专利名称：一种新型番荔枝内酯衍生物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型番荔枝内酯衍生物，进一步涉及它的制备方法，更进一步涉及它在癌症的治疗和农业病虫害防治中的用途。
本发明的一种番荔枝内酯衍生物的结构通式为
其中，R1和R2选自H和H、H和OH、H和OAc、或＝O；n＝7-17；R1和R2中氧取代基总数等于或小于5。
本发明的番荔枝内酯衍生物是由两个五元内酯环通过一个碳链相连而成，其中，在两个内酯环中，一个是甲基取代的α，β-不饱和五元内酯环，另一个是饱和五元内酯环，两个内酯环γ碳的构型是R型或S型，两个内酯环γ碳的构型可以相同也可以不同；碳链是由7-17个碳原子组成，在该碳链上通常有羟基、酮基、乙酰氧基取代基团。
本发明的典型代表是新化合物番荔枝双酯素(Annolidin)，结构式为； 它的结构中，α，β-不饱和五元内酯环γ碳的构型与其它番荔枝科植物来源的番荔枝内酯相同，为S型；碳链部分共由13个碳原子组成(C-3-C-15)，碳链的15位碳(C-15)上有一羟基取代，15位羟基与16位内酯酰氧基之间的相对构型与已知化合物Muricatacin[Matthew等，Tetrahedron Letters，1991，32(9)1137-1140]的相应部分相同，为苏式(threo)。
本发明的番荔枝内酯衍生物可从番荔枝科(Annonaceae)植物提取、分离得到，或由其它类型的番荔枝内酯化合物通过半合成方法获得，或通过化学合成的方法得到。
从番荔枝科植物提取的方法，其特征是依次包括如下步骤a.番荔枝种子干粉用乙醇提取；b.乙醇提取物用石油醚脱酯；c.然后用氯仿萃取得到番荔枝内酯部位提取物；d.番荔枝内酯部位提取物首先用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱进行粗分，得到番荔枝总内酯；e.番荔枝总内酯再用硅胶柱层析，石油醚-丙酮洗脱，得到粗番荔枝双酯素；f.粗番荔枝双酯素用丙酮重结晶得纯番荔枝双酯素。
本发明的番荔枝内酯衍生物对癌细胞有较强的细胞毒作用，对细胞耗氧呼吸有较强的抑制作用，可用于癌症的治疗和农业病虫害的防治。
体外抗癌试验显示，番荔枝双酯素对人肝癌细胞(Bel-7402)的IC50(半数抑制浓度)为4.79μg/ml[对照品DDP(顺铂)的IC50为2.12μg/ml]，对人鼻咽癌细胞(CNE2)的IC50亦为4.79μg/ml(对照品DDP的IC50为2.18μg/ml)。肝细胞耗氧呼吸抑制试验显示，番荔枝双酯素对肝细胞呼吸控制率(respiration control ratio，RCR)的IC50(nmol·L-1·mg-1)为137.7(对照品氰化钾为2.1×104)。
本发明的用途中，具有抗癌或杀虫的有效成分是单一化合物、二种以上化合物的混合物、或含有本发明番荔枝内酯衍生物的植物提取物、分部提取物或分离部位。应用方式是把有效成分添加到药用载体、药用组合物、农药用载体或农药用组合物中。
取F0129.0g上硅胶(100-200目，青岛海洋化工厂产，290g)柱，依次用氯仿、氯仿-甲醇(98∶2)、氯仿-甲醇(97∶3)、氯仿-甲醇(90∶10)洗脱。根据薄层层析[用硅胶板，以石油醚-丙酮(3∶1)为展开剂，Dragendoff试剂和碘蒸汽显色]结果合并成三个部分F02(6.55g)、F03(15.15g)和F04(5.60g)。取F03 10.0g上硅胶(100-200目，青岛海洋化工厂产，285g)柱，用石油醚-丙酮(75∶25)洗脱，每份收集100mL，将1-32份合并蒸干后得淡黄色腊状固体(3.17g)，将该腊状固体再次上硅胶(100-200目，青岛海洋化工厂产，200g)柱，石油醚-丙酮(85∶15)洗脱，得到粗番荔枝双酯素。将该粗番荔枝双酯素用丙酮重结晶，得到纯番荔枝双酯素(0.06g)。
主要试剂仪器RPMI-1640培养液、噻唑蓝粉(MTT)、顺铂(DDP)、酶联检测仪试验方法用噻唑蓝还原法(MTT法)。具体方法为在无菌条件下，取上述各人癌细胞，调成
的细胞悬液，分装于96孔细胞培养板，每孔0.2ml，设无药对照组，DMSO溶剂对照组，已知抗癌药DDP组和5~6个不同浓度的受试物组，每组设4个平行孔，分别加入药物作用48h后，于酶联仪上测各孔的OD值，按[(1-实验组平均OD值/DMSO组平均OD值)×100％]公式计算生长抑制率(IR)％，重复2~3批实验，取各批的平均抑瘤率，再用药理计算系统求出半数抑制浓度(IC50)。
结果见表2和表3。
表2 番荔枝双酯素对人肝癌细胞(Bel-7402)的生长抑制作用
表3 番荔枝双酯素对人鼻咽癌细胞(CNE2)的生长抑制作用
实施例四对肝细胞耗氧呼吸的抑制作用样品和试剂将番荔枝双酯素溶解于95％的乙醇，浓度为20～100μmol·L-1。抑制剂鱼藤酮(rotenone)购自Sigma公司，浓度为50μmol·L-1。抑制剂氰化钾(KCN)为国产分析纯试剂，浓度为1～100mmol·L-1。
肝细胞的制备将活鸡宰杀后立即取出肝脏，浸泡于冰冷的匀浆液洗净。匀浆液含蔗糖0.25mol·L-1，EDTA·Na20.5mmol·L-1，Tris-HCl(pH7.4)4mmol·L-1。肝脏洗净后放入匀浆器，加入足量预冷至含浮冰的匀浆液，匀浆40s左右，用6层以上纱布过滤匀浆液。将滤液在4000r·min-l转速下离心15min，用匀浆液悬浮细胞沉淀。将细胞悬浮转移到试管中，置于冰浴中保存，留待下一步呼吸测定。
肝细胞耗氧呼吸抑制作用的测定用氧电极方法测定ACG对肝细胞耗氧呼吸的抑制作用[5，6]。反应液含KCl 0.1mol·L-1，KH2PO45mmol·L-1，EDTA·Na21mmol·L-1，DL-谷氨酸5mmol·L-1，DL-苹果酸1mmol·L-1，Tris-HCl(pH7.4)20mmol·L-1。肝细胞加到氧电极反应杯(3mL，30℃)中耗氧呼吸开始，此时为呼吸状态2；接着加入50mmol·L-1二磷酸腺苷(adenosine-5′-diphosphate，ADP)15μL，耗氧呼吸速率明显增加，此时为呼吸状态3；当ADP耗尽时，转入呼吸状态4；跟着注入抑制剂，然后再加入ADP 15μL，又出现状态3和状态4。肝细胞耗氧呼吸的变化用呼吸控制率(respiration control ratio，RCR)表示，RCR等于状态3呼吸速率比上状态4呼吸速率，根据不同状态RCR大小确定呼吸抑制程度。反应混合液中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝方法。
呼吸抑制程度的分析加入抑制剂前后RCR分别用RCR1和RCR2表示，呼吸抑制百分比等于(1-RCR2/RCR1)×100％。以反应混合液中每毫克蛋白肝细胞中的抑制剂浓度为横坐标、呼吸抑制百分比为纵坐标作曲线对数回归分析，计算IC50。
结果如
图1，番荔枝双酯素的IC50为137.7nmol·L-1·mg-1，鱼藤酮的IC50为12.1nmol·L-1·mg-1，KCN的IC50为2.1×104nmol·L-1·mg-1。
权利要求
1.一种番荔枝内酯衍生物，它的结构通式为 其中，R1和R2选自H和H、H和OH、H和OAc、或＝O；n＝7-17；R1和R2的氧取代基总数等于或小于5。
2.根据权利要求1中所述的一种番荔枝内酯衍生物，其典型结构式为
3.权利要求1或2中所述的番荔枝内酯衍生物的制备方法，其特征是它包括从番荔枝科植物提取、分离得到，或由其它类型的番荔枝内酯化合物通过半合成方法获得，或通过化学合成的方法得到。
4.根据权利要求3中所述的番荔枝内酯衍生物的制备方法，其特征是从番荔枝科植物中提取、分离的方法，依次包括如下步骤a.番荔枝种子干粉用乙醇提取；b.乙醇提取物用石油醚脱酯；c.然后用氯仿萃取得到番荔枝内酯部位提取物；d.番荔枝内酯部位提取物首先用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱进行粗分，得到番荔枝总内酯；e.番荔枝总内酯再用硅胶柱层析，石油醚-丙酮洗脱，得到粗番荔枝双酯素；f.粗番荔枝双酯素用丙酮重结晶得纯番荔枝双酯素。
5.权利要求1或2中所述的番荔枝内酯衍生物的用途在于癌症的治疗或农业病虫害的防治。
6.根据权利要求5中所述的番荔枝内酯衍生物的用途，其特征是作为抗癌或杀虫的有效成分包括单一化合物、二种以上化合物的混合物，亦包括含有本发明番荔枝内酯衍生物的植物提取物、分部提取物或分离部位。
7.根据权利要求5中所述的番荔枝内酯衍生物的用途，其特征是作为有效成分添加到药用载体、药用组合物、农药用载体或农药用组合物中。
全文摘要
本发明提供一种新型番荔枝内酯(Annonaceousacetogenin)衍生物，其结构通式(I)为右式。其中，R
文档编号A01N43/08GK1446809SQ0211500
公开日2003年10月8日 申请日期2002年3月26日 优先权日2002年3月26日
发明者魏孝义, 谢海辉, 徐志防, 杨仁洲 申请人:中国科学院华南植物研究所