专利名称：：一种提取猪血抗菌肽的方法
技术领域：
：本发明涉及一种提取抗菌肽的方法，特别是关于一种提取猪血抗菌肽的方法。技术背景目前，由于抗生素的大量滥用，传统抗生素耐药性的问题越来越引起人们的关注，寻求一种无残留、无耐药性的新型抗菌药物已成为当务之急。抗菌肽因为其高效的抑菌效果和广泛而稳定的生物活性，逐渐引起人们的兴趣和关注。抗菌肽具有广谱、高效的抗微生物活性，还能促进动物生长，诱导动物的获得性免疫。而且其独特的抗菌机理不会使微生物产生耐药性，在机体内无残留，具有良好的应用开发前景，抗菌肽的应用可能会带来一场抗微生物战略的新革命。我国是养猪业大国，猪血是生猪屠宰加工的废弃物，如何使该废弃物产生高值化的利用，具有废弃物加工利用和公共卫生等多方面的重要意义。有关研究确认，猪血中具有较强抗菌活性的多肽，因此开发研究一种从猪血中提取、纯化抗菌肽的成熟方法，可以一举多得。而目前在国内外还未见有从猪血中提取抗菌肽的技术方法和产品。
发明内容本发明的目的是提供一种提取猪血抗菌肽的方法。本发明提取猪血抗菌肽的方法，包括以下步骤1)将猪血粉溶入缓冲液中，然后在混合液中加入木瓜蛋白酶进行酶解，调整酶解液的pH为3.54.5;2)将氯仿和亚硫酸氢钠加入到所述酶解液中进行脱色，然后调整脱色后酶解液的pH值至6.07.0，成为猪血抗菌肽的粗提物。对所述粗提物进行以下纯化步骤，可得到纯化的猪血抗菌肽精制品1)冷冻干燥所述猪血抗菌肽的粗提物，并将所述粗提物过凝胶型阳离子交换柱，对交换柱进行洗脱，收集洗脱液；2)对所述洗脱液进行真空冷冻干燥，成为猪血抗菌肽。在上述过程中，缓冲液可以是pH-7.0、浓度为0.05mmol/L的磷酸氢二钠一柠檬酸混合液。猪血粉与所述木瓜蛋白酶的重量份数之比为100:13。酶解的温度为65—75"C，酶解的时间为810h。脱色过程中，所述氯仿与所述酶解液体积份数之比为23:5;亚硫酸氢钠的终质量百分浓度为0.5%1.0%。冷冻干燥猪血抗菌肽粗提物的温度一般为-50-60°C，冷冻时间为24h48h。凝胶型阳离子交换柱可选择S印hadexG100凝胶柱；洗脱液可以为0.2mol/L的乙酸铵，洗脱的速度为10.0mL/cm2.h;对洗脱液进行真空冷冻干燥的温度一般为-50-60°C，冷冻干燥的时间为24h48h。本发明的原料猪血粉可以在市场上购买普通的猪血粉成品，也可以自行用以下方法进行制备，制备的方法包括以下步骤1)对新鲜猪血进行抗凝处理；2)对所述猪血进行过滤，去除其中的纤维物质；3)再对滤下物进行反复冻融，冷冻干燥，制成猪血粉。本发明研究了猪血中的低分子肽类物质的分离纯化技术，并对分离纯化的肽类物质的生物学活性进行了研究，结果表明猪血中多种肽类物质对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌等常见的致病菌有明显的抑制作用；猪血多肽还对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)均有显著的灭活作用。更有意义的是，本发明分离到的多肽可提高机体非特异性免疫功能、鸡特异性免疫血清抗体水平和肠道黏膜免疫功能，并且能提高雏鸡日增重、降低料重比，促进鸡胚和雏鸡的生长发育。研究结果表明本发明方法生产的猪血抗菌肽是一种新型的绿色抗微生物制剂和免疫调节剂，可广泛用于生猪屠宰厂等畜牧生产企业、饲料生产或饲料添加剂生产企业。本发明具有以下优点1、本发明方法实现了从猪血中提取具有较强抗菌活性的多肽物质，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法。2、采用本发明方法生产的抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌等特点，是一种新型的绿色抗微生物药物。3、采用本发明方法生产的抗菌肽，具有广谱抗菌、抗病毒、不产生耐药性、有免疫调节作用等功能。4、本发明方法操作方便，所需设备简单，分离提取率高。5、实施本发明方法的原料猪血来源丰富，价格低廉，可以满足大规模深化加工的需要，具有很强的开发应用推广价值。原料猪血属于生猪屠宰加工的废弃物，本发明方法可使废弃物得到高值化的利用，因此本发明具有重要的公共卫生学意义。图1是猪血抗菌肽粗提物经S印hadexG100凝胶柱的层析曲线图图2是猪血抗菌肽洗脱液对鸡多杀性巴氏杆菌的抗菌实验效果图具体实施方式实施例1、从猪血中提取猪血抗菌肽1、从屠宰场收集1L新鲜猪血，然后，按6g/L血液的用量迅速加入柠檬酸三钠抗凝，然后用纱布过滤，去除其中的纤维物质，对滤下物进行反复冻融得溶血液(在-2(TC和4。C之间冻融1一3次)，冷冻干燥，制成猪血粉。此步骤的目的是破碎猪血细胞，释放血红蛋白。猪血粉也可以采用市售的成品猪血粉。2、将2g猪血粉溶入200ml的pH为7.0、浓度为0.05mmol/L的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液(吕世明，谭艾娟。木瓜蛋白酶对猪血粉蛋白的水解作用。贵州农业科学，2001，29(4):67)中，然后在混合液中加入20mg的木瓜蛋白酶(血粉酶=100:1100:3即可)，在70°C(65—75。C均可)条件下进行酶解810h。然后用6mol/LHC1调整酶解液的pH为3.54.5，以消灭残留的活性酶。3、向酶解液中加入2/53/5酶解液体积的氯仿和终浓度为0.5%1.0%的亚硫酸氢钠，406(TC条件下水浴30rain，进行脱色、分液，取上清液。将该脱色过程重复3次，至上清液脱为无色。4、滴加1raol/LNaOH，将脱色后的酶解液调整其pH值至6.07.0，成为猪血抗菌肽的粗提物。5、采用真空冷冻干燥机，将猪血抗菌肽的粗提物进行常规真空冷冻、干燥(冷冻温度为-50-6(TC，干燥时间为2448h)，制成猪血抗菌肽粗提物干粉。然后取5g粗提物干粉置于S印hadexG-100凝胶离子交换柱中，用0.2mol/L的乙酸铵洗脱液对粗提物进行洗脱分离，流速为10.0mL/cm2.h，收集约40mL洗脱液。如图1所示，猪血提取物经S印hadexG100凝胶柱层析后出现1个洗脱峰。将各收集管的组分取20uL进行抑菌试验。6、收集洗脱液的同时，经核酸蛋白检测仪，采用琼脂糖弥散方法对收集的洗脱液进行检测，检测收集液对鸡多杀性巴氏杆菌的抗菌作用。结果显示，从第13管即有抑菌圈出现，至第23管抑菌圈消失，最大抑菌圈出现在第17—21管。(图2所示为第l-18管的情况)。合并具有抑菌作用的洗脱液，在-2(TC进行真空冷冻干燥，成为猪血抗菌肽。在-20。C条件下对猪血抗菌肽保存。实施例2、猪血抗菌肽抗菌、抗病毒的试验1、猪血抗菌肽的抗菌活性实验采用琼脂糖弥散法，对实施例1从猪血中提取的猪血抗菌肽进行抗菌活性检测。供试细菌有鸡多杀性巴氏杆菌、鸡致病性沙门氏菌自然分离株、大肠杆菌088、金黄色葡萄球菌ACTT25923株、绿脓杆菌ACTT27853株。猪血抗菌肽抗菌活性的测定结果表明，猪血抗菌肽对鸡多杀性巴氏杆菌、鸡致病性沙门氏菌、大肠杆菌088、金黄色葡萄球菌ACTT25923株、绿脓杆菌ACTT27853株均有明显的抑制作用，具体结果如表l所示。表l猪血抗菌肽对不同菌株的抑菌效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>"-"5ram以下。结果表明，猪血抗菌肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较强的抑菌作用。2、猪血抗菌肽的抗病毒活性实验取10日龄鸡胚12枚，随机分为3组。I组(NDV组)接种鸡新城疫病毒；II组(ABP处理组)接种经本发明猪血抗菌肽处理的NDV;III组(对照组)接种灭菌生理盐水。每枚鸡胚尿囊腔接种样品O.1mL。尿囊腔接种后，每12h照蛋一次，观察鸡胚发育情况。到18日龄，剖杀鸡胚，观察鸡胚变化，称重，并取其尿囊液冷冻保存，进行NDV血凝效价的测定。实验结果如下(1)鸡胚的大体病变鸡胚接种病毒液后的第4天，可见NDV组鸡胚运动减弱。接种后的第8天，剖检鸡胚进行观察，可见NDV组鸡胚卵黄囊收縮，囊膜易撕裂尿囊液增多；出现矮小胚，羊膜增厚并粘连在胚体上。而ABP处理组和对照组的鸡胚发育正常。(2)各处理组鸡胚重量的比较用吸水纸拭干鸡胚，称重，ABP处理组鸡胚重量与对照组差异不显著，而病毒组鸡胚重量明显低于前两组(如表2所示)。表2不同处理之间鸡胚重量的比较(I土S，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>NDV血凝效价测定结果如表3所示。表3鸡胚尿囊液中NDV的血凝效价(i±S，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3备注组间均数进行。检验，标有不同字母者表示差异极显著(P〈0.01)，标有相同字母者表示差异显著(p<0.05)。由此可以看出，经猪血抗菌肽处理的病毒液，由于病毒与猪血抗菌肽的相互中和作用，使得病毒的致病力丧失或减弱，不能在鸡胚内大量繁殖，因而表现为病毒的血凝效价较低。从而说明猪血抗菌肽对病毒有较强的灭活作用。权利要求1、一种提取猪血抗菌肽的方法，包括以下步骤1)将猪血粉溶入缓冲液中，然后在混合液中加入木瓜蛋白酶进行酶解，调整酶解液的pH为3.5～4.5；2)将氯仿和亚硫酸氢钠加入到所述酶解液中进行脱色，然后调整脱色后酶解液的pH值至6.0～7.0，成为猪血抗菌肽的粗提物。2、如权利要求1所述的方法，其特征在于对所述粗提物进行以下纯化步骤:1)冷冻干燥所述猪血抗菌肽的粗提物，并将所述粗提物过凝胶型阳离子交换柱，对交换柱进行洗脱，收集洗脱液；2)对所述洗脱液进行真空冷冻干燥，成为猪血抗菌肽。3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述缓冲液是pH习.O、浓度为0.05raraol/L的磷酸氢二钠一柠檬酸混合液。4、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述猪血粉与所述木瓜蛋白酶的重量份数之比为100:13。5、如权利要求4所述的方法，其特征在于所述酶解的温度为65—75。C，酶解的时间为810h。6、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述氯仿与所述酶解液体积份数之比为23:5;亚硫酸氢钠的终质量百分浓度为0.5%1.0%。7、如权利要求2所述的方法，其特征在于所述冷冻干燥猪血抗菌肽粗提物的温度为-50-60°C，冷冻时间为24h48h。8、如权利要求2所述的方法，其特征在于所述凝胶型阳离子交换柱为S印hadexG100凝胶柱；所述洗脱液为0.2mol/L的乙酸铵，洗脱的速度为10.0mL/cra2.h;对所述洗脱液进行真空冷冻干燥的温度为-50-60°C，冷冻干燥的时间为24h48h。9、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述猪血粉的制备包括以下步骤1)对新鲜猪血进行抗凝处理；2)对所述猪血进行过滤，去除其中的纤维物质；3)再对滤下物进行反复冻融，冷冻干燥，制成猪血粉。全文摘要本发明公开了一种提取猪血抗菌肽的方法，该方法包括以下步骤1)将猪血粉溶入缓冲液中，然后在混合液中加入木瓜蛋白酶进行酶解，调整酶解液的pH为3.5～4.5；2)将氯仿和亚硫酸氢钠加入到所述酶解液中进行脱色，然后调整脱色后酶解液的pH值至6.0～7.0，成为猪血抗菌肽的粗提物。为了得到猪血抗菌肽的精制品，对所述粗提物进行以下纯化步骤1)冷冻干燥所述猪血抗菌肽的粗提物，并将所述粗提物过凝胶型阳离子交换柱，对交换柱进行洗脱，收集洗脱液；2)对所述洗脱液进行真空冷冻干燥，成为猪血抗菌肽。本发明为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法。本发明方法具有操作简单、分离提取率高、成本低的特点，适用于较大量的从猪血中分离纯化抗菌肽。文档编号C12P21/00GK101250572SQ20071017647公开日2008年8月27日申请日期2007年10月29日优先权日2007年10月29日发明者叶丁,佘锐萍,刘天龙,包汇慧,张艳梅,李文贵,王德成,罗冬梅,胡艳欣申请人:中国农业大学