专利名称：：褶皱臂尾轮虫微核制备技术的制作方法
技术领域：
：本发明涉及到轮虫微核的制备方法及其作为污染物毒性指标的应用，是一种应用细胞毒理学来进行环境污染物毒性;险测的4支术。
背景技术：
：在化学物质中，有很多能引起染色体的异常，化学物质诱发染色体异常在细胞核水平表现为染色体丢失或断片形成而出现的微核，检测微核出现的几率可以作为衡量化学物质毒性的一种指标。目前，国内外对于从细胞毒理学角度研究生物对环境污染物的反应集中在以下几个方面；一是利用植物根尖细胞在有丝分裂过程中对重金属毒性的反应情况，如以蚕豆根尖、洋葱根尖、大蒜根尖等植物根系放入含有重金属镉离子的溶液中培养24小时，然后对细胞核进行染色，观察并统计产生微核的概率，以此来衡量重金属镉离子的毒性；二是利用动物细胞来做类似的实验，如利用小白鼠骨髓红细胞微核率来检测污染物的毒性。至今未见利用水体浮游生物的细胞核作为受试材料进行微核检测的报道。就水体污染物环境;f全测而言，充分利用水体的浮游生物，尤其是浮游动物来检测污染的程度是一个理想的指标，目前从细胞毒理学角度，尤其是利用陆生动植物中已经广泛应用的微核技术来作为检测指标还处于空白状态。
发明内容本发明是描述以水体浮游生物褶皱臂尾轮虫作为衡量水体污染物有害程度的一种微核技术，主要解决了轮虫微核的制备技术及其在水体环境监测上的应用，主要内容为先对轮虫进行毒性实验，再利用压片法从轮虫卵母细胞中制备微核，以统计微核率的大小作为衡量污染物毒性的指标，是一种新型水体环境检测技术。图中线条指示的小核为微核，其周围两个大的核为卵母细胞核分裂后形成的两个细胞核。具体实施例方式本发明可以通过以下几个操作步骤实现一、轮虫采集及鉴别从野外含有褶皱臂尾轮虫的水样中取水样，经虑网筛虑，浓缩含有轮虫的液体，用虹吸管吸取单个轮虫，放置于载玻片上，在解剖镜(4xl0-40倍镜)下鉴别轮虫的种类，挑选出褶皱臂尾轮虫。二、轮虫扩大培养从以上野外采集的水样中选取1000个左右的褶皱臂尾轮虫放入6孔细胞培养板中进行扩大培养。培养过程中选用淡水小球藻作为褶皱臂尾轮虫的辨料投喂淡水小球藻时，小球藻与轮虫培养液的比例为1:50。三、重金属镉离子攻毒培养以上轮虫集中培养2-3天后，把其平均分成8组分别放入12孔培养板中进行镉离子攻毒实验，方法如下根据镉离子毒性剂量试验所测得的浓度范围，确定八个实验镉离子浓度即0.1mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L，0.8mg/L,1.2mg/L,2,4mg/L,4.8mg/L和原培养液对照组实验。分别取上述浓度的镉离子处理液2毫升放在12孔培养板中，再在每个培养孔中放入大约200个活力较强的轮虫，然后每个培养孔中再加入0.5毫升的淡水小球藻，最后调节处理液的PH值使其达到8.0左右。把培养板放入25。C培养箱中，培养24-48小时。四、微核镜检与制片观察分别用吸管吸取一滴各浓度镉离子轮虫培养液滴在载玻片上，加入10%Giemsa染色液进行活体染色十五分钟，加上盖玻片后放在10x10倍显微镜下用解剖针轻轻挤压盖玻片，此时一边观察显微镜中轮虫形态的变化，一边反复挤压盖玻片，直至看见有液体从轮虫尾部流出为止；调整显微镜视野，观察盖玻片下所有轮虫的形态变化情况，直至利用解剖针把约80%左右的轮虫都从其尾部挤出液体为止。此时，用滤纸轻轻擦、吸干盖玻片周围的液体，调整显微镜，利用10x100倍的油镜进行观察。此时会在视野中发现大量的处于细胞核分裂状态的卵母细胞核出现，由于轮虫属于主要营孤雌生活的浮游生物，其繁殖力很强，所以每个轮虫都可以观察到15-30个左右的这样卵母细胞的存在。同时，在这些卵母细胞处于分裂期的细胞核周围，还会出现处于染色较深状态小细胞核(称之为微核)的存在。五、微核统计与分析对微核出现的数目和观察到的总卵母细胞数进行计数，每个镉离子浓度下约观察5000个细胞，统计微核率，微核率(％)=微核数目/总观察细胞数。微核率统计结果见表1表1轮虫微核率统计结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>从表1中可以看出，用不同浓度的镉离子处理轮虫，轮虫细胞中出现的微核几率存在着差异，且随着镉离子浓度从最低浓度Omg/L到0.4mg/L的范围内，所产生的微核率呈递增趋势，而0.4mg/L至4.8mg/L的范围内，轮虫微核率又呈递减趋势。前者微核率逐渐递增变化说明以轮虫微核率作为衡量重金属镉离子的毒性是很有规律可循的，可以把这种微核出现的几率作为评价重金属等水体污染物毒性的指标；后者微核率又呈逐渐递减趋势的变化是由于随着镉离子浓度提高，其毒性越强，产生了毒性抑制，轮虫卵母细胞核不再进行分裂，轮虫的正常生殖能力受到了干扰造成的。权利要求1、褶皱臂尾轮虫微核制备方法利用重金属如镉离子溶液对褶皱臂尾轮虫进行急性毒性实验，处理24小时后以10％Giemsa染料进行虫体整体染色，染色15分钟后在轮虫上盖上盖玻片；在10×10＝100倍的显微镜下，先找到轮虫，再利用解剖针在轮虫的位置向下挤压盖玻片，力量由轻逐渐加重，反复多次，直至看见带有细胞核的卵母细胞由轮虫身体尾部从两侧流出，挤压至完全流出为止；利用油镜，10×100＝1000倍的显微镜下检验卵母细胞核，发现在主细胞核附近出现一些小的细胞核，即微核。全文摘要本发明是一种褶皱臂尾轮虫微核的制备技术，其特征在于，水体中环境污染物(如重金属镉离子)可以对水体中大量生存的浮游生物——轮虫产生毒性，在细胞水平上表现为轮虫卵母细胞的核分裂受到影响，可以产生小的细胞核，即微核，统计这种微核出现的次数，计算微核率，进一步可以以微核率的大小来衡量环境污染物的毒性大小。本发明以重金属镉离子对轮虫细胞微核率的影响为例，具体阐述了褶皱臂尾轮虫微核的制备方法，包括轮虫攻毒、压片、染色和观察等几个操作步骤，摘要附图中显示了轮虫细胞微核的大小和形态。文档编号C12Q1/02GK101131385SQ200710132449公开日2008年2月27日申请日期2007年9月17日优先权日2007年9月17日发明者静徐,李晓英,赵艳景,阎斌伦,陈建华,焕高申请人:淮海工学院