专利名称：：羊型布鲁氏杆菌m5菌株核糖体蛋白l7/l12的基因、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及羊型布鲁氏杆菌M5菌株(5n/ce〃flwetoe"w'sM5)核糖体蛋白L7/L12的基因、其编码蛋白及应用。
背景技术：
：布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属引起的一种人畜共患传染病。布鲁氏菌是哺乳动物寄生菌，对人和哺乳动物具有高度感染性和致病性。该菌属有羊、牛、猪、犬、林鼠、海洋哺乳动物和绵羊七个生物种，中国流行的主要是前4种。羊、牛、猪等家畜最易感染，其中以羊种最为常见。由于布鲁氏菌是兼性细胞内寄生菌，它不仅寄生于单核-巨噬细胞系统，且可在胎盘绒毛上皮细胞、肾实质细胞、睾丸的纤维母细胞及胚胎细胞中繁殖，引起生殖器官和胎膜发炎、流产、不育和各种组织的局部病灶。人类对布鲁氏菌易感，一般羊种布鲁氏菌对人毒力最高。人与病畜接触后，细菌可通过消化道和呼吸道粘膜、皮肤及眼结膜等途径而感染。由于布鲁氏菌的细胞内寄生特性，致使抗生素等化学药剂对其防治效果较差，而只有机体产生的由T细胞介导的细胞免疫则是预防及控制该病的最为有效的措施。虽然目前应用的全菌减毒活疫苗、死疫苗及亚单位疫苗对于疾病的发生起到了一定的预防作用。但是由于不能诱导机体产生强而有效的细胞介导免疫，因而研究与开发新型疫苗对于控制疫情的蔓延已经成为一项重要的研究课题。由于布鲁氏菌的细胞内寄生特性，使其可以在巨噬细胞内长期潜伏，因此，接种疫苗的关键在于能够诱导机体产生具有记忆功能的适应性免疫应答，细胞介导免疫是针对布鲁氏菌病所需要的最重要的免疫应答。因此，选择能够诱导Thl型免疫应答的T细胞抗原研制亚单位疫苗或者选择编码T细胞抗原的基因制备DNA疫苗国内外已有一些报道。最近一些国家应用的牛种RB51、羊种REV.1及羊种M5(司瑞等，羊布鲁氏菌BCSP31、OMP31、L7/L12基因的原核表达载体构建及表达，中国人兽共患病杂志，1002-2694(2005)11-0961-04)(中国)减毒活疫苗，虽然可以分别用于牛和羊的免疫，然而，这些遗传性不确定的菌株仍可引起流产和持续性发热，致使其安全性和有效性出现了问题。目前已经证实的布鲁氏杆菌T细胞抗原包括BFR、P39、L7/L12、SOD及31KD蛋白等已经用于亚单位疫苗的实验研究，而这些蛋白抗原的编码基因也有用于DNA疫苗的实验研究。但目前国内外尚未见有关羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因序列和氨基酸序列的报道。由于现有疫苗存在诸多不足，同时人群对羊型布鲁氏杆菌最易感、毒性反应最强烈，因此造成了近年来布鲁氏菌病感染率呈直线上升趋势，对畜牧业的发展及人类的健康造成极大的危害。條选和鉴定羊型布鲁氏杆菌M5菌株L7/L12基因对开发新型疫苗及检测试剂盒具有极其重要的意义。
发明内容本发明的目的在于提供羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因、其编码蛋白及应用。L7/L12基因具有如序列表SEQIDNO.l所示的核苷酸序列，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDN0.2所示。本发明还包括序列表SEQIDNO:2所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质，以及编码这些蛋白质的基因。L7/L12基因全长438bp，5，非编码区长39bp，3'非编码区长24bp，自40bp414bp为其开放阅读框，编码124个氨基酸。在GenBank中进行同源搜索，未发现与该基因相同的序列报道，为一新基因。本发明基因可以通过如下方法获得以羊型布鲁氏杆菌M5菌株基因组DNA为模板，利用如序列表SEQIDN0.3和4所示的引物进行扩增，扩增条件是94'C预变性4min后，以94°C30s、55°C40s、72°C40s反应35个循环，72。C延伸10min。本发明还包括含有上述基因的表达载体、含有所述表达载体的宿主细胞。利用本发明的基因可以用来制备基因疫苗，如通过本发明的序列设计合成siRNA或者shRNA或者是microRNA用于基因沉默。也可以通过制备本发明基因的表达蛋白，研发重组蛋白疫苗，或者是开发检测试剂盒。本发明的基因具有极其重要的价值，通过本发明基因开发出的相关基因工程产品，可以有效地用于布鲁氏菌病的检测、预防和治疗。为布鲁氏菌病提供有新的有效的解决途径。图1为PCR获得的目的基因片段L7/L12的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图中1为DL2000DNAMarker;2、3为PCR产物。具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例l羊型布鲁氏杆菌M5核糖体蛋白L7/L12基因的获得及鉴定1.羊型布鲁氏杆菌M5菌株的培养首先用布氏肉汤培养基复苏羊型布鲁氏杆菌M5株冻干菌(CMCC55009,购自中国药品生物制品检定所)，布氏肉汤培养基(购自中国进出口商品检验技术研究所)固体斜面上进行划线培养，37°C、5呢CO2条件下培养10天，待布鲁氏杆菌在固体斜面上生长形成肉眼可见的单菌落后，用接种环小心刮取单个菌落，接种到液体布氏肉汤培养基中，37°C水洛摇床培养24hr后得到浓度适宜的菌液。2.提取细菌全基因组DNA将培养得到的浓度适宜的菌液用(离心柱型)细菌基因组DNA提取试剂盒(购自天为时代公司)获得羊型布鲁氏杆菌M5菌株的全基因组DNA,参照试剂盒说明书操作，收集浓度适宜的布鲁氏杆菌培养液3ml，10000rpm离心lmin,弃上清；加200ul缓冲液GA，悬浮沉淀，加入20ul蛋白酶K(20mg/ml)溶液，混匀；加入220ul缓冲液GB，充分混匀，70。C放置10min;加入220ul无水乙醇，混勻；将所得的溶液和絮状沉淀加入吸附柱CB中，12000rpm离心30s，弃废液；加500ul蛋白液GD，12000rpm离心30s,弃废液；加入700ul漂洗液GW,12000rpm离心30s,弃废液；加入500ul漂洗液GW，12000rpm离心30s,弃废液；将吸附柱CB放回废液收集管中，12000rpm离心2min;将吸附柱转入一个干净的离心管中，加入200ul洗脱缓冲液TE(60-70。C水洛预热)，混匀，室温放置5min,12000rpm离心30s;得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2min,12000rpm离心2min，离心得到的溶液即为基因组DNA溶液。最后在260nm波长下检测DNA浓度。3.PCR扩增获得L7/L12基因以上述操作方法2所得到的基因组DNA为模板，设计引物(上游引物5，-CTGTCAACAGTTCAAACCTTAAT-3，(SEQIDN0.3);下游引物5，-AACATCCGCCAGAATAGTCC-3，(SEQIDNO.4))，PCR方法扩增目的基因片段。具体实验方案36.6ul灭菌六蒸水，6.6ulMgCl2(25mM)，各1.2ul上下游引物(100uM),6ulbuffer(10xExTaqBuffer,Mg2+free),4.8uldNTPMixture(2.5mM)，3.0ul模板(4.4326ug/ml)，0.6ulExTaqDNA聚合酶(5U/ul)，于终体积为60ul反应体系中进行如下PCR循环94。C预变性4min后，以94°C30s、55。C40s、72。C40s反应35个循环，72。C延伸10min。反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为0.8%,电压为110V。电泳结東后，用(离心柱型)琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天为时代)回收目的电泳条带(参照说明书)，得到目的基因片段。4.核糖体蛋白L7/L12基因序列测定将上述经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳并回收纯化得到的目的基因片段连接入pMD19-TSimpleVector(购自大连宝生物TaKaRa公司)中，并转化入感受态DH5(x中，接种到LB细菌培养基平板(内含终浓度为100ug/mlAmp,0.5mMIPTG,80ug/mlX-gal)培养12hr,进行蓝白筛选。小心挑取筛选得到的阳性菌落接种到LB液体培养基中(内含终浓度为100ug/mlAmp)进行扩增，37。C水洛摇床培养12hr。取适量的阳性菌培养液，由上海生工生物工程有限公司进行DNA序列测定。其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.l所示。将测定的核糖体蛋白L7/L12的基因序列结果与GenBank中公布的DNA序列进行比较，结果显示，本发明获得的核糖体蛋白L7/L12的基因序列与公布的布鲁氏杆菌核糖体蛋白L7/L12的基因序列存在较多差异，为一个新的羊型布鲁氏杆菌核糖体蛋白L7/L12基因序列。实施例2羊型布鲁氏菌M5株L7/L12基因与(对照菌株)16M株效果比较目的考察由羊型布鲁氏菌M5株(CMCC55009)获得的核糖体蛋白L7/L12基因的免疫效果，同时与对照菌株羊型布鲁氏菌16M株来源的核糖体蛋白L7/L12的免疫效果进行比较。一、质粒构建将PCR获得的M5株的L7/L12基因(L7/L12S)与全序列合成的16M株L7/L12基因(L7/L1216,GenBankL27819)分别构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，得到pcDNA3.1(+)-L7/L125和pcDNA3.1(+)-L7/L1216两种质粒。将构建得到的上述两种质粒分别转染大肠杆菌五.co/fDH5a,并在含有100ug/ml氨苄青霉素进行筛选。筛选得到的阳性克隆进行扩大培养，大量提取重组质粒，用0.01MPBS(pH7.2)缓冲液稀释质粒至1000ug/ml。二、实验动物及试剂1.实验动物选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠为实验动物(购自中国医学科学院实验动物研究所)，共分为6组，每组10只。分别为pcDNA3.1(+)-L7/L125组、pcDNA3.1(+)-L7/L125+CpGODN1826组、pcDNA3.1(+)-L7/L12"组、pcDNA3.1(+)-L7/L1216+CpGODN1826组、PBS组和pcDNA3.1(+)组。分别肌注O.lml质粒/只各自的质粒。力口CpGODN1826的两组则除注射O.lml质粒/只外尚注射10pg/只CpGODN1826,PBS组注射同等剂量的0.01MPBS(pH7.2)。各组均在初次免疫后第2周和第4周分别加强免疫一次，注射部位及剂量同初次免疫。于第2次加强免疫后2周经眶静脉釆血、离心分离血清；拉颈处死小鼠，无菌取脾，制备细胞悬液2x107。2.主要试剂CpGODN1826(5，-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3，)，由上海生工生物工程公司合成，全链硫代嫌酸化修饰，PAGE纯化；羊抗小鼠IgGrHRP、IgG2a-HRP、IL-2、IL-4、IL-10及IL-12检测试剂盒购自晶美生物；ConA和MTT购自Sigma。三、检测方法1.抗体亚类IgG2a/IgGi的测定釆用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测IgG2a/Ig^将获得的M5株的L7/L12基因(L7/L12S)原核表达载体PET32a(+)中得到PET32a(+)-L7/L125,转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆，10Ommol/LIPTG诱导重组L7/L12蛋白(rL7/L125)的表达。将纯化得到的重组蛋白rL7/L12S包被酶标板，分别将阴性、阳性对照及倍比稀释的待测血清加入预包被的96孔反应的相应孔中，5(HU/孔，每孔加入羊抗小鼠IgGrHRP或IgG2a-HRP5(^1,混匀，设三复孔及空白对照孔(不加酶标抗体)，置37。C恒温反应60分钟。洗涤五次，每孔加显色剂A和显色剂B各50pl，37。C避光显色IO分钟，每孔加入终止液1滴(50pl),混匀，在酶标仪上检测波长490nm处三复孔平均OD值作为判定标准。样品孔OD值2阴性对照平均OD值x2.1时，该孔样品抗rL7/L12Slg^或IgG^为阳性；反之，为阴性。2.IFN-y测定取免疫小鼠血清作为待测样品，操作方法按试剂盒说明书，结果以标准品浓度作为横坐标，以OD，值作为纵坐标，绘制标准曲线，将待测样品的OD值在标准曲线上查出相应浓度。3.IL-2含量测定取免疫小鼠血清作为待测样品，操作方法按试剂盒说明书，结果以标准品浓度作为横坐标，以OD49o值作为纵坐标，绘制标准曲线，将待测样品的OD值在标准曲线上查出相应浓度。4.IL-12测定(ABC-ELISA法)以免疫小鼠血清作为待测标本，按试剂盒说明书操作，结果以标准品浓度作为横坐标，以OD49。值作为纵坐标，绘制标准曲线，将待测样品的OD值在标准曲线上查出相应浓度。5.IL-4活性测定(ABC-ELISA法)除空白孔外，以免疫小鼠血清作为待测标本，按试剂盒说明书操作，结果以标准品浓度作为横坐标，以OD490值作为纵坐标，绘制标准曲线，将待测样品的OD值在标准曲线上查出相应浓度。6.IL-10活性测定(ELISA法)将加强免疫小鼠血清作为待测标本，按试剂盒说明书操作，结果以标准品浓度作为横坐标，以OD49o值作为纵坐标，绘制标准曲线，将待测样品的OD值在标准曲线上查出相应浓度。7.淋巴细胞增殖试验2xl06的脾淋巴细胞按100ul/孔加入96孔细胞培养板，分别设3个复孔，刺激组每孔加2ugConA,37。C含5y。C02细胞培养箱中培养72h;加入MTT50ug/孔，37。C继续培养4h后，加入二甲基亚砜(DMSO)，于酶标仪570nm波长处测吸光度(A57Q值)，结果以均数±牛示>|#(mean土SD)*示。四、实验结果1.抗重组蛋白rL7/L125抗体亚类检测结果表明，构建得到的pcDNA3.1(+)-L7/L125和pcDNA3.1(+)-L7/L1216两种重组质粒均可以有效诱导Balb/c小鼠产生抗体，并且产生的IgG抗体亚类以Thl型IgG2a为主；同时，在有无CpGODN1826为佐剂的情况下，pcDNA3.1(+)-L7/L125重组质粒诱导的IgG抗体亚类IgG2a/IgGl比值分别高于pcDNA3.1(+)-L7/L12"相应组(如表1所示)。表1.抗体亚类(IgG2a/1gG1)检测结果组另'j_IgG2a/IgGlpcDNA3.1(+)-L7/L1251.326:1pcDNA3.1(+)-L7/L125+CpGODN18261.402:1pcDNA3.1(+)-L7/L12161.311:1pcDNA3.1(+)-L7/L1216+CpGODN18261.386:1PBS1:1pcDNA3.1(+;)1.021:12.免疫小鼠血清IFN-y检测结果表明，构建得到的pcDNA3.1(+)-L7/L125和pcDNA3.1(+)-L7/L1216两种重组质粒均可以有效诱导Balb/c小鼠产生IFN-y;并且，在CpGODN1826为佐剂的情况下，pcDNA3.1(+)-L7/L125重组质粒诱导产生IFN-y的量高于pcDNA3.1(+)-L7/L12"相应组(如表2所示)。_表2.IFN-Y测定结果__^_IFN-y(IU/ml)_pcDNA3.1(+)-L7/L1255.113±0.108pcDNA3.1(+)-L7/L125+CpGODN182615,132±0.169pcDNA3.1(+)-L7/L12165.106±0.215pcDNA3.1(+)陽L7/L1216+CpGODN182613.618±0.202PBS3.203±0.151pcDNA3.1(+)3.326±0.1833.免疫小鼠血清IL-2和IL-12检测结果表明，构建得到的pcDNA3.1(+)-L7/L125和pcDNA3.1(+)-L7/L1216两种重组质粒均可以有效诱导Balb/c小鼠产生IL-2和IL-12;并且，在有无CpGODN1826为佐剂的情况下，pcDNA3.1(+)-L7/L12S重组质粒诱导的IL-12分别高于pcDNA3.1(+)-L7/L12"相应组(如表3所示)。表3.IL-2和IL-12检测结果组别IL-2(IU/ml)IL-12(IU/ml)pcDNA3.1(+)-L7/L125pcDNA3.1(+)-L7/L125+CpGODN1826pcDNA3.1(+)-L7/L1216pcDNA3.1(+)-L7/L1216+CpGODN1826PBSpcDNA3.1(+)110.332±8.352326.520±32.016102.622±10.643322.838±18.55120.012±5.30826.166±4.238623.083±12.362986.136±28.518562.863±22.406963馬±31.61652.268±8.46560.306±6.5364.免疫小鼠血清IL-4和IL-10测定结果说明，在有无CpGODN1826为佐剂的情况下，构建得到的pcDNA3.1(+)-L7/L125诱导Balb/c小鼠产生IL-4和IL-10的量分别低于pcDNA3.1(+)-L7/L1216重组质粒的相应组(如表4所示)。表4.IL-4和IL-10检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>5.免疫小鼠脾细胞增殖试验结果表明，构建得到的pcDNA3.1(+)-L7/L125和pcDNA3.1(+)-L7/L1216两种重组质粒均可以有效增强Balb/c小鼠脾细胞增殖；并且，在有无CpGODN1826为佐剂的情况下，pcDNA3.1(+)-L7/L125重组质粒刺激脾细胞增殖效果好于pcDNA3.1(+)-L7/L12"重组质粒诱导的相应组(如表5所示)。表5.脾淋巴细胞增殖实验结果(平均值士SD)组别自发增值刀豆蛋白ApcDNA3.1(+)-L7/L1251.103±0扁1.226±0.063pcDNA3.1(+)-L7/L125+CpGODN18261.121±0劍1.356±0.038pcDNA3.1(+)-L7/L12161.096±0.0411.208±0.026pcDNA3.1(+)-L7/L1216+CpGODN18261.118±0.0351.302±0.045PBS1.018±0.0431.215±0.052pcDNA3.1(+)1.056±0.0361.263±0扁五、结论上述实验结果显示，PCR获得的M5株的L7/L12基因(L7/L125)可以有效诱导Balb/c小鼠产生Thl型为主的免疫应答，并且诱导的免疫效果好于全序列合成的16M株L7/L12基因(L7/U216),在抗羊型布鲁氏杆菌核酸疫苗、蛋白疫苗以及相应的检测方法等多个方面具有较大的开发应用前景。<110>内蒙古大学<120>羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因、其编码蛋白及应用〈130〉<160><170>4Patentlnversion3.3<210>〈211>〈212><213><220><221><222>〈400〉1438DNA羊型布鲁氏杆菌M5菌株CDS(40).1(414)ctgtcaacagttcaaaccttaattataggaaatacaaaaatggetgatetcgcaMetAlaAspLeuAla1aeigateLysliectgtecLeuSergtcgetValAlagaaaagGluLys55ateaaclieAsn70g33gCCGluAlagcctegAlaSerggcgccGlyAlagttValaagLysgttVal40ThrgtgVal卿LysaagLysaagLysgaaGlucttLeu25getAlagaaGluateliegacAspgacAsp105gttValg3CAsp10etcLeugetAlattcPheaagLysttgLeu90gaaGluGlucttLeug肪GlugccAlagacAspgaaGlu75gtcValgetAlaetcLeutegSerg恥GluggtGlygtcVal60gtgValg犯GlugagGlu肌gLysgccAla肌gLysggcGly45gttValcgcArgggcGly卿LysctgLeutggTrp30getAlaetcLeuAlagetAlaatelie110accThr15ggcGlygccAlagetAlaetcLeuccgPro95朋gLysgttValgttValcctProAspaccThr80肌gLysgcaAlactgLeutegSergetAlaggcGly65ggtGlygetAlaGing肌GlugetAlagetAla50ggcGlyetcLeugtcValetcLeugccAlagetAla35gccAlagetAlaggcGlyaagLysgaaGlu1155getgsgAlaGlu20getccgAlaProAlaGluasc朋gAsnLysetcaagLeuLys85gaaggcGluGly100getgetAlaAlat肌gtttggactattctggcggatgtt54102150198246294342390438120〈210〉2〈211〉124<212>PRT<213>羊型布鲁氏杆菌M5菌株〈400〉2MetAlaAspLeuAlaLyslieVal15LeuGluAlaAlaGluLeuSerLys20AlaAlaAlaProValAlaSerAlaGly65GlyAlaGinAla50GlyLeuValLeuAla35AlaAlaGlyLysGlu115AlaGluGluLys55AsnLyslieAsn70LeuLysGluAla85GluGlyAlaSer100AlaAlaGlyAlaVal40ThrValLysLysLys120GluAspLeuSerAlaLeuThrVal1015LeuLeuGluGluLysTrpGlyVal2530AlaAlaAlaGlyGlyAlaAlaPro45GluPheAspValValLeuAlaAsp60lieLysGluValArgAlaLeuThr7580AspLeuValGluGlyAlaProLys9095AspGluAlaGluLyslieLysAla105110ValGluLeuLys<210>3<211>23<212>DNA<213〉人工序列<400>3ctgtcaacagttcaaaccttaat23<210>4〈211>20<212>腿〈213>人工序列<400〉4a3C8tccgccagaatagtcc20权利要求1、羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因，其编码具有下述氨基酸序列的蛋白a)SEQIDNO.2所示氨基酸序列，或b)SEQIDNO.2所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2、如权利要求l所述的基因，其具有如SEQIDNO.l所示的核苷酸序列。3、含有权利要求1或2所述基因的表达载体。4、含有权利要求3所述表达载体的宿主。5、权利要求1或2所述基因编码的蛋白质。6、权利要求1或2所述的基因在制备核酸疫苗中的应用。7、权利要求l或2所述的基因在制备检测试剂盒中的应用。8、权利要求5所述的蛋白质在制备蛋白疫苗中的应用。9、权利要求5所述的蛋白质在制备检测试剂盒中的应用。全文摘要本发明提供了羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因、其编码蛋白质及应用。本发明所述的基因，其编码蛋白具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列。利用本发明的基因可以用来制备基因疫苗，如通过本发明的序列设计合成siRNA或者shRNA或者是microRNA用于基因沉默。也可以通过制备本发明基因的表达蛋白，研发重组蛋白疫苗，或者是开发检测试剂盒，为布鲁氏菌病提供有新的有效的解决途径。文档编号C12N15/31GK101177684SQ20071017648公开日2008年5月14日申请日期2007年10月29日优先权日2007年10月29日发明者旭日干,石艳春,郑源强申请人:内蒙古大学