发酵含木素纤维素材料的制作方法

专利名称：发酵含木素纤维素材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于含木素纤维素材料的发酵方法。
背景技术：
由于化石燃料有限的储量和对温室气体排放的担忧，人们越来越多地关注使用可 再生能源。包含含木素纤维素材料的植物材料可由发酵生物(包括细菌、酵母和真菌)转化 为可发酵的糖，并用作能源用于工业目的。例如，含木素纤维素材料可由酶转化为糖，且所 得的糖可用作原料供工业微生物产生产物，如塑料和乙醇。由含木素纤维素材料的发酵生成发酵产物(如乙醇)在本领域中是已知的，并且 通常包括含木素纤维素材料的预处理、水解和发酵。含木素纤维素材料的预处理导致例如，乙酸、酚类和呋喃由含木素纤维素材料释 放，所述材料在水解和发酵期间可以不可逆地结合加入的酶。这些化合物也可对于发酵生 物体的代谢是有毒的，并且抑制发酵生物体的性能。为了克服对酵母的这种抑制，实践中将 水解物稀释，并在低干固体浓度的条件下发酵，从而实现了对所述抑制化合物浓度的相应 的稀释。通过增加pH可减少特别是乙酸和其它弱酸对酵母的毒性也是众所周知的。然而， 为了控制腐败(spoilage)细菌的污染，对经水解的含木素纤维素材料的发酵通常在酸性 PH(低于5. 5)进行。因此，经水解的含木素纤维素材料的发酵通常在低pH和低干固体浓度 进行。需要从含木素纤维素材料产生发酵产物的改进的方法。发明概述本发明人现已发现，可在较高pH发酵经水解的含木素纤维素材料的醪液(mash)， 并同时控制腐败细菌的污染。这是通过在发酵过程中使用非常高的干固体浓度来实现的。 不拘于理论，相信虽然弱酸(如乙酸)对发酵生物的毒性在高PH时减少从而允许发酵生物 的增殖，但是腐败细菌的生长受高浓度的其它抑制化合物控制。因此，本发明在第一个方面涉及从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括 下述步骤(a) (i)预处理含木素纤维素材料的材料，(a) ( )水解经预处理的含木素纤维 素材料，(b)使用发酵生物发酵在步骤(a)中获得的水解物，和(c)任选地，回收所述发酵 产物，其中，在步骤(b)中的发酵过程中，pH为5. 5-9.0，而高的干固体浓度为至少20%。在第二个方面，本发明涉及产生发酵产物的方法，所述方法包括(a)提供经预处 理的含木素纤维素材料的水解物，(b)将所述水解物与发酵生物相接触以产生发酵产物，和 (c)任选地，回收所述发酵产物，其中，在步骤(b)中的发酵过程中，pH为5. 5-9.0，而高的 干固体浓度为至少20%。在上述方面中，所述发酵生物优选酵母，而发酵产物优选乙醇。上述方面步骤的具体细节如下所述(例如，在“预处理”、“水解”和“发酵”部分 中)。
具体实施例方式★储震胃遍本文使用的术语“含木素纤维素材料”指主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的 材料。该术语与“木素纤维素材料”同义。这种材料经常称为“生物质”。本发明包括任何含木素纤维素材料。含木素纤维素材料可以是包含木质纤维 素的任何材料。在一个优选实施方案中，含木素纤维素材料包含至少30wt. %，优选至少 50wt. %，更优选至少70wt. %，甚至更优选至少90wt. %的木质纤维素。应理解的是，含木 素纤维素材料还可以包含其它组分，如蛋白质材料、淀粉、糖，如可发酵的糖和/或不可发 酵的糖。通常在例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树的叶、枝和木材中发现含木素纤维素 材料。含木素纤维素材料还可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固 体废物、废纸，和纸浆和造纸厂残余物。在本文应理解的是，含木素纤维素材料可以是植物 细胞壁材料的形式，其在混合的基体中包含木质素、纤维素和半纤维素。在一个优选实施方案中，含木素纤维素材料包括玉米秸秆、玉米纤维、稻草、松木、 木屑/刨花(wood chip)、杨木、甘蔗渣、纸和纸浆(pulp)处理废物中的一种或多种。其它含木素纤维素材料的实例包括硬木，如杨木和桦木，软木，谷类草杆(cereal straw)，如麦秆(wheat straw)，柳枝稷(switchgrass)，城市固体废物，工业有机废物，办公 用纸，或它们的混合物。在一个优选实施方案中，木素纤维素材料是玉米秸秆或玉米纤维，优选通过蒸汽 爆炸(steam explosion)预处理，优选经酶法水解，并在约6的pH和约30%的干固体浓度 用酵母发酵产生乙醇。所述乙醇优选回收用作燃料乙醇。预处理木素纤维素的结构对酶法水解而言不是直接可及的。因此，必须预处理含木素纤 维素材料(例如，通过在充分的压力和温度条件下酸水解)以打破木质素的密封并破坏纤 维素的晶体结构。这导致半纤维素和纤维素级分的溶解(solubilization)。然后可将纤维 素和半纤维素用酶水解，例如，通过纤维素酶酶(纤维素分解酶)，以将糖聚合物转化为可 发酵的糖，其使用发酵生物(例如，酵母)，可发酵为期望的发酵产物(如乙醇)。任选地， 所述发酵产物可(例如，通过蒸馏)回收。当预处理含木素纤维素材料时，产生了可能抑制酶和/或可能对发酵生物有毒性 的降解产物。这些降解产物严重地减少了水解和发酵两者的速率。预处理含木素纤维素材料的方法在本领域是众所周知的。本发明涵盖的方法的实 例描述于下面“预处理”部分。经预处理的木素纤维素降解产物包括木质素降解产物、纤维素降解产物和半纤维 素降解产物。经预处理的木质素降解产物本质上可为酚。半纤维素降解产物包括来自糖(如己糖和/或戊糖)的呋喃，所述糖包括木 糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖。半纤维素的实例包括木聚糖、半乳葡甘露聚糖 (galactoglucomannan)、阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan)、阿拉伯葡糖醛酸木聚糖 (arabinoglucuronoxylan)、葡糖醛酸木聚糖(glucuronoxylan)，及其衍生物和组合。
抑制化合物(即，经预处理的木质纤维素降解产物)的实例，包括4-0H苯甲醇， 4-0H苯甲醛，4-0H苯甲酸，三甲基苯甲醛，2-糠酸，香豆酸，阿魏酸，酚，愈创木酚，藜芦醚， 连苯三酚(pyrogallollol)，连苯三酚单甲酯，香草醇，香草醛，异香草醛，香草酸，异香草 酸，高香草酸(homovanillic acid)，藜芦醇，藜芦醛，藜芦酸，2_0_甲基五倍子酸，丁香醇， 丁香醛，丁香酸，三甲基五倍子酸，高儿茶酚，乙基香草醛，木焦油醇，对甲基苯甲醚，茴香 醛，茴香酸，糠醛，羟甲基糠醛，5-羟甲基糠醛，甲酸，乙酸，乙酰丙酸，桂皮酸，松柏醛，异丁 子香酚，对苯二酚，丁子香酚或它们的组合。其它抑制化合物可见于，例如Luo等，2002， Biomass and Bioenergy 22 125-138。可以以任何合适的方式预处理含木素纤维素材料。预处理可以在水解和/发酵前 和/或期间进行。在一个优选实施方案中，在发酵前和/或期间，将经预处理的材料水解，优 选酶水解。预处理的目的是分离和/或释放纤维素，半纤维素和/或木质素，并且这种方式 可以改善水解速率(rate of hydrolysis)。预处理方法如湿氧化和碱预处理靶向(target) 木质素，而稀酸和自水解靶向半纤维素。蒸汽爆炸(steam explosion)是靶向纤维素的预 处理的实例。根据本发明，步骤(a)中的预处理可以是使用本领域公知技术的常规预处理步 骤。合适的预处理的实例在下文描述。在一个优选实施方案中，预处理在含水浆料中发生。预处理期间，含木素纤维素材料可以以10_80wt. %，优选20_70wt. %，特别是 30-60wt. %，如约50wt. %的干固体浓度存在。化学、机械和/或牛物预处理根据本发明，含木素纤维素材料在水解和/或发酵前可以进行化学、机械和/或生 物预处理。机械预处理(经常称作物理处理)可以单独使用或者与随后或同时进行的水解 (特别是酶水解)组合使用。优选地，在水解和/或发酵前进行化学、机械和/或生物预处理。或者，化学、机械 和/或生物预处理可以与水解同时进行，如与加入一种或多种纤维素酶(纤维素分解酶) 或下述其它酶活性同时进行，以释放例如可发酵糖，如葡萄糖和/或麦芽糖。在本发明的实施方案中，可洗涤经预处理的含木素纤维素材料。然而，洗涤不是必 须的，且在优选的实施方案中可以去除。化学预处理术语“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的任 何化学预处理。合适的化学预处理的实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化 硫、二氧化碳处理。此外，湿氧化和控制PH的水热解(hydrothermolysis)也被认为是化学 预处理。在一个优选实施方案中，化学预处理是酸处理，更优选地，连续的稀酸和/或弱酸 (mild acid)处理，如，用硫酸，或者另一种有机酸，如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或 它们的混合物处理。也可以使用其它酸。弱酸处理指处理PH在1-5，优选1-3的范围内。 在具体的实施方案中，酸浓度为0. 1至2. Owt. %的酸，优选硫酸。酸可以接触含木素纤维素 材料，并且混合物可以在160-220°C，如165-195°C的温度保持数分钟至数秒钟的时间，例 如1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可以加入强酸，如硫酸，用于去除半纤维素。这增 强了纤维素的可消化性。
也涵盖其它技术。已经显示，纤维素溶剂处理可将约90%的纤维素转化成葡萄 糖。也已经显示，当木质纤维素结构破坏时能极大地增强酶水解。碱性H2O2、臭氧、有机溶 剂(organosolv)(使用含水醇中的 Lewis 酸、FeCl3、(Al)2SO4)、甘油、二p恶烷(dioxane)、苯 酚或乙二醇属于已知可破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，2005，Bioresource Technology 96 :673-686)。本发明也涵盖用碱，例如NaOH、Na2CO3和/或氨等进行的碱性化学预处理。使 用氨的预处理方法在例如 WO 2006/110891、WO 2006/110899、W02006/110900 和 WO 2006/110901(通过提述并入本文)中描述。湿氧化技术包括使用氧化剂，如基于亚硫酸(sulphite)的氧化剂等。溶剂预处 理的实例包括用DMSO (二甲基亚砜)等处理。化学预处理通常进行1至60分钟，如从5至 30分钟，但是依赖于待预处理的材料，化学预处理可以进行更短或更长的时间。合适的预处理方法的其它实例由Schell等，2003，Appl. Biochem and Biotechn. Vol. 105-108 :69-85，和 Mosier 等，2005，Bioresource Technology 96 :673_686，和美国公 开2002/0164730描述，所述文献通过提述全部并入本文。机械预处理术语“机械预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木素纤维素 材料分离和/或释放的任何机械(或物理)处理。例如，机械预处理包括各种类型的磨制 (milling)、辐射(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆炸，和水热解。机械预处理包括粉碎(机械减小尺度)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨。机械 预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本发明的一个实施方案中，高压指300至 600psi，优选400至500psi，如约450psi范围内的压力。在本发明的一个实施方案中，高温 指在约100至300°C，优选约140至235°C范围内的温度。在一个优选实施方案中，机械预 处理是分批工艺的蒸汽枪(steam gun)水解器系统，其使用如上所定义的高压和高温。为 此可使用 Sunds Hydrolyzer (可由 Sunds Defibrator AB(Sweden)得至Ij )。组合的化学和机械预处理在一个优选实施方案中，化学和机械预处理均进行。例如，预处理步骤可以涉及稀 酸或弱酸处理和高温和/或高压处理。化学和机械预处理可以根据需要顺序或同时进行。因此，在一个优选实施方案中，对含木素纤维素材料进行化学和机械预处理，以促 进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。在一个优选实施方案中，预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步骤进行。在另一 个优选的实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸步骤(或AFEX预处理步骤)进行。生物预处理如同本发明所使用的，术语“生物预处理”指可促进纤维素、半纤维素和/或木质 素从含木质纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可涉及应用 溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu, 1996, Pretreatment of biomass,于 Handbook on Bioethanol !Production and Utilization, Wyman 编，Taylor & Francis, Washington, DC,179-212 ；Ghosh 禾口 Singh,1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv.Appl. Microbiol. 39 :295-333 ；McMillan,1994, Pretreating lignocellulosic biomass :areview,于 Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Baker 禾口 Overend 编，ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, 第 15 章；Gong, Cao, Du 禾口 Tsao, 1999, Ethanol production from renewable resources, 于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65 :207-241 ；Olsson 禾口 Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech.18 312-331 ；及Vallander禾口Eriksson, 1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials :State of the art, Adv. Biochem. Eng. /Biotechnol. 42 :63-95)。水解在发酵前和/或与发酵同时，可以将经预处理的含木质纤维素材料水解，以分解 (break down)纤维素和半纤维素。水解期间的干燥固体含量可在5_50wt. %，优选10_40wt. %，优选20_30wt. %的 范围内。在一个优选实施方案中，水解可以作为补料分批方法进行，其中将经预处理的含木 素纤维素材料(底物)向例如包含酶的水解溶液中逐渐补料。在一个优选实施方案中，水解以酶法进行。根据本发明，经预处理的含木质纤 维素材料可以通过一种或多种水解酶(根据酶命名法为EC 3类)水解，优选选自下 组的一种或多种糖酶纤维素酶、半纤维素酶，淀粉酶如α-淀粉酶、蛋白酶、糖生成酶 (carbohydrate-generating enzyme)如葡糖淀粉酶、酯酶如脂肪酶。在水解和/或发酵期 间可存在α -淀粉酶、葡糖淀粉酶等，因为含木素纤维素材料可能包括一些淀粉。用于水解的酶能直接或间接将糖聚合物转化成可发酵的糖，后者能发酵成为期望 的发酵产物，如乙醇。在一个优选实施方案中，糖酶具有纤维素酶的活性。合适的糖酶在下面的“酶”部 分中描述。可通过半纤维素酶和/或酸水解分解半纤维素聚合物，以释放其五碳糖和六碳糖 组分。六碳糖(己糖)，如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖，通过合适的发酵生物体(包 括酵母)可容易地发酵成为，例如乙醇、丙酮、丁醇、甘油、柠檬酸、富马酸等。优选用于乙醇 发酵的是酿酒酵母菌种的酵母，优选对高水平乙醇，即，高至例如约10、12或15vol. %乙醇 或者更多，如20vol. %乙醇有抗性的菌株。在一个优选实施方案中，使用半纤维素酶，优选木聚糖酶、酯酶、纤维二糖酶或其 组合水解经过预处理的含木质纤维素材料。水解也可以在半纤维素酶和/或纤维素酶，和任选的下文“酶”部分中提及的一种 或多种其它酶活性的组合存在的情况下进行。可以在可由本领域技术人员容易确定的条件下，在合适的含水环境中进行酶处理。在一个优选实施方案中，在适于所述酶的条件(优选最适条件)下进行水解。合适的工艺时间、温度和pH条件可由本领域的技术人员容易地确定。优选地，水 解在25-70°C，优选40-60°C，特别是约50°C的温度进行。优选地，该工艺在pH 3_8，优选pH 4-6，特别是约pH 5的pH进行。优选地，水解进行12-96小时，优选16-72小时，更优选小时。
发酵根据本发明，通过至少一种能将可发酵糖如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖直接或 间接发酵成为期望发酵产物的发酵生物体，来发酵经预处理(和水解)的含木素纤维素材 料。发酵中的pH在5. 5到9. 0，优选在5. 7到8. 0，更优选5. 8到7. 0，且最优选在至少 PH5. 9到6. 5的范围，如约pH 6。pH可以使用任何合适的化合物调整。在一个优选实施方 案中，使用NaOH调整pH。发酵过程中的干固体浓度在约20 %到高至约35 %的范围，如至少20 %、至少 21%、至少22%、至少23%、至少25%、至少、至少27%、至少、至少四％，和高至 约30%、高至31%、高至32%、高至33%或甚至高至；34%。发酵优选进行8至96小时，优选12至72小时，更优选从M至48小时。在一个实施方案中，发酵在20至40°C，优选沈至:34°C，特别是约32°C的温度进 行。在一个实施方案中，PH为pH 5. 5至9. 0，优选从约pH 6至6. 5。根据本发明，步骤(a)中的水解和步骤(b)中的发酵可同时(SSF方法)或顺次 (SHF方法)，或作为混合水解和发酵(HHF)进行。在一个优选实施方案中，水解和发酵作为同时水解和发酵步骤进行(SSF)。通常这 意味着组合的/同时水解和发酵在对所述发酵生物合适(优选为最佳)的条件(例如，温 度和/或pH)下进行。在一个实施方案中，没有水解的单独保持阶段，意味着水解酶和发酵生物体一 起加入。当发酵(例如，使用酵母属酵母的乙醇发酵)与水解同时进行时，温度优选为 260C -35°C，更优选30°C _34°C，如约32°C。根据本发明可以使用包含在不同温度的至少两 个保持阶段的温度程序。在另一个优选实施方案中，水解和发酵作为混合水解和发酵(HHF)进行。HHF—般 以单独的部分水解步骤起始，并以同时水解和发酵步骤结束。所述单独的部分水解步骤是 酶法纤维素糖化步骤，一般在对所述水解酶合适(优选为最佳)的条件(例如，在较高的温 度)下进行。后续的同时水解和发酵步骤通常在对所述发酵生物合适的条件(通常在比所 述单独水解步骤更低的温度)下进行。最后，水解和发酵步骤还可以以分开的水解和发酵 来进行，其中在发酵起始之前完成所述水解。这常常称作“SHF”。Ml^发酵后，可以从发酵培养基/培养液(broth)分离发酵产物。可以蒸馏培养基/ 培养液以提取发酵产物，或者可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基/培养液提取发酵 产物。或者可以通过气提(stripping)回收发酵产物。回收方法是本领域中公知的。发酵产物本发明的方法可以用于产生任何发酵产物。特别期望的发酵产物包括醇(例如， 乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸)；酮(例如，丙 酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)； 酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选实施方案中，发酵产物是醇，特别是乙醇。根据本发明获得的发酵产 物，如乙醇，可以优选为燃料醇/乙醇。然而，在乙醇的情况中，其还可以用作饮料乙醇。
发酵牛物体术语“发酵生物体”指适于产生期望的发酵产物的任何生物体，包括细菌和真菌 生物体。根据本发明的特别合适的发酵生物体能发酵，即，将糖如葡萄糖，直接或间接转化 成期望的发酵产物。发酵生物体的实例包括真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母 属的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)，特别是树干毕赤酵母(Pichia stipitis)或巴斯德 毕赤酵母(Pichia pastoris)的菌株；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是产朊假丝酵 母(Candida utilis)、阿糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)、迪丹斯假丝酵母 (Candida diddensii)或博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的菌株。其它涵盖的酵母包 括汉逊酵母属(Hansenula)，特别是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或异常汉逊酵 母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，特别是马克斯克鲁维酵 母(Kluyveromyces marxianus)或脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fagilis)的菌株，禾口 裂殖酵母属(Schizosaccharomyces),特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) 的菌株。优选的细菌发酵生物体包括埃希氏菌属Escherichia)，特别是大肠杆 菌(Escherichia coli)的菌株，发酵单孢菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单 孢菌(Zymomonas mobilis)的菌株，发酵杆菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵杆 菌(ZymcAactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯 氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串 珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium),特另Ij 是 丁酸梭 菌(Clostridium butyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter),特另Il是产气肠杆 菌(Enterobacter aerogenes)的菌株，禾口 热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌 株，特别是热厌氧杆菌BGlLl (App 1. Micrbiol. Biotech. 77 :61-86)和乙醇热厌氧杆菌 (Thermoanarobacter ethanolicus)。商业上可用的酵母包括，例如，RED STAR 或ETHANOL RED 酵母(可由i^ermentis/ Lesaffre, USA 获得)、FALI (可由 Fleischmann，s Yeast, USA 获得)、SUPERSTART 和 THERMOSACC 新鲜酵母(可由 Ethanol Technology, WI,USA 获得)、BI0FERM AFT 和 XR(可 由 NABC-North American Bioproducts Corporation, GA, USA 获得)、GERT STRAND(可由 Gert Strand AB, Sweden 获得)和 FERMI0L(可由 DSM Specialties 获得)。酶在本发明方法的语境中，即使未特别提及，应理解酶(以及其它化合物)是以“有 效量”使用。纤维素分解酶在发酵、水解、SHF或HHF过程中，可存在一种或多种纤维素分解酶。本文所使用的术语“纤维素分解酶”应理解为包括纤维二糖水解酶(EC3. 2. 1. 91)， 例如，纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及内切葡聚糖(EC3. 2. 1. 4)和β -葡糖苷 酶(EC3. 2. 1. 21)。对上述酶进一步的描述参见下面的相关部分。为了有效，对纤维素的消化可需要数种类型的酶合作发挥作用。通常需要至少三 类酶来将纤维素转化为葡萄糖内切葡聚糖酶(EC 3.2. 1.4)，其随机剪切纤维素链；纤维二糖水解酶(EC 3. 2. 1. 91)，其自纤维素链末端切割纤维二糖基单元，以及β -葡糖苷酶 (EC 3. 2. 1. 21)，其将纤维二糖和可溶性纤维糊精转化为葡萄糖。在这三类涉及纤维素生物 降解的酶中，纤维二糖水解酶是降解天然微晶纤维素的关键酶。在本文中，术语“纤维二糖 水解酶I”定义为纤维素1，4-β -纤维二糖糖苷酶(亦称为外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水 解酶或1，4-β纤维二糖水解酶)活性，如酶分类EC 3.2. 1.91所定义，其通过从链的非还 原末端释放纤维二糖来催化纤维素和纤维四糖中l，4-i3-D-葡糖苷键的水解。对术语“纤 维二糖水解酶II活性”的定义是相同的，只是纤维二糖水解酶II自链的还原末端进攻。所述纤维素分解酶可包含糖结合模块(CBM)，其增强该酶与含木素纤维素纤维的 结合，并增加该酶催化活性部分的功效。CBM定义为在对糖有活性的酶中邻接的氨基酸序 列，其带有具糖结合活性的谨慎折叠(discreet fold)。关于CBM进一步的信息参见CAZy 互联网服务器(见上)或 iTomme 等(1995)于 Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides(Saddler 禾口 Penner 编)，Cellulose-binding domains -classification and properties, pp. 142-163, AmericanChemical Society, Washington。在一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶可为如美国申请号60/941251中定义 的纤维素分解制备物，该文件通过提述并入本文。在一个优选实施方案中，所述纤维素分 解制备物包含具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)，优选WO 2005/074656中公开的 桔橙嗜热霉(Thermoascus aurantiacus)GH61A(通过提述并入本文)。所述纤维素分解 制备物可进一步包括β-葡糖苷酶，如源自腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、 曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)菌株的β -葡糖苷酶，包括美国申请 号 US 11/781，151 或 PCT/US2007/074038 (Novozymes)中公开的特异腐质霉(Humicola ins0lens)CEL45A内切葡聚糖酶核心/米曲霉(Aspergillus oryzae) β -葡糖苷酶融 合蛋白。在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物亦可包括CBH II，优选土生梭孢霉 (Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II (CEL6A)。在另一个实施方案中，所述纤维素 分解酶制备物也可包含纤维素酶制备物，优选源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的。在一个优选实施方案中，纤维素分解活性可源自真菌来源，如木霉属的菌株，优选 里氏木霉菌株；或腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株，或金孢子菌属(Chrysosporium) 的菌株，优选 Chrysosporium Iucknowense 的菌株。在一个实施方案中，所述纤维素分解酶制备物包括WO 2005/074656中公开的具 有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；纤维二糖水解酶，如土生梭孢霉纤维二糖水解酶 II (CEL6A) ； β -葡糖苷酶(例如，美国申请号60/832，511中公开的融合蛋白)，以及纤维素 分解酶，例如，源自里氏木霉的。在一个实施方案中，所述纤维素分解酶为商业上可得到的产品CEI. lUCLAST 1. 5L 或 CELLUZYME (可从 Novozymes A/S, Denmark 获得)或 ACCELERASE 1000 (可从 Genencor Inc. , USA 获得)。可添加纤维素分解酶用于水解经预处理的含木素纤维素材料。所述纤维素分解酶 可以0. 1-100FPU每克干固体，优选0. 5-50FPU每克干固体，特别为1-20FPU每克干固体范 围内的剂量添加。所述纤维素分解酶可以1-1000EGU每克干固体，优选10-500EGU每克干固体，特别 是50到200EGU每克干固体的剂量添加。
在另一个实施方案中，将至少Img纤维素分解酶每克干固体(DS)，优选至少3mg纤 维素分解酶每克干固体，如5-10mg纤维素分解酶每克干固体用于水解。内切葡聚糖酶(EG)内切葡聚糖酶(E. C. No. 3. 2. 1. 4)催化下述物质中1，4_β -D-糖苷键的内水解纤 维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉、在混合β-1，3-葡聚 糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β _1，4键，以及其它含有纤维素部分的植物材料。 其官方名称为内-l，4-i3-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，但在本说明书中使用其简称内切葡 聚糖酶。内切葡聚糖酶活性可使用羧甲基纤维素(CMC)水解根据(ihose，1987，Pure and App 1. Chem. 59 :257-268 的方法确定。在一个优选实施方案中，内切葡聚糖酶可源自木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌 株；腐质霉属的菌株，优选特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporium Iucknowense 的菌株。纤维二糖水解酶(CBH)术语“纤维二糖水解酶”意指1，4- β -D-葡聚糖纤维二糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 91)， 其在纤维素、纤维寡糖或任何含有β -1，4-连接的葡萄糖的聚合物中催化1，4-β -D-葡糖 苷键的水解，自链的还原或非还原末端释放纤维二糖。纤维二糖水解酶的实例为上面提及的，包括来自里氏木霉、特异腐质霉的CBH I和 CBH II ；来自土生梭孢霉的CBH II纤维二糖水解酶(CELL6A)。纤维二糖水解酶活性可根据由Lever等，1972，Anal. Biochem. 47 :273-279和由 van Tilbeurgh 等，1982，FEBS Letters 149 :152-156 ；van Tilbeurgh 禾口 Claeyssens， 1985,FEBS Letters 187 :283-288描述的方法来确定。所述Lever等的方法适用于评估玉 米秸杆中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等的方法适用于对于荧光二糖衍生物确定纤维 二糖水解酶活性。g -葡糖苷酶一种或多种β-葡糖苷酶(有时称为“纤维二糖酶”)可在水解、发酵、SHF或HHF 过程中存在。术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2. 1.21)，其催化末 端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，及β-D-葡萄糖的释放。就本发明而言，葡糖苷 酶的活性根据由Venturi等，2002，J. Basic Microbiol. 42 :55-66描述的基本方法确定， 只是如本文所述使用不同的条件。一单位的葡糖苷酶活性定义为自4mM对-硝基苯 基-β-D-吡喃葡糖苷作为底物在IOOmM柠檬酸钠，0.01 %TWEEN 20中在50°C，pH 5 每分钟产生1. 0微摩尔的对-硝基苯酚。在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶为真菌来源的，如木霉属、曲霉属或青 霉属的菌株。在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶源自里氏木霉，如由bgll基因 编码的β-葡糖苷酶(参见EP 562003的

图1)。在另一个优选实施方案中，所述β -葡 糖苷酶源自米曲霉(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(根据WO 02/095014的实施例22在米曲霉中重组产生)，或黑曲霉(1981， J. Appl. 3157-163)。纤维素分解增强活件
术语“纤维素分解增强活性”在本文中定义为使具有纤维素分解活性的蛋白质对 木素纤维素衍生材料的水解增强的生物活性。就本发明而言，通过测量与具有相等总蛋白 加载量但没有纤维素分解增强活性(l-50mg纤维素分解蛋白/g PCS (经预处理的玉米秸) 中的纤维素)的对照水解相比，在如下条件下由于纤维素分解蛋白对木素纤维素衍生材料 (例如经预处理的含木素纤维素材料)的水解而发生的还原糖的增加或纤维二糖和葡萄糖 总量的增加来测定纤维素分解增强活性l_50mg总蛋白质/g PCS中的纤维素，其中总蛋白 质的组成为(comprised of) 80-99. 5% w/w纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素和0. 5-20% w/w纤维素分解增强活性蛋白，在50°C进行1-7天。具有纤维素分解增强活性的多肽通过降低达到相同程度水解所需的纤维素分解 酶量来增强具有纤维素分解活性的蛋白质所催化的对木素纤维素来源材料的水解，所述纤 维素分解酶量的降低优选至少0. 1倍、更优选至少0. 2倍、更优选至少0. 3倍、更优选至少 0. 4倍、更优选至少0. 5倍、更优选至少1倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至 少5倍、更优选至少10倍、更优选至少20倍、更优选至少30倍、最优选至少50倍、甚至最 优选至少100倍。在一个优选的实施方案中，水解和/或发酵是在存在与具有增强活性的多肽组合 的纤维素分解酶的情况下进行的。在一个优选的实施方案中，具有增强活性的多肽是家族 GH61A多肽。WO 2005/074647披露了来自土生梭孢霉的具有纤维素分解增强活性的分离的 多肽及其多核苷酸。WO 2005/074656披露了来自桔橙嗜热霉(Thermoascus aurantiacus) 的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。美国申请
发明者任海彧, 黄鸿志 申请人:中粮集团有限公司, 诺维信公司