用于制备(r)-网状番荔枝碱及其前体的组合物和方法

用于制备(r)-网状番荔枝碱及其前体的组合物和方法
【专利摘要】可用于制造化合物(R)?网状番荔枝碱及其合成前体的方法。还提供可用于合成(R)?网状番荔枝碱和合成前体的组合物。
【专利说明】用于制备(R)-网状番荔枝碱及其前体的组合物和方法 相关申请
[0001] 本专利合作条约申请要求来自2013年12月4日提交的美国临时专利申请号61/ 911，759和2014年9月15日提交的美国临时专利申请号62/050,399的根据351^0§119(6)的 权益，这两个专利都通过引用以其全文结合在此。 披露领域
[0002] 在此披露的组合物和方法涉及次级代谢物和用于制造这些次级代谢物的方法。更 具体地说，本披露涉及(R)-网状番荔枝碱及其某些前体以及用于制造(R)-网状番荔枝碱和 此类前体的方法和组合物。 披露背景
[0003] 以下段落通过背景的方式提供给本披露。然而，它们并不是承认在此所讨论的任 何内容是现有技术或是本领域技术人员常识的一部分。
[0004] 生命体的生物化学途径通常被分类为初级代谢的一部分或次级代谢的一部分。为 活细胞初级代谢的一部分的途径涉及用于能量产生的分解代谢或涉及用于细胞的结构单 元(building block)产生的合成代谢。另一方面，次级代谢物由不具有任何明显的合成代 谢或分解代谢功能的活细胞产生。然而很久以前就已经认识到，许多次级代谢物可用于许 多方面，包括例如作为治疗剂或天然忌避剂。
[0005] 次级代谢物（R)-网状番蒸枝碱由罂粟（罂粟(Papaversomniferum))和植物家族罂 粟科、樟科、番荔枝科、大戟科以及桑科的其他成员产生，并且可被用作一种用于产生药物 活性化合物(包括吗啡和可待因）的源材料。
[0006] 已知的是，植物中的（R)-网状番荔枝碱是由（S)-网状番荔枝碱产生的。然而还不 清楚是哪些基因和多肽涉及催化一个或多个转化反应。
[0007] 目前可从天然来源（诸如罂粟）收获(R)-网状番荔枝碱。可替代地可以合成制备 (R)-网状番荔枝碱。然而现有的用于制造(R)-网状番荔枝碱的方法受(R)-网状番荔枝碱产 率低的困扰和/或是昂贵的。不存在由（S)-网状番荔枝碱生物合成制备(R)-网状番荔枝碱 的方法。因此在本领域中存在对于合成(R)-网状番荔枝碱的改进方法的需要。 披露概述
[0008] 以下段落意在向读者介绍随后的更详细说明并且不限定或限制本披露所要求保 护的主题。
[0009] 本披露涉及次级代谢物(R)-网状番荔枝碱及其某些前体，以及涉及制备(R)-网状 番荔枝碱及其某些前体的方法。
[0010] 因此，本披露在至少一个方面中提供一种制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔 枝碱前体的方法的至少一个实施例，该方法包括： (a) 提供一种苄基异喹啉衍生物； (b) 使该苄基异喹啉衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异 喹啉衍生物转化成(R)_网状番荔枝碱或(R)_网状番荔枝碱前体的条件下将该苄基异喹啉 衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。
[0011]本披露进一步在至少一个方面中提供一种制备(R)_网状番荔枝碱或其前体的方 法的至少一个实施例，该方法包括： (a) 提供一种苄基异喹啉衍生物； (b) 使该苄基异喹啉衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异 喹啉衍生物转化成(R)_网状番荔枝碱或(R)_网状番荔枝碱前体的条件下将该苄基异喹啉 衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体； 其中该苄基异喹啉衍生物具有化学式(I):
其中Rl、R2、R3以及R4各自表不氣原子、羟基基团或甲氧基基团； 并且其中抱表示氢原子或甲基基团；并且 其中该(R)-网状番荔枝碱前体具有化学式(II):
其中Rl、R2、R3以及R4各自表不氣原子、羟基基团或甲氧基基团； 并且其中抱表示氢原子或甲基基团，其条件是化学式(II)将(R)-网状番荔枝碱除外。 [0012]在优选实施例中，在该苄基异喹啉衍生物中，Ri是甲氧基基团；R2是羟基基团；R 3是 羟基基团;R4是甲氧基基团并且R5是甲基基团，从而提供化学式：
也称为(S)-网状番荔枝碱。
[0013]在另外的优选实施例中，该酶混合物包含一种第一多肽，该第一多肽能够将该苄 基异喹啉衍生物氧化以形成一种具有化学式(IV)的氧化苄基异喹啉衍生物：
其中RiUs以及R4各自表示氢原子、羟基或甲氧基基团； 并且其中抱表示氢原子或甲基基团；以及 一种第二多肽，该第二多肽能够将该氧化苄基异喹啉衍生物(IV)还原以形成具有化学 式(Π )的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体：
其中Rl、R2、R3以及R4各自表不氣原子、羟基基团或甲氧基基团； 并且其中抱表示氢原子或甲基基团，其条件是化学式(II)将(R)-网状番荔枝碱除外。
[0014] 在另外的优选实施例中，该酶混合物包含一种能够将(S)-网状番荔枝碱氧化以形 成1，2_脱氢网状番荔枝碱的第一多肽和一种能够将1，2_脱氢网状番荔枝碱还原以形成 (R)-网状番荔枝碱的第二多肽。
[0015] 在另外的优选实施例中，能够将该苄基异喹啉衍生物氧化以形成该氧化苄基异喹 啉衍生物的该第一多肽是一种细胞色素 P450,并且能够将该氧化苄基异喹啉衍生物还原以 形成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的该第二多肽是一种醛-酮还原酶(AKR)。
[0016] 根据本披露，这些方法可以在体外或体内进行，包括但不限于在植物、植物细胞培 养物、微生物以及无细胞系统中进行。
[0017] 在此进一步提供一种用于制备选自由CYP450和AKR或其混合物组成的组的酶的方 法，该方法包括： (a) 提供一种嵌合核酸序列，该嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的以下各项： (i) 编码选自由CYP450和AKR组成的组的一种或多种多肽的一种或多种核酸序列；以及 (ii) 能够控制在宿主细胞中的表达的一种或多种核酸序列； (b) 将该嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主细胞生长以产生选自由 CYP450和AKR组成的组的该多肽;并且 (c) 从该宿主细胞中回收选自由CYP450和AKR组成的组的多肽。
[0018] 在此进一步提供一种用于制备具有化学式（II)的（R)-网状番荔枝碱或(R)-网状 番荔枝碱前体的方法，该方法包括： (a)提供一种嵌合核酸序列，该嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的以下各项： (i) 一种编码CYP450多肽的第一核酸序列； (ii) 一种编码AKR多肽的第二核酸序列；以及 (iii) 能够控制在宿主细胞中的表达的一种或多种核酸序列； (b) 将该嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主细胞生长以产生CYP450和 AKR，并且产生具有化学式(II)的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体;并且 (c) 回收具有化学式(II)的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。
[0019] 在优选实施例中，该第一核酸序列和该第二核酸序列被可操作地连接以便产生一 种包含CYP450和AKR的融合多肽。
[0020] 在此进一步提供一种用于制备具有化学式（II)的（R)-网状番荔枝碱或(R)-网状 番荔枝碱前体的方法，该方法包括： (a) 提供一种第一嵌合核酸序列，该第一嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的 一种编码CYP450多肽的第一核酸序列和一种控制该第一核酸序列在细胞中的表达的第一 核酸序列； (b) 提供一种第二嵌合核酸序列，该第二嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的 一种编码AKR多肽的第二核酸序列和一种控制该第二核酸序列在细胞中的表达的第二核酸 序列； (c) 将该第一嵌合核酸序列和该第二嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主 细胞生长以产生CYP450和AKR，并且产生具有化学式（II)的（R)-网状番荔枝碱或(R)-网状 番荔枝碱前体;并且 (d) 回收具有化学式(II)的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。
[0021] 本披露进一步提供用于制备(R)-网状番荔枝碱的组合物，这些组合物包含一种酶 混合物，该酶混合物包含一种能够将(S)-网状番荔枝碱氧化以形成1，2_脱氢网状番荔枝碱 的第一多肽和一种能够将1，2_脱氢网状番荔枝碱还原以形成(R)-网状番荔枝碱的第二多 肽。
[0022] 在优选实施例中，该酶混合物包含一种能够将(S)-网状番荔枝碱氧化以形成1，2_ 脱氢网状番荔枝碱的第一多肽和一种能够将1，2_脱氢网状番荔枝碱还原以形成(R)-网状 番荔枝碱的第二多肽。
[0023]在另外的优选实施例中，能够将(S)-网状番荔枝碱氧化以形成1，2_脱氢网状番荔 枝碱的该第一多肽是一种细胞色素 P450,并且能够将1，2_脱氢网状番荔枝碱还原以形成 (R)-网状番荔枝碱的该第二多肽是一种醛-酮还原酶(AKR)。
[0024]本发明还进一步提供包含核酸序列的组合物，这些核酸序列编码一种能够将(S)-网状番荔枝碱氧化以形成1，2_脱氢网状番荔枝碱的第一多肽和一种能够将1，2_脱氢网状 番荔枝碱还原以形成(R)-网状番荔枝碱的第二多肽。在优选实施例中，这些核酸序列是一 种编码能够一起将(S)-网状番荔枝碱氧化以形成1，2_脱氢网状番荔枝碱的细胞色素 P450 和醛-酮还原酶，以及能够将1，2_脱氢网状番荔枝碱还原以形成(R)-网状番荔枝碱的第二 多肽的核酸序列。
[0025]本披露进一步包括使用编码AKR和/或CYP450的核酸序列的方法，以便检测其在样 品（例如包含植物细胞的样品）中的存在或不存在，以便调节AKR和/或CYP450在植物细胞和 其他细胞中的表达，并且作为一种标记物以便评估植物群体中基因遗传连接AKR和/或 CYP450的分离。
[0026] 在一个另外的实施例中，本披露提供一种检测编码AKR和/或CYP450的核酸序列的 存在或不存在的方法，该方法包括： (a) 提供一种怀疑包含编码AKR和/或CYP450的核酸序列的样品;并且 (b) 针对编码AKR和/或CYP450的核苷酸序列的存在分析该样品。
[0027] 在一个另外的实施例中，本披露提供一种用于调节核酸序列在天然表达AKR和/或 CYP450的细胞中的表达的方法，该方法包括： (a) 提供一种天然表达AKR和/或CYP450的细胞； (b) 诱变处理该细胞； (c) 使该细胞生长以获得多个细胞;并且 (d) 确定该多个细胞是否包括一种包含调节水平的AKR和/或CYP450的细胞。
[0028]在又另一个实施例中，本披露提供一种减少AKR和/或CYP450在细胞中的表达的方 法，该方法包括： (a) 提供一种表达AKR和/或CYP450的细胞;并且 (b) 使AKR和/或CYP450在该细胞中的表达沉默。
[0029] 本披露的其他特征和优点将从以下详细说明中变得清楚。然而，应该理解详细说 明，在指示本披露的优选实施的同时，仅以说明的方式给出，因为在此披露内容的精神和范 围内的不同变化和修改将由该详细说明而对本领域技术人员而言变得明显。 附图简要说明
[0030] 本披露在以下提供关于其附图描述的段落。在此提供的附图提供说明的目的并且 不旨在限制本披露。
[0031] 图1描绘不同苄基异喹啉前体至(R)_网状番荔枝碱、（R)_网状番荔枝碱前体、吗啡 以及萨卢它定的合成途径。包括所示化合物的化学结构。
[0032] 图2描绘一种用于由（S)-网状番荔枝碱及其合成中间体制造(R)-网状番荔枝碱的 合成途径。包括这些合成中间体和能够催化这些合成中间体的化学转化的酶的化学结构。 [0033]图3描绘本披露的一个实施例的一系列HPLC记录，该实施例提供如在实例1中进一 步所述的(S)-网状番荔枝碱至(R)-网状番荔枝碱的转化。
[0034]图4描绘本披露的一个实施例的一系列HPLC记录，该实施例提供如在实例2中进一 步所述的(S)-网状番荔枝碱至1，2_脱氢网状番荔枝碱的转化。
[0035 ]图5描绘本披露的一个实施例的一系列HPLC记录，该实施例不出如在实例3中进一 步所述的1，2_脱氢网状番荔枝碱至(R)-网状番荔枝碱的转化。
[0036] 图6描绘本披露的一个实施例的一系列HPLC记录，该实施例示出如在实例4中进一 步所述的(S)-N-甲基乌药碱至(R)-N-甲基乌药碱的转化。
[0037] 图7描绘关于如在实例5中进一步所述的基因沉默实验所获得的结果。靶向REPI基 因中的两个不同区域（图7A;图7C)和C0R1.3基因中的一个区域（图7B)。在图7A-7C的每个 中，不同图表示以下：（图A)用于组装pTRV2构建体的REPI或C0R1.3cDNA的片段(灰色框）。黑 色框表示编码区，而黑色线是侧翼非翻译区。箭头示出用于qRT-PCR分析的引物的退火位 点。（图B)示出使用总RNA通过RT-PCR检测pTRV2载体的溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，该总 尺祖从用具有口了1^2-1^?1-3 4了1^2-1^?1-5'、或口了1^2-〇)1?1.3构建体、或口了1^2空载体对照 的根瘤土壤杆菌浸润的单独的植物中提取。PCR引物(TRV2-MCS)被设计成退火至侧接pTRV2 的多克隆位点（MCS)的区域。（图C)与对照（pTRV2)相比，在REP I -沉默（pTRV2 - REP I -a ; PRTV2-REPI-5'）或C0R1.3-沉默(pRTV2-C0Rl. 3)植物茎和根中的相对REPI或C0R1.3转录物 水平。（图〇)与对照（口了1^2)相比，示出1^?1-沉默（口了1^2-1^?1141?1^2-1^?1-5'）或 COR 1.3-沉默（pRTV2-C0R 1.3)植物的主要生物碱分布的总离子色谱图。（图E)与对照 (pTRV2)相比，示出 REPI -沉默(pTRV2 - REP I -a; pRTV2-REPI -5 '）植物或C0R1 · 3-沉默(pRTV2-C0R1.3)植物中的抑制水平的主要乳胶生物碱和其他生物碱的相对丰度。（图F)与对照 (口丁1^2)相比，1^?1-沉默化了1^2-1^?1-3$1?1'￥2-1^?1-5'）植物或卬1?1.3-沉默化1?1'￥2-C0R1.3)植物中的（S)-网状番荔枝碱与(R)-网状番荔枝碱的比率。星号指示使用一种不成 对、双尾学生t检验确定的显著性差异(p〈0.05)。棒表示由6个单独浸润植物中的每个的3个 技术重复获得的值的平均值土标准偏差。
[0038]图8描绘如在实例6中进一步所述的在评估AKR多肽在还原剂和氧化剂存在下的活 性时所获得的结果。图8A示出罂粟网状番荔枝碱表异构酶(REPI)的1，2_脱氢网状番荔枝碱 还原酶(PsDRR)组分的活性。在NADH或NADPH的存在下，PsDRR将1，2_脱氢网状番荔枝碱[1] 转化成(R)_网状番荔枝碱[2](图8A，图A)。在NAD+或NADP+的存在下，PsDRR将(R)-网状番荔 枝碱[2]转化成1，2_脱氢网状番荔枝碱[1](图8A，图B)。图8B示出来自虞美人的1，2_脱氢网 状番荔枝碱还原酶(PrDRR)的活性。在NADH或NADPH的存在下，PrDRR将1，2_脱氢网状番荔枝 碱[1 ]转化成(R)_网状番荔枝碱[2](图8B，图A)。在NAD+或NADP+的存在下，PrDRR将(R)-网状 番荔枝碱[2]转化成1，2_脱氢网状番荔枝碱[1](图8B，图B)。
[0039]图9描绘如在实例7中进一步所述的在评估CYP450和AKR多肽的pH依赖性时所获得 的结果。示出使用罂粟CYP450(PsDRS)和AKR在NADPH(PsDRS正向）存在下并且在NADP+ (PsDRS反向）存在下所获得的结果（图A)。进一步示出使用虞美人CYP450(PrDRS)和AKR在 NADPH(PrDRS正向）存在下并且在NADP+ (PrDRS反向）存在下所获得的结果（图B)。
[0040] 图10描绘如在实例8中进一步所述的在经受病毒诱导性基因沉默(VIGS)的罂粟植 物中的REPI和C0R转录物水平的共抑制。其中C0R的沉默被靶向的植物(pTRV2-C0Rl. 3)示出 C0R的显著抑制（图10-底图），并且另外地示出REPI的抑制（图10-顶图）。其中使用在REPI和 C0R两者中发现的保守区靶向的REP I的沉默的植物(pTRV2-REP I a)也示出⑶R的显著抑制 (图10-底图）和REPI的显著抑制（图10-顶图）。其中使用REPI的独特区域(一个并未也在C0R 中发现的区域)靶向REPI的沉默的植物(pTRV2-REPIb)未示出C0R的共沉默（图10-底图）。 PTRV2是空载体对照。星号指示使用一种不成对、双尾学生t检验相比于对照显著不同的值 (P〈0.05)。误差棒表示平均值土标准偏差。 披露详细说明
[0041] 将在以下描述不同的组合物和方法以提供每个要求保护的主题的实施例的实例。 以下描述的实施例不限制任何要求保护的主题，并且任何要求保护的主题可以涵盖不同于 以下描述的那些方法、过程、组合物或系统。该要求保护的主题不限于具有以下描述的任何 一种组合物、方法、系统或过程的所有特征的组合物或方法，或不限于为以下描述的组合 物、系统或方法中的多个或全部所共有的特征。以下描述的一种组合物、系统、方法或过程 不是任何要求保护的主题的一个实施例是可能的。在以下描述的一种组合物、系统、方法或 过程中披露的、在本文件中未要求保护的任何主题可以是另一种保护工具(例如，一个继续 专利申请）的主题，并且
【申请人】、发明人或所有人不打算在本文件中通过其披露向公众放 弃、否认或贡献任何这样的主题。
[0042]应该注意，如在此使用的诸如"基本上"、"实质上"、"约"以及"大约"的程度术语意 味着所修饰术语的合理偏差量，使得最终结果没有显著改变。如果此偏差不会否定它所修 饰的术语的含义，那么这些程度术语应该被解释为包括所修饰术语的偏差。
[0043]如在此所使用的，词语"和/或"旨在表示包含性的或者。也就是说，例如"X和/或Y" 意思是指X或Y或两者。作为一个另外的实例，"X、Y、和/或Z"意思是指X或Y或Z或其任何组 合。
[0044] 所有出版物、专利和专利申请以如同每个单独的公开的相同程度通过引用以其全 文结合在此。
[0045] 如上文所提到的，本披露涉及次级代谢物(R)-网状番荔枝碱及其前体，以及涉及 制备(R)_网状番荔枝碱及其前体的方法。当前披露进一步涉及能够催化导致转化(S)-网状 番荔枝碱以形成(R)_网状番荔枝碱的反应的某些酶。在此提供的方法表示一种制造 (R)_网 状番荔枝碱及其前体的新颖和有效手段。在此提供的方法不依赖于化学合成并且可以在商 业规模下进行。就本发明人所知的，当前披露首次提供一种使用通常不能合成(R)-网状番 荔枝碱及其前体的活细胞来制造 (R)-网状番荔枝碱及其前体的方法。此类细胞可被用作一 种由此可经济地提取(R)-网状番荔枝碱及其前体的来源。根据本披露产生的(R)-网状番荔 枝碱及其前体是有用的，尤其是在包含吗啡和可待因的药物组合物的制造中。
[0046] 因此，本披露在至少一个方面中提供一种制备(R)-网状番荔枝碱或其前体的方法 的至少一个实施例，该方法包括： (a) 提供一种苄基异喹啉衍生物； (b) 使该苄基异喹啉衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异 喹啉衍生物转化成(R)_网状番荔枝碱或(R)_网状番荔枝碱前体的条件下将该苄基异喹啉 衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。
[0047] 本披露进一步在至少一个方面中提供一种制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番 荔枝碱前体的方法的至少一个实施例，该方法包括： (a) 提供一种苄基异喹啉衍生物； (b) 使该苄基异喹啉衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异 喹啉衍生物转化成(R)_网状番荔枝碱或(R)_网状番荔枝碱前体的条件下将该苄基异喹啉 衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体； 其中该苄基异喹啉衍生物具有化学式(I):
其中Rl、R2、R3以及R4各自表不氣原子、羟基基团或甲氧基基团； 并且其中抱表示氢原子或甲基基团；并且 其中该(R)-网状番荔枝碱前体具有化学式：
其中Rl、R2、R3以及R4各自表不氣原子、羟基基团或甲氧基基团； 并且其中抱表示氢原子或甲基基团。 定义
[0048] 如在此使用的术语"苄基异喹啉衍生物"是指具有化学式(VII)的化合物：
其中RiUs以及R4各自独立地或同时地是氢原子、羟基基团、烷基基团（例如Ci-Cio-烷基)或烷氧基基团（例如烷氧基），并且其中抱表示氢原子或烷基基团（例如&-&〇-烷基)。
[0049] 如在此使用的术语"(R)-网状番荔枝碱前体"是指一种具有化学式(VIII)的化合 物：
其中RiUs以及R4各自独立地或同时地是氢原子、羟基基团、烷基基团（例如Ci-Cio-烷基)或烷氧基基团（例如烷氧基），并且其中抱表示氢原子或烷基基团（例如&-&〇-烷基），并且其中，在优选实施例中，R 5表示氢原子或烷基基团，其条件是化学式(VIII)将 (R)-网状番荔枝碱除外，即确切地排除在如在此使用的术语(R)-网状番荔枝碱前体之外的 是其中R!是甲氧基基团；R2是羟基基团，R 3是羟基基团，R4是甲氧基基团并且R5是甲基基团的 化合物。
[0050] 如在此使用的术语"(S)-网状番荔枝碱"是指网状番荔枝碱的（S)-对映异构体和 一种具有化学结构（I11)的化合物：
[0051] 术语"氧化苄基异喹啉衍生物"是指一种具有化学式(IX)的化合物：
其中RiUs以及R4各自独立地或同时地是氢原子、羟基基团、烷基基团（例如Ci-Cio-烷基)或烷氧基基团（例如烷氧基），并且其中抱表示氢原子或烷基基团（例如&-&〇-烷基)。
[0052] 如在此使用的术语"(R)-网状番荔枝碱"是指网状番荔枝碱的（R)-对映异构体和 一种具有化学结构(V)的化合物：
[0053] 如在此使用的术语"1，2_脱氢网状番荔枝碱"是指一种具有化学式(VI)的化合物：
[0054]如在此可互换使用的术语"(R)_网状番荔枝碱途径"或"(R)_网状番荔枝碱合成途 径"是指在图1中所描绘的用于合成(R)-网状番荔枝碱的代谢途径。当(R)-网状番荔枝碱途 径中的第一化合物被表示为该途径中的第二化合物的''时，其在此意味着该第一化合物的 合成先于该第二化合物的合成。相反地，当第一化合物被表示为该(R)_网状番荔枝碱途径 中的第二化合物的"下游"时，其在此意味着该第二化合物的合成先于该第一化合物的合 成。
[0055]如在此使用的术语"酶混合物"是指一种包含一种或两种或更多种酶的混合物。应 该注意，在含有两种或更多种酶的混合物中，这些酶可能是独立地生物活性的，不具有相互 作用或协调以形成混合物。在一个实施例中，包含在该酶混合物中的这些酶可以作为独立 的非连续的多肽链缔合或相互作用。在另一个实施例中，该酶混合物可以被制备成一种两 个多肽之间的融合多肽。
[0056] 在此可互换使用的术语"细胞色素 P450"、"CYP450"或"P450"是指包含以下氨基酸 残基序列的任何和所有的酶：（i)与构成在此列出的任何CYP450多肽的氨基酸序列基本上 一致，包括例如，SEQ.ID N0:219 至 SEQ.ID N0:321;SEQ.ID N0:325;以及 SEQ.ID N0:338,或 (ii)由一种能够在至少适度严格的条件下杂交至编码在此列出的任何CYP450多肽的任何 核酸序列的核酸序列编码，但对于使用同义密码子。
[0057]在此可互换使用的术语"醛-酮还原酶"或"AKR"指的是包含以下氨基酸残基序列 的任何和所有的酶：（i)与构成在此列出的任何AKR多肽的氨基酸序列基本上一致，包括例 如，SEQ.ID N0:59 至 SEQ.ID N0:115;SEQ.ID N0:327;SEQ.ID N0:329;SEQ.ID N0:330;以及 SEQ. ID NO: 340，或（ii)由一种能够在至少适度严格的条件下杂交至编码在此列出的任何 AKR多肽的任何核酸序列的核酸序列编码，但对于使用同义密码子。
[0058]如在此使用的术语"核酸序列"是指一种由天然存在的碱基、糖和糖间（主链)键组 成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语还包括包含非天然存在的单体或其部分的修饰或取 代序列。本披露的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)并且可以 包含包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷以及尿嘧啶的天然存在的碱基。这些序列还可以含 有修饰碱基。此类修饰碱基的实例包括氮杂和脱氮的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧 啶、以及黄嘌呤和次黄嘌呤。
[0059]在此可互换使用的术语"编码CYP450的核酸序列"和"编码CYP450多肽的核酸序 列"是指编码CYP450多肽的任何和所有的核酸序列，包括例如，SEQ.ID N0:116至SEQ.ID NO: 218; SEQ. ID NO: 324;以及SEQ. ID NO: 337。编码CYP450多肽的核酸序列进一步包括以下 的任何和所有的核酸序列：（i)编码与在此列出的CYP450多肽序列基本上一致的多肽;或 (ii)在至少适度严格的杂交条件下，杂交至在此列出的任何CYP450核酸序列，或将在至少 适度严格的条件下杂交至其上的核酸序列，但对于使用同义密码子。
[0060] 在此可互换使用的术语"编码AKR的核酸序列"和"编码AKR多肽的核酸序列"是指 编码AKR多肽的任何和所有的核酸序列，包括例如，SEQ. ID NO: 1至SEQ. ID N0: 58; SEQ. ID NO: 326; SEQ. ID NO: 328;以及SEQ. ID NO: 339。编码AKR多肽的核酸序列进一步包括以下的 任何和所有的核酸序列：（i)编码与在此列出的AKR多肽序列基本上一致的多肽;或（ii)在 至少适度严格的杂交条件下，杂交至在此列出的任何AKR核酸序列，或将在至少适度严格的 条件下杂交至其上的核酸序列，但对于使用同义密码子。
[0061] 通过术语"基本上一致"其意味着两种多肽序列优选地是至少70%-致，并且更优 选地是至少85 % -致，并且最优选地至少95 % -致，例如96 %、97 %、98 %或99 % -致。为了 确定两种多肽序列之间的一致性百分比，使用例如由史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman) (应用数学进展（Adv · Appl .Math · )，1981，2 : 482)修订的尼德尔曼（Needleman)和温施 (Wunsch)(分子生物学杂志(11〇1.8丨〇1.)，1970,48:443)比对方法将此类两种序列的氨基 酸序列进行比对，从而获得这两种序列之间的最高级匹配并且确定这两种序列之间的一致 氨基酸的数目。计算两种氨基酸序列之间的百分比一致性的方法通常是本领域认可的并且 包括，例如，由卡里略（0 &411〇)和李普顿（1^?〖〇11)(工业和应用数学学会杂志（31八1 J.Applied Math.)，1988,48:1073)描述的那些方法和在计算分子生物学（Computational Molecular Biology)，莱斯克(Lesk)编著，牛津大学出版社(Oxford University Press)， 纽约，1988,生物计算:信息学和基因组学项目（Biocomputing: Informatics and Genomics Projects)中描述的那些方法。通常，计算机程序将被用于此类计算。在此方面可使用的计 算机程序包括但不限于GCG(德弗罗（Devereux)等人，核酸研究（Nucleic Acids Res)， 1984，12:387)81^3了？、81^3了~以及?43了4(阿特休尔（4^8(^111)等人，分子生物学杂志 (J.Molec.Biol) ,1990:215:403)。一种用于确定两种多肽之间的百分比一致性的特别优选 方法涉及Clustal W算法(汤普森(Thompson)J D、希金斯(Higgines)D G和吉普森(Gibson) T J，1994,核算研究(Nucleic Acid Res)22(22) :4673-4680)连同使用10空位开放罚分和 0.1空位延伸罚分的BL0SUM 62评分矩阵(海尼科夫(Henikoff)S和海尼科夫J G，1992,美国 国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.USA)89:10915-10919)，从而在两种序列之间获得 最高级匹配，其中这两种序列中的一种的全长的至少50%涉及比对。
[0062] 通过"至少适度严格的杂交条件"其意味着选择促进在溶液中的两种互补核酸分 子之间的选择性杂交的条件。杂交可发生于核酸序列分子的全部或一部分中。该杂交部分 典型地是至少15(例如20、25、30、40或50)个核苷酸长度。本领域的技术人员将认识到核酸 双链体或杂交体的稳定性是由Tm确定的，在含钠缓冲液中的该稳定性是钠离子浓度和温度 的函数(1'111=81.5°(：-16.6〇^^10[似+])+0.41(%(6+〇-600/1)，或类似的方程）。因此，在 洗涤条件中确定杂交体稳定性的参数是钠离子浓度和温度。为了鉴定与一种已知核酸分子 类似但不一致的分子，1 %的不匹配可被认为导致Tm下降约1°C，例如如果寻求具有>95% - 致性的核酸分子，那么最终洗涤温度将下降约5°C。基于这些考虑，本领域的技术人员将能 够容易地选择适当的杂交条件。在优选实施例中，选择严格杂交条件。通过实例，可采用以 下条件以实现严格杂交:在_5°C的Tm(基于上述方程)下在5X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5X 邓哈特溶液/1. 〇% SDS下杂交，随后用60°C的0.2 X SSC/0.1 %SDS洗涤。适度严格的杂交条 件包括一个在42 °C下的3 X SSC中的洗涤步骤。然而应该理解，可使用替代的缓冲液、盐和温 度来实现等效严格性。关于杂交条件的附加指导可在以下找到：分子生物学实验指南 (Current Protocols in Molecular Biology)，约翰威利（John Wiley)和圣思（Sons)， Ν·Y.，1989，6·3· 1 ·_6·3·6和萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆(Molecular Cloning)， 实验手册（Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989，第3卷。
[0063] 如在此使用的术语"嵌合"在核酸序列的语境中是指并非天然连接的至少两个连 接的核酸序列。嵌合核酸序列包括不同天然来源的连接的核酸序列。例如一种构成连接至 编码C0R蛋白的核酸序列上的酵母启动子的核酸序列被认为是嵌合的。嵌合核酸序列还可 包含相同天然来源的核酸序列，条件是它们不是天然连接的。例如一种构成由特定细胞类 型获得的启动子的核酸序列可以连接至一种编码由相同细胞类型获得的多肽的核酸序列 上，但是通常不连接至构成该启动子的该核酸序列上。嵌合核酸序列还包括包含连接至任 何非天然存在的核酸序列上的任何天然存在的核酸序列的核酸序列。
[0064] 如在此可互换使用的术语"基本上纯的"和"分离的"描述一种已经从与其天然共 存的组分分离的化合物，例如，一种途径合成中间体或一种多肽。典型地，当一个样品中的 总材料的至少60%、更优选至少75%、更优选至少90 %、95 %、96 %、97 %、或98%、并且最优 选至少99% (以体积、湿重或干重、或者摩尔百分比或摩尔分数计)是感兴趣的化合物时，该 化合物是基本上纯的。可以通过任何适当的方法，例如在多肽的情况下，通过色谱法、凝胶 电泳或HPLC分析来测量纯度。
[0065] 如在此使用的与一种酶或蛋白质相关联的术语"回收"是指该酶或蛋白质的或多 或少纯的形式。
[0066] 如在此使用的、用于描述制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的方法 的术语"体内"是指在一个活细胞(包括例如，一个微生物细胞或一个植物细胞）内使一种苄 基异喹啉衍生物与一种能够催化转化该苄基异喹啉衍生物的酶接触以形成(R)_网状番荔 枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。
[0067] 如在此使用的、用于描述制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的方法 的术语"体外"是指在一个活细胞外部环境(包括但不限于，例如在微孔板、试管、烧瓶、烧 杯、罐、反应器等）中使一种苄基异喹啉衍生物与一种能够催化转化该苄基异喹啉衍生物的 酶接触以形成(R)_网状番荔枝碱或(R)_网状番荔枝碱前体。 一般实施方式 合成(R)-网状番荔枝碱和(R)-网状番荔枝碱前体
[0068] 本披露在至少一个方面中提供制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体 的至少一个实施例，该至少一个实施例包括： (a) 提供一种苄基异喹啉衍生物； (b) 使该苄基异喹啉衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异 喹啉衍生物转化成(R)_网状番荔枝碱或(R)_网状番荔枝碱前体的条件下将该苄基异喹啉 衍生物转化成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体； 其中该苄基异喹啉衍生物具有化学式(I):
其中Rl、R2、R3以及R4各自表不氣原子、羟基基团或甲氧基基团； 并且其中抱表示氢原子或甲基基团；并且 其中该(R)-网状番荔枝碱前体具有化学式(II):
其中Rl、R2、R3以及R4各自表不氣原子、羟基基团或甲氧基基团； 并且其中抱表示氢原子或甲基基团，其条件是化学式(II)将(R)-网状番荔枝碱除外。
[0069] 在一个优选实施例中，该苄基异喹啉衍生物（I)是一种其中心是甲氧基基团、办是 羟基基团、R3是氢原子或羟基基团、R4是羟基基团或甲氧基基团、并且R 5是氢原子或甲基基 团的衍生物。
[0070] 在一个另外的优选实施例中，该苄基异喹啉衍生物（I)是一种其中心是甲氧基基 团、R2是羟基基团、R 3是氢原子、R4是羟基基团并且他是氢原子的衍生物。此化合物又称为 (S)-乌药碱(参见:图1)。
[0071] 在一个另外的优选实施例中，该苄基异喹啉衍生物（I)是一种其中心是甲氧基基 团、R2是羟基基团、R 3是氢原子、R4是羟基基团并且抱是甲基基团的衍生物。此化合物又称为 (S)-N-甲基-乌药碱(参见：图1)。
[0072] 在一个另外的优选实施例中，该苄基异喹啉衍生物（I)是一种其中心是甲氧基基 团、R2是羟基基团、R 3是羟基基团、R4是羟基基团并且抱是甲基基团的衍生物。此化合物又称 为(S)_3'_羟基-N-甲基乌药碱(参见:图1)。
[0073] 在一个另外的优选实施例中，该苄基异喹啉衍生物（I)是一种其中心是甲氧基基 团、R2是羟基基团、R 3是羟基基团、R4是甲氧基基团并且R5是甲基基团的衍生物。此化合物又 称为(S)-网状番荔枝碱(参见:图1;化合物(III))。
[0074] 在一个另外的优选实施例中，该(R)-网状番荔枝碱衍生物（II)是一种其中心是甲 氧基基团、R2是羟基基团、R 3是氢原子或羟基基团、R4是羟基基团并且他是甲基基团的衍生 物。
[0075] 在一个另外的优选实施例中，该(R)-网状番荔枝碱衍生物（II)是一种其中心是甲 氧基基团、R2是羟基基团、R 3是氢原子、R4是羟基基团并且抱是甲基基团的衍生物。此化合物 又称为(R)-N-甲基乌药碱(参见：图1)。
[0076] 在一个另外的优选实施例中，该(R)-网状番荔枝碱衍生物（II)是一种其中心是甲 氧基基团、R2是羟基基团、R 3是羟基基团、R4是羟基基团并且抱是甲基基团的衍生物。此化合 物又称为(R)_3 ' -羟基-N-甲基乌药碱(参见:图1)。
[0077] 在一个另外的优选实施例中，该苄基异喹啉衍生物（I)是一种其中心是甲氧基基 团、R2是羟基基团、R 3是氢原子、R4是羟基基团并且抱是甲基基团的衍生物;并且该(R)-网状 番荔枝碱衍生物（II)是一种其中心是甲氧基基团、R 2是羟基基团、R3是氢原子、R4是羟基基 团并且Rs是甲基基团的衍生物。
[0078] 在一个另外的优选实施例中，该苄基异喹啉衍生物（I)是一种其中心是甲氧基基 团、R2是羟基基团、R 3是羟基基团、R4是羟基基团并且抱是甲基基团的衍生物;并且(R)-网状 番荔枝碱衍生物（II)是一种其中心是甲氧基基团、R2是羟基基团、R3是羟基基团、R4是羟基 基团并且R5是甲基基团的衍生物。
[0079] 在本披露的一个优选实施例中，提供一种制备(R)-网状番荔枝碱的方法，该方法 包括： (a) 提供(S)-网状番荔枝碱;并且 (b) 使(S)-网状番荔枝碱与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将(S)-网状番 荔枝碱转化成(R)_网状番荔枝碱的条件下将(S)-网状番荔枝碱转化成(R)-网状番荔枝碱。
[0080] 在优选实施例中，该酶混合物包含一种能够将(S)-网状番荔枝碱氧化以形成1，2_ 脱氢网状番荔枝碱的第一多肽和一种能够将1，2_脱氢网状番荔枝碱还原以形成(R)-网状 番荔枝碱的第二多肽(参见:图2)。
[0081] 在优选实施例中，该酶混合物包含一种第一多肽，该第一多肽能够将该苄基异喹 啉衍生物(I)氧化以形成一种具有化学式(IV)的氧化苄基异喹啉衍生物：
其中，在优选实施例中，Ri、R2、R3以及R4各自表示氢原子、羟基基团或甲氧基基团；并且 其中，在优选实施例中，R5表示氢原子或甲基基团；以及一种第二多肽，该第二多肽能够将 具有化学式（IV)的该氧化苄基异喹啉衍生物还原以形成具有化学式（II)的(R)-网状番荔 枝碱或(R)-网状番荔枝碱衍生物，其中以及R4各自表示氢原子、羟基基团或甲氧基 基团;并且其中R 5表示氢原子或甲基基团，其条件是化学式(II)将(R)-网状番荔枝碱除外。
[0082] 在优选实施例中，能够将该苄基异喹啉衍生物（I)氧化以形成该氧化苄基异喹啉 衍生物(IV)的该第一多肽是一种细胞色素 P450,并且能够将氧化苄基异喹啉衍生物还原以 形成（R)-网状番荔枝碱或（R)-网状番荔枝碱衍生物的该第二多肽是一种醛-酮还原酶 (AKR)。在特别优选的实施例中，该AKR多肽获得自或可获得自罂粟、大红罂粟以及虞美人。 [0083]在某些实施例中，该第一多肽和该第二多肽以两个分离的多肽（即，不通过共价化 学键连接的多肽)的形式被提供。在某些优选实施例中，该第一多肽和该第二多肽被制备成 一种包含编码CYP450多肽的第一部分和编码AKR多肽的第二部分的融合多肽。这种融合多 肽可被重组制备或者它可以是一种可以使用的天然存在的融合多肽，诸如在SEQ. ID N0: 323中列出的罂粟多肽。
[0084] 根据本披露可使用的CYP450多肽的实例包括在SEQ.IDN0:219至SEQ.IDN0:321 ; SEQ. ID N0:325;和SEQ. ID N0:338中列出的多肽。根据本披露可使用的AKR多肽的实例包括 在SEQ.ID N0:59至SEQ.ID N0:115;SEQ.ID N0:327;SEQ.ID N0:329;SEQ.ID N0:330以及 SEQ. ID NO: 340中列出的多肽。
[0085] 使前述反应在允许将该苄基异喹啉前体转化成(R)_网状番荔枝碱或(R)_网状番 荔枝碱前体的条件下进行。这些条件包括体内或体外条件，如以下进一步详述。这些条件进 一步典型地包括水和缓冲剂的存在。进一步典型地包括一种还原剂以便允许进行一种导致 将该氧化苄基异喹啉前体转化成(R)-网状番荔枝碱或转化成(R)-网状番荔枝碱前体的还 原反应。该还原剂可以是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，并且在其他实施例中，该还原剂是 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。进一步典型地包括在该反应中的是一种还原酶和一 种还原剂，该还原酶能够还原将该苄基异喹啉衍生物转化成该氧化苄基异喹啉的酶。在优 选实施例中，该还原酶是一种能够还原CYP450的细胞色素 P450还原酶(诸如例如罂粟细胞 色素 P450还原酶），并且该还原剂是NADH、或者更优选是NADPH。应该进一步注意，这些反应 可以在不同的pH(例如在大约pH3、pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9或pH 10)下进行。本领 域技术人员应该清楚，可如在此实例7中所示的通过在不同pH范围下进行一个反应并且评 估该反应速率来鉴定用于该反应的最佳pH。该最佳pH可取决于例如据此选择的底物和酶而 变化。因此，仅通过实例，实例7记录了用于将(S)-网状番荔枝碱转化成1，2_脱氢网状番荔 枝碱的大约pH 8的最佳pH，用于将1，2_脱氢网状番荔枝碱转化成(R)-网状番荔枝碱的大约 pH 7的最佳pH，以及用于将(R)-网状番荔枝碱转化成1，2_脱氢网状番荔枝碱的大约pH9的 最佳pH。
[0086] 据此应该指出，取决于所选择的反应条件，涉及将1，2-脱氢网状番荔枝碱转化成 (R)-网状番荔枝碱的反应可以反向或部分反向实现。因此，如实例6中所记录，（R)-网状番 荔枝碱可被转化成1，2_脱氢网状番荔枝碱。因此，本披露进一步提供一种制备1，2_脱氢网 状番荔枝碱的方法，该方法包括： (a) 提供(R)_网状番荔枝碱;并且 (b) 使(R)-网状番荔枝碱与一种AKR多肽接触，该AKR多肽能够在允许将(R)-网状番荔 枝碱转化成1，2-脱氢网状番荔枝碱的条件下将(R)-网状番荔枝碱转化成1，2-脱氢网状番 荔枝碱。可用于进行前述反应的AKR多肽包括在SEQ.IDN0 :59至SEQ.IDN0:115;SEQ.ID N0:327 ;SEQ.IDN0:329;SEQ.IDN0:330以及SEQ.IDN0:340中列出的任何多肽。允许该转化 的反应条件包括在反应混合物中存在一种氧化剂，优选NAD+或NADP+。如以上所指出，用于该 反应的pH可以被优化。进一步在图2中示出前述反应的可逆性。
[0087] 在优选实施例中，能够将该苄基异喹啉衍生物氧化以形成该氧化苄基异喹啉衍生 物的该第一多肽是一种细胞色素 P450,并且能够将该氧化苄基异喹啉衍生物还原以形成 (R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱衍生物的该第二多肽是一种醛-酮还原酶(AKR)。在 特别优选的实施例中，该AKR获得自或可获得自罂粟、大红罂粟以及虞美人。
[0088] 在某些实施例中，该第一多肽和该第二多肽以两个分离的多肽（即，不通过共价化 学键连接的多肽)的形式被提供。在某些优选实施例中，该第一多肽和该第二多肽被制备成 一种包含编码CYP450多肽的第一部分和编码AKR多肽的第二部分的融合多肽。这种融合多 肽可被重组制备或者它可以是一种可以使用的天然存在的融合多肽，诸如在SEQ. ID N0: 323中列出的罂粟多肽。
[0089]根据本披露可使用的CYP450多肽的实例包括可获得自不同的罂粟物种的CYP450 多肽，包括:罂粟、虞美人和大红罂粟;蓟罂粟物种，包括蓟罂粟(Argemone mexicana);小檗 属物种，包括小檗黑松（1^1^61^8 1：11111^6以；[；0;紫堇属物种，包括地柏枝（(：0巧(^118 chelantifolia);白屈菜属物种，包括白屈菜(Chelidonium majus);锡生藤属物种，包括棘 状锡生藤（Cissampelos mucronata);木防己属物种，包括木防己（Cocculus trilobus);紫 堇属物种，包括地柏枝（Corydalis chelantifolia);海罂粟属物种，包括黄花海罂粟 (Glaucium flavum);北美黄连属物种，包括加拿大黄连(Hydrastis canadensis);鲜黄莲 属物种，包括二叶鲜黄莲(Jeffersonia diphylla);十大功劳属物种，包括冬青叶十大功劳 (Mahoniaaquif01 ium);蝙蝠葛属物种，包括蝙蝠葛(Menispermum canadense);南天竹属物 种，包括南天竹(似11(1；[仙（10111681：；[03);黑种草属物种，包括黑种草(附86113 831：；^3);血根 属物种，包括血根草(Sanguinaria canadensiS);金罂粟属物种，包括金罂粟(Stylophorum diphyllum);唐松草属物种，包括黄唐松草(Thalictrum flavum);青牛胆属物种，包括心叶 青牛胆（Tinospora cordifolia);以及姜黄物种，包括黄根草（Xanthoriza simplicissima)。前述内容特定地包括来自在此于SEQ.ID N0:219至SEQ.ID N0:321; SEQ. ID NO: 325;和SEQ. ID NO: 338中列出的上述物种的多肽。根据本披露可使用的AKR多肽 的实例包括可获得自不同的罂粟物种的AKR多肽，包括:罂粟、虞美人和大红罂粟;蓟罂粟物 种，包括蓟罂粟;小檗属物种，包括小檗黑松;紫堇属物种，包括地柏枝；白屈菜物种，包括白 屈菜;锡生藤属物种，包括棘状锡生藤;木防己属物种，包括木防己；紫堇属物种，包括地柏 枝;海罂粟属物种，包括黄花海罂粟;北美黄连属物种，包括加拿大黄连;鲜黄莲属物种，包 括二叶鲜黄莲;十大功劳属物种，包括冬青叶十大功劳;蝙蝠葛属物种，包括蝙蝠葛;南天竹 属物种，包括南天竹;黑种草属物种，包括黑种草;血根属物种，包括血根草;金罂粟属物种、 金罂粟;唐松草属物种，包括黄唐松草;青牛胆属物种，包括心叶青牛胆；以及姜黄物种，包 括黄根草。前述内容特定地包括来自在此于SEQ.ID N0:59至SEQ.ID N0:115;SEQ.ID NO: 327;SEQ.IDN0:329;SEQ.IDN0:330;以及SEQ.IDN0:340中列出的上述物种的多肽。
[0090] 将前述反应在允许将该苄基异喹啉前体转化成(R)_网状番荔枝碱或(R)_网状番 荔枝碱前体的条件下进行。这些条件包括体内或体外条件，如以下进一步详述。这些条件进 一步典型地包括水和缓冲剂的存在。进一步典型地包括一种还原剂以便允许进行一种导致 将该氧化苄基异喹啉前体转化成(R)_网状番荔枝碱或转化成(R)_网状番荔枝碱前体的还 原反应。该还原剂可以是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，并且在其他实施例中，该还原剂是 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。进一步典型地包括在该反应中的是一种还原酶和一 种还原剂，该还原酶能够还原将该苄基异喹啉衍生物转化成该氧化苄基异喹啉的酶。在优 选实施例中，该还原酶是一种能够还原CYP450的细胞色素 P450还原酶，并且该还原剂是 NADH、或者更优选是NADPH。 体外合成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱衍生物
[0091] 根据本披露的某些方面，在体外反应条件下在允许一种酶催化的化学转化一种苄 基异喹啉衍生物的反应条件下，使该苄基异喹啉衍生物与催化量的酶CYP450和AKR接触。在 此类体外反应条件下，以或多或少纯的形式提供初始反应成分并且在允许必要的化学反应 充分进行的条件下混合。可购买基本上纯的形式的初始苄基异喹啉衍生物。（S)-网状番荔 枝碱，例如，可作为一种基本上纯的化合物被购买(例如购自圣克鲁斯生物技术公司（Santa Cruz Biotechnology Inc.))、由前体化合物化学合成、或从天然来源分离，这些天然来源 包括罂粟和包含如所希望的此类化合物的植物的罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科或桑科家 族的其他成员。适合的罂粟科成员包括，但不限于属于罂粟属；紫堇属；白屈菜属；以及卢默 龙属的物种。此类物种可以能够制备（S)-网状番荔枝碱，包括但不限于选自以下物种的植 物物种：白屈莱属;延胡索;延胡索静脉;黄紫堇;蛇果黄堇；异果黄堇;块茎紫堇；安纳托利 亚罂粟;大红罂粟;柱形罂粟;德凯纳罂粟;杏黄罂粟;鬼罌粟;东方罂粟;罂粟花;波斯罂粟； 伪东方罂粟;虞美人;维也纳罂粟;渥美罂粟;罂粟;tauricolum罂粟;三叶罂粟；以及卢默龙 属番木瓜。可使用如例如在S.泰特尔(Teitel)和A.布罗斯(Bross)，杂环化学杂志(Journal of Heterocyclic Chemistry)5，825_829，1968中描述的标准方法进行（S)_网状番蒸枝碱 的化学合成。
[0092]据此，或多或少纯的形式的酶可从包括但不限于罂粟、大红罂粟以及虞美人的天 然来源分离，或者它们可以重组制备或合成。因此，在此进一步提供一种用于制备选自由 CYP450和AKR或其混合物组成的组的酶的方法，该方法包括： (a) 提供一种嵌合核酸序列，该嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的以下各项： (i) 编码选自由CYP450和AKR组成的组的一种或多种多肽的一种或两种核酸序列；以及 (ii) 能够控制在宿主细胞中的表达的一种或多种核酸序列； (b) 将该嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主细胞生长以产生选自由 CYP450和AKR组成的组的该多肽;并且 (c) 从该宿主细胞中回收选自由CYP450和AKR组成的组的多肽。
[0093]该核酸序列可由含有此类序列的任何天然来源(例如，一个植物来源)获得。优选 的植物来源包括罂粟物种，包括罂粟、虞美人和大红罂粟;蓟罂粟物种，包括蓟罂粟;小檗属 物种，包括小檗黑松;紫堇属物种，包括地柏枝；白屈菜属物种，包括白屈菜;锡生藤属物种， 包括棘状锡生藤;木防己属物种，包括木防己；紫堇属物种，包括地柏枝;海罂粟属物种，包 括黄花海罂粟;北美黄连属物种，包括加拿大黄连;鲜黄莲属物种，包括二叶鲜黄莲;十大功 劳属物种，包括冬青叶十大功劳;蝙蝠葛属物种，包括蝙蝠葛；南天竹属物种，包括南天竹； 黑种草属物种，包括黑种草;血根属物种，包括血根草;金罂粟属物种、金罂粟;唐松草属物 种，包括黄唐松草；青牛胆属物种，包括心叶青牛胆；以及姜黄物种，包括黄根草。关于 CYP450，可获得自或获得自前述植物物种的核酸序列包括在SEQ. ID NO: 116至SEQ. ID N0: 218;SEQ.ID N0:324;以及SEQ.ID N0:337中列出的核酸序列。关于AKR，可获得自或获得自 前述植物物种的核酸序列包括在此处列出为SEQ.ID N0:1至SEQ.ID N0:58;SEQ.ID N0: 326 ;SEQ. ID NO: 328;以及SEQ. ID N0:339的核酸序列。在另外的优选实施例中，可使用一种 编码所阐述的CYP450与AKR之间的天然融合多肽的核酸序列，包括在此于SEQ.ID N0:322中 列出的核酸序列。
[0094] 宿主细胞的生长导致CYP450和/或AKR多肽的产生。随后可通过各种不同的蛋白质 纯化技术将这些多肽从其他宿主细胞组分中回收、离析和分离，这些蛋白质纯化技术包括 例如离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、反相色谱法、凝 胶过滤等。关于蛋白质纯化的另外的一般指导可例如在卡特勒(Cutler)P.蛋白质纯化操作 (Protein Purification Protocols)，Humana Press出版社，2004,第二版中找到。因此可 获得基本上纯的CYP450和/或AKR多肽的制剂。
[0095]据此，在允许一种酶催化的化学转化一种苄基异喹啉衍生物的反应条件下，使该 苄基异喹啉衍生物与催化量的酶CYP450和AKR中的一种或多种接触。在优选实施例中，使这 些试剂彼此接触并且混合以形成一种混合物。在优选实施例中，该混合物是一种包含水和 用于促进酶催化的另外任选的额外试剂(包括缓冲剂、盐、pH改性剂)的水性混合物。如上文 所述，特别优选的是，该反应混合物包含NADPH和一种还原酶。可以在不同温度范围下进行 该反应。在优选实施例中，在约18°C与约37°C之间的温度下进行该反应。在完成体外反应 后，可获得以或多或少纯的形式的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。 体内合成(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体
[0096] 根据本披露的某些方面，在体内反应条件下在允许一种酶催化的化学转化一种苄 基异喹啉衍生物的反应条件下，使该苄基异喹啉衍生物与催化量的酶CYP450和AKR中的一 种或多种接触。在此类体内反应条件下，以使得活细胞产生(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状 番荔枝碱前体的方式来修饰它们。在某些实施例中，这些活细胞是微生物，包括细菌细胞和 真菌细胞。在其他实施例中，这些活细胞是多细胞生物，包括植物和植物细胞培养物。
[0097] 在一个实施例中，这些活细胞被选择为不能天然产生一种苄基异喹啉衍生物 ((S)-网状番荔枝碱）、（R)_网状番荔枝碱前体或(R)-网状番荔枝碱的宿主细胞。在另一个 实施例中，这些宿主细胞能够天然产生(S)-网状番荔枝碱或苄基异喹啉衍生物但不能产生 (R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体，即，这些细胞不能天然从(S)-对映异构体进 行差向异构化反应至(R)-对映异构体。在另一个实施例中，这些细胞能够产生一种苄基异 喹啉衍生物或(S)-网状番荔枝碱和(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体，但(R)-网 状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的水平低于所希望的水平，并且相对于未修饰细胞中 的水平调节(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的水平。此类细胞包括但不限于： 细菌、酵母、其他真菌细胞、植物细胞、或动物细胞。
[0098] 为了产生(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体，在此进一步提供一种用于 制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的方法，该方法包括： (a) 提供一种嵌合核酸序列，该嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的以下各项： (i) 一种编码CYP450多肽的第一核酸序列； (ii) 一种编码AKR多肽的第二核酸序列；以及 (iii) 能够控制在宿主细胞中的表达的一种或多种核酸序列； (b) 将该嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主细胞生长以产生CYP450和 AKR，并且产生(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体;并且 (c) 回收(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。
[0099] 在优选实施例中，该第一核酸序列和该第二核酸序列被可操作地连接以便产生一 种包含CYP450和AKR的融合多肽。
[0100] 进一步提供一种用于制备(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的方法，该 方法包括： (b) 提供一种第一嵌合核酸序列，该第一嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的 一种编码CYP450多肽的第一核酸序列和一种控制该第一核酸序列在细胞中的表达的第一 核酸序列； (c) 提供一种第二嵌合核酸序列，该第二嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的 一种编码AKR多肽的第二核酸序列和一种控制该第二核酸序列在细胞中的表达的第二核酸 序列； (c) 将该第一嵌合核酸序列和该第二嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主 细胞生长以产生CYP450和AKR，并且产生(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体;并且 (d) 回收(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。
[0101 ]在优选实施例中，编码CYP450和AKR的核酸序列选自可获得自或获得自罂粟和包 含如所希望的此类化合物的植物的罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科或桑科家族的其他成员 的编码CYP450和AKR的核酸序列。适合的罂粟科成员包括，但不限于属于罂粟属；紫堇属；白 屈菜属；以及卢默龙属的物种。此类物种可以能够制备(R)_网状番荔枝碱，包括但不限于选 自以下物种的植物物种：白屈莱属;延胡索;延胡索静脉;黄紫堇;蛇果黄堇;异果黄堇;块茎 紫堇;安纳托利亚罂粟;大红罂粟;柱形罂粟;德凯纳罂粟;杏黄罂粟;鬼罌粟;东方罂粟;罂 粟花;波斯罂粟;伪东方罂粟;虞美人;维也纳罂粟;渥美罂粟;罂粟;tauricolum罂粟;三叶 罂粟；以及卢默龙属番木瓜。在特别优选的实施例中，编码CYP450和AKR的核酸序列是选自 可获得自或获得自罂粟、大红罂粟以及虞美人的编码CYP450和AKR的核酸序列的核酸序列。 在另外的优选实施例中，编码CYP450的核酸序列中的一种在此被列出为SEQ. ID N0:116至 SEQ.ID N0:218;SEQ.ID N0:324;和SEQ.ID N0:337。在优选实施例中，编码AKR的核酸序列 是在此被列出为SEQ.ID N0:1 至SEQ.IDN0:58;SEQ.ID N0:326;SEQ.ID N0:328以及SEQ.ID NO: 339的编码AKR的核酸序列中的一种。在另外的特别优选的实施例中，编码CYP450和AKR 的核酸序列是能够产生一种CYP450-AKR融合多肽的核酸序列，包括但不限于在SEQ. ID NO: 322中列出的序列。
[0102] 据此，编码CYP450和AKR的核酸序列被连接至一种能够控制CYP450和AKR在宿主细 胞中的表达的核酸序列上。因此，本披露还提供一种连接至能够控制在宿主细胞中的表达 的启动子上的编码CYP450和AKR的核酸序列。可在此使用的能够控制在宿主细胞中的表达 的核酸序列包括能够控制多肽在宿主细胞中的表达的任何转录启动子。通常，当据此选择 一种细菌宿主时，使用由细菌细胞获得的启动子，而当选择一种真菌宿主时，将使用一种真 菌启动子，当选择一种植物细胞时，将使用一种植物启动子等等。能够控制在宿主细胞中的 表达的另外的核酸元件包括转录终止子、增强子等，所有这些核酸元件可包括在本披露的 嵌合核酸序列中。本领域技术人员应该理解的是，核酸序列的可操作连接包括在转录的5' 至3 '方向上能够控制表达的启动子和序列与编码序列的连接。
[0103] 根据本披露，包含一种能够控制在宿主细胞中的表达的启动子的连接至编码 CYP450和AKR的核酸序列上的嵌合核酸序列可被整合入一种确保在宿主细胞中良好表达的 重组表达载体中。因此，本披露包括一种重组表达载体，包含作为可操作地连接部件的以下 各项： (i)一种能够控制在宿主细胞中的表达的核酸序列；以及 (i i) 一种编码CYP450的核酸序列， 其中该表达载体适合于在宿主细胞中的表达。
[0104] 本披露包括一种重组表达载体，包含作为可操作地连接部件的以下各项： (i) 一种能够控制在宿主细胞中的表达的核酸序列；以及 (ii) 一种编码AKR的核酸序列， 其中该表达载体适合于在宿主细胞中的表达。
[0105] 本披露进一步包括一种重组表达载体，包含作为可操作地连接部件的以下各项： (i) 一种能够控制在宿主细胞中的表达的核酸序列；以及 (ii) 一种编码CYP450和AKR的核酸序列， 其中该表达载体适合于在宿主细胞中的表达。术语"适合于在宿主细胞中的表达"意指 该重组表达载体包含连接至实现在宿主细胞中的表达所需的遗传元件上的本披露嵌合核 酸序列。在这点上，可包含在该表达载体中的遗传元件包括转录终止子区，编码标记基因的 一个或多个核酸序列、一个或多个复制起点等。在优选实施例中，该表达载体进一步包含在 宿主细胞的基因组中整合该载体或其一部分所需的遗传元件，例如如果使用一种植物宿主 细胞，则为有助于整合入该植物的核基因组中的T-DNA左边界序列和右边界序列。
[0106] 根据本披露，该表达载体可进一步含有一个标记基因。根据本披露可使用的标记 基因包括允许区分转化细胞与非转化细胞的所有基因，包括所有可选择和可筛选的标记基 因。标记基因可以是一种抗性标记物，诸如一种抵抗例如卡那霉素或氨比西林的抗生素抗 性标记物。S可用于通过目测来鉴定转化体的可筛选标记物包括β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS) (美国专利号5，268，463和5，599，670)和绿色荧光蛋白（GFP)(尼特斯(Niedz)等人，1995，植 物细胞(Plant Cell R印.），14:403)。
[0107] 可以特别方便地使用的一种宿主细胞是大肠杆菌。可使用诸如限制性酶切消化、 连接、凝胶电泳、DNA测序、聚合酶链式反应(PCR)以及其他方法的通常已知技术来完成大肠 杆菌载体的制备。各种克隆载体可用于进行制备一种重组表达载体所需的必要步骤。在具 有大肠杆菌中的复制系统功能的载体中的是诸如PBR322的载体、pUC系列载体、M13mp系列 载体、pBluescript等。典型地，这些克隆载体含有一种允许选择转化细胞的标记物。可将核 酸序列引入这些载体，并且可通过制备感受态细胞、电穿孔或使用本领域技术人员熟知的 其他方法来将载体引入大肠杆菌。大肠杆菌可在包括但不限于LB(Luria-B r〇th)培养基的 适当培养基中生长并且收获。重组表达载体可在细胞收获和溶解时易于从细胞回收。另外， 关于重组载体的制备和重组生物体的生长的一般指导可在例如：萨姆布鲁克等人，分子克 隆，实验手册，冷泉港实验室出版社，2001，第三版中找到。
[0108] 本披露进一步包括一种宿主细胞，其中该宿主细胞包含一种嵌合核酸序列，该嵌 合核酸序列包含作为可操作地连接部件的编码选自由CYP450和AKR组成的组的一种或两种 多肽的一种或多种核酸序列。如上文所提到的，该宿主细胞优选地是一种不能天然产生一 种苄基异喹啉衍生物（（S)-网状番荔枝碱)或(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体 的宿主细胞。在另一个实施例中，该宿主细胞能够天然产生(S)-网状番荔枝碱(一种苄基异 喹啉衍生物），但不能天然产生(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体。在另一个实施 例中，该宿主细胞能够产生一种苄基异喹啉衍生物（（S)-网状番荔枝碱)或(R)-网状番荔枝 碱或(R)-网状番荔枝碱前体，但(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的水平低于所 希望的水平，并且相对于天然的未修饰细胞中的(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前 体的水平调节(R)-网状番荔枝碱或(R)-网状番荔枝碱前体的水平。在其中细胞不能天然产 生(S)-网状番荔枝碱或一种苄基异喹啉衍生物的实施例中，可向这些细胞提供(S)-网状番 荔枝碱或该苄基异喹啉衍生物作为这些细胞的生长培养基的一部分。在其中细胞不能天然 产生(S)-网状番荔枝碱或一种苄基异喹啉衍生物的其他实施例中，可提供一种能够通过这 些细胞分别转化成(S)-网状番荔枝碱或一种苄基异喹啉衍生物的（S)-网状番荔枝碱或一 种苄基异喹啉衍生物的前体化合物。可向这些细胞提供作为细胞生长培养基的一部分的可 替代底物包括但不限于：（S)_去甲基乌药碱、（S)-N-甲基去甲基乌药碱、（S)-全去甲劳丹 碱、（S)-N-甲基全去甲劳丹碱、（S)-乌药碱、（S)-N-甲基乌药碱、（S)-3'_羟基乌药碱、（S)-3'-羟基-N-甲基乌药碱、（S)-去甲乌药碱、（S)-N-甲基去甲乌药碱、（S)-劳丹灵、（S)-去甲 网脉番荔枝碱、（S)-C〇lletine、以及(S)-东罂粟灵。据此可使用的细胞包括但不限于细菌、 酵母、或其他真菌细胞、植物细胞、动物细胞、或合成细胞。
[0109]本披露进一步包括用于将一种（S)-对映异构体差向异构化成一种(R)-对映异构 体的组合物，这些组合物包含一种酶混合物，该酶混合物包含一种能够将一种苄基异喹啉 衍生物氧化成一种氧化苄基异喹啉衍生物的第一多肽和一种能够将该氧化苄基异喹啉衍 生物还原成(R)-网状番荔枝碱前体的第二多肽，并且进一步包含一种酶混合物，该酶混合 物包含一种能够将(S)-网状番蒸枝碱氧化以形成1,2-脱氢网状番蒸枝碱的第一多肽和一 种能够将1，2_脱氢网状番荔枝碱还原以形成(R)-网状番荔枝碱的第二多肽。在优选实施例 中，该第一多肽是一种细胞色素 P450并且该第二多肽是一种AKR。
[0110] 在一些实施例中，AKR和CYP450多肽被可操作地连接以形成一种融合多肽。因此， 本披露进一步包括一种多肽，该多肽包含或由SEQ. ID N0:323组成。
[0111] 本发明进一步包括包含编码能够将一种(S)_对映异构体差向异构化成一种(R)_ 对映异构体的多肽的核酸序列的组合物。在优选实施例中，这些核酸序列是一种如下的核 酸序列:编码CYP450和AKR，能够一起将一种(S)-对映异构体差向异构化成一种(R)-对映异 构体，并且优选地能够将一种苄基异喹啉衍生物氧化成一种氧化苄基异喹啉衍生物且将该 苄基异喹啉衍生物还原成(R)-网状番荔枝碱前体，并且更优选能够将(S)-网状番荔枝碱氧 化以形成1，2_脱氢网状番荔枝碱、将1，2_脱氢网状番荔枝碱还原以形成(R)-网状番荔枝 碱。在优选实施例中，编码AKR和CYP450的核酸序列被可操作地连接以便产生一种CYP450-AKR融合多肽。因此，本披露进一步包括SEQ. ID N0:322。
[0112] 在宿主细胞中累积的(R)-网状番荔枝碱的量可改变。在本披露的其中宿主细胞天 然产生(R)-网状番荔枝碱和(S)-网状番荔枝碱(例如罂粟细胞)的实施例中，通过被制备成 包含根据本披露的嵌合核酸序列的此类细胞而在体内合成的（R)_网状番荔枝碱与（S)-网 状番荔枝碱的比率，超过存在于天然宿主细胞（即，不包含这些嵌合核酸序列的细胞)或宿 主细胞提取物中的(R)-网状番荔枝碱与（S)-网状番荔枝碱的比率。优选地，宿主细胞或宿 主细胞提取物中的（R)-网状番荔枝碱与（S)-网状番荔枝碱的比率大于21:79,例如至少 0.3:1、至少0.4:1、至少0.5:1、至少1: 1、至少2:1、至少3:1、或至少4:1。 (R)-网状番荔枝碱和(R)-网状番荔枝碱前体的使用
[0113] 根据本披露获得的（R)-网状番荔枝碱可被配制用作一种药物、治疗剂或医疗试 剂。因此本披露进一步包括一种包含根据本披露方法制备的(R)-网状番荔枝碱的药物组合 物。包含根据本披露的(R)-网状番荔枝碱的药物制剂优选地进一步包含媒介物、赋形剂、稀 释剂、以及诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等的辅助物质。这些媒介物、赋形剂和辅助物 质通常是可以被给予但没有过分毒性的药物试剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于诸 如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油以及乙醇的液体。在此还可以包括药学上可接受的 盐，例如，诸如盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐等的无机酸盐；以及诸如醋酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐等 的有机酸盐。同样优选地，尽管不是必要的，该制剂将含有一种作为稳定剂的药学上可接受 的赋形剂。也用作肽的稳定剂的适合的载体实例包括但不限于，药物级右旋糖、蔗糖、乳糖、 山梨糖醇、肌醇、右旋糖酐等。其他适合的载体包括，也不限于淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸 钙、柠檬酸、甘氨酸、聚乙二醇(PEG)及其组合。该药物组合物可以被配制用于口服和静脉内 给予以及所希望的其他给予途径。给药可改变并且可使用常规实验来优化。包含(R)-网状 番荔枝碱的药物组合物可用于治疗秃顶或肌肉紧张。
[0114] 在另外的实施例中，本披露提供用于使用一种包含根据本披露制备的(R)-网状番 荔枝碱的药物组合物来治疗患者的方法。因此，本披露进一步提供一种用于使用根据本披 露的方法制备的(R)-网状番荔枝碱来治疗患者的方法，所述方法包括向该患者给予一种包 含(R)-网状番荔枝碱的组合物，其中（R)-网状番荔枝碱以足以改善该患者医学病状的量被 给予。在优选实施例中，该医学病状选自由秃顶和肌肉张力释放组成的组。
[0115] 此外，在此提供的(R)_网状番荔枝碱可用作一种制造其他次级代谢物或医学组合 物的试剂，包括但不限于萨卢它定、可待因和吗啡，并且进一步包括蒂巴因、罂粟碱、那可 丁、可旦民碱、劳丹碱以及劳丹素(+)-深山黄堇碱、（-)-异波尔定碱、以及(-)-紫堇块茎碱。
[0116] 在此提供的(R)-网状番荔枝碱前体可用作一种制造其他次级代谢物，特别是(R)-网状番荔枝碱的试剂。如图1所示，（R)-N-甲基乌药碱可用作一种制造(R)-3'-羟基-N-甲基 乌药碱的试剂。(R)-3'_羟基-N-甲基乌药碱可用作一种制造(R)-网状番荔枝碱的试剂。 编码AKR和CYP450多肽的核苷酸序列的可替代使用
[0117] 在另一个方面中，编码AKR和/或CYP450的核酸序列可用于检测一个样品中这些基 因的存在或不存在。因此在本披露的一个实施例中，提供一种检测编码AKR和/或CYP450的 核酸序列的存在或不存在的方法，该方法包括： (a) 提供一种怀疑包含编码AKR和/或CYP450的核酸序列的样品;并且 (b) 针对编码AKR和/或CYP450的核苷酸序列的存在分析该样品。
[0118] 在一个优选实施例中，该样品包含含基因组DNA的细胞。因此在一个优选实施例 中，提供一种检测一个细胞中编码AKR和/或CYP450的核酸序列的存在或不存在的方法，该 方法包括： (a) 提供一种细胞； (b) 从该细胞提取基因组DNA;并且 (c) 针对编码AKR和/或CYP450的核酸序列的存在分析该基因组DNA。
[0119] 分析基因组DNA的方法通常是本领域已知的，并且包括，例如使用聚合酶链式反应 (PCR)和特定的多核苷酸引物以便扩增编码AKR和/或CYP450的核苷酸序列的特定部分。可 使用另外的限制性酶切消化和DNA印迹分析。该分析可进一步涉及编码AKR和/或CYP450的 核酸序列的内含子、外显子或上游区域或下游区域。该分析可进一步涉及鉴定一种包含编 码AKR和/或CYP450的核酸序列的基因组基因座，其中这种基因座与AKR和/或CYP450表达的 调节水平有关。
[0120] 在优选实施例中，该细胞是一种植物细胞。在另外的优选实施例中，该细胞是由一 种属于植物家族罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科或桑科的植物获得的植物细胞，并且更优 选地，该植物属于物种罂粟、大红罂粟或虞美人。
[0121] 在优选实施例中，为了进行前述分析而使用的CYP450和/或AKR序列在SEQ.ID N0: 116至SEQ.ID N0:218;SEQ.ID N0:324;以及SEQ.ID N0:337中列出；或在SEQ.ID N0:1 至 SEQ.ID N0:58;SEQ.IDN0:326;SEQ.ID N0:328;以及SEQ.ID N0:339中的列出的那些序列； 或在SEQ.ID N0:322中列出的序列。
[0122] 在另外的方面中，编码AKR和/或CYP450的核酸序列可用于产生一种具有调节水平 的AKR和/或CYP450表达的细胞。这样的细胞优选是一种天然表达AKR和/或CYP450的植物细 胞，并且更优选地一种由一种属于植物家族罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科或桑科的植物 获得的植物细胞，并且最优选地，该植物属于物种罂粟、大红罂粟或虞美人。因此本披露进 一步提供一种用于调节核酸序列在天然表达AKR和/或CYP450的细胞中的表达的方法，该方 法包括： (a) 提供一种天然表达AKR和/或CYP450的细胞； (b) 诱变处理该细胞； (c) 使该细胞生长以获得多个细胞;并且 (d) 确定该多个细胞是否包括一种包含调节水平的AKR和/或CYP450的细胞。
[0123] 在优选实施例中，该方法进一步包括一个如下步骤(e): (e) 选择一种包含调节水平的AKR和/或CYP450的细胞并且使这种细胞生长以获得多个 细胞。
[0124] 在另外的优选实施例中，植物种子细胞可用于进行该诱变。可使用的诱变剂是化 学试剂，包括但不限于，碱基类似物、脱氨剂、烷化剂、嵌入剂、转座子、溴、叠氮化钠、甲磺酸 乙酯(EMS)以及物理试剂，包括但不限于，诸如电离辐射和UV辐射的辐射物。因此本披露进 一步提供一种用于产生结籽植物的方法，该结籽植物包含核酸序列在天然表达AKR和/或 CYP450的细胞中的调节表达，该方法包括： (a) 提供一种天然表达AKR和/或CYP450的结籽植物； (b) 诱变该植物的种子以获得诱变的种子； (c) 使该诱变的种子生长成能够结籽下一代种子的下一代诱变植物;并且 (d) 获得这些诱变植物的下一代种子或另一个部分，并且分析这些下一代植物或下一 代种子是否表现出调节的AKR和/或CYP450表达。
[0125] 在优选实施例中，可获得植物和/或种子的多个代，并且可分析任何和所有此类代 中的植物和/或种子的部分。典型地通过比较在非诱变(野生型)植物或种子中的表达水平 (例如RNA水平或蛋白质水平)与在诱变植物或种子中的表达来进行分析。在另外的优选实 施例中，可通过分析野生型DNA与突变DNA之间的异源双链体形成来进行步骤(d)中的分析。 因此在优选实施例中，步骤(d)中的分析包括： i. 从突变植物提取DNA; ii. 扩增包含一种编码AKR和/或CYP450的核酸序列的DNA的一部分以便获得扩增的突 变 DNA; i i i .从野生型植物提取DNA; iv. 将来自野生型植物的该DNA与该扩增的突变DNA混合并且形成一种异源双链多核苷 酸； v. 将该异源双链多核苷酸与一种单链限制性内切核酸酶孵育，该单链限制性内切核酸 酶能够限制在错配的该异源双链多核苷酸的一个区域处;并且 vi .确定该异源双链体多核苷酸中的错配位点。
[0126] 在优选实施例中，所使用的编码AKR和/或CYP450的核酸序列在SEQ.IDN0:116至 SEQ.ID N0:218;SEQ.ID N0:324;以及 SEQ.ID N0:337 中列出；或在 SEQ.ID N0:1 至 SEQ.ID N0:58;SEQ.ID N0:326;SEQ.ID N0:328;以及 SEQ.ID N0:339 中的列出的那些序列；或在 SEQ.ID N0:322中列出的序列。
[0127] 在另外的方面中，编码AKR和/或CYP450的核酸序列可用于通过基因沉默产生一种 具有调节水平的AKR和/或CYP450表达的细胞。因此，本披露进一步包括一种减少AKR和/或 CYP450在细胞中的表达的方法，该方法包括： (a) 提供一种表达AKR和/或CYP450的细胞;并且 (b) 使AKR和/或CYP450在该细胞中的表达沉默。
[0128] 在优选实施例中，该细胞是一种植物细胞。优选地，该植物是一个属于植物家族罂 粟科、樟科、番荔枝科、大戟科或桑科的成员，并且更优选地，该植物属于物种罂粟、大红罂 粟或虞美人。所使用的一种使AKR和/或CYP450沉默的优选方法是病毒诱导性基因沉默(本 领域已知为VIGS)。通常，在感染未修饰病毒的植物中，该病毒基因组被靶向。然而，当病毒 载体已被修饰成携带来源于宿主基因的插入(例如，编码AKR和/或CYP45的序列的部分)时， 该方法另外地靶向对应的mRNA。因此，本披露进一步包括一种产生表达降低水平的AKR和/ 或CYP450的植物的方法，该方法包括： (a) 提供一种表达AKR和/或CYP450的植物;并且 (b) 使用病毒诱导性基因沉默降低AKR和/或CYP450在该植物中的表达。
[0129] 在实例5中进一步详述本披露的此方面。
[0130] 上文所提到的调节AKR和/或CYP450表达水平的方法可能导致调节植物中的植物 碱的水平，这些植物碱包括但不限于：吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁、（S)-网状番荔 枝碱、（R)_网状番荔枝碱、可旦民碱、劳丹碱以及劳丹素。这些方法可进一步导致调节(S)-网状番荔枝碱、（R)-网状番荔枝碱的比率。优选地这种调节导致植物细胞或植物细胞提取 物中的(R)-网状番荔枝碱与（S)-网状番荔枝碱的比率小于21:79、更优选小于0.1、更优选 小于0.05、更优选小于0.025并且更优选小于0.01。在实例5中示出这种调节。因此本披露包 括使用这些方法以便在能够天然产生植物碱的植物中调节植物碱的水平。优选地，此类植 物属于植物家族罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科或桑科，并且更优选地，该植物属于物种罂 粟、大红罂粟或虞美人。
[0131] 在本披露的又另外的方面中，编码AKR和/或CYP450的核酸序列可用于基因型植 物。优选地，该植物是一个属于植物家族罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科或桑科的成员，并 且更优选地，该植物属于物种罂粟、大红罂粟或虞美人。通常，基因分型提供一种区别染色 体对同系物的手段并且可用于鉴定植物群体的后续代中的分离子。分子标记方法可用于系 统发生研究、表征植物品种之间的遗传关系、鉴定杂交或体细胞杂种、定位影响单基因性状 的染色体片段、基于作图的克隆以及数量遗传的研究。参见，例如，植物分子生物学(Plant Molecular Biology):实验手册，第7章，克拉克（Clark)编辑，柏林施普林格（5口1'；[叫61·-Verlag，Berlin)(1997)。对于分子标记方法，通常参见，通过在以下中的安德鲁(Andrew)H. 帕特森(Paterson) 1996(第2章）的DNA改革:基因组作图植物(安德鲁Η·帕特森编著)通过德 克萨斯州奥斯汀市（Austin，Tex.)的学术出版社（Academic Press )/R. G.兰迪斯公司 (Landis Company)，第7-21页。根据本披露的基因分型的具体方法可涉及采用任何分子标 记分析技术，包括但不限于限制性片段长度多态性(RFLPhRFLP反映由核苷酸序列变异性 导致的DNA限制性片段之间的等位基因差异。如本领域的技术人员已知的，RFLP典型地通过 植物基因组DNA的提取和用一种或多种限制性内切酶消化基因组DNA来检测。典型地，根据 大小将所得片段分离并且用一种核酸探针杂交。揭示来自同源染色体的限制性片段。等位 基因中的片段大小的差异表示RFLP。因此，本披露进一步提供一种遵循分离一部分或编码 AKR和/或CYP450的基因组DNA，以及使用此类技术作为RFLP分析来遗传连接至这些AKR和/ 或CYP450编码核酸序列上的染色体核酸序列的手段。连接的染色体核酸序列在一个编码 AKR和/或CYP450的基因组核酸序列的50厘摩(cM)内，经常在40或30cM内、优选在20或10cM 内、更优选在5、3、2、或lcM内。因此，根据本披露，本披露的AKR和/或CYP450编码序列可用作 标记物评估植物群体中遗传连接至其上的核酸序列的分离。优选地，该植物群体包括或由 属于植物家族罂粟科、樟科、番荔枝科、大戟科或桑科的植物组成，并且更优选地，该植物群 体包括或由属于物种罂粟、大红罂粟或虞美人的植物组成。
[0132] 根据本披露，用于分子标记作图植物核基因组的核酸探针在选择性杂交条件下选 择性杂交至一种编码AKR和/或CYP450的基因组序列。在优选实施例中，这些探针选自由本 披露提供的编码AKR和/或CYP450的核酸序列。典型地，这些探针是cDNA探针。典型地这些探 针是至少15个碱基长度、更优选至少20、25、30、35、40、或50个碱基长度。然而，通常，这些探 针小于约1千碱基长度。优选地，这些探针是杂交单倍体植物染色体补体中的独特基因座的 单拷贝探针。用于RFLP作图的一些示例性限制性内切酶是EcoRI、EcoRv、和SstI。如在此使 用的术语"限制性内切酶"包括提及一种单独或与另一种组合物结合来识别并且裂解一个 特定核苷酸序列处的多核苷酸的组合物。
[0133] 区别本披露核酸序列的多态(等位基因）变体的其他方法可以通过利用本领域技 术人员熟知的分子标记技术来使用，这些分子标记技术包括但不限于：1)单链构象分析 (SSCP); 2)变性梯度凝胶电泳（DGGE) ; 3)RNA酶保护测定；4)等位基因特异性寡核苷酸 (AS0);5)识别核苷酸错配的蛋白质(诸如大肠杆菌mutS蛋白）的使用；以及6)等位基因特异 性PCR。基于检测两个互补DNA链之间的错配的其他方法包括但不限于，夹固的变性凝胶电 泳(CDGE);异源双链分析(HA)以及化学错配裂解法(CMC)。因此，本披露进一步提供一种基 因分型的方法，该方法包括以下步骤：在严格的杂交条件下，使一种怀疑包含编码AKR和 CYP450的核酸的样品与一种能够杂交至其上的核酸探针接触。通常，该样品是一种植物样 品;优选地，一种怀疑包含编码AKR和/或CYP450的罂粟核酸序列(例如，基因、mRNA)的样品。 该核酸探针在严格条件下选择性地杂交至包含一种多态性标记物的编码AKR和/或CYP450 的核酸序列的子序列。该核酸探针至该多态性标记物核酸序列的选择性杂交产生一种杂交 复合物。该杂交复合物的检测指示了该多态性标记物在该样品中的存在。在优选实施例中， 该核酸探针包含一种编码AKR和/或CYP450的核酸序列的一部分。 实例
[0134] 以下提供用于进行本披露方法的具体实施例、以及表示本披露组合物的实施例的 实例。这些实例仅出于说明性目的提供，而非旨在以任何方式限制本披露的范围。 实例1-(S)_网状番荔枝碱至(R)-网状番荔枝碱的转化
[0135] 此实例示出使用一种酶混合物的（S)-网状番荔枝碱至(R)-网状番荔枝碱的体外 转化，该酶混合物呈一种包含CYP450和AKR部分的罂粟的融合多肽（SEQ. ID:N0 323)的形 式。
[0136] 使具有pESC-leu2d: :PsCPR/PsREPI的酿酒酵母菌株YPH499生长并且如下所述进 行微粒体纯化。简言之，将该酵母菌株在使用2%葡萄糖增补的缺乏亮氨酸的合成完全(SC) 培养基中在30°C和250rpm下生长16小时。将一毫升培养物添加到50mL使用1.8%半乳糖、 0.2%葡萄糖和1 %棉子糖增补的缺乏亮氨酸的SC培养基中，并且在30 °C和250rpm下生长72 小时。然后将培养物在4,000g下离心5分钟并且用5mL TEK缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8， ImM EDTA，100mM KC1)进行洗涤。使沉淀在lmL TESB缓冲液（50mM Tris-HCl pH 8，lmM EDTA，0.6M山梨糖醇）中再悬浮并且添加相等体积的0.5mm玻璃珠。在10 °C下手动地摇动试 管4分钟。用TESB洗涤这些珠子，并且收集洗涤液且在14,000g下离心10min。将上清液在 125,000g下超速离心1小时并且废弃该上清液。然后使微粒体在pH 7.5的50mM HEPES中再 悬浮。
[0137] 酶测定物含有500μΜ NADPH和50μΜ的在HEPES缓冲液(pH7.5)中的（S)-网状番荔枝 碱以及如上所述制备的微粒体。将测定物在30°C下孵育过夜。在该反应后，将测定样品以 0.2ml/min的流速在安捷伦（4 8丨1611〇1260!11^(：上运行，并且使用〇^纤维素-1手性柱 (150mmX 2.1mm内径;Phenomenex)、使用增补有0.1 %二乙胺的75%碳酸氢铵(溶剂A)和具 有0.1%二乙胺的25%乙腈(溶剂B)来分离化合物。在284nm波长处监测(R)-网状番荔枝碱 和(S)-网状番荔枝碱。
[0138] 结果在图3中示出。如在图3中可以看出，在该手性柱上的可信标准对照(R)-网状 番荔枝碱和(S)-网状番荔枝碱的保留时间分别是大约13.5分钟(顶图）；和15分钟（从顶部 的第二个图）。底图示出其中没有酶存在于混合物中的测定的结果，并且证实在些反应条件 下没有(S)-网状番荔枝碱被差向异构化成(R)-网状番荔枝碱。从顶部的第三个图示出，在 该酶混合物的存在下，（S)-网状番荔枝碱被差向异构化成(R)-网状番荔枝碱(参见箭头，以 及在大约15min的保留时间处的峰的外观）。 实例2-(S)_网状番荔枝碱至1，2_脱氢网状番荔枝碱的转化
[0139] 此实例示出使用虞美人的CYP450(SEQ.ID:N0 325)，在酵母中的（S)-网状番荔枝 碱至1，2_脱氢网状番荔枝碱的体外转化。使具有pESC-leu2d: :PsCPR/PrDRS的酿酒酵母菌 株YPH499生长并且如下所述进行微粒体纯化。简言之，将该酵母菌株在使用2%葡萄糖增补 的缺乏亮氨酸的合成完全(SC)培养基中在30 °C和250rpm下生长16小时。将一毫升此培养物 添加到50mL使用1.8%半乳糖、0.2%葡萄糖和1%棉子糖增补的缺乏亮氨酸的SC培养基中， 在30°C和250rpm下生长72小时。然后将培养物在4,000g下离心5分钟并且用5mL TEK缓冲液 (50mMTris-HCl pH 8，lmM EDTA，100mM KC1)进行洗涤。然后使沉淀在lmLTESB缓冲液（50mM Tris-HCl pH 8，lmM EDTA，0.6M山梨糖醇）中再悬浮并且添加相等体积的0.5mm玻璃珠。在 10°C下手动地摇动试管4min。用TESB洗涤这些珠子，并且收集洗涤液且在14,000g下离心 lOmin。然后将上清液在125,000g下超速离心1小时并且废弃该上清液。然后使微粒体在pH 7.5的50mM HEPES中再悬浮。
[0140] 酶测定物含有500μΜ NADPH和50μΜ的在HEPES缓冲液(pH7.5)中的（S)-网状番荔枝 碱以及如上所述制备的微粒体。将测定物在30°C下孵育过夜。在该反应后，将测定样品在结 合6400B质谱仪的安捷伦1260HLPC上运行，该质谱仪具有以阳性模式操作的一个电喷雾离 子源。该质谱仪从200-400m/z进行扫描。对于先前描述的酶测定物使用HLPC方法来分离化 合物（法罗（Farrow)SC和法基尼卬 &(^1^1^)?1，（2013)，生物化学杂志（1.8丨〇1.(：116111.) (288)第28,997-29,012页;双加氧酶催化在罂粟中的苄基异喹啉生物碱新陈代谢中具有广 泛作用的0-脱甲基作用和0，0-脱甲基作用）。
[0141] 结果在图4中示出。如在图4(顶图）中可以看出，在一个不包含该酶的对照样品中 的HPLC柱上观察到一个具有大约3.1分钟的保留时间的峰。此峰对应于针对(S)-网状番荔 枝碱的碰撞诱导解离谱在m/z 330处的最大片段的3.13分钟的预测保留时间（参见:表1)。 从顶部的第二个图示出，在相同对照样品的m/z 328处没有观察到峰，因此表明1，2_脱氢网 状番荔枝碱不存在于该对照样品中。从顶部的第三个图示出，在包含该酶的样品的m/z 330 处、在大约3.1分钟的保留时间处观察到一个峰，因此表明（S)_网状番荔枝碱存在于该测定 样品中。底图示出，在测定样品的m/z 328处观察到一个具有大约3.0的保留时间的峰。此峰 对应于针对1，2-脱氢网状番荔枝碱的碰撞诱导解离谱在m/z 328处的最大片段的3.02分钟 的预测保留时间（参见:表1)，表明了 1，2_脱氢网状番荔枝碱在该酶的存在下存在于该测定 样品中。 实例3-1，2_脱氢网状番荔枝碱至(R)-网状番荔枝碱的转化
[0142] 此实例示出使用虞美人的AKR(SEQ.ID:N0 327)，在酵母中的1，2_脱氢网状番荔枝 碱至(R)-网状番荔枝碱的体外转化。
[0143] 将增补有具有pET47b: :PrDRR的大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)的50yg/mL硫酸卡那 霉素和35yg/mL氯霉素培养物的16小时、50mL LB添加到1L相同培养基中，并且在37°C、 180rpm下生长直到0D600为0.6。然后添加 IPTG至ImM的最终浓度，并且允许在25°C、180rpm 下生长4h，并且通过离心收集细胞沉淀。使用一种弗氏压碎器将细胞溶解于增补有2mM苯甲 基磺酰氟(PMSF)的缓冲液A(100mM磷酸钠缓冲液pH 7.0,300mM NaCl，10% (v/v)甘油）中。 通过在14,000g下离心15分钟来去除细胞碎片。将总可溶性蛋白质提取物与缓冲液A平衡的 TALON(Clonetech)树脂在4°C、65rpm下合并45分钟。使用缓冲液A将该树脂洗涤两次，并且 使用缓冲液A中的咪唑梯度(2.5、10、100、200mM)逐步洗脱蛋白质。将纯化的蛋白质在1 OOmM 咪唑中洗脱。
[0144] 酶测定物含有500μΜ NADPH、50yM的在磷酸钠缓冲液(pH7.0)中的1，2_脱氢网状番 荔枝碱以及如上所述制备的蛋白质。将测定物在30 °C下过夜。在该反应后，将测定样品在结 合6400B质谱仪的安捷伦1260HLPC上运行，该质谱仪具有以阳性模式操作的一个电喷雾离 子源。该质谱仪从200-400m/z进行扫描。对于先前描述的酶测定物使用HLPC方法来分离化 合物(法罗SC和法基尼PJ，（2013)，生物化学杂志（288)第28,997-29,012页；双加氧酶催化 在罂粟中的苄基异喹啉生物碱新陈代谢中具有广泛作用的0-脱甲基作用和〇,〇-脱甲基作 用)。
[0145] 结果在图5中示出。如在图5(顶图）中可以看出，在一个不包含该酶的对照样品中 的HPLC柱上观察到一个具有大约3.0分钟的保留时间的峰。此峰对应于针对1，2_脱氢网状 番荔枝碱的碰撞诱导解离谱在m/z328处的最大片段的3.02分钟的预测保留时间（参见:表 1)。从顶部的第二个图示出，在大约3.1分钟的保留时间处没有观察到峰，因此(R)-网状番 荔枝碱不存在于该样品中。在相同对照样品中在大约3.0分钟处观察到一个小峰。此峰表示 底物1，2_脱氢网状番荔枝碱的一个同位素形式。从顶部的第三个图示出，在含有该酶的样 品的m/z 328处观察到一个具有大约3.0分钟的保留时间的峰，因此表明少量未耗尽的1，2_ 脱氢网状番荔枝碱存在于该测定样品中。底图示出，在测定样品的m/z 330处观察到一个具 有大约3.1的保留时间的峰。此峰对应于针对(R)-网状番荔枝碱的碰撞诱导解离谱在m/z 330处的最大片段的3.13分钟的预测保留时间（参见:表1)，表明了（R)_网状番荔枝碱在该 酶的存在下存在于该测定样品中。 实例4-(S)-N-甲基乌药碱至(R)-N-甲基乌药碱的转化
[0146] 此实例示出使用一种酶混合物，在酵母中的（S)-N-甲基乌药碱至(R)-N-甲基乌药 碱的体外转化，该酶混合物呈一种包含CYP450和AKR部分组成的罂粟的融合多肽(SEQ.ID: N0 2)的形式。
[0147] 使具有pESC-leu2d: :PsCPR/PsREPI的酿酒酵母菌株YPH499生长并且如下所述进 行微粒体纯化。简言之，将该酵母菌株在使用2%葡萄糖增补的缺乏亮氨酸的合成完全(SC) 培养基中在30°C和250rpm下生长16小时。将一毫升培养物添加到50mL使用1.8%半乳糖、 0.2%葡萄糖和1 %棉子糖增补的缺乏亮氨酸的SC培养基中，并且在30 °C和250rpm下生长72 小时。然后将培养物在4,000g下离心5分钟并且用5mL TEK缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8， ImM EDTA，100mM KC1)进行洗涤。使沉淀在lmL TESB缓冲液（50mM Tris-HCl pH 8，lmM EDTA，0.6M山梨糖醇）中再悬浮并且添加相等体积的0.5mm玻璃珠。在10 °C下手动地摇动试 管4分钟。用TESB洗涤这些珠子，并且收集洗涤液且在14,000g下离心10min。将上清液在 125,000g下超速离心1小时并且废弃该上清液。然后使微粒体在pH 7.5的50mM HEPES中再 悬浮。
[0148] 酶测定物含有500μΜ NADPH和50μΜ的在HEPES缓冲液(pH7.5)中的（S)-N-甲基乌药 碱以及如上所述制备的微粒体。将测定物在30°C下孵育过夜。在该反应后，将测定样品以 0.2ml/min的流速在安捷伦1260HLPC上运行，并且使用LUX纤维素-1手性柱（150_ X 2.1_ 内径;Phenomenex)、使用增补有0.1 %二乙胺的75%碳酸氢铵(溶剂A)和具有0.1 %二乙胺 的25%乙腈(溶剂B)来分离化合物。在230nm波长处监测(R)-N-甲基乌药碱和(S)-N-甲基乌 药碱。
[0149] 结果在图6中示出。如在图6中可以看出，在该手性柱上的可信标准对照（S)-N-甲 基乌药碱的保留时间是大约13.9分钟(顶图）。底图示出其中没有酶存在于混合物中的测定 的结果，并且证实在些反应条件下没有(S)-N-甲基乌药碱被差向异构化成(R)-N-甲基乌药 碱。中间图示出，在酶混合物的存在下，（S)-N-甲基乌药碱被差向异构化成(R)-N-甲基乌药 碱。（参见箭头，以及在大约16.3min的保留时间处的峰的外观） 实例5 - AKR和AKR-CYP450融合基因的基因沉默
[0150] 此实例示出使用病毒诱导性基因沉默(VIGS)来使编码AKR和/或CYP450的基因沉 默。
[0151] 使用烟草脆裂病毒(TRV)载体系统来抑制来自罂粟(罂粟)的REPI和/或C0R1.3(编 码可待因酮还原酶)在罂粟(罂粟）的Bea的选择化学型中的转录物水平(分别由SEQ.ID.N0: 322和SEQ.IDN0:328转录）。使用以下引物对来扩增REPIcDNA的两个区域(REPI-a(图7A ; 图A)和REPI-5'（图7C;图A))以及C0R1.3cDNA的一个区域（图7B;图A):
[0152] REPI-a区域和C0R1.3区域表现相当大的相似性，在每种情况下导致REPI和C0R1.3 的相互共沉默。相比之下，REPI-5'区域是独特的并且仅导致REPI而没有C0R1.3的沉默。
[0153] 如前所述地将扩增子单独地克隆到pTRV2中，并且将载体转移在根瘤土壤杆菌中。 用一种具有PTRV1的根瘤土壤杆菌与含有基因特异性片段的构建pTRV2的1:1混合物来浸润 两至三周龄的幼苗的顶端分生组织。空PTRV2被用作阴性对照，并且编码八氢番茄红素去饱 和酶的PTRV2-PDS构建体被用作阳性浸润对照。将浸润的植物在温室中培养8-10周。如前所 述地进行用根瘤土壤杆菌的浸润、和针对生物碱的乳胶、茎和根样品的收集与处理、以及转 录物分析。典型地，用具有PTRV1的根瘤土壤杆菌和一种pTRV2构建体来浸润20-30个植物。 在大约70 %-80 %的浸润植物中，通过RT-PCR检测出该pTRV2构建体的一个移动片段（图7A (图B);图7B(图B);图7C，图B)，这说明这些植物成功地被感染。使用甲醇从冻干乳胶提取生 物碱。通过qRT-PCR来确定相对转录物丰度（图7A(图C);图7B(图C);图7C，图C)。从6个单独 浸润的植物得出生物碱含量和相对转录物丰度的数据，并且在每个样品上进行三个技术复 制。通过LC-MS/MS分析浸润植物的乳胶样品。使用总离子色谱图（图7A(图D);图7B(图D);图 7C，图D)并且通过确定9种不同生物碱(吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁、可旦民碱、劳 丹碱和劳丹素)在乳胶和根中的相对丰度(图7A(图E);图7B(图E);图7C，图E)来评估对于用 具有pTRVl的根瘤土壤杆菌和分离pTRV2构建体中REPI或C0R1.3两个区域中的每个浸润的 罂粟植物生物碱含量的影响。除了吗啡含量更低之外，REPI或C0R1.3的沉默导致可待因和 蒂巴因水平的显著降低。REP I (即，AKR-CYP450基因）的沉默以及⑶R1.3 (即，AKR基因）的沉 默导致网状番荔枝碱、可旦民碱、劳丹碱、劳丹素累积的显著增加，并且罂粟碱和那可丁一 致地更少。对照(PTRV2)植物的乳胶中的(R)-网状番荔枝碱与（S)-网状番荔枝碱的比率是 大约21:79，但是pTRV2-REPI-a植物（图7A(图F)和pTRV2-C0Rl. 3植物（图7B(图F))的乳胶中 的（R)-网状番荔枝碱与（S)-网状番荔枝碱的比率降低至大约2:98;并且在乳胶和根中在 PTRV2-REPI-5 '植物的乳胶中降低至大约5:95 (图7C，图F)。 实例6-AKR在NADPH/NADH和NADP+/NAD+存在下的催化活性
[0154] 此实例示出在还原剂NADH或NADPH的存在下，由AKR多肽将1，2_脱氢网状番荔枝碱 转化成(R)_网状番荔枝碱。此实例进一步示出前述反应在氧化剂NAD+或NADP+存在下的可逆 性。
[0155] 基本上如以上实例3所述地进行实验，除了使用从罂粟和虞美人获得的AKR进行这 些反应，以及在相反的反应中，将(R)-网状番荔枝碱提供为底物，并且将NAD+或NADP+用作氧 化剂以进行酶促反应。在PH9下进行最后提到的反应。如图8所示，在NADH和NADPH两者的存 在下，使用催化量的来自罂粟(PsDRR)(图8A，图A)和虞美人(PrDRR)(图8B，图A)两者的AKR 多肽将1，2_脱氢网状番荔枝碱转化成(R)-网状番荔枝碱。如图8进一步所示，使用罂粟AKR 多肽PsDRR(图8A，图B)和虞美人多肽PrDRR(图8B，图B)两者，该反应可以被逆转，并且在NAD +或NADP+存在下，（R)_网状番荔枝碱被转化成1，2_脱氢网状番荔枝碱。 实例7-AKR活性的pH依赖性
[0156] 此实例示出AKR多肽在还原剂和氧化剂两者存在下的pH依赖性。
[0157] 检查罂粟和虞美人CYP450和AKR多肽两者的pH依赖性。基本上如实例3和实例6所 述地进行酶促反应，除了将每个反应中的pH从pH 3.5逐步增加至pH 10。通过在结合6400B 质谱仪的安捷伦1260HLPC上分析样品来定量每个评估pH下的酶活性，该质谱仪具有以阳性 模式操作的一个电喷雾离子源。该质谱仪从200-400m/z进行扫描。对于先前描述的酶测定 物使用HLPC方法来分离化合物(法罗SC和法基尼PJ，（2013)，生物化学杂志(288)第28,997-29,012页;双加氧酶催化在罂粟中的苄基异喹啉生物碱新陈代谢中具有广泛作用的0-脱甲 基作用和〇,〇_脱甲基作用）。
[0158] 在图9中提供这些结果。在图A中示出的是示出使用罂粟CYP450(PsDRS)和AKR在 NADPH(PsDRS正向）存在下并且在NADP+(PsDRS反向）存在下作为pH函数的酶促活性的图。在 图B中示出的是示出使用虞美人CYP450(PsDRS)和AKR在NADPH(PrDRS正向）存在下并且在 NADP+(PrDRS正向）存在下作为pH函数的酶促活性的图。如在图9中可看到的，PsDRS和PrDRS 在大约pH 8的最佳条件下将(S)_网状番荔枝碱转化成1，2-脱氢网状番荔枝碱。在NADPH的 存在下，PsDRR和PrDRR在大约pH 7的最佳条件下将1，2_脱氢网状番荔枝碱转化成(R)-网状 番荔枝碱。在NADP+的存在下，PsDRR和PrDRR在大约pH 9的最佳条件下将(R)-网状番荔枝碱 转化成1，2-脱氢网状番荔枝碱。 实例8-AKR和AKR-CYP450融合基因的基因沉默
[0159] 此实例进一步示出使用病毒诱导性基因沉默(VIGS)来使编码AKR和/或CYP450的 基因沉默。
[0160] 基本上如实例5所述地进行基因沉默实验，除了使用以下构建体来靶向COR(AKR) 和REPI(CYP450)基因：REPIa、REPIb和⑶R.^AEPIa表示一种靶向保存在COR基因和REPI 基因两者中的序列的构建体。相比之下，REPIb靶向REPI独有的区域。C0R 1.3靶向C0R独有 的区域。如实例5所述地确定REPI和C0R的转录物水平。将一个空载体用作对照(PTRV2)。如 在图10中可看到的，其中REPI通过REPIb独特靶向的植物相对于对照表现出降低水平的 REPI转录物（图10-顶图），而C0R转录物水平基本上保持相同（图10-底图）。其中REPI和C0R 两者均通过REPIa靶向的植物表现出降低转录物水平的REPI (图10-顶图）和C0R(图10-底 图）。当使用⑶R1.3靶向C0R时，C0R转录物水平减小（图10-底图）。此外，通过C0R1.3响应于 C0R转录物水平的沉默，REPI转录物水平相对于对照也降低（图10-顶图）。
【主权项】
1. 一种制备(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体的方法，该方法包括： (a) 提供一种苄基异哇嘟衍生物； (b) 使该苄基异哇嘟衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异 哇嘟衍生物转化成(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体的条件下将该苄基异哇嘟 衍生物转化成(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体。2. -种制备(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体的方法，该方法包括： (a) 提供一种苄基异哇嘟衍生物； (b) 使该苄基异哇嘟衍生物与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将该苄基异 哇嘟衍生物转化成(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体的条件下将该苄基异哇嘟 衍生物转化成(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体； 其中该苄基异哇嘟衍生物具有化学式：其中化、R2、R3W及R4各自表示氨原子、径基基团或甲氧基基团； 并且其中化表示氨原子或甲基基团；并且 其中该(R)-网状番慕枝碱前体具有化学式：其中化、R2、R3W及R4各自表示氨原子、径基基团或甲氧基基团； 并且其中Rs表示氨原子或甲基基团，其条件是(R)-网状番慕枝碱被排除在该化学式之 外。3. 根据权利要求2所述的方法，其中该苄基异哇嘟衍生物选自下组，该组由W下各项组 成：（S)-N-甲基乌药碱、（S)-3'-径基-N-甲基乌药碱和(S)-网状番慕枝碱，并且其中该(R)- 网状番慕枝碱前体选自（R)-N-甲基乌药碱、(R)-3'-径基-N-甲基乌药碱。4. 根据权利要求2所述的方法，其中该酶混合物包含一种能够将该苄基异哇嘟前体氧 化W形成氧化苄基异哇嘟前体的第一多肤和一种能够将该氧化苄基异哇嘟前体还原W形 成(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体的第二多肤，其中该氧化苄基异哇嘟前体具 有化学式：其中化、R2、R3W及R4各自表示氨原子、径基或甲氧基基团； 并且其中化表示氨原子或甲基基团。5. 根据权利要求4所述的方法，其中能够将该苄基异哇嘟前体氧化成该氧化苄基异哇 嘟前体的该第一多肤是一种细胞色素 P450,并且能够将该苄基异哇嘟前体还原W形成(R)- 网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体的该第二多肤是一种醒-酬还原酶。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其中该第一多肤是一种选自下组的多肤，该组由W 下各项组成:N0:219至SEQ.ID N0:321;SEQ.ID N0:325;W及沈Q.ID N0:338,并且其中该第 二多肤是一种选自下组的多肤，该组由W下各项组成：SEQ.ID N0:59至SEQ.ID N0:115; 沈Q.ID N0:327;SEQ.ID N0:329;SEQ.ID NO:33〇W及沈Q.ID N0:340。7. 根据权利要求4或5所述的方法，其中该第一多肤和该第二多肤是一种融合多肤。8. 根据权利要求7所述的方法，其中该融合多肤是在SEQ. ID NO: 323中列出的该多肤。9. 根据权利要求1-8所述的方法，其中该方法在体内或体外进行。10. 根据权利要求5-9所述的方法，其中该细胞色素 P450和该醒-酬还原酶可获得自W 下植物家族的组中的一个成员，该组由W下各项组成:磐粟科、精科、番慕枝科、大戟科W及 桑科。11. 根据权利要求10所述的方法，其中植物家族的该成员选自W下植物物种的组，该组 由W下各项组成:磐粟、大红磐粟W及虞美人。12. -种用于制备(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体的方法，该方法包括： (a) 提供一种嵌合核酸序列，该嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的W下各项： (i) 一种编码CYP450多肤的第一核酸序列； (ii) 一种编码AKR多肤的第二核酸序列；W及 (iii) 能够控制在宿主细胞中的表达的一种或多种核酸序列； (b) 将该嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主细胞生长W产生CYP450和 AKR，并且产生(R)-网状番慕枝碱或该(R)-网状番慕枝碱前体;并且 (C)回收(R)-网状番慕枝碱或该(R)-网状番慕枝碱前体。13. 根据权利要求12所述的方法，其中该(R)-网状番慕枝碱前体具有化学式：其中化、R2、R3W及R4各自表示氨原子、径基基团或甲氧基基团； 并且其中Rs表示氨原子或甲基基团，其条件是(R)-网状番慕枝碱被排除在该化学式之 外。14. 根据权利要求12或13所述的方法，其中该第一核酸序列和该第二核酸序列被可操 作地连接W便产生一种包含CYP450和AKR的融合多肤。15. 根据权利要求12-14所述的方法，其中编码CYP450的该核酸序列选自下组，该组由 W下各项组成：SEQ.ID N0:116至沈Q.ID N0:218;SEQ.ID N0:324;W及沈Q.ID N0:337,并 且其中编码AKR的该核酸序列选自下组，该组由W下各项组成：SEQ. ID NO: 1至SEQ. ID NO: 58;沈Q.ID N0:326;SEQ.ID N0:328;W及沈Q.ID N0:339。16. 根据权利要求12-14所述的方法，其中该CYP450和该AKR可获得自W下植物家族的 组中的一个成员，该组由W下各项组成:磐粟科、精科、番慕枝科、大戟科W及桑科。17. 根据权利要求16所述的方法，其中植物家族的该成员选自W下植物物种的组，该组 由W下各项组成:磐粟、大红磐粟W及虞美人。18. -种用于制备(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体的方法，该方法包括： (a) 提供一种第一嵌合核酸序列，该第一嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的 一种编码CYP450多肤的第一核酸序列和一种控制该第一核酸序列在细胞中的表达的第一 核酸序列； (b) 提供一种第二嵌合核酸序列，该第二嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的 一种编码AKR多肤的第二核酸序列和一种控制该第二核酸序列在细胞中的表达的第二核酸 序列； (C)将该第一嵌合核酸序列和该第二嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主 细胞生长W产生CYP450和AKR，并且产生(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体;并且 (d)回收(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体。19. 根据权利要求18所述的方法，其中该(R)-网状番慕枝碱前体具有化学式：其中化、R2、R3W及R4各自表示氨原子、径基基团或甲氧基基团； 并且其中Rs表示氨原子或甲基基团，其条件是(R)-网状番慕枝碱被排除在该化学式之 外。20. 根据权利要求19所述的方法，其中编码CYP450的该核酸序列选自下组，该组由W下 各项组成：SEQ.ID NO:116至沈Q.ID NO:218;SEQ.ID NO:324W及沈Q.ID NO:337,并且其中 编码AKR的该核酸序列选自下组，该组由W下各项组成：SEQ.ID NO:l至SEQ.ID NO:58; 沈Q. ID NO:326;SEQ. ID NO:328及沈Q. ID NO: 339。21. 根据权利要求18或19所述的方法，其中该CYP450和该AKR可获得自W下植物家族的 组中的一个成员，该组由W下各项组成:磐粟科、精科、番慕枝科、大戟科W及桑科。22. 根据权利要求21所述的方法，其中植物家族的该成员选自W下植物物种的组，该组 由W下各项组成:磐粟、大红磐粟W及虞美人。23. -种用于制备(R)-网状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体的组合物，该组合物包 含一种酶混合物，该酶混合物包含一种能够将一种苄基异哇嘟衍生物氧化W形成一种氧化 苄基异哇嘟衍生物的第一多肤和一种能够将该氧化苄基异哇嘟衍生物还原W形成(R)-网 状番慕枝碱或(R)-网状番慕枝碱前体的第二多肤； 其中该苄基异哇嘟类生物碱衍生物具有化学式其中化、R2、R3W及R4各自表示氨原子、径基基团或甲氧基基团； 并且其中化表示氨原子或甲基基团；并且 其中该(R)-网状番慕枝碱前体具有化学式：其中化、R2、R3W及R4各自表示氨原子、径基基团或甲氧基基团； 并且其中Rs表示氨原子或甲基基团，其条件是(R)-网状番慕枝碱被排除在该化学式之 外。24. 根据权利要求23所述的组合物，其中该第一多肤是一种细胞色素 P450并且该第二 多肤是一种醒-酬还原酶。25. 根据权利要求23或24所述的组合物，其中该第一多肤是一种选自下组的多肤，该组 由W下各项组成:N0:219至沈Q.ID N0:321;SEQ.ID N0:325;W及沈Q.ID N0:338,并且其中 该第二多肤是一种选自下组的多肤，该组由W下各项组成：SEQ.ID N0:59至SEQ.ID NO: 115;沈Q.ID N0:327;SEQ.ID N0:329;SEQ.ID NO:33〇W及沈Q.ID.N0:340。26. 根据权利要求23-25所述的组合物，其中该第一多肤和该第二多肤是一种融合多 肤。27. 根据权利要求23至24或权利要求26所述的组合物，其中该细胞色素 P450和该醒-酬 还原酶可获得自W下植物家族的组中的一个成员，该组由W下各项组成:磐粟科、精科、番 慕枝科、大戟科W及桑科。28. 根据权利要求27所述的组合物，其中植物家族的该成员选自W下植物物种的组，该 组由W下各项组成:磐粟、大红磐粟W及虞美人。29. -种重组表达载体，包含作为可操作地连接部件的W下各项： (i)一种能够控制在宿主细胞中的表达的核酸序列；W及 (i i) 一种编码CYP450的核酸序列， 其中该表达载体适合于在宿主细胞中的表达。30. 根据权利要求29所述的重组表达载体，其中编码CYP450的该核酸序列是一种选自 下组的核酸序列，该组由W下各项组成：SEQ.ID N0:116至SEQ.ID N0:218;SEQ.ID N0:324; W及沈Q. ID NO: 337。31. 根据权利要求29所述的重组表达载体，其中该CYP450可获得自磐粟科、精科、番慕 枝科、大戟科W及桑科组成的植物家族的一个成员。32. 根据权利要求31所述的方法，其中植物家族的该成员选自由磐粟、大红磐粟W及虞 美人组成的植物物种。33. -种重组表达载体，包含作为可操作地连接部件的W下各项： (i) 一种能够控制在宿主细胞中的表达的核酸序列；W及 (ii) 一种编码AKR的核酸序列， 其中该表达载体适合于在宿主细胞中的表达。34. 根据权利要求％所述的重组表达载体，其中编码AKR的该核酸序列选自下组，该组 由 W 下各项组成：SEQ.ID N0:1 至 SEQ.ID N0:58;SEQ.ID N0:326;SEQ.ID N0:328;W 及 沈Q.ID NO:339。35. 根据权利要求33所述的重组表达载体，其中该AKR可获得自磐粟科、精科、番慕枝 科、大戟科W及桑科组成的植物家族的一个成员。36. 根据权利要求35所述的方法，其中植物家族的该成员选自由磐粟、大红磐粟W及虞 美人组成的植物物种。37. -种重组表达载体，包含作为可操作地连接部件的W下各项： (i) 一种能够控制在宿主细胞中的表达的核酸序列；W及 (ii) 一种编码CYP450和AKR的核酸序列， 其中该表达载体适合于在宿主细胞中的表达。38. 根据权利要求37所述的重组表达载体，其中编码CYP450的该核酸序列是一种选自 下组的核酸序列，该组由W下各项组成：SEQ.ID N0:116至SEQ.ID N0:218;SEQ.ID N0:324 W及SEQ. ID N0:337,并且其中编码AKR的该核酸序列是一种选自下组的核酸序列，该组由 W下各项组成：SEQ.ID N0:1 至沈Q.ID N0:58;沈Q.ID N0:326;SEQ.ID N0:328;W及沈Q.ID NO:339。39. 根据权利要求37所述的重组表达载体，其中该AKR和该CYPR可获得自磐粟科、精科、 番慕枝科、大戟科W及桑科组成的植物家族的一个成员。40. 根据权利要求39所述的方法，其中植物家族的该成员选自由磐粟、大红磐粟W及虞 美人组成的植物物种。41. 一种制备(R)-网状番慕枝碱的方法，该方法包括： (a) 提供(S)-网状番慕枝碱;并且 (b) 使（S)-网状番慕枝碱与一种酶混合物接触，该酶混合物能够在允许将(S)-网状番 慕枝碱转化成(R)-网状番慕枝碱的条件下将(S)-网状番慕枝碱转化成(R)-网状番慕枝碱。42. 根据权利要求41所述的方法，其中该酶混合物包含一种能够将(S)-网状番慕枝碱 氧化W形成1,2-脱氨网状番慕枝碱的第一多肤和一种能够将1,2-脱氨网状番慕枝碱还原 W形成(R)-网状番慕枝碱的第二多肤。43. 根据权利要求41所述的方法，其中能够将（S)-网状番慕枝碱氧化W形成1,2-脱氨 网状番慕枝碱的该第一多肤是一种细胞色素 P450,并且能够将1,2-脱氨网状番慕枝碱还原 W形成(R)-网状番慕枝碱的该第二多肤是一种醒-酬还原酶。44. 根据权利要求41-42所述的方法，其中该第一多肤选自下组，该组由W下各项组成： N0:219至SEQ.ID N0:321;沈Q.ID N0:325;W及沈Q.ID N0:338,并且其中该第二多肤选自 下组，该组由 W下各项组成：SEQ.ID N0:59至SEQ.ID N0:115;SEQ.ID N0:327;沈Q.ID NO: 329;沈Q.ID NO:33〇W及沈Q.ID N0:340。45. 根据权利要求42-44所述的方法，其中该第一多肤和该第二多肤是一种融合多肤。46. 根据权利要求41-45所述的方法，其中该方法在体内或体外进行。47. 根据权利要求43或45-46所述的方法，其中该细胞色素 P450和该醒-酬还原酶可获 得自磐粟科、精科、番慕枝科、大戟科W及桑科组成的植物家族的一个成员。48. 根据权利要求47所述的方法，其中植物家族的该成员选自由磐粟、大红磐粟W及虞 美人组成的植物物种。49. 一种用于制备(R)-网状番慕枝碱的方法，该方法包括： (a) 提供一种嵌合核酸序列，该嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的W下各项： (i) 一种编码CYP450多肤的第一核酸序列； (ii) 一种编码AKR多肤的第二核酸序列；W及 (iii) 能够控制在宿主细胞中的表达的一种或多种核酸序列； (b) 将该嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主细胞生长W产生CYP450和 AKR，并且产生(R)-网状番慕枝碱;并且 (C)回收(R)-网状番慕枝碱。50. 根据权利要求51所述的方法，其中该第一核酸序列和该第二核酸序列被可操作地 连接W便产生一种包含CYP450和AKR的融合多肤。51. 根据权利要求49或50所述的方法，其中编码CYP450的该核酸序列选自下组，该组由 W下各项组成：SEQ.ID N0:116至沈Q.ID N0:218;SEQ.ID N0:324;W及沈Q.ID N0:337,并 且其中编码AKR的该核酸序列选自下组，该组由W下各项组成：SEQ. ID NO: 1至SEQ. ID NO: 58;沈Q.ID N0:326;SEQ.ID N0:328;SEQ.ID N0:339。52. 根据权利要求49或50所述的方法，其中该CYP450和该AKR可获得自磐粟科、精科、番 慕枝科、大戟科W及桑科组成的植物家族的一个成员。53. 根据权利要求52所述的方法，其中植物家族的该成员选自由磐粟、大红磐粟W及虞 美人组成的植物物种。54. -种用于制备(R)-网状番慕枝碱的方法，该方法包括： (a) 提供一种第一嵌合核酸序列，该第一嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的 一种编码CYP450多肤的第一核酸序列和一种控制该第一核酸序列在细胞中的表达的第一 核酸序列； (b) 提供一种第二嵌合核酸序列，该第二嵌合核酸序列包含作为可操作地连接部件的 一种编码AKR多肤的第二核酸序列和一种控制该第二核酸序列在细胞中的表达的第二核酸 序列； (C)将该第一嵌合核酸序列和该第二嵌合核酸序列引入一个宿主细胞中并且使该宿主 细胞生长W产生CYP450和AKR，并且产生(R)-网状番慕枝碱;并且 (d)回收(R)-网状番慕枝碱。55. 根据权利要求54所述的方法，其中编码CYP450的该核酸序列是一种选自下组的核 酸序列，该组由 W下各项组成：SEQ.ID NO:116至SEQ.ID NO:218;SEQ.ID NO:324W及 SEQ. ID NO:337，并且其中编码AKR的该核酸序列是一种选自下组的核酸序列，该组由W下 各项组成：SEQ.ID N0:1 至沈Q.ID N0:58;沈Q.ID N0:326;SEQ.ID N0:328;W及沈Q.ID NO: 339。56. 根据权利要求54所述的方法，其中该CYP450和该AKR可获得自磐粟科、精科、番慕枝 科、大戟科W及桑科组成的植物家族的一个成员。57. 根据权利要求56所述的方法，其中植物家族的该成员选自由磐粟、大红磐粟W及虞 美人组成的植物物种。58. -种用于制备(R)-网状番慕枝碱的组合物，该组合物包含一种酶混合物，该酶混合 物包含一种能够将(S)-网状番慕枝碱氧化W形成1,2-脱氨网状番慕枝碱的第一多肤和一 种能够将1,2-脱氨网状番慕枝碱还原W形成(R)-网状番慕枝碱的第二多肤。59. 根据权利要求58所述的组合物，其中该酶混合物包含一种能够将（S)-网状番慕枝 碱氧化W形成1,2-脱氨网状番慕枝碱的第一多肤和一种能够将1,2-脱氨网状番慕枝碱还 原W形成(R)-网状番慕枝碱的第二多肤。60. 根据权利要求59所述的组合物，其中能够将(S)-网状番慕枝碱氧化W形成1,2-脱 氨网状番慕枝碱的该第一多肤是一种细胞色素 P450,并且能够将1,2-脱氨网状番慕枝碱还 原W形成(R)-网状番慕枝碱的该第二多肤是一种醒-酬还原酶。61. 根据权利要求58-60所述的组合物，其中该第一多肤选自下组，该组由W下各项组 成:N0:219至沈Q.ID N0:321;SEQ.ID N0:325;W及SEQ.ID N0:338,并且其中该第二多肤选 自下组，该组由 W 下各项组成：SEQ.ID N0:59 至 SEQ.ID N0:115;SEQ.ID N0:327;SEQ.ID N0:329;SEQ.ID NO:33〇W及沈Q.ID N0:340。62. 根据权利要求58-61所述的组合物，其中该第一多肤和该第二多肤是一种融合多 肤。63. 根据权利要求58-60和61所述的组合物，其中该细胞色素 P450和该醒-酬还原酶可 获得自磐粟科、精科、番慕枝科、大戟科w及桑科组成的植物家族的一个成员。64. 根据权利要求63所述的组合物，其中植物家族的该成员选自由磐粟、大红磐粟W及 虞美人组成的植物物种。65. -种检测编码AKR和/或CYP450的核酸序列在细胞中的存在或不存在的方法，该方 法包括： (a) 提供一种细胞； (b) 从该细胞提取基因组DNA;并且 (C)针对编码AKR和/或CYP450的核酸序列的存在分析该基因组DNA。66. 根据权利要求65所述的方法，其中该细胞是一种可获得自一种植物的植物细胞，该 植物属于由磐粟科、精科、番慕枝科、大戟科W及桑科组成的植物家族。67. 根据权利要求65所述的方法，其中该植物细胞可获得自一种植物，该植物属于由磐 粟、大红磐粟W及虞美人组成的植物家族。68. -种用于调节核酸序列在天然表达AKR和/或CYP450的细胞中的表达的方法，该方 法包括： (a) 提供一种天然表达AKR和/或CYP450的细胞； (b) 诱变处理该细胞； (C)使细胞生长W获得多个细胞;并且 (d)确定该多个细胞是否包括一种包含调节水平的AKR和/或CYP450的细胞。69. 根据权利要求68所述的方法，其中该细胞是一种可获得自一种植物的植物细胞，该 植物属于由磐粟科、精科、番慕枝科、大戟科W及桑科组成的植物家族。70. 根据权利要求68所述的方法，其中该植物细胞可获得自一种植物，该植物属于由磐 粟、大红磐粟W及虞美人组成的植物家族。71. -种用于产生结巧植物的方法，该结巧植物包含核酸序列在天然表达AKR和/或 CYP450的细胞中的调节表达，该方法包括： (a) 提供一种天然表达AKR和/或CYP450的结巧植物； (b) 诱变该植物的种子W获得诱变的种子； (C)使该诱变的种子生长成能够结巧下一代种子的下一代诱变植物;并且 (d)获得运些诱变植物的下一代种子或另一个部分，并且分析运些下一代植物或下一 代种子是否表现出调节的AKR和/或CYP450表达。72. 根据权利要求71所述的方法，其中该植物属于由磐粟科、精科、番慕枝科、大戟科W 及桑科组成的植物家族。73. 根据权利要求71所述的方法，其中该植物属于由磐粟、大红磐粟W及虞美人组成的 植物家族。74. -种产生表达降低水平的AKR和/或CYP450的植物的方法，该方法包括： (a) 提供一种表达AKR和/或CYP450的植物;并且 (b) 使用病毒诱导性基因沉默降低AKR和/或CYP450在该植物中的表达。75. 根据权利要求74所述的方法，其中该植物属于由磐粟科、精科、番慕枝科、大戟科W 及桑科组成的植物家族。76. 根据权利要求74所述的方法，其中该植物属于由磐粟、大红磐粟W及虞美人组成的 植物家族。77. 根据权利要求69-76所述的方法，其中运些方法提供在能够天然产生生物碱的植物 中的生物碱产生水平的调节。78. 根据权利要求77所述的方法，其中该生物碱选自W下生物碱的组，该组由W下各项 组成：吗啡、可待因、蒂己因、磐粟碱、那可下、（S)-网状番慕枝碱、（R)-网状番慕枝碱、可旦 民碱、劳丹碱W及劳丹素。79. -种编码AKR或CYP450的核酸序列对植物进行基因分型的用途。80. 根据权利要求79所述的用途，其中该植物是由磐粟科、精科、番慕枝科、大戟科W及 桑科组成的植物家族的一个成员。81. 根据权利要求79所述的用途，其中该植物选自由磐粟、大红磐粟W及虞美人组成的 植物家族。82. -种编码AKR或CYP450的核酸序列作为标记物评估植物群体中遗传连接至其上的 核酸序列的分离的用途。83. 根据权利要求82所述的用途，其中该植物群体包括属于由磐粟科、精科、番慕枝科、 大戟科W及桑科组成的植物家族的植物。84. 根据权利要求82所述的用途，其中该植物群体包括属于由磐粟、大红磐粟W及虞美 人组成的植物家族的植物。
【文档编号】C12P17/10GK105980563SQ201480071559
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年12月3日
【发明人】彼得·詹姆斯·法基尼, 斯科特·卡梅伦·法罗, 纪劳姆·亚瑟·韦尔奇·博杜安
【申请人】埃皮梅伦公司