专利名称：一种用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物检测领域，特别是药物成分检测领域。
二背景技术：
如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重 大障碍，
三
发明内容
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种用于检测具有降压功能的药 物成分的蛋白芯片，对生物分子准确、快速、大信息量的检测。本发明的另一 个目的是提供其制法，制法简单易操作，产品性能稳定，本发明最后的目的是 提供其检测方法，操作简单，结果准确。
本发明为实现上述目的所采用的方案是 一种用于检测具有降压功能的药 物成分的蛋白芯片，BSA-NHS玻片上固定有靶蛋白血管紧张素转换酶或肽基二肽 水解酶。
所述玻片上的靶蛋白分为若干个区域，区域间为亲水处理带。
本发明蛋白芯片的制法，具体步骤为
第一步玻片制作N， N-碳酸双羟琥亚胺酯(100mmol/L)和N， N-二异丙基 乙胺(100ramol/L)溶于无水N， N-二甲基甲酰胺中配制成混合液，将醛基化玻片 浸入上述混合液中室温条件下浸泡3h，取出玻片后用95%乙醇冲洗玻片两次， 再将玻片浸入磷酸盐缓冲液中室温下浸泡12h，取出玻片先后用蒸馏水冲洗玻片 两次、95%乙醇冲洗玻片两次，离心以甩掉多余溶液，最后将玻片浸入N， N-二
甲基甲酰胺中室温下放置3h，取出玻片后用95%乙醇冲洗玻片4遍，离心即成 为BSA-NHS玻片，室温下贮存于真空干燥器中，2个月无明显的活性丢失；
第二步固定耙蛋白待固定的耙蛋白溶于40%的甘油和60%的磷酸盐缓冲液 的混合液，靶蛋白终浓度为100 ug/ml，将上述靶蛋白溶液用点样机点至第一 步制得的醛基化玻片上，室温湿室放置3h，倒转玻片浸入磷酸盐缓冲液中，一 分钟后取出玻片并将玻片正向浸入BSA溶液中，室温下轻度振荡放置lh，取出 玻片，用磷酸盐缓冲液冲洗玻片即制得用于检测具有降压功能的药物成分的蛋 白芯片。
所述第一步玻片制作N， N-碳酸双羟琥亚胺酯(100mmol/L)和N， N-二异 丙基乙胺(100mmol/L)溶于无水N, N-二甲基甲酰胺中，三者按1: 1: 2重量比 配制成混合液，将醛基化玻片浸入上述混合液中室温条件下浸泡3h，取出玻片 后用95%乙醇冲洗玻片两次，再将玻片浸入浓度0.2mol/L磷酸盐缓冲液中室温 下浸泡12h，取出玻片先后用蒸馏水冲洗玻片两次、95%乙醇冲洗玻片两次，离 心以甩掉多余溶液，最后将玻片浸入浓度99%的N， N-二甲基甲酰胺中室温下放 置3h，取出玻片后用95%乙醇冲洗玻片4遍，离心即成为BSA-NHS玻片，室温 下贮存于真空干燥器中，2个月无明显的活性丢失；
第二步固定靶蛋白待固定的靶蛋白溶于40%的甘油和60%的磷酸盐缓冲液 的混合液，靶蛋白终浓度为100 lig/ml，将上述靶蛋白溶液用点样机点至第一 步制得的醛基化玻片上，室温放置3h，倒转玻片浸入0.2mol/L磷酸盐缓冲液中， 一分钟后取出玻片并将玻片正向浸入20ijg/mL BSA溶液中，室温下轻微振荡放 置lh，取出玻片，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液冲洗玻片即制得用于检测具有降压 功能的药物成分的蛋白芯片。
所述第二步固定靶蛋白蛋白点样至玻片上室温下放置3h，倒转浸入磷酸 盐缓冲液一分钟后取出玻片并将玻片正向浸入甘氨酸溶液，室温下轻微振荡放 置lh，取出玻片即制得用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片。
所述醛基化玻片为30CMT-GAP玻片，表面带有氨基， 所述靶蛋白在玻片上被分为若干区域，区域间做疏水处理。
本发明用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片检测药物成分的方 法采用荧光检测法，荧光标记待测蛋白(与固定蛋白配对特异结合)后用磷酸 盐缓冲液稀释，加样至玻片固定靶蛋白上，室温湿室反应lh，取出玻片，磷酸 盐缓冲液冲洗，再用磷酸盐缓冲液与0.1%吐温20按10: 1体积比混合液(PBST) 洗3次，每次3min。然后，磷酸盐缓冲液冲洗2次，离心l-2min甩掉多余缓 冲液，用荧光检测仪观测荧光结果。
本发明蛋白芯片将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面 行成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析 系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。能够大规模地筛选、 通用性强，能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用芯片分析用药前 后机体的不同组织、器官基因表达的差异。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明不限于具体实施例。
实施例1
按下述方法制备一种用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片， BSA-NHS玻片上固定有靶蛋白血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,用于检测含有待测蛋白血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)， R-P-P-G-F-S-P-F-R。
第一步玻片制作购买醛基化玻片——30CMT-GAP玻片，表面带有氨基；将 N， N-碳酸双羟琥亚胺酯(100mmol/L)和N， N-二异丙基乙胺(100mmol/L)溶于无 水N， N-二甲基甲酰胺中，三者按l: 1: 2重量比配制成混合液，将醛基化玻片 浸入上述混合液中室温条件下浸泡3h，取出玻片后用95%乙醇冲洗玻片两次，再将玻片浸入浓度0.2mol/L磷酸盐缓冲液中室温下浸泡12h，取出玻片先后用 蒸馏水冲洗玻片两次、95%乙醇冲洗玻片两次，离心以甩掉多余溶液，最后将玻 片浸入浓度99％的N， N-二甲基甲酰胺中室温下放置3h，取出玻片后用95%乙醇 冲洗玻片4遍，离心即成为BSA-NHS玻片，室温下贮存于真空干燥器中，2个月 无明显的活性丢失
第二步固定靶蛋白待固定的靶蛋白溶于40%的甘油和60%的磷酸盐缓冲液 的混合液，耙蛋白终浓度为100 μg/ml，将上述耙蛋白溶液用点样机点至第一 步制得的醛基化玻片上，室温放置3h，倒转玻片浸入0.2mol/L磷酸盐缓冲液中， 一分钟后取出玻片并将玻片正向浸入20μg/mL BSA溶液中，室温下轻微振荡放 置lh，取出玻片，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液冲洗玻片即制得用于检测具有降压 功能的药物成分的蛋白芯片。
实施例2
按下述方法制备一种用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片， BSA-NHS玻片上固定有靶蛋白肽基二肽水解酶EC 3.4.15.1)，待测蛋白血管 紧张素转换酶抑制剂(ACEI)， pE-G-R-P-L-G-P-P-1-P-P。
第一步制作玻片与实施例1相同；
第二步固定靶蛋白待固定的靶蛋白溶于40%的甘油和60%的磷酸盐缓冲液 的混合液，靶蛋白终浓度为100 μg/ml，用点样机将靶蛋白点样至玻片，室温 下放置3h，倒转浸入磷酸盐缓冲液一分钟后取出玻片并将玻片正向浸入甘氨酸 溶液中，室温下轻度振荡放置lh，取出玻片，固定靶蛋白被分为若干区域，区 域间做疏水处理，即制得用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片。
实施例3
采用上述方法制得的用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片进行药物成分检测，具体检测方法为
用荧光检测法荧光标记待测蛋白(与固定蛋白配对特异结合)后用磷酸盐
缓冲液稀释。加样至玻片固定蛋白上，室温湿室反应lh。取出玻片，磷酸盐缓
冲液冲洗，再用PBST(磷酸盐缓冲液中加O. 1% TWEEN-20)洗3次，每次3min。 然后，磷酸盐缓冲液冲洗2次，离心l-2min甩掉多余缓冲液。用荧光检测仪 观测荧光结果。荧光检测仪包括激发和发射滤光片、放大镜头、CCD相机，观测 到的荧光根据荧光标记物的不同显示蓝、绿、红等颜色。背景为黑色，最强最 亮的像素点为纯色。
权利要求
1、一种用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片，其特征是BSA-NHS玻片上固定有靶蛋白血管紧张素转换酶或肽基二肽水解酶。
2、 根据权利要求1所述的一种用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片，其特征是玻片上的靶蛋白分为若干个区域，区域间为亲水处理带。
3、 一种用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片的制法，其特征是具体步骤为:第一步玻片制作N, N-碳酸双羟琥亚胺酯(100mmol/L)和N， N-二异丙基 乙胺(100mmol/L)溶于无水N， N-二甲基甲酰胺中配制成混合液，将醛基化玻片 浸入上述混合液中室温条件下浸泡3h，取出玻片后用95%乙醇冲洗玻片两次， 再将玻片浸入磷酸盐缓冲液中室温下浸泡12h，取出玻片先后用蒸馏水冲洗玻片 两次、95%乙醇冲洗玻片两次，离心以甩掉多余溶液，最后将玻片浸入N， N-二 甲基甲酰胺中室温下放置3h，取出玻片后用95%乙醇冲洗玻片4遍，离心即成 为BSA-NHS玻片，室温下贮存于真空干燥器中，2个月无明显的活性丢失；第二步固定靶蛋白待固定的靶蛋白溶于40%的甘油和60%的磷酸盐缓冲液 的混合液，靶蛋白终浓度为100 ug/ml，将上述靶蛋白溶液用点样机点至第一 步制得的醛基化玻片上，室温湿室放置3h，倒转玻片浸入磷酸盐缓冲液中，一 分钟后取出玻片并将玻片正向浸入BSA溶液中，室温下轻度振荡放置lh，取出 玻片，用磷酸盐缓冲液冲洗玻片即制得用于检测具有降压功能的药物成分的蛋 白芯片。
4、 根据权利要求3所述的一种用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯 片的制法，其特征是第一步玻片制作N， N-碳酸双羟琥亚胺酯(100mmol/L) 和N， N-二异丙基乙胺(100ramol/L)溶于无水N， N-二甲基甲酰胺中，三者按1:1: 2重量比配制成混合液，将醛基化玻片浸入上述混合液中室温条件下浸泡3h,取出玻片后用95%乙醇冲洗玻片两次，再将玻片浸入浓度0.2mol/L磷酸盐缓冲 液中室温下浸泡12h,取出玻片先后用蒸馏水冲洗玻片两次、95%乙醇冲洗玻片两次，离心以甩掉多余溶液，最后将玻片浸入浓度99%的N， N-二甲基甲酰胺中室温下放置3h，取出玻片后用95%乙醇冲洗玻片4遍，离心即成为BSA-NHS玻片，室温下贮存于真空干燥器中，2个月无明显的活性丢失；第二步固定靶蛋白待固定的靶蛋白溶于40%的甘油和60%的磷酸盐缓冲液 的混合液，靶蛋白终浓度为100 μg/ml，将上述靶蛋白溶液用点样机点至第一步制得的醛基化玻片上，室温放置3h，倒转玻片浸入0.211101化磷酸盐缓冲液中， 一分钟后取出玻片并将玻片正向浸入20μg/mL BSA溶液中，室温下轻微振荡放置lh，取出玻片，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液冲洗玻片即制得用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片。
5、 根据权利要求3所述的一种用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片的制法，其特征是第二步固定靶蛋白蛋白点样至玻片上室温下放置3h， 倒转浸入磷酸盐缓冲液一分钟后取出玻片并将玻片正向浸入甘氨酸溶液，室温下轻微振荡放置lh，取出玻片即制得用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白心片。
6、 根据权利要求3所述的一种用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片的制法，其特征是醛基化玻片为30CMT-GAP玻片，表面带有氨基，
7、 根据权利要求3所述的一种用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片的制法，其特征是靶蛋白在玻片上被分为若干区域，区域间做疏水处理。
全文摘要
本发明涉及药物检测领域。一种用于检测具有降压功能的药物成分的蛋白芯片，BSA-NHS玻片上固定有靶蛋白血管紧张素转换酶或肽基二肽水解酶。制法为先玻片制作再在玻片上固定靶蛋白。本发明蛋白芯片将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面行成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。能够大规模地筛选、通用性强，能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。
文档编号C12Q1/00GK101344527SQ20081001274
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月7日 优先权日2008年8月7日 公开号200810012743.发明者华子昂 申请人:华子昂