列，并且其中在与未包含所述抑制DNA构建 体的对照植物进行比较时，所述植物表现出在氮限制条件下至少一种农学特性的改变。8.上述其它实施方案1-7中的植物的任何子代、上述其它实施方案1-7中的植物 的任何种子、上述其它实施方案1-7中的植物的子代的任何种子以及来自上述其它实施方 案1-7中的植物以及它们的子代的细胞。在上述其它实施方案1-8或本发明的任意其他实施方案中的任意一项中，重组 DNA构建体(或抑制DNA构建体)在一个实施方案中包含至少一个在植物中有功能的启动 子作为其它调控序列。在上述其它实施方案1-8或本发明的任意其他实施方案中的任意一项中，至少一 种农学特性的改变是增加或减少，在一个实施方案中是增加。在任一前述的其它实施方案1-8或本发明的任何其他实施方案中，至少一种农学 特性选自绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产 量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织中的含氮量、总植物氨基酸含量、营 养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、 果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏抗性、收 获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、和穗长。产量、绿度和生物量尤其是其它进行改变的农学 特性(在一个实施方案中是增加)。在任意上述其它实施方案1-8或本发明的任意其他实施方案中，在与不包含所述 重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的对照植物在氮胁迫条件下进行比较时，在一个实 施方案中植物表现出至少一种农学特性的改变。本领域的普通技术人员熟悉模拟氮条件(限制性的或非限制性的)的规程，以及 用于评估已经经受过模拟的或天然存在的氮条件(限制性的或非限制性的)的植物的规 程。例如，技术人员能够通过向植物提供比正常需求更少的氮或在一定时期内不提供氮来 模拟氮条件，并且技术人员能够通过寻找农学特性的差异来评估此类植物，例如在生理学 和/或物理条件上的变化，包括(但不限于)活力、生长、大小、或根长、或具体地讲叶片颜 色或叶片面积大小。用于评估此类植物的其它技术包括测量叶绿素荧光、光合作用速率、根 生长或换气速率。下面的实施例描述了一些用于模拟氮限制条件和/或在此类条件下评估植物的代表性规程和技术。技术人员也能够通过植物在田间测试中，在模拟的或天然存在的低氮或高氮条件 下保持足够产量的能力(例如通过测量在低氮或高氮条件下，与标准氮条件下相比基本 上等同的产量，或通过测量在低氮或高氮条件下与对照或参照植物相比更少的产量损失) 来评估氮胁迫耐受性(在一个实施方案中至少75 %、76 %、77 %、78 %、79 %、80 %、81 %、 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、99%、或 100%的产量)。在评估或测量其中利用了对照或参照植物的本发明任何实施方案(如，如本文描 述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将很容 易认识到要利用的合适对照或优选植物。例如，通过如下非限制性示例来说明1.转化植物的子代，该植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)来说是半 合子的，使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株包 含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于未包含该重组DNA构建体 (或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即，未包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建 体)的子代是对照或参照植株)。2.重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)基因渗入至自交系中，例如在玉米中，或 基因渗入进变体中，例如在大豆中基因渗入品系将通常相对于亲本自交系或变种品系进 行测量(即，亲本自交系或变种品系是对照或参照植物)。3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本自交系产生，而第二杂交系由相同的两 个亲本自交系产生，不同的是其中一个亲本自交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建 体)第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植 物)。4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株该植株可以相对于这样 的对照植株进行评估或测量，该对照植株不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)， 但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的 植株相比较，核遗传物质具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实 验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态 性DNA (RAPD)、任何引物聚合成酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域 (SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP )和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评估或测量转基因植物的农学特性 或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型，通过诱变 或转化而选择的植物。其它方法其它方法包括但不限于用于提高植物氮胁迫耐受性的方法、用于评估植物氮胁迫 耐受性的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于测定植物农学特性改变的方法、和用于 制备种子的方法。在一个实施方案中，植物是单子叶植物或双子叶植物，是玉米或大豆植 物，甚至在一个实施方案中是玉米植物。植物还可以是向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉 花、水稻、大麦或黍。种子可以是玉米或大豆种子，可以是玉米种子，并且甚至在一个实施方
28案中可以是是玉米杂交种种子或玉米自交系种子。其它方法尤其包括但不限于如下方法增加植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(在一个实施方 案中是在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的 氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较 时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；和(b)在步骤(a)后从该 可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构 建体并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受 性。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在 其基因组中包含抑制DNA构建体并且在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现 出增加的氮胁迫耐受性。增加植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将包含至少一个调控序列(在 一个实施方案中是植物中有功能的启动子)的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞， 该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽 的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行 比较时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%, 77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,100% 的序列同一性，或(ii) (a) (i)的核 酸序列的全长互补序列；和(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物， 其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体 的对照植物进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。所述方法可进一步包括(c)获得源自 该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体并且在与 未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。增加植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可 再生的植物细胞，该抑制DNA构建体包括至少一个调控序列(在一个实施方案中是植物 中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链 的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于 Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2或LNT2样多肽；和(b)在步骤(a) 之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑 制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。所述方法可进一步包括(C)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代 植物在其基因组中包含抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较 时表现出增加的氮胁迫耐受性。评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(在一个实施方 案中是在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的 氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较 时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；(b)在步骤(a)后从该可 再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建 体；以及(c)评价该转基因植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮 胁迫耐受性。该方法还可包括(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在 其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该重组DNA构建 体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(在一个实施方 案中是在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分(i)编码多肽的核酸序列， 所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或 32 进行比较时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性；或(ii) (a) (i) 的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植 物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在 与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性；该方法可另外包括 (d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构 建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的氮 胁迫耐受性。评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再 生的植物细胞，该抑制DNA构建体包括至少一个调控序列(在一个实施方案中是植物中有 功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的 全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全 部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2或LNT2样多肽；(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制 DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比 较时的氮胁迫耐受性；该方法可另外包括(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该 子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该抑 制DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(在一个实施方 案中是在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的 氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较 时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；(13)在步骤(a)后从该可 再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建 体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组 DNA构建体；以及(d)评价该转子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比 较时的氮胁迫耐受性；评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(在一个实施方 案中是在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分(i)编码多肽的核酸序列， 所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或 32 进行比较时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性；或(ii) (a) (i) 的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植 物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物 的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)评价该转子代 植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性；评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再 生的植物细胞，该抑制DNA构建体包括至少一个调控序列(在一个实施方案中是植物中有 功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的 全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全 部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2或LNT2样多肽；(b)在步骤(a)之 后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该 抑制DNA构建体；以及(d)评价该转子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进 行比较时的氮胁迫耐受性；确定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(在一个实施方 案中是在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的 氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较 时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；(b)在步骤(a)后从该可 再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构 建体；以及(c)确定所述转基因植物在一个实施方案中在氮限制条件下与不包含所述重组 DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法还可包括(d) 获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建 体；以及(e)确定所述子代植物在一个实施方案中在氮限制条件下与不包含所述重组DNA 构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。确定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(在一个实施方 案中是在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分(i)编码多肽的核酸序列， 所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或 32 进行比较时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性；或(ii)⑴的 核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物， 其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)确定所述转基因植物在 一个实施方案中在氮限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表 现出至少一种农学特性的改变。该方法可另外包括(d)获得源自该转基因植物的子代植 物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)确定所述子代植物在一 个实施方案中在氮限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现 出至少一种农学特性的改变。确定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可 再生的植物细胞，该抑制DNA构建体包括至少一个调控序列(在一个实施方案中是植物 中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链 的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于 Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,
3286%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2或LNT2样多肽；(b)在步骤(a)之 后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制 DNA构建体；以及(c)确定所述转基因植物在一个实施方案中在氮限制条件下与不包含所 述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可另外 包括(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制 DNA构建体；以及(e)确定所述子代植物在一个实施方案中在氮限制条件下与不包含所述 抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。确定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(在一个实施方 案中是在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的 氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较 时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；(b)在步骤(a)后从该可再 生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建 体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组 DNA构建体；以及(d)确定所述子代植物在一个实施方案中在氮限制条件下与不包含所述 重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。确定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(在一个实施方 案中是在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分(i)编码多肽的核酸序列， 所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 18、20、24、26、28、30、或 32 进行比较时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%, 76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性；或(ii)⑴的 核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物， 其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的 子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)确定所述子代植 物在一个实施方案中在氮限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是 否表现出至少一种农学特性的改变。确定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可 再生的植物细胞，该抑制DNA构建体包括至少一个调控序列(在一个实施方案中是植物 中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链 的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于 Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、 56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2或LNT2样多肽；(b)在步骤(a)之 后从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制 DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含 该抑制DNA构建体；以及(d)确定所述子代植物在一个实施方案中在氮限制条件下与不包 含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。产生种子(在一个实施方案中可以作为提供氮胁迫耐受性的产品销售的种子)的 方法，该方法包括任意上述的其它方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种 子在它们的基因组中包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。在任一前述的其它方法或本发明方法的任何其它实施方案中，测定转基因植物中 农学特性改变的步骤(如果适用的话)在一个实施方案中可包括测定在改变的环境条件下 与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时该转基因植物是否表现出至少一种农学 特性的改变。在任一前述的其它方法或本发明方法的任何其它实施方案中，测定子代植物中农 学特性改变的步骤(如果适用的话)可包括测定在改变的环境条件下与不包含重组DNA构 建体的对照植物进行比较时该子代植物是否表现出至少一种农学特性的改变。在任何前述的其它方法或本发明方法的任何其它实施方案中，在所述导入步骤中 所述可再生的植物细胞可包括愈伤组织细胞(在一个实施方案中是胚胎)、配子细胞、分生 细胞或未成熟胚芽细胞。可再生的植物细胞在一个实施方案中来自自交玉米植物。在任意上述的其它方法或本发明方法的任意其他实施方案中，所述再生步骤在一 个实施方案中包括(i)在包含促进胚发生的激素的培养基中培育所述转化的植物细胞直 至观察到愈伤组织；(ii)将所述步骤(i)的转化的植物细胞转移至包含促进组织机体形成 的激素的第一培养基；以及(iii)在第二培养基上传代培养步骤(ii)后的所述转化的植物 细胞，以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。在任意上述的其它方法或本发明方法的任意其它实施方案中，至少一种农学特性 选自绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总 植物氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织中的氮含量、总植物氨基酸含量、营养组织 中的游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果 实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏抗性、 收获指数、茎杆倒伏、植物高度、穗高、以及穗长。产量、绿度和生物量尤其是其它进行改变 的农学特性(在一个实施方案中是增加)。在任意上述其它方法或本发明的方法的任意其它实施方案中，在与不包含所述重 组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的对照植物在氮胁迫条件下进行比较时，在一个实施 方案中植物表现出至少一种农学特性的改变。在任一前述的其它方法或本发明方法的任何其它实施方案中，存在供选择的替代 方案用于将包含可操作地连接至少一种调控序列上的多核苷酸的重组DNA构建体导入可 再生的植物细胞。例如，可将调控序列(例如一种或多种增强子、在一个实施方案中作为转 位因子的部件)导入可再生的植物细胞，然后筛选其中将所述调控序列可操作地连接至编码本发明多肽的内源基因的事件。将本发明的重组DNA构建体引入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包 括但不限于DNA直接摄取、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、感染、病毒介导的DNA转 移、轰击或农杆菌介导的转化。其它技术如下文实施例所示，用于转化玉米植物细胞和大豆植物细胞。用于转化双子叶植物(主要通过利用根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)) 以及获得转基因植物的其它方法包括公开的用于棉花的那些(美国专利5，004，863、美 国专禾Ij 5，159，135、美国专利5，518，908)；用于大豆的那些(美国专利5，569，834、美国 专利 5，416，011、McCabe 等人，Bio/Technology 6 923(1988), Christou 等人，Plant Physiol. 87 =671674 (1988))；用于芸苔属植物(Brassica)的那些(美国专利 5，463，174)； 用于花生的那些(Cheng 等人，Plant Cell Rep. 15 653 657 (1996)，McKently 等人，Plant Cell R印.14:699 703 (1995))；用于番木瓜的那些；以及用于豌豆的那些(Grant等人， Plant Cell R印· 15 :254_258 (1995))。用电穿孔、粒子轰击和农杆菌转化单子叶植物也已有报道并且作为其它方法包 括(例如)如在天门冬属(asparagus)中实现的转化和植物再生(Bytebier等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 84 :5354，(1987))；在大麦中实现的转化和植物再生(Wan和 Lemaux, Plant Physiol. 104 37(1994)) ；corn (Rhodes φ 人，Science 240:204(1988)， Gordon-Kamm 等人，Plant Cell 2 603 618(1990)， Fromm 等人，Bio/Technology 8 833(1990)，Koziel 等人，Bio/Technology 11 194 (1993)，Armstrong 等人，Crop Science 35:550-557(1995))；在燕麦中实现的转化和植物再生(Somers等人，Bio/Technology 10:1589(1992))；在野茅(orchardgrass)中实现的转化和植物再生(Horn等人，Plant Cell Rep. 7 =469(1988))；在稻中实现的转化和植物再生(Toriyama等人，Theor. Appl. Genet. 205 :34 (1986) ；Part 等人，Plant Mol. Biol. 32 1135 1148，(1996) ；Abedinia 等 人，Aust. J. Plant Physiol. 24 133 141 (1997) ；Zhang 禾口 Wu，Theor. Appl. Genet. 76 835(1988) ；Zhang 等人，Plant Cell Rep. 7 379, (1988) ；Battraw 和 Hall，Plant Sci. 86 191 202(1992) ；Christou 等人，Bio/Technology 9:957(1991))；裸麦(De la Pena 等人， Nature325 =274(1987))；在甘蔗中实现的转化和植物再生(Bower和Birch，Plant J. 2 409(1992))；高羊茅(Wang 等人，Bio/Technology 10:691(1992))；以及小麦(Vasil 等人， Bio/Technology 10:667(1992)；美国专利 5，631，152)。存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组 织以及待再生的具体植物物种。从单植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本 领域所熟知的(Weissbach 禾口 Weissbach(编辑)，载于Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Inc. San Diego, CA, (1988))。该再生和生长方法通常包括如下 步骤选择转化的细胞、培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植 株阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸 如土壤之类的合适植物生长培养基中。含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本 领域所熟知的。在一个实施方案中，将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来 自这些重要品系的植物用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有 所需多肽的本发明的转基因植物。
实施例本发明将在下面的实施例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数 是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的其它实施方案，但仅 是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发 明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修 饰，以使其适用于多种用法和条件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文 所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也 旨在属于附加的权利要求书的范围内。实施例1制备具有激活标记基因的拟南芥种群构建18. 49kb 的 T-DNA 基二元构建体，pHSbarENDs2 (SEQ ID NO :1 ；图 1)包含四 个来源于花椰菜花叶病毒35S启动子的四个多聚增强子元件(对应于序列-341至-64，如 Odell等人Nature 313 :810_812所述(1985))。该构建体也包含允许质粒救援的载体序列 (PUC9)和多接头(SEQ ID NO :11)、再动员T-DNA的转座子序列(Ds)、以及允许草胺磷选择 转基因植物的bar基因。原则上，仅将从右边界(RB)至左边界(LB)包含的10. 8kb片段转 移到寄主植物基因组中。因为增强子元件位于靠近RB处，它们可诱导T-DNA整合后的基因 组位点顺式激活。通过整个植株的农杆菌转化制备拟南芥激活标记种群。将pHSbarENDd构建体转 化到根癌农杆菌菌株C58中，在25°C下在溶菌肉汤培养基中培养至0D600 1.0。然后离 心沉淀细胞，并重悬在相等体积的5%蔗糖/0. 05% Silwet L-77 (OSI Specialties, Inc) 中。在早期抽薹时，培育拟南芥属生态型Col-O的土壤使用农杆菌悬浮液进行顶部灌溉。一 周后，相同植株再次用在蔗糖/Silwet中的相同农杆菌菌株进行顶部灌溉。然后将该植物 的种子设为标准。所得Tl种子在土壤中播种，通过喷洒草胺磷(FINALE ；AgrEvo ；Bayer Environmental Science)选择转基因幼苗。选择了总计100，000个草胺磷抗性Tl幼苗。 分开保存来自每个品系的T2种子。实施例2筛诜以鉴定具有低氮耐警件的品系来自每个100，000个分离Tl激活标记品系的i^一个T2植物可种植在方板 (15mmX15mm)上，方板包含 0. 5xN_Free Hoagland，s，0. 4mM硝酸钾，0. 蔗糖，ImM MES 和 0. 25% Phytagel (低氮培养基)。每个板种植五个品系，并且每个板包括9个野生型个体 以使总计64个个体排列成8X8的网格图案(参见图11)。在暗处、4°C条件下保持平板三 天以使种子分层，然后在22°C光照和20°C黑暗交替条件下水平放置九天。光周期为十六小 时光照和八小时黑暗，平均光照强度为 200mmol/m2/S。每天旋转并振动每个架子中的平 板。在第十二天(生长九天)，对整个板拍照以评估幼苗状态。在掩蔽该平板图像以移除背景颜色后，每个个体收集两个不同的测量数据总罗赛塔面积和进入绿色区的颜色百分比。使用色调、饱和度和强度数据(HSI)，绿色区由色调 50至66组成。总罗赛塔面积用作植物生物量的量度，而绿色区通过剂量-响应研究已经显 示指示氮同化作用(参见图12)。将在与野生型对照植物进行比较时具有显著的总罗赛塔面积和/或绿色区增加 的品系命名为Phase 1 hits。在相同分析条件下进行Phase Ihits的重复试样再筛选 (Phase 2筛选)。还通过Phase 3筛选以进一步验证通过Phases 1和2的突变体。在 Phase 3中，将每个品系分开种植在低氮培养基中，使得32个T2个体紧邻着32个野生型个 体生长，为分析提供更高的统计学严谨性。如果一个品系显示与Phase 3中对照的显著差 异，然后可认为该品系是经验证的氮缺乏抗性品系。实施例3鉴定激活标记基因使用下述两个标准程序中的一个或两个鉴定侧接导致氮耐受性的T-DNA插入序 列的基因(1)热不对称交错(TAIL) PCR(Liu 等人，Plant J. 8 :457_63 (1995))；以及(2) SAIFF PCR(Siebert 等人，NucleicAcids Res. 23 1087-1088 (1995))。至于复杂的多聚 T-DNA插入序列，TAIL PCR和SAIFF PCR可能均不足以鉴定候选基因。在这些情况下，可使 用包括反式PCR、质粒拯救和/或基因组文库构建在内的其他程序。成功的结果是其中单个TAIL或SAIFF PCR片段包含T-DNA边界序列和拟南芥属 基因组序列。一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记，通过与公开可用的拟南芥 属基因组的序列比对来鉴定候选基因。具体地讲，最靠近35S增强子元件/T-DNA RB的注 释基因是激活的基因的候选基因。为了验证鉴定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合伪克隆的可 能性，用一个T-DNA中的寡核苷酸和一个候选基因特异性的寡核苷酸进行对基因组DNA的 诊断PCR。将提供PCR产品的基因组DNA样本理解为表示T-DNA插入序列。该分析也验证 了其中一种以上的插入事件发生在相同品系中的情况，例如，在TAIL和/或SAIFF PCR分 析中鉴定是否有多个不同基因组片段。实施例4鉴定激活标记LNT2基因进一步分析显示氮缺乏耐受性的激活标记品系(品系111786)。提取来自该品系 的DNA，并且在突变品系中侧接T-DNA插入序列的基因通过连接介导PCR(Siebert等人， Nucleic Acids Res. 23 1087-1088 (1995))进行鉴定。鉴定一个单独扩增的片段，它包含 T-DNA边界序列和拟南芥基因组序列。一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记， 通过与完全拟南芥属基因组的序列比对鉴定候选基因。具体地讲，最靠近35S增强子元 件/T-DNA RB的注释基因是品系中激活的基因的候选基因。就品系111786而言，最靠近 35S增强子的基因是At5g50930 (SEQ ID NO 27)，它编码拟南芥“unknown蛋白”，本文称为 LNT2(SEQ ID NO 28 ；NCBI GI 15241317)。实施例5通过转化拟南芥验证候选拟南芥基因(At5g50930)可将候选基因转化到拟南芥属中并在35S启动子作用下过表达。如果在转基因品 系中观察到与亲本激活标记品系相同或相似的表型，则将该候选基因认为是拟南芥属中验证过的“前导基因”。通过以下方法测试拟南芥At5g50930基因(SEQ ID NO ,21)的赋予氮缺乏耐受性 的能力。通过RT-PCR扩增At5g50930cDNA，使用以下引物LAt5g5O93O-5' attB 正向引物(SEQ ID NO 35)正向引物包含attBl 序列(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ；SEQ ID NO 12)和共有 的Kozak序列(CAACA)的所述cDNA蛋白编码区上游的前21个核苷酸(以ATG起始密码子 开头)。2. At5g50930_3，attB 反向引物(SEQ ID NO 36)反向引物包含attB2 序列(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ； SEQ ID NO 13)，该序列 邻近所述cDNA蛋白编码区的反向互补序列的后21个核苷酸(以终止密码子的反向互补序 列开头)。RT-PCR反应生成两个产物，本文称为lnt2-2和lnt2_3 (分别是SEQID NO 29和 31)。将这些产物鉴定为At5g50930基因的剪接变体。使用INVITROGEN GATEWAY. CL0NASE 技术，用 pD0NR Zeo (SEQ ID NO :2 ；图 2) 进行每个RT-PCR产物的BP重组反应。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基 因(CAM)从pD0NRTMZeo移除并定向地克隆了该在旁侧具有attBl和attB2位点的PCR产物 而得到入门克隆(entry clone)。如下所述，将每个剪接变体序列的一个鉴定为阳性的入门 克隆与一个目的载体一起用于随后的LR重组反应。用紧接INVITROGEN GATEWAY Cl转化插入序列上游的1. 3_kb35S启动子构建称 为pBC-yellow(SEQ ID NO :4 ；图4)的16. 8_kb T-DNA基的二元载体(目的载体)，所述插 入序列包含ccdB细菌致死基因以及侧接attRl和attR2序列的氯霉素抗性基因(CAM)。该 载体也包含RD29a启动子，该启动子驱动基因表达ZS-YellowdNVITROGEN )，它赋予转化 过的种子黄色荧光。使用INVITROGEN GATEWAY 技术，使用包含lnt2_2和pBC-yellow载 体的入门克隆进行LR重组反应。该扩增允许快速定向克隆Int2-2(SEQ ID NO :29)，克隆 发生在pBC-yellow中的35S启动子之后。还使用包含lnt2_3和pBC-yellow载体的入门 克隆进行LR重组反应。申请人:然后使用如实施例1所述的相同农杆菌介导转化程序，将35S启动子 At5g50930表达构建体导入野生型拟南芥生态型Col-Ο。转基因Tl种子通过黄色荧光进行 选择，并且将32个这些Tl种子紧邻着32个野生型拟南芥生态型Col-O种子种植在低氮培 养基上。所有随后的生长和拍照条件均如实施例1所述。发现来自激活标记的、对氮限制 条件具有耐受性的初始表型能在用其中At5g50930基因通过35S启动子直接表达的构建体 转化过的野生型拟南芥植物中重现。实施例6cDNA f库 他目成、cDNA克降的分离和测丨序cDNA文库可通过许多可用的方法中的任一种制备。例如，通过首先根据生产商的 说明书(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)制备Uni-ZAPTMXR载体中的 cDNA 文库，可将cDNA引入质粒载体中。根据Stratagene提供的说明书，将Uni-ZAPTMXR文库转换成质粒文库。当转换的时候，将把cDNA插入序列包含于质粒载体rBLUESCRIPT 中。 此外，可使用T4连接酶(New England Biolabs)将cDNA直接导入预切过的Bluescript II SK(+)载体(Stratagene)中，随后按照制造商规程(GIBCO BRL Products)转染 DHlOB 细胞。一旦cDNA插入序列处于质粒载体中，从随机选取的含重组pBLUESCRIPT 质粒的细 菌菌落制备质粒DNA，或者用对插入的cDNA序列旁侧的载体序列特异性的引物，通过聚合 酶链式反应扩增插入的cDNA序列。将扩增的DNA插入序列或质粒DNA在引物标记法测序 反应(dye-primer sequencingreaction)中进行测序，以产生部分cDNA序列(表达序列标 记或“EST，，;参见 Adams 等人，1991，Science 252:1651-1656)。用 Perkin Elmer Model377 荧光测序仪分析所得的EST。用改进的转座规程产生全长插入序列(FIS)数据。从归档的甘油原种作为单一菌 落回收确定了 FIS的克隆，并通过碱性裂解分离质粒DNA。将分离的DNA模板在基于PCR的 测序反应中与载体引物M13正向和反向寡核苷酸反应并上样至自动化的测序仪上。通过与 对其进行FIS查询的初始EST序列进行序列比对来确认克隆鉴定。将确认的模板通过基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Tyl转座因子 (Devine和Boeke，1994，Nucleic Acids Res. 22 :3765_3772)的Primer Island转座试剂盒 (ΡΕ Applied Biosystems, Foster City, CA)进行转座。该体外转座系统在整个一组大DNA 分子中随机地放入独特的结合位点。随后将转座的DNA用于通过电穿孔转化DHlOB电-感 受态细胞(Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。转座因子含有另外的可选标 记(称为 DHFR ；Fling 禾口 Richards, 1983, Nucleic AcidsRes. 11 :5147_5158)，使得能在琼 脂平板上仅双重筛选含有整合的转座子的那些亚克隆。从每次转座反应随机地选择多个亚 克隆，通过碱性裂解制备质粒DNA，并用对转座子内的结合位点特异性的独特引物从转座事 件位点向夕卜进行测序(ABI Prism dye-terminator ReadyReaction mix)。收集序列数据(ABIPRISM Collections)并用 Phred 和 Phrap (Ewing 等人， Genome Res. 8 175-185 (1998) ；Ewing 等人，Genome Res. 8 186-194 (1998))进行装配。 Phred是一种公用软件程序，该程序再次读取ABI序列数据，再次调出(recall)碱基，赋质 量值，并将碱基序列(base call)和质量值写入可编辑的输出文件中。Phrap序列组装程序 使用这些质量值来增加组装的序列重叠群的准确度。通过Consed序列编辑器(Gordon等 人，1998，Genome Res. 8 195-202)检查装配序列。在一些克隆中，cDNA片段对应基因的3’ -端的一部分并且不会涵盖整个开放阅 读框。为了获得上游信息，使用两种不同规程中的一者。这两种方法中的第一种方法导致 产生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二种方法导致产生含有整个开放阅读框的 片段。这两种方法均使用两轮PCR扩增以从一个或多个文库获得片段。有时基于以前的知 识(特定的基因应该存在于某些组织中)选择文库，有时则进行随机地选择。获得相同基 因的反应可平行地在若干文库中进行，或者在文库池中进行。文库池通常用3至5个不同 的文库制备并且使其归一化而成为一致的稀释度。在第一轮扩增中，两种方法均使用载体 特异性的(正向)引物，同时还使用基因特异性的(反向)引物，该正向引物对应位于克 隆5’ -端处的载体的一部分。-第一种方法使用与已知基因序列的一部分互补的序列，而 第二种方法使用与3’ -非翻译区(也称为UTR)的一部分互补的基因特异性引物。在第二 轮扩增中，两种方法均使用套式引物组。按照生产商的说明书，用市售试剂盒将所得DNA片段连接进pBLUESCRIPT 载体中。该试剂盒选自可得自包括Invitrogen (Carlsbad，CA)、 Promega Biotech (Madison, WI)和 Gibco-BRL (Gaithersburg，MD)在内的一些供应商的许 多试剂盒。如上所述，将质粒DNA通过碱性裂解方法分离并进行测序和用Phred/Phrap进 行装配。实施例7cDNA克降的鉴定编码LNT2样多肽的cDNA克隆通过这样鉴定进行BLAST(基本的局部比对搜索 工具)；Altschul等人，J.Biol. 215 =403-410,1993 ；还可参见国立卫生研究院国家医学 图书馆的国家生物技术信息中心的万维网址上对BLAST算法的解释)进行鉴定，寻找与 BLAST “nr”数据库中所包含氨基酸序列(包括所有非冗余GenBank⑶S翻译序列、源自 3_维结构Brookhaven蛋白质数据库(Protein Data Bank)、SWISS_PR0T蛋白质序列数据库 的最新的主要版本、EMBL和DDBJ数据库的序列)的相似性。在所有的阅读框中翻译来自克 隆的 DNA 并用 NCBI 提供的 BLASTX 算法(Gish 和 States，Nat. Genet. 3 :266_272 (1993))。 采用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法，分析cDNA序列编码的多肽与包含 在“nr”数据库中的所有可公开获得的氨基酸序列的相似性。为方便起见，通过BLAST计算 仅仅偶然观察到cDNA序列与所搜索的数据库中所包含序列的匹配的P值(概率)或E值 (期望值)，在本文报导为“pLog”值，它代表所报导的P值或E值的负对数。-因此，pLog 值越大，cDNA编码的序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。EST序列能与如上所述的Genbank数据库进行比较。通过使用BLASTn算法 (Altschul等人，Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402 (1997))对杜邦专利数据库比较具有序 列同源共有区域或重叠区域的核苷酸序列，可找到含更5'端或3'端序列的EST。在两个 或更多个核酸片段之间存在共有或重叠序列时，该序列可装配成单一的连续核苷酸序列， 从而使最初的片段在5'或3'初始方向上延伸。一旦确定了最5'的EST后，可以通过全 长插入序列来确定其完整的序列。可用tBLASTn算法，通过将已知基因(来自专有来源或公开数据库的已知基因) 的氨基酸序列对EST数据库进行比较，可找到属于不同物种的同源基因。tBLASTn算法对所 有6个阅读框都翻译了的核苷酸数据库进行氨基酸查询的搜索。该搜索允许不同物种之间 的核苷酸密码子使用的差异，并且允许密码子简并。实施例8表征编码LNT2样多肽的cDNA克降制备提供来自玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、和大豆(Glycinemax)不同 组织的mRNA的cDNA文库。下面描述了该文库的特征。表2来自玉米、大米、和大百的cDNAt库________________________________________文库________________________________________玉米(Zea mays L.)，用与RNA、DNA合成相关cpglc
rcaln pkOOl. f6 :fis
的化学制品处理过的收集的BMS
归一化的水稻(Oryza sativa L.，Nipponbare)愈伤
组织
rcaln.
Jl pkOOl. k5
sfllnl 归一化的大豆(Glycine max L.，Wye)未成熟的花。 sfllnl. pk002.
大豆(Glycine max，Wye) 11天龄幼苗的全长文
sdslf
sdslf.
库，使用海藻糖如表3、图14A-14B、和图15所示，表2中鉴定的cDNA编码的多肽类似于来自拟南 芥的LNT2多肽(At5g50930 ；NCBI通用标识号15241317 ；SEQ ID NO 28)和来自水稻(GI No. 38347162，对应于 SEQID NO 33)以及葡萄(GI No. 147791927，对应于 SEQ ID NO 34) 的LNT2样多肽。表3(非专利文献)和表4 (专利文献)中所示的分别是单独的EST (“EST”) BLASTP 结果、包含标明的cDNA克隆的整个cDNA插入物的序列(“FIS”)、由两个或更多个EST、FIS 或PCR序列装配而成的重叠群序列(“Contig”)、或编码源自FIS或重叠群的完整蛋白或 功能性蛋白的序列(“CGS”)。表3和表4也显示了使用Clustal V比对方法、使用默认参 数计算的每对氨基酸序列的序列同一性百分比值(如下所述)。
表3
多肽的BLASTP结果 与LNT2多肽的同源性
序列
(SEQ ID NO #)
状况 NCBI GI
% 同一性 BLAST
PLOG打分
cpglc. pk013. 06 :fis
(SEQ ID NO 18) rcaln. pkOOl. f6:fis
(SEQ ID NO 20) PS0415619
(SEQ ID NO 24) PS0415620
CGS
CGS
重叠群
38347162
(SEQ ID :33. 38347162
(SEQ ID :33. 147791927
(SEQ ID :34. 147791927
77. 4
100. 0
58. 7
17. 8
15. 8
13. 0(SEQ ID NO 26)
重叠群57. 1
(SEQ ID 34.
表4
多肽的BLASTP结果 与LNT2多肽的同源件重叠群57.111.8_序列BLAST状况 参照序列％同一性(SEQ ID NO #)pLOG 打分_CGSCGS重叠群重叠群图14A和14B提供如SEQ ID NO :18、20、24、26所示的氨基酸序列和来自拟南 芥(分别是 SEQ ID NO :28、30、和 32)的 LNT2 (At5g50930 ；NCBI 通用标识号 15241317)、 LNT2-2、以及LNT2-3多肽的氨基酸序列的比对。也包括来自水稻(GI No. 38347162，对应 于 SEQ ID NO 33)以及葡萄(GI No. 147791927，对应于 SEQ ID NO 34)的 LNT2 样多肽的 比对。图15是图14A和14B中显示的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值的图 表。用LASERGENE 生物信息计算包(DNASTAR Inc. ,Madison, WI)的 MEGALIGN 程序 进行序列比对和同一性百分比计算。用带默认参数(空位罚分=10，空位长度罚分=10) 的Clustal比对方法(Higgins和Sharp, 1989，CAB I OS. 5 :151_153)进行序列的多重比对。 使用Clustal方法的成对比对的默认参数为KTUPLE 1，空位罚分=3，窗口 = 5,DIAGONALS SAVED = 5。实施例9制备含有拟南芥属前导基因的同源物的棺物表汰载体可使用诸如BLAST(基本的局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool ；Altschul等人，J. Mol. Biol. 215 =403-410,1993 ；也参见美国国家卫生研究院 (National Institutes of Health)国立医学图书馆(National Library of Medicine)的 国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的万维网网
cpglc. pk013. 06 :fis
(SEQ ID NO 18) rcaln. pkOOl. f6:fis
(SEQ ID NO 20) PS0415619
(SEQ ID NO 24) PS0415620
(SEQ ID NO 26)
SEQ ID NO=224380
在 US2004214272-A1 中 SEQ ID NO 188525
在 US2004123343-A1 中 SEQ ID NO : 183694
在 US2004031072-A1 中 SEQ ID NO : 183694
在 US2004031072-A1 中
92. 3
100. 0
92. 1
84. 9
21. 0
15. 7
21. 4
19. 8址上对BLAST算法的解释)之类的序列比较算法，鉴定与前导LNT2基因同源的序列。同源 LNT2样序列，如实施例8所述的序列，可通过任何一种以下方法进行PCR扩增。方法1 (基于RNA的方法)如果LNT2同源物的蛋白编码区域的5’和3’序列信息 是可用的，可如实施例5A所述设计基因特异性引物。可将RT-PCR用于植物RNA来获得含 有蛋白编码区的核酸片段，该EXST蛋白编码区旁侧为attBl (SEQ ID NO 12)和attB2 (SEQ ID NO 13)序列。引物可含有起始密码子上游的共有Kozak序列(CAACA)。方法2 (基于DNA的方法)作为另外一种选择，如果LNT2同源物的cDNA克隆是可 用的，可以PCR扩增完整cDNA插入序列(含有5'和3'非编码区)。可设计正向引物和反向 引物，使它们分别或者含有attBl序列和在该cDNA插入序列前面的载体特异性序列或者含 有attB2序列和在该cDNA插入序列后面的载体特异性序列。对于克隆进载体pBluescript SK+中的cDNA插入序列，可使用正向引物VC062(SEQ IDNO 15)和反向引物VC063 (SEQ ID NO 16)。方法1和方法2可根据本领域技术人员已知的步骤进行修改。例如，方法1的引物 可含有限制性酶切位点而不是attBl和attB2位点，用于后来将PCR产物克隆进含有attBl 和attB2位点的载体内。另外，方法2可涉及从cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因组DNA 扩增。可利用BP重组反应将通过任一种上述方法获得的PCR产物与GATEWAY 供体载体 (例如 pDONR Zeo (SEQ ID NO :2 ；图 2)或 pD0NR 221 (SEQ ID NO :3 ；图 3)组合。这种方 法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONR Zeo或pD0NR 221移除并定 向地克隆了该在旁侧具有attBl和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆(entry clone)。 使用INVITR0GEN GATEWAY CL0NASE 技术，然后可将来自入门克隆的编码同源LNT2多 肽的序列转移到合适的目的载体中(如pBC-Yellow(SEQ ID NO :4 ；图4)、PHP27840 (SEQID NO 5 ；图5)、或PHP23236(SEQ ID NO 6 ；图6))以获得植物表达载体，所述载体分别用于拟 南芥、大豆、和玉米。图2和3中分别示出了供体载体pD0NRTM/Zeo或pDONR 221的attPl和attP2位 点。图 4、5 和 6 分别示出 了 目的载体 pBC-Yellow、PHP27840、和 PHP23236 的 attRl 和 attR2 位点。作为另外一种选择，可进行多个入门克隆和合适的目的载体之间的MultiSite Gateway LR重组反应以产生表达载体。实施例10吿組百.表汰裁■臓H寸_赫能細·拥为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达每个验证过的拟南芥属 (Arabidopsis)基因或来自不同物种的对应同源物。可将实施例5中所述的相同GATEWAY · Λ门克隆用于将每个基因定向克隆进 ΡΗΡ27840载体(SEQ ID NO 5 ；图5)中，使得该基因的表达处于SCPl启动子的控制下。然后可用包含编码本多肽的序列的表达载体转化大豆胚。为了诱导体细胞胚，可将子叶(长度为3_5mm，从大豆品种A2872的表面灭菌的未 成熟种子解剖出来)于26°C在光下或黑暗下培养六至十周。然后切取体细胞胚(其产生次 生胚)并将其置于合适的液体培养基内。在重复选择增殖为早期球形阶段胚的体细胞胚的簇后，按下面的描述保持该悬浮液。可将大豆胚发生悬浮培养物在26°C下在摇床(150rpm)上的35mL液体培养基中 保持，荧光光照采用16 8小时(白天/黑夜)的时间表。通过将大约35mg组织移植进 35ml液体培养基中，每两周将培养物进行传代培养。然后可通过基因枪轰击方法(Klein等人，Nature (London) 327 :70_73 (1987)，美 国专利4，945，050)转化大豆胚发生悬浮培养物。杜邦公司的BIOLISTIC PDS1000/HE仪 器(氦气改进型)可用于这些转化。可用于帮助大豆转化的可选标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子 (Odell 等人，Nature 313 :810_812 (1985))、来自质粒 pJR225 (来自大肠杆菌；Gritz 等人， Gene 25 :179_188，1983)的潮霉素磷酸转移酶基因以及胭脂碱合成酶基因的3'区构成的 嵌合基因，该胭脂碱合成酶基因来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) Ti质粒的 T-DNA。可用于帮助大豆转化的另一种可选标记基因是来自大豆或拟南芥属的除草剂抗性 乙酰乳酸合成酶(ALS)基因。ALS是支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成中 的第一共用酶。已经鉴定出ALS中的突变导致对三类ALS抑制剂中的某些或全部具有抗性 (美国专利5，013，659 ；其全部内容以引用的方式并入本文)。除草剂抗性ALS基因的表达 可处于SAM合成酶启动子(美国专利申请US-2003-0226166-A1 ；藉此将其全部内容以引用 的方式并入本文)的控制下。将如下物质(依次)加入50 μ L 60mg/mL的1 μ m金颗粒悬浮液5 μ L DNA (1 μ g/ μ L),20 μ L亚精胺(0. 1Μ)和50 μ L CaCl2 (2. 5Μ)。然后搅拌该颗粒制备物三分钟，在微量 离心机(microfuge)中离心10秒并移除上清液。然后将DNA包覆的颗粒在400 μ L 70%乙 醇中洗涤一次并再悬浮于40 μ L无水乙醇中。可将DNA/颗粒悬浮液用超声波处理三次，每 次一秒钟。然后将五μ L该DNA-包覆的金颗粒装载至每个宏载体盘上。将大约300_400mg两周大的悬浮培养物置于60X 15mm的空培养皿中并用吸管将 残留的液体从组织移除。对于每次转化实验，大约5-10板的组织受到正常轰击。膜破裂压 力设定为IlOOpsi并将腔室抽成28英寸汞柱的真空。将组织置于离阻挡网大约3. 5英寸 的地方并轰击三次。轰击后，可将组织分成两份并放回液体培养基中，如上所述进行培养。轰击后五至七天，用新鲜培养基更换该液体培养基，并在轰击后七至十二天，用含 有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基更换。可每周更换这种选择培养基。轰击后七至八周，可 观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚芽发生簇长出来。移出分离的绿色组织并将其 移植进单独的烧瓶中以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系 当成是独立的转化事件。然后可将这些悬浮培养物作为未成熟胚进行传代培养和维持，或 者通过使单独体细胞胚成熟并萌发而再生成整株植株。可分析用验证过的基因转化大豆植株以研究相对于对照或参照植株的农学特性。 例如，能够分析在低氮和高氮条件(如氮限制条件和氮充分条件)下的产量增加和/或稳 定性。实施例11使用粒子轰击用验证过的拟南芥前导基因转化玉米为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来 自不同物种的对应同源物。
可以将实施例5中所述的相同GATEWAY 入门克隆用于将每种相应的基因定向 克隆进玉米转化载体中。在玉米转化载体中的基因的表达可以处于组成型启动子的控制 下，例如玉米泛素启动子(Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 12 =619-632,1989,以及 Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 18 :675_689，1992)。然后可通过下面的方法将上述重组DNA构建体引入玉米细胞中。可从源于自交玉 米系H99和LH132杂交的发育中的颖果切取未成熟的玉米胚。在授粉后10至11天分离 胚，这时它们长为1. O至1. 5mm。然后将胚以轴线侧朝下放置并与琼脂糖硬化的N6培养基 (Chu等人，Sci. Sin. Peking 18 =659-668,1975)接触。将胚在27°C下保持在黑暗中。从这 些未成熟胚的胚鳞增生出易脆的胚发生愈伤组织，该愈伤组织由未分化的细胞块构成，在 胚柄结构上长有体细胞原胚状体和胚状体。可将从该原外植体分离的胚发生愈伤组织在N6 培养基上培养，并每两至三周在这种培养基上进行传代培养。可将质粒 p35S/Ac (得自 Peter Eckes 博士，Hoechst Ag, Frankfurt, Germany)用 于转化实验以便提供可选标记。该质粒含有pat基因(见欧洲专利公布O 242 236)，该基因 编码草胺膦乙酰转移酶(PAT)。酶PAT赋予对除草性谷氨酰胺合成酶抑制剂例如草胺膦的 抗性。p35S/Ac的pat基因处于来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，Nature313 810-812(1985))和胭脂碱合成酶基因的3'区的控制下，该胭脂碱合成酶基因来自根癌农 杆菌Ti质粒的T-DNA。可将粒子轰击法(Klein等人，Nature 327 :70_73 (1987))用于将基因转移至愈伤 组织培养细胞。根据该方法，利用下面的技术用DNA包覆金颗粒(直径1 μ m)。将十yg 质粒DNA加到50 μ L金颗粒的悬浮液(60mg每mL)中。将氯化钙(50 μ L的2. 5Μ溶液)和 亚精胺游离碱(20 μ L的1. OM溶液)加入到该颗粒中。再加入这些溶液过程中涡旋该悬浮 液。10分钟后，将试管粗略地离心(以15，OOOrpm进行5秒钟)并移除上清液。将该颗粒 再悬浮于200mL的无水乙醇中，再次离心并移除上清液。再次进行乙醇冲洗并将颗粒再悬 浮于终体积为30 μ L的乙醇中。可将DNA包覆的金颗粒等分试样(5 μ L)置于KAPTON飞行 圆盘(Bio-Rad Labs)的中心。然后使用 BI0LISTIC PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA)，采用IOOOpsi的氦气压、0. 5cm的间隙距离以及1. Ocm的飞行距离，将颗粒加 速射入玉米组织中。对于轰击，将胚发生组织置于琼脂糖硬化的N6培养基上的滤纸上。组织布置成薄 薄一层，并覆盖直径为约5cm的圆形区域。然后可将包含组织的培养皿置于离阻挡网大约 8cm的PDS-1000/He的腔室内。然后将该腔室中的空气抽出至28英寸汞柱的真空。利用在 击波管中氦气压力达到IOOOpsi时破裂的可破裂膜，宏载体被氦气冲击波加速。轰击后七天，可将组织转移至N6培养基中，该培养基含有双丙氨磷(每升5mg)并 缺少酪蛋白或脯氨酸。组织继续在这种培养基上缓慢生长。另外两周后，可将组织转移至含 有bialaphos的新鲜N6培养基上。六周后，在某些装有补充了双丙氨磷的培养基的盘上， 可辨别直径约Icm的区域上有活性生长的愈伤组织。当在选择培养基上传代培养时，这些 愈伤组织可继续生长。可以通过以下方法由愈伤组织再生出植物首先将组织簇转移到N6培养基中，所 述培养基补充了 0.2mg 2，4-D/升。-两周后，可将组织转移至再生培养基中(Fromm等人， Bio/Technology 8:833-839(1990))。
可再生出转基因的TO植株并按照下面的HTP步骤确定它们的表型。可收集Tl种子。可在氮限制条件下(例如ImM硝酸盐)栽培Tl植株并分析表型变化。利用图像 分析可定量下面的参数可收集并定量植株面积、体积、生长速率以及颜色分析。超表达构 建体与合适的对照植物比较导致绿度(绿色区)、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重或 干重、果实或种子产量、总植物氮含量、果实或种子氮含量、营养组织的氮含量、总植物游离 氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、果实或种子中的游离氨基酸含量、果实或种子 中的蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量发生变化，可认为它是拟南芥前导基因在玉米 中发挥功能提高对氮缺乏耐受性(增加的氮耐受性)的证据。此外，可通过直接转化或者 从单独转化的品系基因渗入而将含有证实的拟南芥基因的重组DNA构建体导入玉米自交 系内。实施例12电穿孔根癌农杆菌LBA4404(概沭)将电穿孔感受态细胞(40 μ L)，例如根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) LBA4404 (含有ΡΗΡ10523)在冰上解冻(20-30分钟)。ΡΗΡ10523含有用于T-DNA转移的VIR 基因、农杆菌属的低拷贝数质粒复制起始区、四环素抗性基因以及用于体内DNA生物分子 重组的cos位点。同时，将电穿孔管(electroporation cuvette)在冰上冷却。将该电穿 孔仪的设置调节至2. lkV。将DNA等分试样(0. 5 μ L亲代DNA，在低盐缓冲液或双蒸H2O中 的浓度为0. 2 μ g-1. 0 μ g)与解冻的根癌农杆菌LBA4404细胞混合，同时仍然保持在冰上。 将该混合物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1-2分钟。通过按下“pulse (脉冲)，， 键两次(理想的是获得4. 0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。 随后，将0. 5ml室温下的2xYT培养基(或SOC培养基)加入到电穿孔管并转移至15mL按 压盖管(例如FALCON 管)中。将细胞在28-300C >200-250rpm下培养3小时。将250 μ L的等分试样散布在包含YM培养基和50 μ g/mL奇放线菌素的板上并在 28-30°C下培养三天。为了增加转化体的数目，可进行如下两个可选步骤中的其中一个选择1 用30 μ L 15mg/ml的利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体 抗性基因。这种附加的选择消除了在使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时观察到的一 些污染克隆。选择2 进行两次重复的电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。转化体的鉴定选取四个独立的克隆并划痕接种在包含AB基本培养基和50 μ g/mL奇放线菌素的 平板上用于分离单个克隆。将平板在28°C下孵育二至三天。对于每个推定的共整合体选取 单个克隆并将其接种在4ml的10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，和50mg/ L奇放线菌素中。将该混合物在28°C下摇动培养24小时。采用QIAGEN Minipr印和可选 的PB缓冲液洗涤，从4ml培养物分离出质粒DNA。DNA在30 μ L中洗提。如上所述，将2 μ L 的等分试样用于电穿孔20 μ L DHlOb+ZOyL双蒸Η20。可任选地，可将15 μ L等分试样用于 转化 75-100 μ L 的 INVITR0GEN Library Efficiency DH5 α。将细胞散布在包含 LB 培养 基和50 μ g/mL奇放线菌素的平板上并将其在37°C下培养过夜。
对于每个推定的共整合体选取三至四个独立克隆并将其接种在4ml的2xYT培养 基(10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)和50yg/mL奇放线菌素中。将 细胞在37°C下摇晃培养过夜。接下来，使用QIApi^p Minipr印，用任选PB缓冲液洗涤液 (稀释成50 μ L)从4mL培养物中分离质粒DNA。8 μ L质粒DNA用SalI (使用亲本DNA和 ΡΗΡ10523作对照物)进行消化。对于4个质粒利用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII 再进行三次消化(使用亲代DNA和PHP10523作为对照)，这4个质粒代表2种具有正确 SalI消化模式的推定共整合体。推荐电凝胶(Electronic gel)用于比较。作为另一种选择，对于高通量应用，例如针对Gaspe Flint衍生的玉米品系(实施 例16)所描述的，代替通过限制性酶切分析来评价所得的共整合载体，可将三个克隆同时 用于如实施例13 (经由农杆菌转化)所述的感染步骤。实施例13使用农杆菌属(Agrobacterium)细菌转化玉米为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来 自不同物种的对应同源物。农杆菌属细菌介导的玉米转化基本上按照以下文献中描述的方法进行Zhao等 人，in Meth. Mol. Biol. 318 315-323 (2006)中描述的方法进行(还可参见Zhao等人，Mol. Breed. 8 =323-333(2001)和1999年11月9日公布的美国专利5，981，840，以引用的方式将 该文献并入本文)。该转化过程涉及细菌接种、共培养、静息、选择和植物再生。1.未成熟胚芽制备将未成熟胚芽从颖果上切下来，并且放置在含有2mL PHI-A培养基的2mL胃管中。2.細謹荆_干麵_趣■士咨养2. 1感染步骤用ImL微吸移管将(1)的PHI-A培养基取出，并且加入ImL农杆菌属细菌悬浮液。 将该管轻轻地倒置以混合。将该混合物在室温下培养5分钟。2. 2共培养步骤用ImL微吸移管将农杆菌属细菌悬浮液从感染步骤中取出。使用无菌刮刀将胚从 管中刮出并转移到100X15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。确定胚的朝向，使得胚 轴在培养基表面上朝下。将具有胚芽的平板在20°C于黑暗中培养3天。L-半胱氨酸可用 于共培养阶段。采用标准二元载体，补充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对于 回收稳定的转基因事件是至关重要的。3.诜择推定的转基因事件向在IOOX 15mm培养皿中的PHI-D培养基的平板中转移10个胚芽，保持朝向，并 且用parafilm将培养皿密封。将平板在黑暗中于28°C培养。预计在6_8周将看见作为黄 色胚芽组织的主动生长推定事件。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的，并且几乎看不见 脆性组织生长。以2-3周的间隔将推定的转基因胚芽组织转移到新鲜的PHI-D平板上进行 传代培养，时间间隔取决于生长速度。记录事件。4. TO棺株的再牛将在PHI-D培养基上繁殖的胚芽组织转移到在100 X 25mm培养皿中的PHI-E培养 基(体细胞胚芽成熟培养基)中进行传代培养，在28°C于黑暗中培养直至体细胞胚芽成熟，培养大约10-18天。将具有良好限定的盾片和胚芽鞘的个体成熟体细胞胚芽转移到PHI-F 胚芽发芽培养基中，并且在28°C于光中(约80 μ E，来自冷光灯或同等荧光灯)培养。在 7-10天，将约IOcm高的再生的植株置于盆中的园艺混合物中，并且使用标准园艺方法进行 耐寒锻炼(hardened-off)。用干棺物转化的培养某1. PHI-A :4g/L CHU基础盐，1. OmL/L 1000XEriksson' s 维生素混合物，0. 5mg/L 盐酸硫胺，1.5mg/L 2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸，68. 5g/L 蔗糖，36g/L 葡萄糖，pH5. 2。加入 100 μ M乙酰丁香酮(过滤灭菌的)。2. PHI-B :ΡΗΙ_Α，不含有葡萄糖，将2，4_D增加至2mg/L，将蔗糖降低至30g/L，并 且补充0. 85mg/L硝酸银(过滤灭菌的)，3. Og/LGELRITE , 100 μ M乙酰丁香酮(过滤灭菌 的)，ρΗ5. 8。3. PHI-C :ΡΗΙ-Β，不含 GELRITE 和乙酰丁香酮，将 2，4_D 降低至 1. 5mg/L，并且补 充8. Og/L琼脂，0. 5g/L 2-[N-吗啉代]乙烷-磺酸(MES)缓冲液，100mg/L羧苄西林(过 滤灭菌的)。4. PHI-D =PHI-C 补充 3mg/L bialaphos (过滤灭菌的)。5. PHI-E 4. 3g/L 的 Murashige and Skoog(MS)盐(Gibco，BRLl 1117-074)、0· 5mg/ L的烟酸、0. lmg/L的盐酸硫胺素、0. 5mg/L的盐酸吡哆醇、2. 0mg/L的甘氨酸、0. lg/L的肌 醇、0. 5mg/L 的玉米素(Sigma，商品目录号:No. Z-0164)，lmg/L 吲哚乙酸(IAA)，26. 4 μ g/L 脱落酸(ABA)，60g/L蔗糖，3mg/L bialaphos (过滤灭菌的)，100mg/L羧苄西林(过滤灭菌 的)，8g/L 琼脂，pH5.6。6. PHI-F 不含玉米素、IAA、ABA 的 PHI-E ；将蔗糖降低至 40g/L ；用 1. 5g/L
(K)
GELRITE替代琼脂；pH为5. 6。可以通过以下方法由愈伤组织再生出植物首先将组织簇转移到N6培养基中，所 述培养基补充了 0.2mg 2，4-D/升。-两周后，可将组织转移至再生培养基中(Fromm等人， Bio/Technology 8:833-839(1990))。转基因TO植株可以再生，并且可以确定其表型。可收集Tl种子。可在氮限制条件下(例如ImM硝酸盐)栽培Tl植株并分析表型变化。利用图像 分析可定量下面的参数可收集并定量植株面积、体积、生长速率以及颜色分析。超表达构 建体与合适的对照植物比较导致绿度(绿色区)、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重或 干重、果实或种子产量、总植物氮含量、果实或种子氮含量、营养组织的氮含量、总植物游离 氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、果实或种子中的游离氨基酸含量、果实或种子 中的蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量发生变化，可认为它是拟南芥前导基因在玉米 中发挥功能提高对氮缺乏耐受性(增加的氮耐受性)的证据。此外，可通过直接转化或者从单独转化的品系基因渗入而将含有证实的拟南芥基 因的重组DNA构建体导入玉米自交系内。实施例14A制各表汰裁体用干用骀iifi寸的候诜拟南芥某因(At5g50930)、使用农杆菌转化玉米品系通过INVITR0GEN GATEWAY· 技术，使用GATEWAY· 入门克隆进行LR重组反应以生成前体质粒PHP28699，GATEWAY 入门克隆包含拟南芥lnt2_2(如实施例5所述)、 入门克隆 PHP23112(SEQ IDNO :14)、入门克隆 PHP20234(SEQ ID NO :9 ；图 9)和目的载 体PHP22655 (SEQ ID NO: 10)。同样地，使用GATEWAY 入门克隆进行LR重组反应以生 成前体质粒PHP28700，GATEWAY 入门克隆包含拟南芥lnt2_2 (如实施例5所述)、入 门克隆 PHP23112(SEQ ID NO 14)、入门克隆 PHP20234 (SEQ ID NO :9 ；图 9)和目的载体 PHP22655 (SEQID NO 10)。PHP28699 和 PHP28700 各包含以下表达盒1.表达PAT抗除草剂性基因的泛素启动子moPAT: :PinII终止子盒，该基因用于 转化过程期间的选择。2.表达DS-RED颜色标记的LTP2启动子DS_RED2: :PinII终止子盒，该标记用于 分选种子。此外，PHP28699包含泛素启动子lnt2_2: PinII终止子盒，该表达盒过表达拟 南芥LNT2-2，而PHP28700包含泛素启动子lnt2_3: :PinII终止子盒，该表达盒过表达拟 南芥 LNT2-3。实施例14B練胃難iH糊謝以赫細(At5g50930)规 口口口胃使用如实施例12和13所述的农杆菌介导转化，可将载体ΡΗΡ28699 (如实施例14Α 所述)中存在的LNT2-2表达盒导入玉米自交系或来源于优良玉米自交系的可转化玉米品 系。也能使用相同程序将ΡΗΡ28700中存在的LNT2-3表达盒导入玉米自交系或来源于优良 玉米自交系的可转化玉米品系。能把表达载体ΡΗΡ28699通过电穿孔导入包含载体ΡΗΡ10523 (SEQID NO :7，图7) 的LBA4404农杆菌菌株以制备共整合载体ΡΗΡ28841，该载体包含lnt2-2表达盒。共整合载 体通过每个载体上包含的COS重组位点重组两个质粒PHP28699和PHP10523形成，并且除 了农杆菌菌株以及农杆菌介导转化需要的其它基因(ΤΕΤ、ΤΕΤ、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR Cl、VIR C2、VIR G、VIR B)之外，还包含上述相同的三个表达盒(实施例14A)。同 样地，能把表达载体PHP28700通过电穿孔导入包含载体PHP10523 (SEQ ID NO -J,图7)的 LBA4404农杆菌菌株以制备共整合载体PHP28840，该载体包含lnt2-3表达盒。可使用(但 不限于)实施例12中的电穿孔规程。实施例15制备目的载体PHP23236用于转化到Gaspe Flint来源的玉米品系中目的载体 PHP23236 (图 6，SEQ ID NO 6)是通过用载体 PHP23235 (图 8 ;SEQ ID NO 8)转化包含PHP10523(图7 ；SEQ ID NO 7)的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整 合产物而获得。目的载体PHP23236可被用于如实施例16所述的与入门克隆的重组反应，以产生 用于转化Gaspe Flint衍生的玉米品系的玉米表达载体。实施例16制各表汰构律体用干转仆Jl丨Gaspe Flint来源的玉米品系中使用INVITROGEN GATEWAY LR重组技术，可使用如实施例5所述的相同入门 克隆将表达盒定向克隆到GATEWAY 目的载体PHP23236 (SEQ ID NO :6;图6)中以制备 相应的表达载体。表达载体PHP29694和PHP29689分别包含lnt2_2 (SEQ ID NO 29)和Int2-3(SEQID NO :31)。每个表达载体包含在UBI启动子控制下的受关注cDNA，并且是 T-DNA 二元载体，用于通过如本文所述实施例所述(但不限于)的农杆菌介导转化到玉米中。实施例17A用骀iifi寸的候诜拟南芥某因(At5g50930)转化Gaspe Flint来源的玉米品系为了检查所得表型，可将玉米植株转化以过表达拟南芥属(Arabidopsis) At5g50930基因(和来自其它物种的对应同源物)。可使用如实施例16所述的表达构建体。受体棺株受体植株细胞可来自具有短的生活周期(“快速循环”)、大小减少以及转化潜能 高的单一玉米品系。对玉米典型的这些植株细胞是来自可公开获得的Gaspe Flint(GF)品 系变种的植株细胞。一种可能的候选植株品系变种是GFXQ (Quick Turnaround Maize (快 速周转玉米)，选择用于在温室条件下生长的Gaspe Flint的可公开获得形式)的Fl杂交 种，其在Tomes等人(美国专利申请10/367,416，提交于2003年2月13日；美国专利公开 公布2003/0221212 Al，公布于2003年11月27日)中有所公开。从该品系获得的转基因 植株具有如此小的大小使得它们可在4英寸的盆中生长(是正常大小的玉米植株所需空间 的1/4)并且它们在少于2. 5个月时间内成熟。(传统上，一旦转基因植株适应温室后需要 3. 5个月来获得转基因TO种子。)另一合适的品系包括但不限于GS3(高度可转化的品系) X Gaspe Flint的双单倍体品系。还有另一种合适的品系是携带引起较早开花、高度减小或 这两者的转基因的可转化的优良玉米自交系。转化规程任何合适的方法可用于将转基因引入玉米细胞中，包括但不限于利用基于农杆菌 载体的接种类型的步骤(参见例如实施例12和13)。转化可在受体(靶标)植株的未成熟 胚上进行。精确的生长和植株跟踪将由转化的玉米胚产生的转基因(TO)植株的事件群体在受控的温室环境中栽 培，该温室使用改良的随机分块(block)设计以降低或消除环境误差。随机分块设计是这 样一种植株布局，在该布局中，实验植株被分成组(如，每组30株植株)，称为块，而每株植 株随块被随机分配一个位置。对于一组30株植株，24株转化的实验植株和6株对照植株(具有设定好的表型 的植株)(总起来说称为“重复组”)被置于盆中，这些盆在位于温室内的桌子上布置成阵列 (也叫做重复组或块)。每株植株(对照植株或实验植株)随块被随机分配一个位置，所述 的块映射一个唯一的、温室物理位置以及映射该重复组。在单次实验中多个30株植株的重 复组中的每一个可栽培在相同的温室中。应该确定重复组的布局(布置方式)以使对空间 的要求最小以及温室内的环境影响最小。这样一种布局可称为压缩的温室布局。对于加入特定的对照组的一种替代方法是鉴定不表达所关注基因的那些转基因 植株。可将诸如RT-PCR之类的多种技术应用于定量评估引入基因的表达水平。可将不表 达转基因的TO植株与表达转基因的那些植株进行比较。在整个评价过程中鉴定和跟踪事件群体中的每株植株，并且从那些植株收集的数据自动与那些植株相关联，使得所搜集的数据可与由该植株携带的转基因关联。例如，每个 植株容器具有机器可读的标签(例如通用货单代码(UPC)条形码)，该标签包含了关于植物 身份的信息，身份信息继而又与温室位置相关，使得从植物获得的数据可自动与该植物相 关联。作为另外一种选择，可使用任何有效的、机器可读的植物识别系统，例如二维矩 阵代码或甚至是射频识别标签(RFID)，其中数据被接收并由射频接收器/处理器进行 翻译。参见提交于2002年12月19日的美国专利申请10/324，288(美国专利公开公布 2004/0122592 Al，公布于2004年6月24日)，该文献以引用方式并入本文。利用三维成像讲行表型分析对TO事件群体中的每株温室植株(包括任何对照植株)分析所关注的农学特性， 并且以这样一种方式记录或存储每株植株的农学数据，该方式使得数据与该植株的辨识数 据(见上面)相关联。可利用与上述类似的实验设计，可在Tl代中完成对表型(基因效 应)的确认。在植物的整个温室生活周期中，利用定量的非破坏性成像技术在表型水平上来分 析TO植株以评估所关注的性状。在一个实施方案中，将数字成像分析仪用于整株植物的自 动多维分析。成像可在温室内进行。将两个摄像系统(位于顶部和侧面)和用于旋转植物 的装置用于从所有侧面观察植物和成像。从每株植物的顶部、前面和侧面采集图像。所有 的三个图像一起提供了足够的信息用于评价例如每株植物的生物量、大小和形态。由于植物在第一片叶片从土壤显现出来时到植物处于它们发育的末期时大小的 改变，在一个实施方案中是从顶部以较高的放大倍率记录植物发育的早期。这摄像可通过 利用完全由成像软件控制的自动变焦镜头系统来完成。在单次成像分析操纵中，进行如下事件(1)将植株传送至分析仪区域内，旋转 360度以便其机器可读标签可被读取，并且让其保持静止直至其叶片停止移动；(2)获取侧 面图像并将其输入数据库；(3)将植株旋转90度并再次让其保持静止直至其叶片停止移 动，以及(4)将该植株传送出分析仪。每24小时的周期让植物至少6个小时处于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。成像仪器可使用任何合适的成像仪器，包括但不限于可从LemnaTec GmbH (ffurselen， Germany)商购获得的光谱数字成像仪。获取图像并用具有1/2" IT Progressive Scan IEE CCD成像设备的LemnaTec ScanalyzerHTS LT-0001-2进行分析。该成像照相机可配备有自 动变焦、自动调节光圈和自动聚焦。可利用LemnaTec软件设定所有的照相机设置。在一个 实施方案中，对于主要组成成像分析仪的仪器差异小于约5%，对于次要组成成像分析仪的 仪器差异小于约10%。^^成像分析系统包括用于颜色和构造分析的LemnaTec HTS Bonit软件程序和用于 存储约500，000次分析的数据(包括分析数据)的服务器数据库。原始图像和分析过的图 像储存在一起以允许用户根据需要进行再次分析。可将数据库连接至成像硬件用于自动的 数据收集和存储。多种可商购获得的软件系统(例如Matlab，其它软件)可用于定量解释 图像数据，并且可将这些软件体系中的任何一种应用于所述图像数据集。
传送系统具有植物旋转装置的传送系统可用于将植物传送至成像区域并在成像过程中选 择植物。例如，将最多4株植物(每株最高高度为1.5m)装上小车，该小车在循环的传送系 统上行进并通过成像测量区域。在这种情况下，该单位(成像分析仪和传送环线)的总占 有面积为约5mX5m。可扩大传送系统以同时容纳更多植物。将植物沿传送环线传送至成像区域并对每 株植物分析最多50秒。获取植物的三个视图。传送系统以及成像设备应该能够用于温室 环境条件。MM任何合适的照明模式可用于图像采集。例如，可在暗背景上使用顶部照明。作为 另外一种选择，可采用使用白色背景的顶部照明和背部照明的组合。应该将被照亮的区域 围起来以确保恒定的照明条件。遮蔽物应该长于测量区域使得能保持恒定的光条件而不需 要打开和关闭门。作为另一种选择，可以变化照明以引起转基因(如，绿色荧光蛋白(GFP)、 红色荧光蛋白(RFP))的激发或者引起内源性(如叶绿素)荧光基团的激发。基于三维成像的牛物量估计为了更好地估计生物量，应该从至少三个轴(在一个实施方案中是顶部视图和两 个侧面(侧面1和侧面2)视图)获取植物图像。然后分析这些图像以将植物从背景(盆 和花粉控制袋(如果适用的话))分离。可通过如下计算评价植物的体积
体积(体素)/顶部面积(像素)x^/侧面1面积(像素)χλ/侧面2面积(像素)在上面的等式中，体积和面积的单位是“任意单位”。在该体系中，任意单位完全足 以检测基因对植物大小和生长影响，因为所需的是检测与实验平均值或对照平均值的差值 (正_较大和负_较小两者)。大小(如面积)的任意单位可通过将物理参照加入到成像 过程而轻易地转化成物理量度。例如，可在顶部成像过程和侧面成像过程两者中均包括已 知面积的物理参照。基于这些物理参照的面积，可测定转换因子以允许从像素转换为面积 单位，例如平方厘米(cm2)。物理参照可以是或可以不是独立的样本。例如，具有已知直径 和高度的盆足可用作物理参照。颜饩分类成像技术还可以用于确定植物颜色以及用于将植物颜色归为各种衍生类型。将图 像颜色归属于颜色类型是LemnaTec软件的固有特色。使用其他图像分析软件系统，可通过 多种计算方法确定颜色分类。对于植物大小和生长参数的测定，一种有用的分类方案是定义一种单一颜色方 案，包括绿色的两种或三种色调(在一个实施方案中色调是50-66，参见图12)，此外，还有 关于缺绿病、坏死和漂白(在这些条件出现时)的颜色类型。还使用了背景颜色类型，其包 括图像中的非植物颜色(例如盆和土壤颜色)，并将这些像素特别地从测定大小中排除。在 受控的恒定照明下分析植物，使得可以定量一株植物内随时间推移的任何改变，或者植物 之间或植物不同分枝之间的任何改变(如季节差异)。除了其在测定植物的大小、生长中的有效性外，颜色分类还可用于评估其他产量 构成性状。对于这些其他产量构成性状，可使用另外的颜色分离方案。例如，称为“保绿度(staygreen) ”的性状(已经将其与产量的提高相关联)可通过颜色分类来评估，该颜色分 类将绿色色调与黄色和棕色色调(其指示老化的组织)相分离。通过将这种颜色分类应用 于在TO或Tl植物生活周期末获取的图像，可鉴定绿色的量相对于黄色和棕色(例如，可表 示为绿色/黄色比率)增加的植物。这种绿色/黄色比率具有显著差异的植物可被鉴定为 携带影响这种重要农学性状的转基因。熟练的植物学家将认识到可以指示植物健康或应激反应的其他植物颜色(花青 素)的出现，以及认识到其他颜色分类方案可以提供对基因在与这些响应相关的性状方面 的作用的进一步度量。棺物结构分析改变植物结构参数的转基因也可以用本发明鉴定，包括诸如最大高度和宽度、节 间距离、叶与茎之间的角度、在节处开始的叶片数以及叶片长度。LemnaTec系统软件可如下 用于确定植物构造。在第一成像步骤中将植物简化至其主要的几何构造，并且随后基于该 图像可进行不同构造参数的参数化鉴定。或者是单独地或者是组合地修改任何这些构造参 数的转基因可通过应用此前所述的统计方法来鉴定。花粉脱落日期花粉脱落日期是转基因植物中要分析的一个重要参数，并且可以通过活性雄花第 一次出现在植物上来确定。为了找到雄花目标，通过颜色对茎的上端进行分类以检测黄色 或紫色花药。然后将这种颜色分类分析用于定义活性花，活性花继而可用于计算花粉脱落日期。作为另外一种选择，花粉脱落日期和其他易于在视觉上检测到的植物属性(如授 粉日期、第一穗丝日期)可以由负责进行植物看护的工作任人员来记录。为了使数据完整 性和过程效率最大化，通过利用相同的由LemnaTec光谱数字分析设备利用的条形码来跟 踪该数据。可将具有条形码阅读器的电脑、掌上设备或笔记本电脑用于使记录观察时间、植 物标识符的数据捕捉变得容易，以及使捕捉数据的操纵者变得舒适。植物的取向以接近商业栽培的密度种植的成熟玉米植物通常具有平面的结构。也就是说，植 物具有一可清晰分辨的宽的侧面和窄的侧面。对来自植物宽侧的图像进行测定。对于每株 植物，给其赋予一个明确界定的基本取向以获得宽侧图像与窄侧(edgewise)图像之间的 最大差别。将顶部图像用于确定植物的主轴，而将额外的旋转装置用于在开始主图像采集 前将植物转至合适的取向。实施例17B用玉米同源物转化Gaspe Flint来源的玉米品系使用INVITROGEN GATEWAY LR重组技术，可制备入门克隆用于玉米同源物 (SEQ ID NO :17)(参见关于入门克隆制备的实施例5)，并且能够将入门克隆定向克隆到 GATEWAY 目的载体PHP23236(SEQID N0:6;图6)中以制备表达载体PHP30115。该表达载 体目前包含在UBI启动子控制下的受关注cDNA，并且是T-DNA 二元载体，用于通过如本文所 述实施例所述(但不限于)的农杆菌介导转化到玉米中。实施例18在最佳和减少氮条件下筛选Gaste Flint衍生的玉米品系
转基因植物将含有两个或三个剂量的Gaspe Flint-3与一个剂量的GS3 (GS3/ (Gaspe-3) 2X或GS3/ (Gaspe-3) 3X)，并且对于显性转基因会以1 1分离。将包含 PHP29689(表达盒=lnt2_3)的转基因植物种植在包含100 % Turface的200个标准盆 中。用l.OmM KNO3生长培养基(参见图13)浇洒植物直到分离确定。在8DAP(种植后天 数)，将幼苗随机均勻置于相应的处理组中。进行两种处理最佳氮(6. 5mMolKN03)和减少 氮(1. OmMol KNO3)处理，每日两次直至13DAP。在13和24DAP之间的每天灌溉时间是在 9:00AM、12:00PM、和3 OOPM用营养物质浇灌3分钟(156mL)。在25DAP，在5 OOAM增加第 四次浇灌，在31DAP，在5:00PM增加第五次浇灌。每个表每周监控pH至少三次，并且记录 哪天出苗以及哪天脱落。每周对每个植株拍照三次(周一、周三、和周五)以评估表面积积 聚、比生长速率(sgr)、和颜色变化。在8DAP对植物取样进行ELISA Μ0ΡΑΤ，并且在35DAP 进行表达和代谢表达谱分析。从在37DAP收获的组织中获取鲜重数据，并且然后将收获的 组织烘干(70°C，120小时)以获取干重数据。评估PHP29689的四个事件(图16)。计算更大的Student t检验的概率用于比较 每个转基因平均值与合适的无效转基因平均值(分离无效转基因或构建体无效转基因)。 使用最小值(P <t)0. 1作为临界值。表5示出每个事件与分离无效转基因相比显著增加 的变量。^ 5PHP29689 事件综沭 当认为所有事件是相对于无效构建体(图17)时，该构建体与无效构建体相比多 个变量平均显示出显著的增加(数据概述于表6中)。PHP29689构建体概述 实施例19H有ffl南芥玉米品系的产量分丰斤自交或顶交杂交体的转基因植物可通过更严谨的大田试验来研究在氮限制条件下和无氮限制条件下的产量增加和/或稳定性。例如，可进行产量分析以测定包含验证过 的拟南芥lnt2-2或lnt2-3基因的植物在与对照植物(或参比植物)进行比较时是否具 有产量改善(在氮限制条件下和无氮限制条件下)，所述对照植物是构建体转化无效植物 或野生型植物。氮限制条件通过以前的能育性实践组合提供，其中施加含量减少的氮一年 或多年，玉米或替代作物在该条件下生长并且每季移除种子作物。在此类条件下，基于由 Federal and State Extension服务对特定生长区域确定的土壤测试标准，低氮(LN)环境 指氮量少于在早春或夏季施加的标准氮肥的量，而标准氮(NN)环境指加入正常产量所需 的充足的氮。包含验证过的拟南芥lnt2_2或lnt2_3基因的玉米杂交体测交以及它们的对照植 物在Woodland，CA和Johnston，IA的LN和NN环境下生长，并且评估产量。在LN环境下观 察到的产量减少与在NN环境下获得的产量比较。包含验证过的拟南芥lnt2-2或lnt2_3 基因的玉米杂交体测交的产量与构建体无效转化植物的产量比较。这些产量试验的结果在 图18-21中显示。包含PHP28840 (表达盒=lnt2_3)的植物的个体事件显示在LN条件下显著增加 的产量(2007 年在 Woodland 的事件 E6919. 105. 1. 11 和 E6919. 105. 1. 21)，而 2007 年在 Johnston测试的E6919. 105. 1. 21事件具有数字上更高的产量。2008年相似的测试揭示事 件 E6919. 105. 1. 21 在 Woodland 和 Johnston 以及事件 E6919. 105. 1. 2 和 E6919. 105. 1. 24 在Woodland和Johnston分别具有显著改善的产量。包含PHP28840的植物在低氮条件下 的结果在图18中显示。在标准氮(NN)处理条件下，2007年在Woodland和Johnston的事件 E6919. 105. 1. 11与无构建体植物的产量相似(无统计学意义上的差异)，说明在更高的氮 含量条件下，该事件保留了高产量的潜力。2008年在Woodland获得了相似的结果。与之 相反，2008 年在 Johnston 的事件 E3919. 105. 1. 11 和 2007 年与 2008 年在 Johnston 的事 件E6919. 105. 1. 21以及E6919. 105. 1. 24具有显著较低的产量。包含PHP28840的植物在 标准氮条件下的结果在图20中显示。包含PHP28841 (表达盒=lnt2_2)的植物的个体事件(2007年，Woodland,在LN 条件下的事件E6919. 106. 1. 17和E6919. 106. 1. 3)显示具有统计意义上的显著性的产量增 加。然而，2007年，Johnston，在LN条件下的事件E6919. 106. 1. 3显示显著较低的产量，并 且未收集事件E6919. 106. 1. 17的产量。图19示出包含PHP28841的植物在低氮(LN)条件 下的结果。在标准氮(NN)处理条件下，与构建体无效转化植物相比，2007年在Woodland和 Johnston的E6919. 106. 1. 17都具有数字上更高的产量，然而事件E6919. 106. 1. 3在2007 年、在Woodland显示显著增加的产量，而在2007年、在Johnston显示数字上增加的产量。 事件E6919. 106. 1. 22和E619. 106. 1. 8在Woodland显示显著减少的产量。包含PHP28841 的植物在标准氮(NN)条件下的结果在图21中显示。实施例20NUE玉米幼苗分析使用种子颜色标记将转基因事件的种子(具有构建体PHP28841或PHP28840)分 成转基因(杂合的)种子和无效转基因种子。进行两组不同的随机分配处理，使用所有处理的9个平行测定，使每个随机分块(block)有排列成6排9列的54个盆。在一个实例 中，混合相同构建体的5个事件的4个无效转基因种子，将其用作批对照用于比较该分块的 5个阳性事件，在每个分块中制备6个处理的组合。在第二个实例中，将3个转基因阳性处 理以及它们对应的无效转基因随机分配到该分块的54个盆中，制备每个分块的6个处理组 合(3个阳性处理以及对应的无效转基因)，包含所有处理组合的9个平行测定。在第一个 实例中，转基因参数与批量无效构建体比较；在第二个实例中，转基因参数与对应的无效转 基因事件比较。在其中每个构建体有10、15、或20个事件的实例中，将事件分成5个事件一 组，并且计算54个盆的每个分块的变量。然而，在进行转基因方法比较前收集分块的分块 无效转基因方法。就每个处理而言，将两个种子种植在4英寸的方盆中，盆中包含在8英寸交错 中心上的Turface。盆每天用包含以下营养物质的溶液浇灌四次lmM CaCl2, 2mM MgSO4, 0. 5mM KH2PO4,83ppm Sprint330, 3mMKCl, ImM KNO3,1 μ M ZnSO4,1 μ M MnCl2,3yM H3BO4, 0. 1 μ MCuSO4,禾口 0· 1 μ M NaMoO4。植物出苗后，将其减少到每盆一个种子。通常在周一种植处理种子，并且植物在周 五后出苗。然后在种植后18天收获植物。在收获时从盆中移除植物，并且将Turface从根 部洗脱。使根与苗分开，把根置于纸袋中并且在70°C干燥70小时。将干燥后的植物部分 (根和苗)称重并置于50mL的圆锥管中，管中有大约20 5/32英寸的钢球，在涂料振荡器中 进行振荡研磨。将大约30mg研磨组织(记录重量用于后续的调节)在2mL 20% H2O2和6M H2SO4中水解30分钟，水解温度为170°C。在冷却后，加水至20ml，充分混合该溶液。移除 50 μ 1的等分试样并加到950 μ 1 IM Na2CO3中。通过将100 μ L该溶液置于96孔板的每个 孔中，然后加入50yL OPA溶液，使用该溶液中的氨评估减少的总植物氮。测定荧光强度， 激发(excitation) = 360nM/发射(emission) = 530nM，并且与溶解在相似溶液并用OPA 溶液处理过的NH4Cl标准品进行比较。以下溶液用于前述实验 OPA溶液-5 μ 1巯基乙醇+Iml OPA储备液(每天新鲜制备)OPA 储备液-50mg 邻苯二醛(0PA_Sigma#P0657)溶解于 1. 5mL 甲醇 +4. 4mL IMBorate 缓冲液 pH9. 5 (3. 09g H3BO4+Ig NaOH,溶于 50mL 水中)+0. 55mL 20% SDS (每周新 鲜制备)测量以下参数，并且使用Student t检验比较参数平均值与无效参数平均值 SPAD (绿度)、茎直径、根干重、苗干重、总干重、和植物氮浓度。在每个随机分块中使用最近 邻计算以及使用完全随机设计(CRD)模型的方差分析(Analysis of Variance, AN0VA)计 算差异。使用F统计，通过将总随机分块处理平均面积除以总随机分块误差平均面积计算 每个随机分块的总处理效应。计算更大的Student t检验的概率用于比较每个转基因平均 值与合适的无效转基因(或者批构建体或单个事件的无效转基因平均值)平均值。使用最 小值(P <t)0.1作为临界值。图 22 示出 PHP28840(表达盒=lnt2_3)和 PHP28841 (表达盒=lnt2_2)构建体 的NUE幼苗测定结果。包含UBI:lnt2-3表达盒的事件E6919. 105. 1. 21显示以下变量具有 统计意义上的显著性的增加苗干重、氮浓度、和总氮。具有UBI:lnt2-3表达盒的另一个事 件和具有UBI:lnt2-2表达盒的六个事件中的四个表现出植物氮浓度具有统计意义上的显著性的增加。此外，包含UBI lnt2-2表达盒的六个事件中的两个显示具有统计意义上的显 著性的总氮增加。实施例21规禾口 i平·械iH寸白■賊_±百.__±百.基于同源性搜索，能鉴定验证过的拟南芥前导基因的一个或若干个候选大豆同源 物，并且还能评估它们增加大豆氮限制条件耐受性的能力。载体构建、植物转化和表型分析 将类似于上文实施例所述的规程。实施例22规禾口 i平·械iH寸白■賊_玉.綱原_絲基于同源性搜索，能鉴定验证过的拟南芥前导基因的一个或若干个候选玉米同源 物(例如SEQ ID NO: 18和20)，并且还能评估它们增加玉米氮限制条件耐受性的能力。载 体构建、植物转化和表型分析可类似于上文实施例所述的规程。实施例23臓H寸白■賊禾找百._浦體赫可将验证过的拟南芥前导基因的大豆和玉米同源物在35S启动子的控制下转化 到拟南芥中，并且当在低氮培养基中生长时分析其叶片面积和绿色区积聚。可如本文实施 例所述进行载体构建和植物转化。检测分析的条件、数据采集和数据分析可类似于上文实 施例所述的规程。
权利要求
在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。
2.权利要求1的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
3.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含(a)可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多 肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQID NO 18、20、24、26、28、30、或32进行 比较时具有至少50%的序列同一性；或(b)抑制DNA构建体，所述构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少50% 的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的完全互补序列；或( )源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V 比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的所述全部或部分进行比较时，所述区域的 核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2多肽，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出至少一 种农学特性的改变。
4.权利要求3的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
5.权利要求3的植物，其中当在氮限制条件下与未包含所述重组DNA构建体的所述对 照植物比较时，所述植物表现出所述至少一种农学特性的所述改变。
6.权利要求5的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
7.权利要求3的植物，其中所述至少一种农学特性选自绿度、产量、生长速率、生物 量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含 氮量、营养组织含氮量、总植物氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含 量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织 蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏抗性、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高度和穗长度。
8.权利要求7的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
9.权利要求3的植物，其中在与所述对照植物相比较时，所述植物表现出所述至少一 种农学特性的增加。
10.权利要求9的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
11.增加植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于Clustal V比对方法在与SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少 50%的序列同一性；和(b)在步骤(a)之后从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物 进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。
12.权利要求11的方法，所述方法还包括(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的 氮胁迫耐受性。
13.评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于Clustal V比对方法在与SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少 50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价所述转基因植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮 胁迫耐受性。
14.权利要求13的方法，所述方法还包括(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体；以及(e)评价所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁 迫耐受性。
15.评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于Clustal V比对方法在与SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少 50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体；以及(d)评价所述转子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮 胁迫耐受性。
16.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于Clustal V比对方法在与SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少 50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
17.权利要求16的方法，所述方法还包括(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体；以及(e)测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表 现出至少一种农学特性的改变。
18.权利要求16的方法，其中所述测定步骤(c)包括测定所述转基因植物在氮限制 条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的 改变。
19.权利要求17的方法，其中所述测定步骤(e)包括测定所述子代植物在氮限制条 件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
20.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体弓I入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地 连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列 基于Clustal V比对方法在与SEQID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少 50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出 至少一种农学特性的改变。
21.权利要求20的方法，其中所述测定步骤(d)包括测定所述转基因植物在氮限制 条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的 改变。
22.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将包含至少一种调控元件的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述调 控元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少50% 的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或( )源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，在与所述区域所来 源的有义链或反义链的所述全部或部分进行比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的 核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2多肽；(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在 其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现 出至少一种农学特性的改变。
23.权利要求22的方法，其中所述测定步骤(c)包括测定所述转基因植物在氮限制 条件下与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
24.权利要求22的方法，所述方法还包括(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 抑制DNA构建体；以及(e)测定所述子代植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时是否表 现出至少一种农学特性的改变。
25.权利要求24的方法，其中所述测定步骤(e)包括测定所述子代植物在氮限制条 件下与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改 变。
26.测定植物中的农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将包含至少一种调控元件的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该调控 元件可操作地连接至(i)以下序列的全部或部分(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、24、26、28、30、或32进行比较时具有至少50% 的序列同一性，或(B)所述(b) (i) (A)的核酸序列的完全互补序列；或( )源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，在与所述区域所来 源的有义链或反义链的所述全部或部分进行比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的 核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT2多肽；(b)在步骤(a)之后从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植 物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物进 行比较时表现出至少一种农学性状的改变；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在基因组中包含该抑制DNA 构建体；以及(d)测定该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少 一种农学特性的改变。
27.权利要求26的方法，其中所述测定步骤(d)包括测定所述转基因植物在氮限制 条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
28.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、24、或26进行比较时具有至少85%的序列同一性；或 ( )所述(i)的核酸序列的全长互补序列。
29.权利要求28的分离的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比对 方法在与SEQ ID NO :18、24、或26进行比较时具有至少90%的序列同一性。
30.权利要求28的分离的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比对 方法在与SEQ ID NO :18、24、或26进行比较时具有至少95%的序列同一性。
31.权利要求28的分离的多核苷酸，其中所述多肽的序列包括SEQIDNO :18、24、或26。5
32.权利要求28的分离的多核苷酸，其中所述核酸序列包括SEQ IDN0:17、23、或25。
全文摘要
尤其可用于在氮限制条件下改变植物农学特性的分离的多核苷酸和多肽以及重组DNA构建体，包含这些重组DNA构建体的组合物(如植物或种子)、以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接在植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码LNT2多肽。
文档编号C12N15/82GK101918560SQ200880124194
公开日2010年12月15日 申请日期2008年11月5日 优先权日2007年11月7日
发明者D·卢塞尔特, H·萨凯, M·奥克曼, S·M·艾伦, S·V·廷盖, S·卢克 申请人:纳幕尔杜邦公司;先锋国际良种公司