使用碱性脱木质化剂加工木质纤维素材料的方法

使用碱性脱木质化剂加工木质纤维素材料的方法
【专利摘要】本发明涉及用于由木质纤维素材料得到糖和木质素部分的方法和用于使用得自木质纤维素的糖类生产发酵产物的方法。具体地，本发明涉及用于改善酶促水解产物中的糖产率的方法，通过引入热水水解的预处理步骤和碱脱木质化步骤来进行。
【专利说明】使用碱性脱木质化剂加工木质纤维素材料的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及用于由木质纤维素材料得到糖和木质素部分的方法并且涉及使用得 自木质纤维素的糖类生产发酵产物的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 木质纤维素是地球上最丰富的生物聚合物。木质纤维素是木本植物和非木本植物 如草的主要结构性组分。木质纤维素生物质指由纤维素、半纤维素和木质素组成的植物生 物质。大量木质纤维素残余物由林业、伐木和制浆和造纸业和农业活动(例如麦杆、秸杆、甘 蔗渣、谷壳、外壳)和许多农业产业产生。另外，城市废物含有可以视为木质纤维素残余物的 部分，如废纸或废纸板、花园废弃物或来自建筑业的废弃木材。木质纤维素残余物，例如农 业废物提供了高度可持续的、非食品的和非-ILUC(间接土地使用改变)的生物燃料的可替 代选择。此外，归因于高丰度和低价格，木质纤维素残余物是用于生产生物燃料的优选材 料。此外，具有生物质生产率的专用木质或草本能源作物赢得作为生物燃料使用的兴趣。
[0004] 已经广泛地研究了通过微生物发酵从木质纤维素材料中生产生物燃料，尤其乙 醇。利用木质纤维素以便微生物学生产生物燃料或生物燃料原料的最大挑战在于木质纤维 素材料的复杂性及其抗生物降解性。在木质纤维素中，纤维素(植物干重的20-50% )纤维包 埋在半纤维素（20-40%)、果胶（2-20%)和木质素（10-25%)的共价存在的基质中，形成非 常抵抗生物降解的结构。另外，半纤维素的糖残基含有取决于生物质的己糖(例如，葡萄糖、 甘露糖和半乳糖)和戊糖(例如，阿拉伯糖和木糖)的不同混合物。
[0005] 某些微生物可以由有机分子例如衍生自木质素纤维素的糖类生产脂质。某些微生 物典型地为酵母、真菌或细菌可以有效地将木质纤维素材料中的C6和C5糖类转化成油。由 异养微生物产生的油通常称作单细胞油或微生物油。使用异养微生物的单细胞油生产方法 典型地包含在充氧的生物反应器中培养微生物、允许细胞蓄积脂质、收获富含脂质的细胞 并且从细胞中回收油。基于微生物的脂质（即单细胞油)可以用作用于生产生物燃料，例如 生化柴油、可再生柴油或生物喷气式发动机燃料。
[0006] 在经济上切实可行的通过微生物发酵由木质纤维素材料生产生物燃料需要将木 质纤维素材料的所有主要的碳水化合物成分有效地转化成生物燃料。另一方面，生物燃料 生产的经济上的切实可行性需要必须将木质纤维素材料的所有主要碳水化合物成分转化 成适合于微生物产生的糖。一般地，这意味着破坏(水解)半纤维素和纤维素的聚合物结构 以得到单体糖。
[0007] 现有技术公开了几种方法，它们可以用于由木质纤维素材料生产糖。
[0008] 专利公开号US2008/032344 A1公开了用于从木质纤维素生物质中回收纤维素糖 和近天然木质素副产物的方法。该方法包括对原料减小自水解、有机溶剂和酶促水解处理， 以产生包含葡萄糖的纤维素糖溶液，用酵母和/或适合的重组微生物发酵，产生生物燃料 和/或化学物质。
[0009] Cunningham和Carr(1984)已经报道了从麦猜中除去半纤维素和木质素的各种方 法，得到改良的纤维素残余物，用于酶促水解。他们还公开了预处理方法，其包含自水解麦 秸，然后用NaOH进行碱处理。用于自水解的麦秸的脱木质化的NaOH的量明显高于本发明。根 据Cunningham和Carr的教导，自水解的麦杆的脱木质化处理没有显著地改善酶处理步骤中 纤维素向葡萄糖的转化，而无自水解步骤的碱处理显著地改善了酶促水解的结果(参见表1II和IV)。此外，得到的半纤维素和纤维素水解产物无法用于生产植物本发明中的单细胞 油。
[0010]专利公开号US 2013/143285 A1描述了用于将木质纤维素原料转化成可发酵糖的 方法。该方法包括在pH 8-12下对木质纤维素原料进行碱处理、稀酸处理且最终进行酶促水 解，产生包含葡萄糖的糖溶液，将其发酵成发酵产物。
[0011]专利公开号US 2012/036768A1描述了由木质纤维素材料生产可发酵糖的方法，其 中该方法是将预处理的木质纤维素材料进行两阶段酶促水解处理。第一次酶处理包含混合 预处理的材料与第一种酶组合物，产生第一种水解混合物，将其增稠以增加纤维浓度，得到 第二种水解混合物。第二次酶处理包含混合第二种水解混合物与第二种酶组合物，产生包 含可发酵糖和固体木质素相的液体混合物。
[0012] 在由木质纤维素材料生产木质纤维素糖的过程中的主要挑战之一在于提供一种 方法，其能够以成本有效的方式生产高质量糖水解产物，它们可以在不进一步纯化的情况 下用于生产单细胞油。高质量的糖水解产物是指杂质例如苯酚和酸的量应当低于对用于发 酵的微生物产生毒性的浓度。成本效益要求水解剂如酶的消耗应当保持在低水平。例如，这 可以通过使熟化的化学物质再循环实现。经济上的切实可行性要求并不用作微生物发酵的 原料的侧流的质量应当尽可能高至能够对这些物流实施物价稳定措施。
[0013] 现有技术工艺水平的木质纤维素预处理技术已经被设计用于厌氧发酵(纤维素乙 醇）。微生物油生产不同于厌氧发酵，因为它是需氧过程(需要氧）。本发明描述了木质纤维 素分级分离方法，其尤其对于需氧生物过程如微生物油生产有益。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明的一个目的在于提供木质纤维素分级分离方法，其能够生产高质量的可用 作使用异养微生物生产微生物油中的碳源的糖水解产物。
[0016] 本发明的另一个目的在于提供一种分级分离方法，其具有改善的生产力和纤维素 部分酶促水解的产率。
[0017] 本发明的第三个目的在于提供生产高质量木质素部分的分级分离方法。
[0018] 本发明的第四个目的在于提供一种分级分离方法，其具有改善的需氧发酵方法成 本效益，这归因于用于需氧发酵中惰性物质(木质素)和抑制剂的量较低。
[0019] 为了实现上述目的，本发明的特征在于独立权利要求中所定义的特征。
[0020] 在本发明的第一方面涉及用于分级分离木质纤维素材料的方法，该方法包括：
[0021] a)对木质纤维素材料进行处理，其中从木质纤维素材料中至少部分除去半纤维素 以产生包含第一液相与第一固相的混合物；
[0022] b)使第一固相与第一液相分离；
[0023] c)在碱性脱木质化剂的存在下对第一固相进行脱木质化处理，以产生包含第二固 相和包含增溶的木质素的第二液相的混合物；
[0024] d)使第二固相与第二液相分离；
[0025] e)在能够水解第二固相的半纤维素和纤维素部分的酶的存在下对第二固相进行 酶促水解处理，以产生包含第三液相和第三固相的混合物。
[0026]本发明的第二方面涉及通过本发明方法可得到的酶促水解产物形式的液相(第三 液相）。
[0027]本发明的第三个方面是通过本发明方法可得到的浓糖水解产物。
[0028] 第四个方面涉及通过本发明方法可得到的沉淀的木质素部分。
[0029] 本发明的另一个方面涉及用于生产微生物脂质的方法，该方法包括：
[0030] (i)提供包含通过用于分级分离木质纤维素材料(第三液相)的方法得到的酶促水 解产物液相或本发明的浓糖水解产物的培养基；
[0031 ] (ii)通过给所述培养基接种含油微生物提供发酵肉汤；
[0032] (iii)温育所述用所述含油微生物接种的培养基，以使脂质蓄积；
[0033] (vi)从所述含油微生物中回收脂质。
[0034] 另外的优选实施方案在从属权利要求中呈现。
[0035] 本发明基于如下发现:通过进行溶解半纤维素的处理和通过在酶促水解步骤前用 碱处理分离木质素，总糖产率增加。这是重要的，因为本发明的目的在于尽可能多地从木质 纤维素材料中提取糖。本发明的另一个优点在于酶促水解的效率和需氧发酵的成本效益得 到显著改善。
[0036] 本发明还基于另一个发现:可以使用与现有技术公开相比极低量的碱剂进行碱处 理。
[0037] 本发明还基于如下发现:在脱木质化前从木质纤维素材料中分离的半纤维素糖可 以在不经任何纯化处理的情况下用于微生物发酵。
[0038]本发明提供了如下优点：
[0039] -高总糖产率，纤维素和半纤维素糖有效地被回收
[0040] -在糖产率和产率方面纤维素部分更有效地酶促水解；
[0041 ]-产生高质量木质素部分，其能够实现木质素物价稳定措施；
[0042]-增加需氧发酵过程的成本效益；
[0043]-由包含少量木质素的需氧发酵产生高质量的微生物生物质残余物，从而能够将 该残余物用作动物饲料；
[0044]-脱木质化的碱性剂消耗减少，且随后溶解的木质素沉淀和酶促水解前pH调节中 酸的消耗减少。
[0045] 附图简述
[0046] 图1-4呈现本发明实施方案的流程图。
[0047]图5呈现本发明实施方案的酶促水解的流程图。
[0048] 图6呈现24h、48h和72h后、第一次、第二次和第三次依次水解后和固体再循环和再 经过24h反应后分批水解中来自NaOH-脱木质化麦杆和自水解麦杆的总糖产率。
[0049]图7呈现分批水解、依次水解和固体再循环中NaOH-脱木质化麦杆和自水解麦杆水 解中的酶生产力。
[0050]图8呈现分批水解、依次水解和固体再循环的体积糖产率。
[0051]图9呈现在水解(A)、反应体积(B)和反应稠度(C)方面具有50%再循环率的固体再 循环反应进程。
[0052]图10呈现米曲霉(Aspergi 1 lus oryzae)对麦猜水解产物的分批补料发酵结果。 [0053]图11呈现来自麦秸自水解的固体残余物产率。
[0054] 图12呈现在得自麦秸自水解的10%稠度(g麦杆固体干物质/g总物质）的液体部分 中总可溶性糖(g/Ι，左侧y_轴)和潜在的微生物抑制剂物质;糠醛、轻甲基糠醛(HMF)和可溶 性酚类(g/Ι，右侧y-周）的浓度。
[0055] 表1.来自具有不同脱木质化处理的自水解的麦杆的干物质产率(DM产率)比较。来 自脱木质化麦杆的酶促水解的糖产率依赖于处理条件。基于自水解的麦杆的干物质并且基 于自水解的麦杆的碳水化合物含量给出如下的糖产率。
[0056]表2:进料前生长培养基的组成。
[0057]表3: pH设定至5，5的接种培养基的组成。
[0058]表4:发酵培养基的组成。
[0059]发明详述
[0060]在描述本发明的过程中，为清楚起见可以采用特定的术语。然而，并不打算将本发 明限制到如此选择的特定术语，且应当理解，每个特定的术语包括为实现类似目的以类似 方式操作的所有技术等效术语。
[0061 ] 定义
[0062] 木质纤维素材料
[0063] 术语"木质纤维素生物质"或"木质纤维素材料"的含义包括、但不限于木本植物或 非木本植物、草本植物或其它包含纤维素和/或半纤维素的材料:材料可以是农业废物(例 如麦秸、麦杆、谷壳、外壳、谷类秸杆、甘蔗渣、甘蔗尖和叶）、专用能源作物(如柳枝稷、芒属 (Miscanthus)、芦竹(Arundo donax)、草芦（reed canary grass)、柳树、风眼莲、能源甘鹿 (energy cane)、能源高粱（energy sorghum))、木材或残余物(包括锯木厂和纸衆和/或造 纸厂残渣或碎片，例如半纤维素、消耗的亚硫酸盐废液、废纤维和/或初沉淤泥）、苔藓植物 或泥煤或市场造纸废水。术语木质纤维素材料还包含低木质素材料，例如巨藻类生物质这 样的材料。此外，该材料还包含半纤维素或来自工业实践的纤维素部分。术语木质纤维素材 料包括任意种类的纤维素部分。原料或一些部分例如来自不同来源的纤维素、植物种类或 工业加工的半纤维素和/或纤维素可以彼此混合并且用作根据本公开的培养微生物生物质 的原料。典型地，木质纤维素中的木质素含量高于5%。木质纤维素生物质还可以包含淀粉， 例如在全植物情况中。
[0064] 水解
[0065] 术语"水解"在本文中是指通过将水加入到非单体碳水化合物的糖苷键或酯键上 解聚成糖寡聚体和单体或羧酸。
[0066] 水解产物
[0067]术语"水解产物"或"水解材料"在本文中是指已经进行水解的材料。
[0068] 木质纤维素水解产物
[0069] 术语"木质纤维素水解产物"在本文中是指木质纤维素或包含纤维素和/或半纤维 素的木质纤维素材料、寡糖类、单糖类和/或二糖类、乙酸、甲酸、其它有机酸、糠醛、羟甲基 糠醛、乙酰丙酸、酚类化合物的水解产物、其它由木质素、纤维素、半纤维素和/或木质纤维 素的其它成分水解和/或降解产物、来源于蛋白质、金属的氮化合物和/或木质纤维素的非 水解或部分水解片段。
[0070] 芳香化合物、酚类化合物
[0071] 芳香烃在本文中是指具有通过碳原子之间的共价键形成的环结构的在环结构上 包含交替共辄双键和单键的化合物。芳香化合物还可以指具有通过碳原子和非碳原子之间 的共价键形成的环结构的在环结构上包含交替共辄双键和单键的化合物。
[0072] 术语"酚类化合物"在本文中是指包含至少一个芳香烃基的化合物，所述芳香烃基 包含至少一个直接连接至芳香烃基的羟基基团（-OH)。在本申请中，已经使用比色分析、根 据Folin-Ciocalteu方法(Waterhouse ,2002)测定了酸类化合物的浓度。这类化合物包括、 但不限于酚类化合物，例如对-香豆醇、松柏醇、芥子醇、4-羟基苯乙酮、香草乙酮、乙酰丁香 酮、4-羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛、4-羟基苯甲酸、香草酸、紫丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、芥 子酸、苯酚、愈创木酚、丁香醇（syringol)、氢醌、儿茶酚、2-甲酚、3-甲酚、4-甲酚、2,6_二甲 酚、2,4_二甲酚、4-乙酚、3,4_二羟基苯甲醛、4-甲基愈创木酚、4-乙烯基酚、4-乙基-2-甲 酚、4-烯丙基酚、3-甲氧基儿茶酚、2,6_二甲氧基-4-甲酚、香草醇、高香草醛、高草香酸、1-(4-羟基-3-甲氧基苯基）乙醇、1-(4-羟基-3-甲氧基苯基）丙二烯、香草酸甲酯、4-乙基-2， 6-二甲氧基酚、4-甲基儿茶酚、4-乙基愈创木酚、4-丙酚、4-乙酰基愈创木酚、4-羟基苄醇、 3-羟基-2-甲基-(4H)-吡喃-4-酮、3，5_二羟基-2-甲基-(4H)-吡喃-4-酮、4-丙烯基酚、2,6-二甲氧基-4-丙酚、二氢松柏醇、高丁香醛、3，5-二甲氧基-4-羟基苄醇、2，6-二甲氧基-4-丙 烯基酸、1-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯基）乙醇、松柏醛、丁香基丙酮（syringylacetone)、紫 丁香酸甲酯、丙酰丁香酮(propiosyringone)、丁香基乙烯基酮（syringyl vinyl ketone)、 二氢芥子醇、芥子醛(sinapaldehyde)、2,6-二甲氧基酚、l-(4-羟基苯基）乙醇、丁香酚、5-乙基焦没食子酚、4-丙基愈创木酚、l，4-二羟基-3-甲氧基苯、异丁子香酚、4-羟基苯甲酸甲 酯、愈创木基丙酮、2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酸、丙酰香草酮化1'(^；[0￥311；[110116)、愈创木 基乙烯基酮、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚，且包括其可能的异构体、寡聚化和/或聚合木质 素、单宁类、多酚类、酚类化合物的混合物、包含非酚类化合物和酚类化合物的共价连接的 化合物。
[0073] 术语"酸类化合物的浓度"是指使用Folin-Ciocal teu方法(Waterhouse，2002)测 定的化合物在水溶液中的浓度(典型地表示为g/1)。
[0074] 水热处理
[0075]在本发明的上下文中，术语"水热处理"是指在超过50°C的温度下热处理木质纤维 素水性悬浮液。水热处理可以在加压反应器中的压力下或在大气压下在不加压反应器中进 行。当加热至沸点时或通过加压气相可以用得自水的蒸汽生成加压反应器中的压力。水热 处理可以在催化剂的存在下或无催化剂的存在下进行。当对木质纤维素生物质的水性悬浮 液在超过120 °C的温度下在压力下进行水热处理时，在无添加的催化剂的情况下进行在无 催化剂的存在下的水热处理(也称作"自水解"或"AH"）以水解木质纤维素生物质。
[0076] "自水解的麦杆"在本文中是指在自水解麦杆后得到的固体部分。自水解的麦杆已 经进行洗涤。
[0077] 苛刻度
[0078]术语"苛刻度"在本文中是指用等式1计算且在温度和反应时间方面描述热水条件 的因子。
[0079] S = Log(Ro)，
[0080]
，且Tr是基础温度（100。〇。
[00811脱木质化处理
[0082] "脱木质化处理"在本文中是指从木质纤维素生物质中除去非碳水化合物材料，例 如木质素。脱木质化处理还指从木质纤维素生物质中除去非碳水化合物和碳水化合物处理 的处理。
[0083]蒸汽爆裂
[0084]在本发明的上下文中，术语"蒸汽爆裂"是指这样的一种处理，其中用高压蒸汽(在 110°C-250°C、典型地在140-230°C温度下）、在压力与添加或不添加化学物质(例如酸)的条 件下加热材料，且将该材料保持在该温度下一定时间，此后，释放压力，导致该物质爆裂性 分解。在本文上下文中，将蒸汽爆裂施加于木质纤维素材料，且典型地导致木质纤维素纤维 的刚性结构破裂，即纤维素纤维束脱纤维。
[0085]碱性脱木质化剂
[0086]在本发明的上下文中，术语"碱性脱木质化剂"是指在添加到水中得到具有低于纯 水的氢离子活性即pH高于7.0时的化学化合物或化学化合物混合物。碱性脱木质化剂可以 选自一组化合物，包含、但不限于氢氧化物，例如LiOH(氢氧化锂）、NaOH(氢氧化钠）、Κ0Η(氢 氧化钾）、Ca(0H) 2(氢氧化钙）、NH4〇H(氢氧化铵)或可以在水中形成氢氧根离子的化合物例 如液态或气态NH3(氨）、碳酸盐例如HC0 3-(碳酸氢根离子）、Li2C03(碳酸锂）、Na2C0 3(碳酸 钠）、K2C03 (碳酸钾）、硫化物例如Na2S(硫化钠)和相应的水合物。
[0087] 碱脱木质化处理
[0088]在本发明的上下文中，术语"碱脱木质化处理"是指在有碱脱木质化剂、pH(起始 pH)典型地为10-13的存在下进行的木质纤维素处理。在碱脱木质化处理过程中，过氧化氢 (H202)可以用于与碱脱木质化剂组合使用。
[0089]酶促水解
[0090] 在本发明的上下文中，术语"酶促水解"是指包含纤维素和/或半纤维素的木质纤 维素材料。典型地，木质纤维素材料的酶促水解处理通过使木质纤维素材料在水或缓冲液 的存在下接触酶的混合物来进行。酶的混合物典型地由1，4-β_葡聚糖酶（内切葡聚糖酶 (endoglucanaces)和外切葡聚糖酶或内纤维素酶和外纤维素酶）、1，4-β_葡糖苷酶(纤维二 糖酶)和半纤维素-降解酶(半纤维素酶、木聚糖酶、阿拉伯糖酶等)组成，但不限于此。
[0091] 微生物脂质或在脂质
[0092] 在本发明的上下文中，"微生物脂质"、"脂质"或"胞内脂质"是指脂肪物质，其分子 一般包含脂族烃链最为组成部分，其在非极性溶剂中溶解，但难溶于水。脂质是活细胞内大 分子的主要基团。例如，脂质是脂肪、油、蜡、蜡酯类、固醇类、萜类化合物、异萜类化合物、类 胡萝卜素、聚羟基脂肪酸酯类、核酸、脂肪酸、脂肪醇类、脂肪醛类、脂肪酸酯类、磷脂类、糖脂 类、鞘脂类和酰基甘油，例如三酰甘油、二酰甘油或单酰甘油。本发明中优选的脂质是脂肪、 油、蜡、酰基甘油和脂肪酸及其衍生物，具体地是三酰甘油和蜡酯类。在本发明的上下文中， 脂质由微生物合成并且蓄积在微生物中（胞内脂质）。在本发明的另一个实施方案中，脂质 由微生物合成和分泌(胞外脂质）。
[0093]在本发明的相关方面，单细胞油用作脂质和脂肪的同义词。
[0094] 术语"酰基甘油"是指甘油和脂肪酸的酯。酰基甘油最为脂肪和脂肪酸天然存在。 酰基甘油的实例包括三酰甘油(TAGs，甘油三酯类）、二酰甘油(二脂酰甘油酯类)和单酰甘 油(单酸甘油酯）。
[0095] 糖
[0096] 在本发明的上下文中，术语"糖"在本文中是指寡聚化、二聚化和单体碳水化合物。 具体地，在本申请中，术语糖是指衍生自木质纤维素材料的水溶性寡聚化、二聚化和单体碳 水化合物。所谓术语"聚合糖类"是指为聚合物形式和典型地不溶于水中的碳水化合物。
[0097] 糖产率
[0098] 在本发明的上下文中，术语"糖产率"在本文中是指来自特定材料的寡聚化、二聚 化和单体碳水化合物的产率。具体地，在本申请中，术语糖产率是指来自木质纤维素材料的 寡聚化、二聚化和单体碳水化合物的产率。
[0099]单细胞油生产方法
[0100] "单细胞油生产方法"在本文中是指一种方法，其包含下列步骤:形成或允许合成 脂质的微生物生长，并且允许由此得到的微生物质产生和/或储存(蓄积)脂质;从液相中回 收细胞;并且从细胞中提取或回收脂质。在一些情况中，单细胞油还可以是胞外的，例如在 培养过程中或之后在培养基中分泌的或释放的。
[0101] 需要培养
[0102] 术语"需氧培养"或"需氧发酵"是指培养，其中微生物利用氧作为能力产生的末端 电子受体(即微生物利用需氧呼吸）。典型地，在生物反应器中，通过添加氧或包含氧的气体 混合物(典型地为空气)进行需氧培养，即给生物反应器充氧。当微生物在培养中利用需氧 呼吸时，可以将其称作"需氧条件下培养"。典型地，这种情况发生在需氧生物反应器中。
[0103] 含油微生物或产生油的微生物
[0104] 用于本发明的含油微生物(也称作产生油的微生物)选自细菌、蓝藻菌、真菌例如 酵母和丝状真菌、古细菌或微藻类。我还是我易于蓄积脂质或被遗传改造以便蓄积脂质或 改善脂质蓄积。
[0105] 优选地，使用能够利用C6和C5糖的微生物。优选地，微生物是酵母。丝状真菌或细 菌。
[0106] 在本发明的上下文中，含油微生物（油性微生物）是指能够蓄积胞内脂质的微生 物，使得在适合条件下培养时脂质占微生物的总生物质(每个细胞干重)的至少15% (w/w)。 在一个优选的实施方案中，含油微生物能够蓄积至少20% (w/w)的微生物总生物质(每个细 胞干重）。
[0107] 用于本发明目的的优选的微生物包括、但不限于如下列出的种类和属：
[0108] 根据本发明的一个实施方案，微生物是能够利用来源于木质纤维素材料的糖的含 油微生物。优选地，含油微生物能够利用木质纤维素水解产物中的C6糖(六碳糖，例如葡萄 糖、甘露糖和半乳糖)和C5糖(例如木糖和阿拉伯糖）。根据本发明的一个实施方案，含油微 生物能够利用木质纤维素或部分中的聚合或寡聚碳水化合物。
[0109]优选的（丝状)真菌菌株来自如下属的种类：曲霉属(Aspergillus)，例如米曲霉 (Aspergillus oryzae);被抱霉属（Mortierella)，例如深黄被抱霉（Mortierella 18已匕611；[11&);黑毛菌属（01&61：0111；[11111);麦角菌属（(]1&￥；^6口8);枝抱属（(]1&(1〇8口01^(1；[11111); 小克银霉属(0111111；[1^1^1116113);裸孢壳属化11161'；[06113);镰刀菌属(？11831'；[11111);球囊霉属 (Glomus);毛霉菌属(Mucor) ;Pseudozyma;腐霉菌属(Pythium);根霉菌属(Rhizopus)，例如 稻根霉菌（Rhizopus oryzae);银耳属（Tremella);接霉属（Zygorhynchus);腐质霉属 (Humicola);分枝抱子菌属（Cladosporium);畸枝霉属(Malbranchea) ;Umbelopsis，例如 Umbelopsis isabellina和黑粉菌属(Ustilago)。最优选的真菌种类来自曲霉属和/或被孢 霉属。优选的真菌是能够有效地产生脂质的那些真菌。
[0110] 优选的酵母菌株是属于来自如下属的种类的那些：地丝菌属（Geotrichum)、 06卩&^〇1115^6 8、管囊酵母属(？&(3115^〇1611)、6&1&(31：〇1115^68、汉逊酵母属(]^118611111&)、白冬抱 酵母属（1^11。08口01^(1；[11111)、掷抱酵母属（3口01'0130101115^68)、锁掷酵母属（3口01^(1；[01301118)、 Waltomyces、隐球菌属（Cryptococcus)例如弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、红冬抱 酵母属（Rhodosporidium)例如圆红冬抱酵母菌（Rhodosporidium toruloides)或 Rhodosporidium fluviale、红酵母属（Rhodotorula)例如胶红类酵母菌（Rhodotorula glutinis)、子囊菌酵母属(Yarrowia)例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、假丝酵 母属(Candida)例如弯假丝酵母(Candida curvata)、油脂酵母属(Lipomyces)例如斯氏油 脂酵母（Lipomyces starkeyi)和毛孢子菌属（Trichosporon)例如皮肤毛孢子菌 (Trichosporon cutaneum)或芽毛抱子菌(Trichosporon pullulans)。大部分优选的酵母 来自油脂酵母属、红冬孢酵母属和隐球菌属。优选的酵母是能够有效地产生脂质的那些酵 母。
[0111] 优选的细菌是属于来自红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)和 链霉菌属(Streptomyces)的种类的那些细菌。优选的细菌是能够有效地产生脂质的那些细 菌。
[0112] 大部分优选的藻类是微藻，例如来自如下属的微藻种类，包含Brachiomonas、 Crypthecodinium、小球藻属（Chlorella)、杜氏藻属（Dunaliella)、菱板藻属 (他1^2 8(：11丨&)、似11110(3111〇1^8、微拟球藻(似11110(3111〇1'(^8丨8)、菱形藻属（附七2 8(311丨&)、原壁 菌属（Prototheca)、栅藻属（Scenedesmus)、裂殖壶菌属（Scihizochytrium)、破囊壶菌 (Traustrochytrium)和吾肯氏壶菌属(Ulkenia)。优选的微藻是能够非自养地生长和有效 地产生脂质的那些微藻。属于裂殖壶菌属(3〇1112〇〇115^1'；[11111)、破囊壶菌和07卩1:11600(1;[11；[11111 和吾肯氏壶菌属的微生物称作海洋真菌。
[0113]根据本发明的另一个实施方案，来自木质纤维素生物质的碳水化合物主要是单体 形式，且不能利用寡聚化或聚合碳水化合物的微生物用于单细胞油生产。这类产生油的微 生物选自细菌、蓝藻菌、真菌例如酵母和丝状真菌、古细菌或微藻。微生物易于蓄积脂质或 被遗传修饰以便蓄积脂质或改善脂质蓄积。
[0114]脂质回收
[0115] "油回收"或"脂质回收"或"从含油微生物中回收脂质"是指一种方法，其中通过机 械、化学、热机械或自动催化方法或通过这些方法的组合从微生物细胞中回收脂质(胞内脂 质）。或者，"油回收"可以指从培养(发酵)肉汤中回收胞外产生的脂质。
[0116]包含脂质的单细胞量
[0117] "包含脂质的单细胞量"表示具有优选至少10%、优选至少15% (w/w)或以上的微 生物生物质干物质的单细胞量和细胞菌丝体。
[0118] 残留细胞量
[0119] 在本发明的上下文中，"残留细胞量"是指固体、半固体或流动材料部分，其包含为 回收胞内脂质处理的微生物。
[0120] 生物燃料
[0121] 在本发明的上下文中，"生物燃料"指主要源自生物质或生物废弃物的固态、液态 或气态燃料并且与源自史前植物和动物的有机残留物的化石燃料不同。
[0122] 根据EU法令2003/30/EU，"生物柴油"指从植物油或动物油中产生的甲基酯，其具 有用作生物燃料的柴油品质。更广泛地，生物柴油指来自植物油或动物油的具有柴油品质 的长链烷基酯，如甲基酯、乙基酯或丙基酯。生物柴油也可以从微生物脂质产生，从而微生 物脂质可以源自细菌、真菌(酵母或霉菌）、藻类或另一种微生物。
[0123] 可再生柴油
[0124] "可再生柴油"指这样的燃料，其通过氢处理动物源、植物源或微生物源脂质或其 混合物产生的燃料，因而微生物脂质可以源自细菌、真菌(酵母或霉菌）、藻类或另一种微生 物。可再生柴油也可以通过气化和Fischer-Tropsch合成从源自生物质的錯产生。任选地， 除了氢处理之外，可以进行异构化或其它加工步骤。可再生柴油工艺也可以用来产生喷气 发动机燃料和/或汽油。可再生柴油的生产已经在专利出版物EP139653UEP1398364、 EP1741767 和 EP1741768 中描述。
[0125] 生物柴油或可再生柴油可以与化石燃料掺合。可以将合适的添加剂如防腐剂和抗 氧化剂添加至燃料产品。
[0126] 润滑剂
[0127] "润滑剂"指当作为表面涂层施加至运动部件时减少摩擦的物质，如润滑脂、脂质 或油。润滑剂的两种其他主要功能是散热和溶解杂质。润滑剂的应用包括但不限于作为发 动机油用于内燃发动机中、燃料中的添加剂、用于油驱动装置如栗和液压设备，或用于不同 类型的轴承中。一般，润滑剂含有75-100%基础油并且其余是添加剂。合适的添加剂是，例 如，洗涤剂、储存稳定剂、抗氧化剂、腐蚀抑制剂、去雾剂、破乳剂、消泡剂、共溶剂和润滑性 添加剂(见例如，US7，691，792)。润滑剂的基础油可以源自矿物油、植物油、动物油或来自细 菌、真菌(酵母或霉菌）、藻类或另一种微生物。基础油也可以通过气化和Fischer-Tropsch 合成源自从生物质衍生的蜡。粘度指数用来表征基础油。典型地，高粘度指数是优选的。
[0128] 根据本发明中所述方法产生的脂质可以用作产生生物柴油、可再生柴油、喷气式 发动机燃料或汽油的原料。生物柴油由脂肪酸甲酯组成并且典型地通过酯交换产生。在酯 交换时，酰基甘油转化成长链脂肪酸烷基（甲基、乙基或丙基)酯。可再生柴油指通过脂质的 氢处理(加氢脱氧、氢化或氢化加工)生产的燃料。在氢处理时，酰基甘油转化成相应的烷烃 (石蜡）。烷烃(石蜡)可以通过异构化或通过其他工艺变体进一步修饰。可再生柴油工艺也 可以用来产生喷气式发动机燃料和/或汽油。此外，可以进行脂质的裂化以生产生物燃料。 另外，脂质可以在某些应用中直接用作生物燃料。
[0129] 采用所述方法产生的脂质可以用作润滑剂（润滑油）的基础油或用作生产润滑剂 基础油的原料。
[0130] 干物质
[0131] "DM"或"干重"在本文中是指干物质并且是在进行基本上从材料中除去水的处理 时材料量的测量值(即材料完全干燥）。
[0132] 稠度
[0133] "稠度"在本文中是指固体与悬浮液总重的干重之比。
[0134] 用于分级分离木质纤维素材料的方法
[0135] 本发明的一个目的在于提供分级分离方法，其具有改善的需氧发酵方法的成本效 益，这归因于用于需氧发酵的惰性材料(木质素)和糖部分中的抑制剂化合物的低用量。
[0136] 发明人令人惊奇地发现，在不过量应用碱性脱木质化剂的情况下可以有效地进行 碱脱木质化，条件是木质纤维素材料进行水热处理，例如自水解，然后进行碱脱木质化。一 个优点在于脱木质化中的碱性剂消耗减少且随后溶解的木质素沉淀和pH调节中的酸消耗 减少，然后进行酶促水解。
[0137] 本发明的第一方面涉及对木质纤维素材料进行分级分离的方法，该方法包括：
[0138] a)对木质纤维素材料进行处理，其中从木质纤维素材料中至少部分除去半纤维素 以产生包含第一液相与第一固相的混合物；
[0139] b)使第一固相与第一液相分离；
[0140] c)在碱性脱木质化剂的存在下对第一固相进行脱木质化处理，以产生包含第二固 相和包含增溶的木质素的第二液相的混合物；
[0141] d)使第二固相与第二液相分离；
[0142] e)在能够水解第二固相的半纤维素和纤维素部分的酶的存在下对第二固相进行 酶促水解处理，以产生包含酶促水解产物形式的第三液相和第三固相的混合物。
[0143] 在另一个步骤中，包含纤维素碳水化合物的第三液相可以与包含木质素的第三固 相分离。
[0144] 本发明方法的一个实施方案图示在图1中。本发明方法的另一个实施方案图示在 图2中。图2中所示的实施方案包括使用酸沉淀得自碱处理的可溶性木质素(第一液相)的方 法。
[0145] 从木质纤维素材料中部分除去半纤维素糖的步骤
[0146] 在木质纤维素分级分离方法的材料步骤a)中，对木质纤维素材料进行处理，其中 从木质纤维素材料中至少部分除去半纤维素，以便产生第一液相和第一固相。在分级分离 方法的步骤a)中，半纤维素至少部分溶解且在液相中分离(称作第一液相）。
[0147] 可以从木质纤维素处理中直接得到第一液相，其中至少部分半纤维素变成可溶于 水（即处理产生液相）。或者，处理不会产生液相（即在如此高的稠度下进行，使得液相不存 在），且通过洗涤已经进行处理的固体物质得到第一液相，其中至少部分半纤维素变成可溶 于水。或者，可以从处理中直接产生第一液相，且进一步洗涤固相并且将得到的液体与第一 液相合并。
[0148] 在本发明的另一个实施方案中，通过水热处理从木质纤维素材料中只是部分除去 半纤维素。在第二实施方案中，水热处理在100-250°C、优选140-240°C且最优选140-200°C 的温度下进行。水热处理的强化表现在苛刻度方面，该术语如本文所定义。在一个优选的实 施方案中，水热处理在相当于2.0-4.5、优选3.0-4.1、最优选3.5-4.0的苛刻度的条件下进 行。
[0149] 在本发明的一个实施方案中，通过自水解处理从木质纤维素材料中至少部分除去 半纤维素。自水解典型地在5-60%干物质含量下进行，温度为140-240°C，持续l-120min，不 添加酸性化合物，导致5-40 %的干物质含量溶于木质纤维素材料，包括半纤维素碳水化合 物。典型地，自水解溶解30-100 %的来自木质纤维素材料的半纤维素碳水化合物，优选〉 50 %、更优选>70 %、更优选>80 %、甚至更优选>90 %。溶解的半纤维素碳水化合物至少部分 为寡聚化形式。更典型地，自水解在10-50%干物质含量、在160-220°C下进行，视木质纤维 素原料而定。在自水解后，通过任意方法分离固相和液相，例如过滤，例如加压过滤，或使用 螺旋压力机。可以洗涤固体部分以便从固相中除去溶解的半纤维素。
[0150] 根据本发明的另一个实施方案，使木质纤维素材料经历蒸汽或蒸汽爆裂，添加或 不添加酸性化合物，通常温度在110-250 °C，更典型地在140-230°C的温度。处理导致半纤维 素碳水化合物溶解。任选地，洗涤来自蒸汽的固体材料以回收溶解的半纤维素碳水化合物。
[0151] 在本发明的一个实施方案中，首先对木质纤维素材料进行水热处理，然后进行蒸 汽爆裂步骤(示例在图4中）。在另一个实施方案中，对第一固相进行蒸汽爆裂，然后在碱性 脱木化剂的存在下进行脱木质化处理。
[0152] 根据本发明，根据步骤a)的木质纤维素处理(其中半纤维素糖变成至少部分溶解 的)能够有效地从微生物培养中回收半纤维素糖，例如产生单细胞油。
[0153] 碱性脱木质化步骤
[0154] 在木质纤维素材料的分级分离方法的步骤c)中，对第一固相(包含部分除去半纤 维素材料的木质纤维素材料)进行碱脱木质化步骤，其中至少部分木质素溶解。通过使部分 除去半纤维素材料的木质纤维素材料接触碱性脱木质化剂进行碱脱木质化。
[0155] 碱处理典型地通过制备包含自水解的木质纤维素材料、水性液体和一种或多种碱 性剂或其混合物的自水解的木质纤维素材料的悬浮液进行，得到悬浮液的pH高于pH 7。优 选地，将碱性物质的量添加至得到在处理开始时悬浮液的pH为10-13。典型地，在碱处理过 程中pH下降。
[0156] 将碱性悬浮液保持在这样的温度，其中悬浮液包含至少一个液相。温育不限于任 何确定的温度，但在等温或非等温的宽温度范围下进行。温育优选在25°C、优选30-160 °C温 度下进行。
[0157] 任选地进行搅拌以增加温育过程中的传热效率。处理时间根据预期的溶出物质的 程度选择。优选地，处理时间从半小时至20小时。
[0158] 在反应时间后，通过使用任意方法分离第二液相和第二固相，例如、但不限于过 滤，例如加压过滤，或使用螺旋压力机。第二固相用于酶促水解以释放糖，用于进一步的应 用，例如微生物油生产。可以处理第二液相以沉淀木质素，例如通过酸处理，且可以通过任 意方法分离沉淀的木质素。
[0159] 在本发明的一个实施方案中，碱性脱木质化剂选自氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、 碳酸钾、氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化锂、碳酸锂、氢氧化铵、氨、硫化钠和相应的水合物。在一 个优选的实施方案中，碱性脱木质化剂是氢氧化钠或碳酸钠。
[0160] 如上所述，发明人令人惊奇地发现，可以在不过量应用脱木质化剂的情况下有效 地进行碱脱木质化，条件是对木质纤维素材料进行水热处理，例如自水解，然后进行碱脱木 质化。水热处理导致固体部分(包含纤维素、木质素和残留半纤维素）的酸度下降。因此，在 碱处理中，与不进行水热处理时的情况相比需要的碱剂较少。因此，水热处理后的碱处理可 以在低于无自水解情况的pH下进行。因此，在木质纤维素材料的碱处理之前，水热处理是有 益的。应用较少量的碱性脱木质化剂的一个优点在于与在大量碱性土木质化剂的存在下的 类似处理相比碱脱木质化步骤中糖的损耗较少。
[0161] 因此，在本发明的一个优选的实施方案中，脱木质化剂的浓度为O.l-lOwt%，更优 选0. l-4wt_%，以第一固相中干物质的量为基准。在另一个实施方案中，向第一固相中加入 碱性脱木质化剂。在另一个实施方案中，向第一固相中加入碱性脱木质化剂，得到具有高于 7、优选10-13的pH的悬浮液。
[0162] 在另一个实施方案中，脱木质化处理在高于25、优选30_160°C的温度下进行。
[0163] 根据本发明的另一个实施方案，使用铵作为脱木质化化学物质进行木质纤维素材 料的脱木质化。根据本发明的一个实施方案，使用铵纤维膨胀(AFEX)或氨再循环渗滤，温度 为 60C-220°C。
[0164] 根据本发明，根据c)步骤的木质纤维素处理，碱脱木质化能够有效地进行酶促水 解和有效地回收纤维素糖，以便进行微生物培养，例如生产单细胞油。
[0165] 碱脱木质化产物的酶促水解
[0166] 在木质纤维素材料的分级分离方法的步骤e)中，使得自碱脱木质化步骤的第二固 相进行酶促水解。
[0167] 酶促水解
[0168] 酶促水解由温育预处理的麦杆或其它底物或原料与酶的混合物组成，所述酶的混 合物典型地由1，4-β_葡聚糖酶（内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶或内纤维素酶和外纤维素 酶）、1，4-β_葡糖苷酶(纤维二糖酶)和半纤维素-降解酶(半纤维素酶、木聚糖酶、阿拉伯糖 酶等)组成，但不限于此。酶可以是商购的酶产品，也可以不是商购的酶产品。将预处理的麦 杆与水或缓冲溶液和酶混合物以适合的比例混合。可以向反应体系中加入添加剂，例如聚 乙二醇、洗涤剂或其它表面活性剂或蛋白质。可以使用悬浮液中任意比例的固体（或"稠 度"），优选10-35%或特别是15-25%。根据用于酶混合物的最佳条件，调整淤浆的plpH调 整在添加酶之前和/或过程中通过添加适合浓度的酸或碱进行，例如H 2S〇4、HCl、HN03、NaOH、 NH3或其它酸或碱。在添加酶之后和水解过程中可以再进行pH调整，或不进行pH调整。
[0169] 在水解过程中，根据酶混合物的最佳条件，通常在40-60°C或特别是50°C维持恒 温。可以将预处理的麦杆、水和/或缓冲溶液和水解悬浮液中另外的成分预热至反应温度， 也可以不预热至反应温度，然后将它们加入到悬浮液中。在反应通常中通过搅拌、振摇、自 由落下或通过另外的搅拌方式搅拌该悬浮液。
[0170] 在本发明的一个实施方案中，木质纤维素材料的酶促水解处理通过使木质纤维素 材料在水或缓冲液的存在下接触酶的混合物来进行。酶的混合物典型地由1，4-β_葡聚糖酶 (内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶或内纤维素酶和外纤维素酶）、1，4-β_葡糖苷酶(纤维二糖 酶)和半纤维素-降解酶(半纤维素酶、木聚糖酶、阿拉伯糖酶等)组成，但不限于此。
[0171] 通过使得自碱脱木质化步骤的第二固相进行酶促水解步骤，来自固体材料的糖溶 解。通过任意方法进行的固-液分离在酶处理之后进行，在水解过程中形成包含溶解的糖的 第三液相，且包含木质素和残留聚合糖(残留纤维）的第三液相也称作酶促水解产物，其可 以用于生产微生物脂质。
[0172] 可以将分离自步骤a)(例如，通过水热处理或自水解）中的材料的部分半纤维素糖 导入系统并且与得自脱木质化步骤的固相(第二固相)材料一起进行酶促水解。
[0173] 因此，可以将至少部分第一液相加入并且与第二固相混合，然后将该混合物进行 步骤e)的酶促水解处理。因此，在本发明的一个实施方案中，将至少部分第一液相与第二固 相合并，并且进行酶促水解处理。
[0174] 或者，第一液相的酶促水解与第二固相分开进行。
[0175] 根据本发明，令人惊奇地发现，木质纤维素处理方法包括依次的如下步骤:木质纤 维素进行处理，通过这种处理，半纤维素糖变成至少部分溶解的(例如自水解），且然后对得 自该粗话了的固相进行碱脱木质化步骤(例如使用NaOH处理），得到更高总（总体)糖产率。 高总糖产率有益于微生物方法例如生产单细胞油的成本效益。
[0176] 在本发明的一个实施方案中，酶促水解作为分批水解进行。
[0177] 分批水解
[0178] 分批水解是指水解反应，其中反应成分混合成悬浮液或淤浆或糊状物，并且温育 适合的时间期限，此后，通过过滤、离心或其它分离方式分离固体，并且需要可溶性糖的液 流，包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等及其寡聚体。可以在反应过程中添加反 应成分或其它物质，也可以不添加它们。然而，在反应结束前，液流不与淤浆分离。
[0179] 分批反应还可以作为连续方法进行。在一种连续的分批水解中，使分级分离的(预 处理的）木质纤维素材料、液体、酶、pH-调节剂和其它反应成分的恒流进料入反应器，同时 从反应器中取出淤浆恒流，从其中分离液流。在一种连续的分批水解中，反应器可以再分成 串联的两个或多个反应器，或不再分成串联的两个或多个反应器，通过这种方式，淤浆恒定 流动，特别是用于改善原料的停留时间分布。在理念上，固体材料与液体仅在反应后分离， 但在反应过程中不进行分离。因此，不进行分离，以便从其它反应器中流出淤浆，除外淤浆 来自最后的反应器，且由此不再从淤浆中除去液流，而是从最终流出的淤浆中分离液流。然 而，另外进料反应成分可以在该过程中任意点进行。如果液体分离在两个反应器之间，则应 当将反应器定义为单独的反应步骤，且应当将水解过程定义为依次(分步)水解。
[0180]在第二实施方案中，酶促水解作为依次水解进行，例如图5中所示例的。
[0181] 依次水解
[0182] 依次水解、也称作分步水解或两阶段、三阶段或多阶段水解等由串联的分批反应 顺序组成，液流与淤浆分离，且浓缩固体流进料至下一个批次反应，并且与新鲜水和/或缓 冲溶液混合。可以向第二、第三个或随后的反应中添加新鲜的酶和其它反应成分，也可以不 进行该步骤。依次反应的流程图呈现在图5中。
[0183] 与对分批反应描述的类似，依次水解作为连续过程进行且依次水解的单一反应步 骤可以再分入串联的单独的反应器，通过这种方式，淤浆恒定流动。液体分离和添加新鲜液 体可以在两个反应之间进行，也可以不在两个反应器之间进行。在理念上，如果液体分离且 液体被两个反应器之间的新鲜液体替代或不被其替代，则应当将反应器定义为单独的反应 步骤。
[0184] 在另一个实施方案中，酶促水解作为固体再循环水解进行，例如示例在图5中。
[0185] 酶促水解中残留固体的再循环(或"固体再循环"）
[0186] 使用残留固体再循环或"固体再循环"的水解方法包括水解反应，此后，液流与淤 浆分离，且浓缩的固体流的比例再循环回同一反应器（图5)。再循环的残留固体的比例称作 再循环率且表示为图5和等式2和3中的r。在恒定原料进料速率下，根据等式2中呈现的几何 结构的串联，固体再循环延长了固体材料的反应时间，其中tn是η个随后的再循环反应后固 体的平均反应时间，to是单个反应的反应时间，或淤浆在反应器中的停留时间，且r是再循 环率。最终，以恒定进料和再循环率和恒定停留时间进行的再循环方法将达到稳态，此时， 固体材料的平均反应时间可以根据等式3计算。
[0189] 例如，24h反应中50 %的再循环率，固体的平均反应时间在稳态时为48h。
[0190] 再循环反应可以作为分批反应进行，此后，固体再循环发生或作为连续过程发生， 其中该方法的成分恒定进料至反应器，淤浆恒定流出物出现且流出淤浆分离至液体和浓缩 残留固体流，且恒流的残留固体再循环回反应器。再循环反应可以再分入单独的串联反应 器，不再分入单独的串联反应器，以便改善停留时间分布，且方法成分再进料至这些反应器 可以进行，也可以不进行。在固体再循环反应之后或之前或过程中可以包括另外的依次反 应步骤，也可以不包括这些步骤。
[0191] 步骤e)中得到的液体酶促水解产物可以进行浓缩水解产物的步骤，例如通过蒸 发，得到浓缩水解产物。因此，在一个实施方案中，本发明的方法还包括浓缩第三液相的步 骤。优选地，第三液相的浓缩通过蒸发进行。
[0192] 液体酶促水解产物(第三液相）
[0193] 包含纤维素糖的液相可以用于制备培养基，例如用于生产如本文所述的微生物脂 质的方法中的培养基。
[0194] 因此，本发明的第二方面涉及可通过本发明方法得到的酶促水解产物形式的液相 (第三液相）。
[0195] 或者，可以将液相酶促水解产物浓缩至得到具有较高浓度糖的液体。因此，本发明 的另一个方面提供可通过本发明方法得到的浓糖水解产物。
[0196] 来自第一液相(包含半纤维素糖单体）的酶促水解产物和第三液相的酶促水解产 物(包含纤维素糖）的酶促水解产物可以用于单独的培养肉汤或彼此混合作为用于生产单 细胞油的碳源。
[0197] 沉淀的木质素部分(得自第二液相）
[0198] 可以如图2中所示例的通过用酸处理包含可溶性木质素的第二液相得到沉淀的木 质素并且分离沉淀的纯木质素。
[0199] 因此，在本发明的一个实施方案中，该方法包括通过降低溶液的pH从第二液相中 沉淀木质素的另外的步骤，并且通过任意适合的分离方法如过滤回收沉淀的木质素。
[0200] 本发明的发明人已经发现，通过本发明方法得到的木质素部分是特别纯的（参见 实施例9)。
[0201] 因此，第四个方面涉及可通过本发明方法得到的沉淀的木质素部分。
[0202] 分离的木质素部分可以因比热值附加应用的价值而使用，例如用于树脂(例如酚 醛树脂应用)或聚合物应用。任选地，洗涤和/或进一步处理分离的木质素部分，以便在用于 增值应用之前纯化。
[0203] 微生物脂质的生产方法
[0204] 本发明的另一个方面涉及用于生产微生物脂质的方法，该方法包括：
[0205] (i)提供包含通过用于木质纤维素材料(主要包含纤维素碳水化合物)分级分离的 方法得到的第三液相或本发明的浓糖水解产物的培养基；
[0206] (ii)通过给所述培养基接种含油微生物提供发酵肉汤；
[0207] (iii)温育所述接种所述含油微生物的培养基，以使脂质蓄积；
[0208] (iv)从所述含油微生物中回收脂质。
[0209] 本发明的方法也称作单细胞油生产方法。本发明的方法可以是用于生产本文所述 的生物燃料的方法的组成部分，其中所述油或至少部分的油以微生物油的形式通过本文所 述方法提供。
[0210] 根据本发明优选的实施方案，所述培养基包含衍生自纤维素和/或半纤维素的木 质纤维素糖。根据本发明，木质纤维素生物质的半纤维素和/或纤维素部分用作用于同一方 法(生物反应器系统）的微生物油生产(单细胞油）的原料。该方法优选使用能够利用C6(例 如葡萄糖、甘露糖、半乳糖)和C5 (例如木糖、阿拉伯糖)糖的含油微生物。
[0211] 根据本发明的另一个实施方案，所述培养基包含衍生自木质纤维素的半纤维素。 根据本发明的另一个实施方案，半纤维素糖在进料至单细胞油生产方法时是至少部分寡聚 化的形式。
[0212] 在本发明的一个优选的用于生产上述权利要求的微生物脂质的方法的实施方案 中，该方法包括下列步骤：
[0213] a)对木质纤维素材料进行处理，其中从木质纤维素材料中至少部分除去半纤维素 以产生包含第一液相和第一固相的混合物；
[0214] b)使第一固相与第一液相分离；
[0215] c)在碱性脱木质化剂的存在下对第一固相进行脱木质化处理，以产生包含第二固 相和包含增溶的木质素的第二液相的混合物；
[0216] d)使第二固相与第二液相分离；
[0217] e)对第二固相进行酶促水解处理，以水解第二固相的半纤维素和纤维素部分，以 产生包含具有酶促水解产物的第三液相和第三固相的混合物；
[0218] f)使第三液相与第三固相分离；
[0219] (i)提供包含步骤f)的酶促水解产物的第三液相和任选地第一液相或其酶促水解 产物的培养基；
[0220] (ii)通过给培养基接种含油微生物提供发酵肉汤；
[0221] (iii)温育所述接种所述含油微生物的培养基，以使脂质蓄积；
[0222] (iv)从所述含油微生物中回收脂质。
[0223] 通过用于生产微生物脂质的方法使用的微生物是含油微生物。含油微生物（如本 文所述)能够蓄积胞间脂质，使得在适合的条件下培养时，脂质占微生物总生物质的至少 15% (w/w)(每个细胞干重）。在一个优选的实施方案中，含油微生物能够蓄积至少20% (w/ w)的微生物的总生物质(每个细胞干重）。在本发明的一个实施方案中，用于生产脂质的含 油微生物选自酵母和丝状真菌。优选地，用于生产微生物脂质的方法在需氧条件下进行。因 此，在本发明的一个实施方案中，步骤(iii)中的温育作为例如本文所述的需氧培养进行。
[0224] 当描述本发明的实施方案时，显然并没有描述所有可能的实施方案的组合和变 更。尽管如此，但是唯一的事实在于一些措施描述在彼此不同的从属权利要求中或描述在 不同实施方案中，这并不表示这些措施的组合不能使优点更突出。本发明涵盖所述实施方 案的所有可能的组合和变更。
[0225] 本文的术语"包含"、"含有"和"包括"在每种情况下都被
【申请人】预期为任选地被术 语"由…组成"替换。
[0226] 条目
[0227] 在下文中通过非限制性条目描述本发明。
[0228] 条目1.用于分级分离木质纤维素材料的方法，该方法包括：
[0229] a)对木质纤维素材料进行处理，其中从木质纤维素材料中至少部分除去半纤维素 以产生包含第一液相与第一固相的混合物；
[0230] b)使第一固相与第一液相分离；
[0231] c)在碱性脱木质化剂的存在下对第一固相进行脱木质化处理，以产生包含第二固 相和包含增溶的木质素的第二液相的混合物；
[0232] d)使第二固相与第二液相分离；
[0233] e)在能够水解第二固相的半纤维素和纤维素部分的酶的存在下对第二固相进行 酶促水解处理，以产生包含第三液相和第三固相的混合物。
[0234] 条目2.条目1的方法，其中至少部分第一液相与第二固相合并并且进行酶促水解 处理。
[0235] 条目3.条目1的方法，其中通过水热处理从木质纤维素材料中只是部分除去半纤 维素。
[0236] 条目4.条目1的方法，其中通过自水解处理从木质纤维素材料中只是部分除去半 纤维素。
[0237] 条目5.上述条目中任一项的方法，其中所述碱性脱木质化剂选自氢氧化钠、碳酸 钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化锂、碳酸锂、氢氧化铵、氨、硫化钠和相应的 水合物。
[0238] 条目6.上述条目中任一项的方法，其中脱木质化剂的浓度为O.l-lOwt%，优选 0.1-4wt_%，以第一固相干物质的量为基准。
[0239] 条目7.上述条目中任一项的方法，其中将所述碱性脱木质化剂加入到第一固相 中，得到具有高于7，优选10-13的pH的悬浮液。
[0240] 条目8.上述条目中任一项的方法，其中脱木质化处理在高于25°C，优选30-160°C 的温度下进行。
[0241] 条目9.上述条目中任一项的方法，其中水热处理在100-250°C，优选140-240°C且 最优选140-200°C的温度下进行。
[0242] 条目10.上述条目中任一项的方法，其中水热处理在相当于2.0-4.5,更优选3.0-? 1且最优选 3.5-4.0的苛刻度的条件下进行。
[0243] 条目11.上述条目中任一项的方法，其中在所述脱木质化处理前对第一固相进行 蒸汽爆裂。
[0244] 条目12.上述条目中任一项的方法，其中所述酶促水解作为分批水解进行。
[0245] 条目13.上述条目中任一项的方法，其中所述酶促水解作为依次水解进行。
[0246] 条目14.上述条目中任一项的方法，其中所述酶促水解作为固体再循环水解进行。
[0247] 条目15.上述条目中任一项的方法，其中通过降低溶液的pH从第二液相中沉淀木 质素，并且通过任意适合的分离方法例如过滤回收沉淀的木质素。
[0248] 条目16.上述条目中任一项的方法，还包含浓缩第三液相的步骤。
[0249] 条目17.可通过上述条目任一项的方法得到的酶促水解产物形式的液相。
[0250] 条目18.可通过条目16的方法得到的浓汤水解产物。
[0251 ]条目19.可通过权条目15的方法得到的沉淀的木质素部分。
[0252] 条目20.用于生产微生物脂质的方法，该方法包括：
[0253] (i)提供包含条目17的第三液相或条目18的浓糖水解产物的培养基；
[0254] (ii)通过给所述培养基接种含油微生物提供发酵肉汤；
[0255] (iii)温育所述接种所述含油微生物的培养基，以使脂质蓄积；
[0256] (iv)从所述含油微生物中回收脂质。
[0257] 条目21.上述条目的用于生产微生物脂质的方法，该方法包括：
[0258] a)对木质纤维素材料进行处理，其中从木质纤维素材料中至少部分除去半纤维素 以便产生包含第一液相和第一固相的混合物；
[0259] b)使第一固相与第一液相分离；
[0260] c)在碱性脱木质化剂的存在下对第一固相进行脱木质化处理，以产生包含第二固 相和包含增溶的木质素的第二液相的混合物；
[0261] d)使第二固相与第二液相分离；
[0262] e)对第二固相进行酶促水解处理，以水解第二固相的半纤维素和纤维素部分，以 产生包含具有酶促水解产物的第三液相和第三固相的混合物；
[0263] f)使具有酶促水解产物的第三液相与第三固相分离；
[0264] (i)提供包含步骤f)的酶促水解产物的第三液相的培养基；
[0265] (ii)通过给培养基接种含油微生物提供发酵肉汤；
[0266] (iii)温育所述接种所述含油微生物的培养基，以使脂质蓄积；
[0267] (iv)从所述含油微生物中回收脂质。
[0268] 条目22.条目20或21任一项的方法，其中用于生产脂质的微生物选自酵母和丝状 真菌。 实施例
[0269] 本发明通过下列非限制性实施例示例。本发明适用于非实施例中示例的木质纤维 素原料。应当理解，上述描述和实施例中给出的实施方案仅用于示例，且各种改变和变型均 可能在本发明范围内。
[0270] 实施例1
[0271]麦秸的自水解(具有预先调整的pH)
[0272] 通过混合预先研磨至通过1mm筛的20g麦猜和180g水制备悬浮液。用乙酸将该悬浮 液调整至pH 4.5。将该悬浮液转入高压反应器，然后使用加热套在连续搅拌下等温加热至 170°C-200°C温度。记录在加热过程中的温度数据并且用于计算自水解苛刻度(等式1)。将 反应器冷却至约50°C，并且手动回收悬浮液用于过滤。使固体部分与液体部分分离，并且使 用HPLC测定糠醛和羟甲基糠醛(HMF)。稀酸水解后测定寡聚化和聚合糖转化成单糖类的液 体部分中糖的总浓度(g/Ι)。用水(〇.5dm3)洗涤固体部分并且加压。称重得到的共同残余 物，采样用于肝物质测定，并且将固体残余物的产率（％ )计算为固体残余物与称重用于自 水解处理的麦猜重量比（100%*g干麦猜/g干固体残余物）。使用Folin-Ciocalteu方法与愈 创木?K gu i a i aco 1)作为标准品测定液体中的可溶性酸类物质。
[0273] 如图11和图12中所示的结果概括了结果。固体残余物的产率随水解苛刻度而降 低，其中在最高苛刻度下产率为67% (Log(RO) =4.4)(图11)。在液体部分中的单糖浓度首 先增加，且然后随自水解苛刻度的增加而降低。当自水解苛刻度为Log(RO) = 3.8时，得到最 大糖浓度(23. lg/Ι)。超过自水解苛刻度，液体部分中的糖浓度显著下降且糠醛和HMF的浓 度突然增加，分别达到4.8g/l和0.3g/l的浓度。与糠醛和HMF突然生成相反，可溶性酚类的 浓度随自水解苛刻度的增加从〇. 5g/l逐步增加至2. Og/Ι。
[0274] 本实施例显示在自水解苛刻度(Log(RO))方面的最佳自水解条件可以选择以避免 糠醛、HMF和可溶性酚类的过量形成，同时维持液体部分中的单糖浓度。
[0275] 实施例2
[0276] 通过混合33.8kg捣碎的包含11 %湿度的麦猜与350kg自来水制备悬浮液，得到 8.5 %稠度。将该悬浮液加热至约60 °C，并且通过在搅拌的Nutsche Fi 1 ter中过滤使液体部 分与固体分离。将固体部分(31.2kg干物质)与水混合，得到5 %稠度的192.4kg悬浮液。将该 悬浮液加热至180°C并且冷却至室温，得到S = 4.15的苛刻度。在沉降式离心机中使液体部 分与固体部分分离。用水洗涤固体部分，并且使用沉降式离心机回收洗涤的不溶性部分"自 水解的麦杆"（15.3kg干物质），且储存在冷藏箱中。基于HPLC分析，液体部分(6.3kg干物质） 包含半纤维素-衍生的糖，约为其干物质的一半。
[0277] 本实施例显示自水解能够使半纤维素与木质纤维素材料分离，然后对包含纤维素 的固体部分进行酶促水解。
[0278] 分离液体和固体部分和任选地洗涤固体部分使自水解中释放的可溶性酚类和有 机酸与自水解的固体部分分离。作为结果，随后脱木质化步骤中消耗的碱性脱木质化化学 物质以协同作用方式减少。
[0279] 由本实验产生的固体部分随后用于脱木质化试验，导致固体部分具有低木质素和 高碳水化合物含量。
[0280] 实施例3
[0281] 通过在100dm3容器中混合10.5kg 7.3%湿度的磨碎的麦杆和54. lkg自来水制备 悬浮液。在室温储存18h后，将64.2kg悬浮液称重入水平圆柱状250dm3搅拌的高压反应器。 封闭反应器并且在75min内加热至140°C，维持在140°C5h并且在30min内冷却至室温。从反 应器中取出水热处理的悬浮液，并且通过过滤分离固体部分。用自来水洗涤固体部分，并且 使用水压机加压。加压的固体部分(20.9kg)具有42.7 %干物质含量。
[0282] 由本实验生产的固体部分用于随后的脱木质化试验，导致固体部分具有低木质素 和高碳水化合物含量。
[0283] 自水解的麦杆的脱木质化
[0284] 自水解的麦杆包含相当大量的木质素，其导致酶促水解中的抑制作用。由于这一 原因，在碱性条件中提取来自自水解的固体材料，以除去木质素，然后进行酶促水解。
[0285] 实施例4
[0286] 通过在安装搅拌单元的180dm3不锈钢反应器中混合20.5kg(8kg干物质）来自实施 例2的自水解的麦杆与262g颗粒NaOH和蒸馏水制备悬浮液。通过将反应器在30min内加热至 95 °C、然后在95 °C与连续搅拌下等温处理lh处理6.6 %稠度的悬浮液。通过用离心机过滤使 提取的固体部分与液体部分分离，用自来水洗涤，加压，并且将NaOH-提取的AH-麦杆 (23.64kg，27%干物质含量)储存在6°C下。将包含1.62kg溶解的来自自水解的麦杆的材料 的液体部分（"NaOH脱木质化溶液"）储存在6 °C下。
[0287] 用等于6FPU(滤纸单位)/g DM纤维素酶活性的35yl/g Flashzyme Plus(Roal 0y, Finland)的酶剂量酶促水解NaOH-提取的AH-麦杆由自水解的麦杆碳水化合物得到65.0% 糖产率。与来自不进行脱木质化的自水解的麦杆碳水化合物的61.0%产率相比，这是改善 的结果。
[0288]将糖产率计算为NaOH-提取的AH-麦杆的酶促水解中释放的单体的总量与在酸水 解中类似重量中释放的单糖总量之比乘以来自脱木质化处理的NaOH-提取的AH-麦杆的干 物质产率。
[0289]本实施例显示在酶促水解中，当在用碱处理(NaOH)进行酶促水解前除去木质素 时，相同的酶用量产生了更高产率的糖。本实施例还显示部分木质素溶于碱性液体部分且 可以通过沉淀回收木质素。
[0290] 实施例5
[0291] 通过在安装磁搅拌器的玻璃反应器中混合来自实施例2的自水解的麦杆(403g， 1568干物质）与405(^自来水和37.5 8固体他2〇)3制备3.6%稠度的悬浮液。将该反应器在 30min内加热至95-100°C并且在95-100°C与连续搅拌该悬浮液下处理4h。通过过滤使 812gNa2C03-提取的具有15%干物质含量的固体部分（"Na2C03-提取的AH-麦杆"）与液体部 分(3325g)分离，用自来水洗涤，加压，并且储存在6°C下。（DM脱木质化的麦杆/DM自水解的 麦杆）的产率为78%。液体部分(Na2C03脱木质化溶液)具有pH 9.8并且储存在6°C下。所用 碳酸盐的用量高于NaOH，因为碳酸盐是比氢氧化物弱的碱。
[0292] 用等于6FPU(滤纸单位)/g DM纤维素酶活性的35yl/g Flashzyme Plus(Roal 0y, Finland)的酶剂量酶促水解Na2C03-提取的AH-麦杆由自水解的麦杆碳水化合物得到59.1 % 糖产率。这低于来自自水解的麦杆碳水化合物的NaOH-提取的AH-麦杆的65.0%糖产率或来 自不进行脱木质化的自水解的麦杆碳水化合物的61.0%糖产率。
[0293] 将糖产率计算为酶促水解中释放的单糖总量与从酸水解中的类似重量的AH-麦杆 中是否的单糖总量之比乘以来自脱木质化处理的Na2C03-提取的AH-麦杆的干物质产率。 [0294]与进行没有脱木质化的酶促水解的自水解的麦杆相比，Na2C03_脱木质化的优点 在于得到了额外的木质素部分(Na2C03脱木质化溶液）。
[0295] 本实施例显示当在酶促水解之前用碱(Na2C03)处理除去木质素时，相同用量的酶 产生更高的糖产率。本实施例还显示部分木质素溶于碱性液体部分且可以通过沉淀回收木 质素。
[0296] 实施例6
[0297] 通过混合来自实施例3的10.Okg(4.41kg干物质）自水解的麦杆与自来水(29.5kg) 和3.401g 50%(w/w)Na0H水溶液制备悬浮液。在类似的反应器中并且在如上述实施例3中 所述的加热条件下处理该悬浮液。通过过滤分离固体部分（"NaOH-脱木质化的麦杆"），在洗 涤后具有30.4%干物质含量。液体部分（"NaOH脱木质化溶液"）具有pH 13.0并且储存在6°C 下。
[0298] 实施例7
[0299] 本实施例的目的在于研究碱处理自水解的麦杆对酶促水解和来自自水解的麦杆 的糖产率的作用。为了达到这一目的，通过混合15g来自实施例1的自水解的麦杆的干物质 与去离子水和表1中列出的化学物质制备7.5%稠度的悬浮液。不同的碱性化学物质用于调 整pH，然后加热至所示的值。用微波炉将该悬浮液快速加热至90°C。过滤热悬浮液以分离固 体和液体部分。用水洗涤固体部分，并且将滤饼搅拌至均匀，且测定其干物质含量。用在pH 5的0.05M醋酸钠缓冲液中10%稠度的350yL(6FPU/g)的分解纤维素的制品Flashzyme Plus (Roal，Finland)在山梨酸钾的存在下水解洗涤固体部分（10g干物质）。水解在置于设定在 50°C的恒温温育器中的250mL锥形瓶中进行，通过200rpm振摇使反应持续72h。通过HPLC从 液体部分中测定释放的单体糖。得到的干物质和糖产率如表1中所示。
[0300] 本实施例显示自水解的麦杆的脱木质化增加了从通过酶促水解的自水解的麦杆 的糖产率，甚至在考量脱木质化处理中的干物质损耗时也是如此。脱木质化处理的另一个 优点在于生成用于进一步加工的可溶性木质素部分。
[0301] 本实施例的令人惊奇的发现在于在自水解的麦杆脱木质化过程中仅需要少量碱 性化学物质。另一个令人惊奇的发现在于分离自固体部分的液体部分的pH相对较低，这意 味着通过降低pH需要少量酸从溶液中沉淀木质素。
[0302]有关自水解的和/或脱木质化的麦杆的酶促水解的实施例
[0303] 实施例8
[0304] NaOH-脱木质化的麦杆(来自实施例6的材料)与自水解的麦杆(来自实施例1的材 料)的比较在三种不同的酶促水解方法中进行，包括分批水解、依次水解和以恒定过程进料 的固体再循环。使用酶混合物，其包含85 %纤维素酶(Econase CE，Roal 0y)、10%纤维二糖 酶（1^〇￥〇叾：71116 188,3丨81]1&/^〇￥〇25〇1168)和5%木聚糖酶（6(]140,6611611(3〇1')。在口!15和50。〇温 度下在振荡器中以200rpm进行反应。
[0305]分批水解
[0306]对10%稠度和8%稠度的NaOH-脱木质化的麦杆和自水解的麦杆进行分批水解(其 中"稠度"是不溶性固体在反应淤浆中的比例，w/w)。使用包含9FPU/g预处理的麦杆DM的酶 活性的酶剂量。糖产率(作为材料中总聚合碳水化合物的百分比释放的无水糖)如图6中所 示。24h、48h和72h水解后，来自8%和10%稠度的NaOH-脱木质化麦杆的糖产率平均为50%、 65 %和74%，而使用自水解的麦杆，8%和10%稠度的产率分别平均为49 %、56 %和59 %，表 明较高的糖产率可以得自使用与来自自水解的麦杆相同的酶用量的NaOH-脱木质化麦杆。 产率在较低稠度下一般稍高。
[0307] NaOH-脱木质化麦杆的48h和72h分批水解的图8中所示的容积效率分别为1.32g/ 1/h(每升反应淤浆每小时的糖克数)和0.82g/l/h，这与分别得自自水解的麦杆的0.74g/l/ h和0.42g/l/h的容积效率相比明显较高。
[0308] 反应的酶生产力(使用1升没得到的kg糖)如图7中所示。NaOH-脱木质化麦杆的72h 分批水解中的酶生产力为4 · 2kg/l酶，其与使用自水解的麦杆的2 · 2kg/l酶生产力相比几乎 倍增。
[0309] 本实施例表示与分批酶促水解中自水解的麦杆相比，较高糖产率、酶生产力和容 积效率得自脱木质化麦杆。
[0310]依次水解
[0311] NaOH-脱木质化麦杆和自水解的麦杆通过由3个依次的24h反应组成的三步水解来 水解。在反应之间。使液体与固体分离。并且将固体残余物与新鲜的液体和酶混合。整个过 程中的固体比例（"总稠度"或"进料稠度"）在前2次反应中为10%，且在3次反应中为8%。因 为在2次反应之间将总液体量分开，所以第一次、第二次和第三次反应的实际稠度分别为 14,3%、12,5%和10,6%，且自水解的麦杆的NaOH-脱木质化麦杆分别为14.4%、12.9%和 12.8%。如"NaOH-脱木质化麦杆的分批水解"中所述使用类似的酶混合物和剂量。总酶剂量 的三分之二(66.6 % )适用于第一次反应且三分之一(33.3 % )适用于第二次反应。
[0312 ]糖产率(作为在材料中的总聚合碳水化合物的百分比的释放的无水糖，如图6中所 示，在第一次、第二次和第三次反应后来自NaOH-脱木质化麦杆的分别为35 %、57 %和70 %， 且来自自水解的麦杆的分别为36%、55%和65%。尽管第一次反应后来自自水解的麦杆的 产率稍高，但是来自NaOH-脱木质化麦杆的产率显然在第二次和第三次反应后占优势。2次 和3次依次24h反应后的总容积效率（图8)Na0H-脱木质化麦杆使用分别为1.74g/l/h和 1.61g/l/h，明显分别高于来自自水解的麦杆的1 · 10g/l/h和0.94g/l/h产率。使用NaOH-脱 木质化麦杆的3次24h反应后的酶生产力为4.4kg/l酶，这明显地高于使用自水解的麦杆的 2.4kg/l酶生产力（图7)。
[0313] 本实施例表示与依次酶促水解中的自水解的麦杆相比，较高的糖产率、酶生产力 和容积效率得自脱木质化麦杆。
[0314] 使用固体再循环水解
[0315]在固体再循环方法中水解NaOH-脱木质化麦杆和自水解的麦杆。进行多次后续的 反应，其中以10%的稠度混合新鲜预处理的麦杆、酶和液体。向新鲜反应成分的混合物中混 入50%的分离的来自在先反应的固体残余物。固体残余物的再循环导致实际反应稠度增 加，使用NaOH-脱木质化麦杆增加至12.3%，且使用自水解的麦杆增加至13.2%。进行6次后 续再循环反应，以便达到稳态。其中反应体积、稠度和水解产率在两次后续反应之间保持恒 定。当达到稳态时，将未再循环的部分固体残余物与恒定量的新鲜液体混合，以10.5 %的稠 度使用NaOH-脱木质化麦杆和13.1 %的稠度使用自水解的麦杆再进行24h反应。在单独的再 循环反应中总固体比例(或"总稠度"或"进料稠度"）为10%，在包括再循环反应和额外反应 的方法中为8 %。
[0316]作为无水糖的糖产率作为材料中总聚合碳水化合物的百分比释放，图6。在不含任 何再循环材料的起始反应中，使用NaOH-脱木质化麦杆和自水解的麦杆分别为51 %和50 %。 在使用50%再循环固体残余物的6次后续反应后，NaOH-脱木质化麦杆和自水解的麦杆的水 解产率使用分别增加至57 %和55 %。在额外反应后，使用NaOH-脱木质化麦杆和自水解的麦 杆的总糖产率分别为69%和65%，由此显示NaOH-脱木质化麦杆一般产率较高。使用NaOH-脱木质化的麦杆和自水解的麦杆的单独的再循环反应的容积效率分别为1.99g/l/h和 1.17g/l/h，且包括额外的反应，分别为1.77g/l/h和0.99g/l/h，表明使用NaOH-脱木质化麦 杆的容积效率较高。使用NaOH-脱木质化的麦杆和自水解的麦杆的单独的再循环反应的酶 生产力分别为3.2kg/l和2. Okg/Ι，而当包括额外反应时，分别为3.8kg/l和2.4kg/l，这显示 与自水解的麦杆相比，NaOH-脱木质化麦杆的酶生产力明显较高。
[0317] 后续反应中水解的进程呈现在图9a中。反应体积进程呈现在图9b中。反应稠度进 程呈现在图9c中。
[0318] 本实施例表示在使用固体再循环的酶促水解方法中，与自水解的麦杆相比，较高 的糖产率、酶生产力和容积效率得自脱木质化麦杆。
[0319] 实施例8的结论
[0320] 1.在所有不同方法的酶促水解过程中，NaOH-脱木质化麦杆比自水解的麦杆的总 糖产率一般较高。
[0321] 2.因为在所有不同的方法中，NaOH-脱木质化的麦杆容积效率高于自水解的麦杆， 所以与自水解的麦杆相比，NaOH-脱木质化麦杆水解过程中得到糖产率需要较小的反应器 和分离器。
[0322] 3.因为在所有不同方法中，使用NaOH-脱木质化麦杆高于使用自水解的麦杆的酶 生产力，所以使用NaOH-脱木质化麦杆的每kg得到的糖的酶成本低于使用自水解的麦杆的 每kg得到的糖的酶成本。
[0323] 4.等量的预处理的麦杆用于本实施例。可以推定固体再循环和依次水解产生等同 的水解产率，但容积效率比分批水解提高。
[0324] 实施例9.木质素质量
[0325] 在如实施例8中所述的3步依次水解中以20 %的进料稠度与9FPU的酶剂量水解自 水解的麦杆(来自实施例2的材料），其中酶混合物如实施例9中所述。得到糖产率(作为在材 料中总聚合碳水化合物百分比释放的无水糖），为64.4%，它等于自水解的麦杆DM的 34.8%。从没水解中残留的固体包含27.2%的糖、55.5%的木质素和8.8%的灰分。
[0326]用0.2M NaOH提取自水解的麦杆（来自实施例2的材料）（40.7g干物质）。提取在 7.7%稠度下在搅拌的玻璃反应器中在95-100°C进行4h。通过过滤使液体部分与提取的固 体部分分离。用12M硫酸将得到的液体部分(657.6g)酸化至pH 4.9,以便沉淀溶解的木质 素。通过离心使与沉淀的木质素液体部分分离，用酸水洗涤，冻干。得到的木质素部分占原 始存在于自水解的麦杆中的木质素的35.9%。与酶促水解后残留固体的55.5%木质素含量 和8.8%灰分含量相，木质素部分具有90.9%的总木质素含量(酸不溶性木质素和酸溶性木 质素的总和)和4.0%灰分。
[0327] 本实施例显示脱木质化处理的优点在于任选地分离固体木质素部分，其具有明显 高于酶促水解残余物的木质素含量的木质素含量。与燃烧相比，较高纯度的木质素对于木 质素在高价值应用中的用途是有利的。
[0328] 木质纤维素糖在生产脂质中的用途
[0329] 实施例10 [0330]水解产物的制备 [0331]自水解液体C
[0332]进行麦秸的自水解反应和随后的半纤维素寡糖的分离以产生用于发酵的液体部 分和对酶促水解敏感的固体部分。为了达到这一目的，将35.7kg麦秸(89.8%干物质含量） 与240kg水混合，在500dm3搅拌爸式反应器中得到11.6 %稠度的悬浮液。将该悬浮液加热至 180°C，然后离去至低于100°C。从反应器中排出水热处理的悬浮液，并且使用沉降式离心机 使第一液体部分与固体部分分离。用酸水洗涤悬浮液的固体部分，用磷酸调整至pH 4。在沉 降式离心机中使固体部分与第二液体部分分离。在降膜式蒸发器中合并第一和第二液体部 分，得到18.3kg浓自水解液体，形成自水解液体C，其包含部分地呈寡聚形式的半纤维素糖 并且具有42 %干物质含量和38° Bx折射干物质。将洗涤的固体部分(具有23.0 %干物质含量 的96.7kg)用作进行酶促水解的进料材料，以产生用于培养的纤维素水解产物。
[0333] 通过经添加40g/l活性炭处理液体、在4°C适度混合20小时并且最终使用400um过 滤布过滤掉碳除去包含的部分酚类化合物，即自水解液体浓缩物。
[0334] 由来自自水解实验的包含纤维素的固体部分(洗涤后）制备来自麦秸的酶促水解 产物，其中制备自水解液体C。将来自形成自水解液体C(具有23.1 %干物质含量的17.3kg) 的自水解处理的洗涤的固体部分称重入40dm3搅拌爸式反应器并且与14.7kg水和10mL 50 % NaOH( w/w)混合，得到12.5 %稠度和pH 5的悬浮液。加热反应器并且维持在50 °C和 216ml酶混合物，其包含82%纤维素(EconaseCE，Roal0y)、10%纤维二糖酶(Novozyme 188,3丨811^/^〇￥〇25〇1168)和7%木聚糖酶(6(]140,6611611〇〇1')。在酶处理过程中，每1小时定期 将该悬浮液搅拌3次，持续SminjSh停留时间后，给该悬浮液补充占起始酶剂量10 %和具有 类似各酶比例的新鲜的酶混合物。在50 °C 72h停留时间后，通过使用水压机过滤使液体部分 与固体部分分离。用水将固体部分洗涤1次，并且再使液体部分与固体部分分离。合并液体 部分，并且通过减压蒸发浓缩。纤维素水解产物浓缩物(1.57kg)包含220g/l的总糖。
[0335] 将包含单体糖的纤维素水解产物照此用于培养。
[0336] 单细胞油生产
[0337] 实验使用产生脂质的真菌菌株米曲霉菌进行。通过添加12ml无菌水形成生长在 TOA-平板上的生成孢子的真菌并且用接种环刮取至液体中。24ml孢子悬浮液直接用于发酵 罐接种。培养基组成呈现在表5中。纯化的自水解液体C(半纤维素溶液，半纤维素糖)和来自 同一实验的纤维素水解产物用于培养。培养在Biostat B+51发酵罐以31体积进行，且在此 过程中，将搅拌设定在500rpm，使用3M NaOH将pH保持在5,5,充气为lvvm，且在生长过程中 的温度为35°C，在脂质生产过程中，将其降至28°C。
[0338] 表2:生长培养基的组成
[0340]在接种后，需要约30h，然后真菌开始活跃地生长。在培养过程中，分小批量加入半 纤维素溶液，并且在95h培养后，将进料改变成纤维素水解产物。在培养过程中，总计加入 236g半纤维素和484g纤维素水解产物。在发酵结束时保持不使用加入的部分糖。当培养结 束时的167h时，存在16g/l生物质，其中43%是脂质。可以推定，由麦猜半纤维素和纤维素糖 生产微生物油是成功的。
[0341 ]实施例11使用半纤维素糖生产微生物油 [0342]水解产物自水解脂质D的制备
[0343] 通过在100dm3容器中混合10.5kg磨碎的麦秸(92.7%干物质含量可）和54. lkg自 来水制备悬浮液。在室温储存18h后，将64.2kg悬浮液称重入水平圆筒状250dm3搅拌的高压 反应器。封闭反应器并且在75min内加热至140°C，保持在140°C下5h并且在30min内冷却至 室温。手动从反应器中排出水热处理的悬浮液，并且通过过滤使第一液体部分与第一固体 分离。用自来水将第一固体部分洗涤2次，使用水压机加压，得到洗涤的固体部分。洗涤的固 体部分(20.9kg)具有42.7%的干物质含量。将第一液体部分与洗涤水合并，并且在降膜式 蒸发器中浓缩至11.5 % (w/w)干物质含量。在稀酸水解后(4%w/w硫酸，121°C，lh)通过高效 液相色谱法(HPLC)测定浓缩的液体自水解的液体D包含49.3 %来自浓缩液体的总感物质的 总糖。总糖含量中的无水木糖、无水阿拉伯糖、无水葡萄糖和无水半乳糖的相对比例分别为 57%、19%、13% 和 11%〇
[0344] 此后，包含部分为寡聚化形式的半纤维素糖的自水解液体D照此无需纯化用于培 养实验。
[0345] 单细胞油生产
[0346] 实验使用产生脂质的真菌菌株米曲霉菌进行。通过添加12ml无菌水从生长在TOA-平板上的从生成孢子的真菌形成孢子悬浮液并且用接种环刮取至液体中。24ml孢子悬浮液 用于6个烧瓶接种。培养基组成呈现在表3中。将接种的烧瓶在30°C160rpm振摇温育1天，且 然后用于发酵罐接种。
[0347] 表3:接种培养基的组成，pH设定至5，5。
[0349]使用自水解液体D(包含半纤维素糖，部分为寡聚化形式）且基于使用Folin-Ciocalteu方法(Waterhouse ,2002)的分析其包含4,2g/l酸类化合物。培养在Biostat B+51 发酵罐中以31体积进行，且在此过程中，将搅拌设定在400rpm，使用3M NaOH将pH保持在5， 5，抽吸为1 vvm且温度为30°C。培养基组成呈现在表4中。
[0350]表4:发酵培养基的组成
[0352] 结果：
[0353] 在培养过程中，分小批量进入半纤维素溶液。总计加入150g半纤维素。在发酵结束 时保持不使用加入的部分糖。当发酵结束时的142h时，存在14g/l生物质，其中21 %是脂质。 可以推定，由麦秸半纤维素糖(部分为寡聚化形式)生产微生物油是成功的，无需纯化水解 产物(不使用糖浓缩中使用的蒸发）。在发酵过程中，酚类化合物的浓度为2,8g/L。
【主权项】
1. 用于分级分离木质纤维素材料的方法，该方法包括： a) 对木质纤维素材料进行处理，其中从木质纤维素材料中至少部分除去半纤维素以产 生包含第一液相与第一固相的混合物； b) 使第一固相与第一液相分离； c) 在碱性脱木质化剂的存在下对第一固相进行脱木质化处理，以产生包含第二固相和 包含增溶的木质素的第二液相的混合物； d) 使第二固相与第二液相分离； e) 在能够水解第二固相的半纤维素和纤维素部分的酶的存在下对第二固相进行酶促 水解处理，以产生包含第三液相和第三固相的混合物。2. 权利要求1的方法，其中通过水热处理从木质纤维素材料中至少部分除去半纤维素。3. 根据权利要求1的方法，其中通过自水解处理从木质纤维素材料中至少部分除去半 纤维素。4. 根据上述权利要求任一项的方法，其中所述碱性脱木质化剂选自氢氧化钠、碳酸钠、 氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化锂、碳酸锂、氢氧化铵、氨、硫化钠和相应的水 合物。5. 根据上述权利要求任一项的方法，其中基于第一固相中干物质的量计，脱木质化剂 的浓度为〇· l_l〇wt%，优选0· l_4wt_%。6. 根据上述权利要求任一项的方法，其中将所述碱性脱木质化剂加入到第一固相中， 得到具有高于7，优选在10和13之间的pH的悬浮液。7. 根据上述权利要求任一项的方法，其中水热处理在相当于在2.0和4.5之间，更优选 在3.0和4.1之间且最优选在3.5和4.0之间的苛刻度的条件下进行。8. 根据上述权利要求任一项的方法，其中在所述脱木质化处理前对第一固相进行蒸汽 爆裂。9. 根据上述权利要求任一项的方法，其中通过降低溶液的pH从第二液相中沉淀木质 素，并且通过任意适合的分离方法诸如过滤来回收沉淀的木质素。10. 根据上述权利要求任一项的方法，还包含浓缩第三液相的步骤。11. 通过上述权利要求任一项的方法可得到的酶促水解产物形式的液相。12. 通过权利要求10的方法可得到的浓糖水解产物。13. 通过权利要求9的方法可得到的沉淀的木质素部分。14. 用于生产微生物脂质的方法，该方法包括： (i)提供包含权利要求11的第三液相或权利要求12的浓糖水解产物的培养基； (i i)通过给所述培养基接种含油微生物提供发酵肉汤； (iii) 温育所述用所述含油微生物接种的培养基，以使脂质蓄积； (iv) 从所述含油微生物中回收脂质。15. 根据上述权利要求的用于生产微生物脂质的方法，该方法包括： a) 对木质纤维素材料进行处理，其中从木质纤维素材料中至少部分除去半纤维素以产 生包含第一液相和第一固相的混合物； b) 使第一固相与第一液相分离； c) 在碱性脱木质化剂的存在下对第一固相进行脱木质化处理，以产生包含第二固相和 包含增溶的木质素的第二液相的混合物； d) 使第二固相与第二液相分离； e) 对第二固相进行酶促水解处理，以水解第二固相的半纤维素和纤维素部分以产生包 含第三固相和酶促水解产物的第三液相的混合物； f) 使酶促水解产物的第三液相与第三固相分离； (i)提供包含步骤f)的酶促水解产物的第三液相的培养基； (i i)通过给培养基接种含油微生物提供发酵肉汤； (iii) 温育所述用所述含油微生物接种的培养基，以使脂质蓄积； (iv) 从所述含油微生物中回收脂质。
【文档编号】C12P19/02GK105980573SQ201480067023
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年12月11日
【发明人】H·瓦伊尼奥, V·皮赫拉亚涅米, M·西波宁, O·帕斯蒂宁, I·莱赫托迈基, S·拉克索, O·米吕迈基, P·科斯基宁
【申请人】耐思特公司