专利名称：番荔枝内酯抗癌有效部位药及其制备方法
技术领域：
本发明涉及从番荔枝(Annona squamosa L.)种子制备的一种番荔枝内酯(Annonaceous acetogenins)抗癌有效部位药及其制备方法。
番荔枝内酯类物质(Annonaceous acetogenins)是由长链脂肪酸γ-内酯衍生出的一类天然产物。这类物质的结构特点是在一长脂肪链的一端有一甲基取代的α，β-不饱和γ-内酯环，在脂肪链上有1～3个四氢呋喃环和其它一些含氧取代基，如羟基、乙酰氧基、酮基、环氧基，以及碳碳双键等。这类天然产物仅存在于番荔枝科(Annonaceae)某些属的植物中。
番荔枝内酯类物质具有多种生物活性，其中最重要的生物活性是极强的体外细胞毒和体内抗肿瘤作用。其作用机理是通过选择性地抑制癌细胞线粒体中NADH氧化还原酶，阻止呼吸链电子的传递，使ADP不能转化成ATP，从而切断癌细胞赖以生存和增殖的能量供应，进而诱导癌细胞走向凋亡(Apoptosis)；同时，番荔枝内酯类物质还能够克服癌细胞的多药抗药性(MDR)。因此，番荔枝内酯类物质成为近年来的研究热点。于1982年报道第一个番荔枝内酯化合物Uvaricin以来，至今已发现了约300个这类化合物。
国外的工作主要在单体化合物方面，但至今仍停留在分离、结构、合成及生物活性等方面的研究，距离实际应用尚很遥远，原因有第一，在已发现的约300个化合物中，在体内真正有效的高活性化合物并不多；第二，由于数目众多的异构体、同系物共存于同一植物中，有些植物中多达30多个同系物，且各同系物及异构体的理化性质极为相似，因此，单体化合物的分离、纯化非常困难；第三，单个化合物在植物中的含量相对较低，植物资源有限；第四，番荔枝内酯类物质的分子中具有多个手性中心，亦难以通过化学合成得到特定单体物；第五，番荔枝内酯单体化合物的毒性较高，治疗指数较低。
国内有人提出以番荔枝总内酯用作药物原料，但这样的总内酯组分复杂，难以建立药物的质量标准和质量控制手段，因而无法保证药物的质量和疗效，难以达到新药应有的“有效、安全、可控”的目标。因此，番荔枝总内酯亦将难以进入实际应用。而且现有公知的番荔枝总内酯制备方法也存在一些问题，例如CN1224016A公开的方法是以番荔枝种子为原料，首先用己烷或石油醚脱脂，然后用醇提取、氯仿萃取及己烷-乙醇分配处理，最后再经硅胶吸附层析得到总内酯。这种方法存在下列缺点(1)首先脱脂所用己烷或石油醚等有机溶剂的量很大，溶剂损耗大，处理时间长，导致成本增加；(2)由于己烷、石油醚等溶剂能溶出部分有效成分，因此首先脱脂会使部分有效成分损失。
另外，番荔枝内酯类物质具有极强的脂溶性，制剂亦是难点。
本发明目的在于解决下述问题(1)以单个番荔枝内酯化合物用作药物原料尚无实际应用价值问题；(2)以番荔枝总内酯作为药物原料时，组分过于复杂，无法保证药物的质量，即质量可控性问题；(3)番荔枝总内酯制备方法中存在的问题；(4)制剂问题。以开发一种以番荔枝内酯化合物为有效成分的有实用价值的抗癌有效部位药。
本发明以番荔枝种子为原料，番荔枝(Annona squamosay L.)是产于我国南方地区的一种药用植物，其果实是著名水果，资源丰富、易得，其种子含大量的番荔枝内酯，其中不乏活性很强的成分。本发明先由番荔枝种子制备番荔枝总内酯，然后将总内酯经精制处理，目的是除去大量活性不高或无活性的内酯成分，仅保留高活性内酯成分而成为一高效部位药。这种高效部位由于已除去了大量无用内酯成分而仅富集高活性内酯成分，因而不仅活性更强，而且组成简单，易于进行质量控制；同时，其制备方法简单、易实施、生产成本低；另外本发明对番荔枝总内酯制备方法作了改进，首先用醇提取，乙醇提取物用有机溶剂例如石油醚脱脂，并用乙醇萃取出有机溶剂例如石油醚中的有效成分，减少了溶剂用量，提高了有效成分收率；还有本发明以脂肪乳作为其剂型，成功地解决了制剂问题。因此本发明具有极强的实用性。
本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药是由下述两个工序制得的物质首先有番荔枝总内酯制备工序，以番荔枝种子为原料制备番荔枝总内酯；其特征在于还有精制工序，把前步工序中所制备的番荔枝总内酯经硅胶柱层析，所述的硅胶柱中充填的硅胶粒度为80～300目，最好100～200目，与所述的番荔枝总内酯的质量比为15∶1～50∶1，最好为30∶1，层析后用体积比为3∶1～3∶2的石油醚-丙酮洗脱，用薄层层析检查，在阿诺宁-6(Annonin VI)流出时开始收集至阿诺宁-1(Annonin I)全部流出为止，洗脱剂石油醚-丙酮的用量就由此来决定，将收集的所述馏分浓缩、干燥，即得本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药。
所述的番荔枝总内酯制备工序可采用现有各种公知的方法，例如CN1224016A的方法。但为了提高有效成分收率和减少溶剂用量，本发明对该工序作了改进。本发明番荔枝总内酯的制备工序为把番荔枝种子粗粉用80％～97％乙醇浸泡提取，乙醇的用量、浸泡时间和次数随意选择，乙醇提取液浓缩后用有机溶剂萃取脱脂，然后用氯仿萃取，氯仿萃取物经硅胶柱层析，所述的硅胶柱中充填的硅胶粒度为80～300目，最好100～200目，与氯仿萃取物的质量比为5∶1～20∶1，最好为10∶1，层析后以体积比为100∶0～90∶10的氯仿-甲醇洗脱，用薄层层析检查，在番荔枝内酯类物质大量流出时开始收集，至无番荔枝内酯类物质流出时为止，将收集的所述馏分浓缩、干燥，得到番荔枝总内酯。
上述的各次萃取所用的溶剂用量和萃取次数均可随意选择。脱脂工序可使用公知的有机溶剂例如石油醚、己烷等。在所述的有机溶剂例如石油醚萃取脱脂前在蒸去乙醇的提取物中最好先加水；脱脂后的有机溶剂例如石油醚层最好用体积分数为60％～97％的乙醇萃取，乙醇萃取液在浓缩后并入脱脂后的水溶液中，具体制备工艺流程详见附
图1。
所述的薄层层析检查是控制本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药质量的方法，可采用通常的薄层层析板，为方便本发明采用自制硅胶H硬板(CMC为粘合剂)，以体积比为3∶1的石油醚-丙酮作为展开剂，可选用下列三种显色剂中之一种进行显色(1)Kedde试剂即3，5-二硝基苯甲酸斑点呈红色，色斑很快消褪；(2)Dragendorff试剂即碘化铋钾试剂呈橙黄色斑点，颜色持久；(3)碘蒸汽呈褐色斑点，颜色持久。
结果本发明番荔枝总内酯有效部位药在TLC上按上述条件展开后，对三种显色剂均显示两个斑点，分别对映于对照品阿诺宁-1和阿诺宁-6。
高效液相色谱法测定本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药中两个主要成分的含量用ODS柱(6mm×15cm)，甲醇-水(体积比9∶1)为流动相，流速1mL/min，用紫外检测仪，检测波长210nm，萘为内标，由峰面积积分值通过内标法或外标法测定阿诺宁-1和阿诺宁-6的含量，二者的回归方程如下阿诺宁-1(Annonin I)y＝5065.05x-6902.7 r＝0.9998；阿诺宁-6(Annonin VI)y＝4975.92x-4179.8 r＝0.9998。
结果阿诺宁-1的含量为质量分数42％～55％，典型值为52.3％，阿诺宁-6的含量为质量分数8％～15％，典型含量为10.5％，二者的含量之和为质量分数50％～70％，典型值为63.1％。
本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药可配成乳剂，其配方比例和制造方法如下每1000mg本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药中，加入50～200g大豆油(最适用量为100g)和10～20g(最适用量为12g)卵磷脂，加热混合、溶解，待全部溶解后加注射用水至总体积为500～1500mL，最好1000mL，经乳化处理后，过滤、灌封、灭菌，即成本发明乳剂，所述的乳化处理可以采用一般的乳化方法，例如可用多级超声乳化处理。
本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药进行下述药理学试验。
(1)急性毒性试验小鼠急性毒性试验，以Bliss法计算LD50，结果如下腹腔注射 ip×1次 LD50＝1.124(1.017～1.242)mg/kg；灌胃 po×1次 LD50＝74.754(58.662～95.260)mg/kg。
(2)体外细胞毒试验本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药体体外对肺癌(A-549)、鼻咽癌(CNE2、SUNE1)、肝癌(BEL-7402)、HT-29(结肠癌)、乳腺癌(MCF-7)及肺腺癌(GLC-82)等7种人癌细胞进行了细胞毒实验，以Taxol作为阳性对照药物，结果如表1。显示本发明有效部位药对试验的7种细胞株均有细胞毒作用，其中对A-549、CNE2、BEL-7402等三种细胞株的作用最强，作用强于taxol或与taxol相当。
表1 对各种人癌细胞的体外细胞毒作用(IC50半数抑制浓度)
(3)对小鼠移植性肿瘤的抗瘤作用采用腹腔注射(ip)和灌胃(po)两种给药途径，ip以小鼠肝癌HepS和小鼠肉瘤S-180两种动物移植性肿瘤、po还增加网状细胞肉瘤(L2)进行体内抑瘤试验。本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药设3～4个剂量组，对照组为不含药物的脂肪乳，阳性药物对照组在ip给药时为环磷酰胺(CTX)，在po给药时为氟脲嘧啶(5-Fu)，各组连续给药10天，每个试验重复3～4批。结果(见表2～表6)表明在ip给药剂量为0.03～0.09mg/(kg.d)时，抑瘤率接近化疗药物CTX 18mg/kg剂量组的抑瘤率，在剂量低至0.01mg/(kg.d)×10天时仍可显示一定的抑制作用；采用灌胃经药，亦显示出极强的体内抗肿瘤作用，但与腹腔注射给药相比，灌胃给药的剂量较大，说明灌胃给药途径药物的吸收性较差。实验中除高剂量(0.09mg/(kg.d))组有部分批次有10％的荷瘤鼠死亡外，其他有效剂量组的荷瘤鼠行为活动正常，未见明显消瘦、松毛、腹泻等毒性表现。
表2 腹腔注射给药对小鼠移植性肝癌HepS的抑制作用
表3 腹腔注射给药对小鼠肉瘤S-180的抑制作用
表4灌胃给药对小鼠移植性肝癌HepS的抑制作用
表5 灌胃给药对小鼠肉瘤S-180的抑制作用
表6 灌胃给药对小鼠网状细胞肉瘤L2的抑制作用
经上述药理学试验说明本发明达到下述技术效果(1)抗肿瘤作用强，由于本发明是将番荔枝总内酯经进一步精制处理，排除大量活性较低或无活性的内酯成分，仅富集了高活性成分，因而其作用更高；(2)组分简单、明确，易于进行质量控制；(3)制备方法简单、易实施，成本低；(4)用脂肪乳作为其药物剂型，成功地解决了制剂问题。
附图1为本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药制备工艺流程图。
本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药实施例如下
总内酯的分离将上述得到的总内酯提取物上硅胶G(300g，100～200目，青岛海洋化工厂)柱，用氯仿-甲醇梯度洗脱，每份接收200mL，起始用纯氯仿洗脱，流分为1～13份，然后换为氯仿-甲醇(98∶2)，为14～21份；再换(97∶3)，22～26份；最后用(90∶10)洗脱，27～36份。用TLC检查，将第19～29份合并，浓缩、干燥，得总内酯(15.15g)。
总内酯的精制取上述制备的总内酯10g，再上硅胶G(300g，100～200目，青岛海洋化工厂)柱，用石油醚-丙酮按如下比例洗脱3∶1，6000mL；7∶3，2000mL；65∶35，1500mL；1∶1，1000mL；以每份100mL接收。用TLC检查，从阿诺宁-6流出时开始收集直至阿诺宁-1全部流出时为止(第43～93份)，将这部分流分合并、浓缩、干燥，得到6.6g微黄色蜡状固体，即为番荔枝内酯抗癌有效部位药物(批号981225)。其主要成分的含量见表7。
表7 不同批次番荔枝内酯有效部位药中主要成分的含量
实施例4乳剂的制备取本发明番荔枝内酯抗癌有效部位药1000mg，加注射用大豆油100g，再加12g卵磷脂，在90℃的水浴上加热使全部固体物溶解于大豆油中，加注射用水至1000mL，经多级超声乳化处理后，过滤、灌封、灭菌，即成番荔枝内酯有效部位药乳剂。
权利要求
1.一种番荔枝内酯抗癌有效部位药是由下述两个工序制得的物质首先有番荔枝总内酯制备工序，以番荔枝种子为原料制备番荔枝总内酯；其特征在于还有精制工序，把前步工序中所制备的番荔枝总内酯经硅胶柱层析，所述的硅胶柱中充填的硅胶粒度为80～300目，与所述的番荔枝总内酯的质量比为15∶1～50∶1，层析后用体积比为3∶1～3∶2的石油醚-丙酮洗脱，用薄层层析检查，在阿诺宁-6(Annonin VI)流出时开始收集至阿诺宁-1(Annonin I)全部流出时止，将收集的所述馏分浓缩、干燥。
2.根据权利要求1所述的番荔枝内酯抗癌有效部位药，其特征在于所述的番荔枝总内酯制备工序如下把番荔枝种子粗粉用80％～97％乙醇浸泡提取，乙醇提取液浓缩后用有机溶剂萃取脱脂，然后用氯仿萃取，氯仿萃取物经硅胶柱层析，所述的硅胶柱中充填的硅胶粒度为80～300目，与氯仿萃取物的质量比为5∶1～20∶1，层析后以体积比为100∶0～90∶10的氯仿-甲醇洗脱，用薄层层析检查，在番荔枝内酯类物质大量流出时开始收集，至无番荔枝内酯类物质流出时为止，将收集的所述馏分浓缩、干燥。
3.根据权利要求1所述的番荔枝内酯抗癌有效部位药，其特征在于所述的番荔枝总内酯制备工序如下把番荔枝种子粗粉用体积分数80％～97％的乙醇浸泡提取，乙醇提取液浓缩后，加水，用有机溶剂萃取脱脂，有机溶剂层用体积分数60％～97％的乙醇萃取，乙醇萃取液在浓缩后并入脱脂后的水溶液中，浓缩后用氯仿萃取，氯仿萃取物经硅胶柱层析，所述的硅胶柱中充填的硅胶粒度为80～300目，与氯仿萃取物的质量比为5∶1～20∶1，层析后以体积比为100∶0～90∶10的氯仿-甲醇洗脱，用薄层层析检查，在番荔枝内酯类物质大量流出时开始收集，至无番荔枝内酯类物质流出时为止，将收集的所述馏分浓缩、干燥。
4.根据权利要求1所述的番荔枝内酯抗癌有效部位药，其特征在于所述的硅胶粒度为100～200目，与番荔枝总内酯的质量比为30∶1，所述的阿诺宁1的含量为质量分数42％～55％，所述的阿诺宁-6的含量为质量分数8％～15％，所述的阿诺宁-1与阿诺宁-6含量之和为质量分数50％～70％。
5.根据权利要求书4所述的番荔枝内酯抗癌有效部位药，其特征在于所述的阿诺宁-1含量为质量分数52.3％，所述的阿诺宁-6含量为质量分数10.5％，所述的阿诺宁-6与阿诺宁1的含量之和为质量分数63.1％。
6.一种番荔枝内酯抗癌有效部位药的制备方法，有下述两个工序首先有番荔枝总内酯制备工序，以番荔枝种子为原料制备番荔枝总内酯；其特征在于还有精制工序，把前步工序中所制备的番荔枝总内酯经硅胶柱层析，所述的硅胶柱中充填的硅胶粒度为80～300目，与所述的番荔枝总内酯的质量比为15∶1～50∶1，层析后用体积比为3∶1～3∶2的石油醚-丙酮洗脱，用薄层层析检查，在阿诺宁-6(Annonin VI)流出时开始收集至阿诺宁-1(Annonin I)全部流出为止，将收集的所述馏分浓缩、干燥。
7.根据权利要求6与所述的番荔枝内酯抗癌有效部位药的制备方法，其特征在于所述的番荔枝总内酯制备工序如下把番荔枝种子粗粉用体积分数80％～97％的乙醇浸泡提取，乙醇提取液浓缩后用有机溶剂萃取脱脂，然后用氯仿萃取，氯仿萃取物经硅胶柱层析，所述的硅胶柱中充填的硅胶粒度为80～300目，与氯仿萃取物的质量比为5∶1～20∶1，层析后以体积比为100∶0～90∶10的氯仿-甲醇洗脱，用薄层层析检查，在番荔枝内酯类物质大量流出时开始收集，至无番荔枝内酯类物质流出时为止，将收集的所述馏分浓缩、干燥。
8.根据权利要求6所述的番荔枝内酯抗癌有效部位药的制备方法，其特征在于所述的番荔枝总内酯制备工序如下把番荔枝种子粗粉用体积分数80％～97％的乙醇浸泡提取，乙醇提取液浓缩后，加水，用有机溶剂萃取脱脂，有机溶剂层用体积分数60％～97％的乙醇萃取，乙醇萃取液在浓缩后并入脱脂后的水溶液中，浓缩后用氯仿萃取，氯仿萃取物经硅胶柱层析，所述的硅胶柱中充填的硅胶粒度为80～300目，与氯仿萃取物的质量比为5∶1～20∶1，层析后以体积比为100∶0～90∶10的氯仿-甲醇洗脱，用薄层层析检查，在番荔枝内酯类物质大量流出时开始收集，至无番荔枝内酯类物质流出时为止，将收集的所述馏分浓缩、干燥。
9.根据权利要求6所述的番荔枝内酯抗癌有效部位药的制备方法，其特征在于所述的硅胶粒度为100～200目，与所述的番荔枝总内酯的质量比为30∶1，所述的薄层层析检查用硅胶H硬板，以体积比3∶1的石油醚-丙酮为展开剂，以Dragendorff试剂即碘化铋钾试剂显色。
10.一种番荔枝内酯抗癌有效部位药乳剂的制备方法，其特征在于所述的番荔枝内酯抗癌有效部位药乳剂配比如下每1000g权利要求1～5所述的番荔枝内酯抗癌有效部位药中加入50～200g大豆油和10～20g卵磷酯，按上述比例加热混合至物质溶解后加注射用水至总体积为500～1500mL，经乳化处理后过滤，灌封，灭菌。
11.根据权利要求10所述的番荔枝内酯抗癌有效部位药乳剂的制备方法，其特征在于所述的大豆油为100g，所述的卵磷酯为12g，所述的总体积为1000mL。
全文摘要
本发明涉及一种番荔枝内酯抗癌有效部位药及其制备方法,以番荔枝种子为原料,首先用有机溶剂提取制备番荔枝总内酯,然后番荔枝总内酯经硅胶柱层析,石油醚－丙酮洗脱精制处理后,制备得阿诺宁－1和阿诺宁－2总含量为质量分数50%～70%的抗癌药,并以脂肪乳作为剂型。本发明抗癌药中由于富集了高活性番荔枝内酯成分,因而不仅活性更强,而且组成简单,易于质量控制;同时,其制备方法简单、易实施、生产成本低,并成功解决制剂问题,具有极强实用性。
文档编号A61K31/365GK1370530SQ0110759
公开日2002年9月25日 申请日期2001年2月27日 优先权日2001年2月27日
发明者魏孝义, 谢海辉, 吴淑君, 郑祥慈, 刘梅芳, 杨仁洲 申请人:中国科学院华南植物研究所