专利名称：筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛査牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒。
技术背景荷斯坦奶牛是当前世界各国广泛使用的奶牛品种，经高度的选育与良好的饲养 管理，生产性能不断提高，在人类生活中发挥着越来越重要的作用。近年来，由于 选种选配的不断进行，使奶牛间的近交不断增加，目前世界上大多数荷斯坦牛都可 以追溯到北美几头特别优秀的种公牛。在我国，由于大量进口种牛、胚胎和冷冻精 液，增加了遗传缺陷快速传播的风险，因此需要逐步建立完善的检测及防控体系。遗传缺陷指的是由于生殖细胞或受精卵中的遗传物质发生了结构或功能上的改 变，从而使发育成的个体出现解剖结构上的异常或生理机能上的损害。遗传缺陷可 分为基因突变和染色体畸变两种。而基因突变有异常染色体隐性基因突变居多。目 前发现的奶牛遗传缺陷大多属于这类突变。由于隐性遗传缺陷，即杂合型个体虽带 有一个异常等位基因，但外表看不出来，因此需要借助分子手段进行检测。如两个亲本都是杂合型个体(Aa)(这里以a表示致病基因，A表示正常基因)，那它们的后 代就有l/4的可能出现二个隐性致病基因(aa)纯合的情况，这样的个体通常是致死 的，即使是非致死的遗传缺陷，也会大大影响生产性能。杂合型公牛(Aa)虽然只带 有一个a，但其却是a基因携带者。这种Aa杂合型公牛常会有健壮外观，女儿牛表现 优良，导致a基因在子代、孙代、曾孙代…逐渐传递，经过多代的人工授精，a基 因携带者在群体中所占比例就大大提高，从而导致带有二个隐性致病基因(aa)的个 体涌现，给奶牛业带来损失。瓜氨酸血症(Citrullinemia， CN)是荷斯坦奶牛的一种常染色体单基因控制的 隐性遗传疾病，最早由澳大利亚科学家Harper报道。随后在新西兰、英国、美国等 国家的荷斯坦奶牛中也相继发现。其主要症状为血液中瓜氨酸含量升高，尿素循环 受阻引起高氨血症，从而导致犊牛在出生一周内死亡。澳大利亚科学家通过对CN患 病犊牛系谱分析发现，几乎所有患病犊牛都可以追溯到一个共同祖先一Linmack Kriss King，且该种公牛冻精大量使用，产生很多携带者后代。1989年，澳大利亚 某种公牛站中携带者占13%。 CN的分子遗传学基础是由位于奶牛第11号染色体(BTA11)上的第5外显子第86和175个氨基酸发生单碱基突变(C—T)所致，该基因 编码精氨酸合成酶(Argininosuccinate Synthetase Deficiency, ASS) 。 ASS参与肝脏的尿素循环，以瓜氨酸和天门冬氨酸为底物合成精氨酸代琥珀酸。第86号氨基酸的点突变形成终止密码子，从而使ASS功能丧失。目前美国、澳大利亚、德国等奶 业发达国家已经建立了比较完善的检测及防控体系。由于第86号氨基酸的点突变造 成了酶切位点的丧失，因此可以采用PCR-RFLP的方法进行分子检测。其基本过程是: ①PCR扩增靶DNA;②用内切酶Eco47I对PCR产物进行酶切。③通过琼脂糖电泳分析结 果。在内切酶足量的前提下，若发现DNA条带由两条变成三条，即有一条DNA链未被 切开，就可以判定该DNA片段中有碱基突变。 发明内容本发明的目的是提供一种筛査牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒。 本发明所提供的筛査牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒，包括PCR引物和内切酶 Eco47I;所述PCR引物为核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2的脱氧核 苷酸组成的引物对、核苷酸序列分别为序列表中序列3和序列表中序列4的脱氧核苷 酸组成的引物对或者核苷酸序列分别为序列表中序列5和序列表中序列6的脱氧核苷 酸组成的引物对。以荷斯坦奶牛的基因组DNA为模板，用所述核苷酸序列分别为序列表中序列l和 序列表中序列2的脱氧核苷酸组成的引物对扩增得到自AS"堪因外显子的第256位的5 '端的第59 — 340位核苷酸序列(即自GenBank Accession Number NW001492999的5' 端第461211位至461492位脱氧核糖核苷酸)；用所述核苷酸序列分别为序列表中序 歹ij3和序列表中序列4的脱氧核苷酸组成的引物对扩增得到自A^基因外显子5的第 256位的5'端的第175—350位核苷酸序列(即自GenBank Accession Number 丽001492999的5'端第461327位至461502位脱氧核糖核苷酸)；用所述核苷酸序列分 别为序列表中序歹IJ5和序列表中序歹U6的脱氧核苷酸组成的引物对扩增得到AS堪因 外显子5的第256位脱氧核糖核苷酸的5'端第166 — 340位核苷酸序列(即自GenBank Accession Number NW001492999的5'端第461318位至461492位脱氧核糖核苷酸)。所述PCR引物优选为核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2的脱氧 核苷酸组成的引物对。所述试剂盒中还包括琼脂糖凝胶电泳试剂，所述琼脂糖凝胶电泳试剂包括琼脂 糖、50XTAE和溴化乙啶贮存液；所述50XTAE为每L含有Tris碱242g、冰乙酸57. lmL、 0. 5mol/L EDTA(pH=8. 0) 100mL的溶液；所述溴化乙啶贮存液为O. 01g/L溴化乙啶溶液。所述试剂盒中还包括非瓜氨酸血症携带者的基因型RFLP检测阳性对照和瓜氨酸 血症携带者的基因型RFLP检测阳性对照；所述非瓜氨酸血症携带者的基因型RFLP检测阳性对照为含有87bp和195bp的DNA片段的溶液；所述瓜氨酸血症携带者的基因型 RFLP检测阳性对照为含有87bp、 195bp和282bp的DNA片段的溶液。所述试剂盒中还包括PCR反应试剂盒。所述PCR反应试剂盒可为市售任意PCR反应 i式剂盒，其中，包括DNA聚合酶，PCR缓冲液，dATP， dGTP， dCTP， dTTP等PCR扩增试 剂。用本发明的试剂盒筛査荷斯坦奶牛瓜氨酸血症携带者时，可以待测荷斯坦奶牛 的基因组DNA为模板，利用扩增AS"堪因外显子5的第256位的单碱基突变的5'端第59 一340位核苷酸的PCR引物(如核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2的一对PCR 引物)进行PCR扩增，然后按照下述方法进行RFLP分析用内切酶Eco47I对PCR产物 进行酶切；酶切时间为2-3h;酶切体系为10ul，其中PCR产物8. 5ul，酶切缓冲液lul， 内切酶0.5ul(10U/ul)，酶切产物通过3y。琼脂糖电泳来区分CN携带者(瓜氨酸血症携 带者)和非CN携带者(非瓜氨酸血症携带者)。利用核苷酸序列分别为序列表中的 序列1和序列2的一对PCR引物进行PCR-RFLP分析，在琼脂糖凝胶电泳图谱中，如待测 荷斯坦奶牛得到三条带(87bp、 195bp、 282bp)，则该待测荷斯坦奶牛为CN携带者 (瓜氨酸血症携带者)；如待测荷斯坦奶牛得到两条带(87bp、 195bp)，则该待测 荷斯坦奶牛为非CN携带者(非瓜氨酸血症携带者)。本发明的筛查荷斯坦奶牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒，使用方法简便、快速、 灵敏，检测结果可靠、稳定、准确；用其筛査荷斯坦奶牛瓜氨酸血症携带者，不需 要特殊的仪器，适合常规实验室检测的需要。
图1为部分荷斯坦牛^^基因PCR产物凝胶电泳图 图2为部分个体PCR-RFLP结果图3为非瓜氨酸血症携带者的ASS基因序列图(箭头处为突变位点) 图4为瓜氨酸血症携带者的ASS基因序列图(箭头处为突变位点)具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例l、筛査荷斯坦奶牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒的制备及其效果验证一、筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒的制备本发明的筛査牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒，包括PCR反应试剂，琼脂糖凝胶 电泳试剂和酶切试剂。它们的具体组成如下 1、 PCR反应试剂PCR引物根据GenBank数据库中奶牛^S幼勺基因序列(GenBankAccessionNumber为NW001492999)，在其外显子5的第256位(即GenBank Accession Number NW001492999的自5'端第461408位)的点突变两侧设计引物，其中，正向引物的序 列为TTTTCAAGACCACCCTGTT (序列表中序列l，该引物由上海生工生物公司 合成)，反向引物的序列为CATACTTGGCTCCTTCTCG (序列表中序列2，该引 物由上海生工生物公司合成)；正、反向引物浓度均为25umol/L。该引物可以奶牛 基因组为模板扩增得到282bp PCR产物(自GenBank Accession Number NW001492999 的5'端第461211位至461492位脱氧核糖核苷酸)。GenBank Accession Number NW001492999的自5'端第461408位碱基为C，基因型为纯合，即为非CN携带者(非 瓜氨酸血症携带者)的基因型，将其命名为AA基因型，该基因型的PCR产物用内切 酵Eco47I酵切应得到两条带(87bp、 195bp) ; GenBank Accession Number NW001492999的自5'端第461408位碱基为同时含有C和T，为杂合基因型，即CN携带 者(瓜氨酸血症携带者)的基因型，将其命名为AB基因型，该基因型的PCR产物用 内切酶Eco47I酶切应得到三条带(87bp、 195bp、 282bp)。T叫DNA聚合酶(2.5U/uL) 、 10xPCR缓冲液(含Mg2+) 、 dNTPs (4x2.5mM) 均购自天根生化科技(北京)有限公司，它们的商品目录号分别为ET101-02、 CD111-02。2、 琼脂糖凝胶电泳试剂琼脂糖西班牙分装，北京普博欣生物技术有限公司50xTAE: Tris碱242g、冰乙酸57.1mL、 0.5mol/L EDTA(pH=8.0)100mL，加水充分溶解，定容至1L;溴化乙啶贮存液lg溶于100mL蒸馏水中。3、 酶切试剂内切酶Eco47I(10U/ul)(含酶切缓冲液)，购自深圳中晶生物技术有限公司。4、 非瓜氨酸血症携带者的基因型RFLP检测阳性对照和瓜氨酸血症携带者的基 因型RFLP检测阳性对照为了方便筛査对比，用含有87bp和195bp的DNA片段的溶液作为非瓜氨酸血症携 带者的基因型RFLP检测阳性对照；用含有87bp、 195bp禾P282bp的DNA片段的溶液作 为瓜氨酸血症携带者的基因型RFLP检测阳性对照。将测序确认的非瓜氨酸血症携带者的基因型用步骤1所述的PCR反应试剂进行 扩增，然后用内切酶Eco47I酶切PCR反应产物得到的溶液，为含有87bp和195bp的 DNA片段的溶液，可作为非瓜氨酸血症携带者的基因型RFLP检测阳性对照；将测序 确认的瓜氨酸血症携带者的基因型用步骤1所述的PCR反应试剂进行扩增，然后用内切酶Eco47I酶切PCR反应产物得到的溶液，为含有87bp、 195bp和282bp的DNA片段 的溶液，可作为瓜氨酸血症携带者的基因型RFLP检测阳性对照。二、利用步骤一制备的试剂盒筛査部分进口澳大利亚荷斯坦奶牛瓜氨酸携带者1、 澳大利亚荷斯坦奶牛母牛凝固血液澳大利亚荷斯坦奶牛样品来自北京三元绿荷奶牛养殖中心金银岛牛场。共采集 199头澳大利亚荷斯坦奶牛母牛血液。2、 凝固血液中基因组DNA的提取釆用天根生化科技(北京)有限公司的DP318试剂盒提取澳大利亚荷斯坦奶牛母 牛血液基因组DNA，即得到澳大利亚荷斯坦奶牛母牛基因组基因。3、 弓I物和PCR扩增以步骤2提取得到的澳大利亚荷斯坦奶牛母牛基因组基因为模板，用步骤一的步 骤1的PCR试剂进行扩增。PCR扩增反应总体系为20pL，其中凝血的基因组100ng，两条引物的终浓度均为 0.5pmol/L，四种dNTP的浓度均为0.25mmol/L， TaqDNA聚合酶lU， 10xPCR缓冲液 (含Mg2。 2.0mL。扩增条件为先94。C预变性5min;然后94。C 30 s， 56°C 30 s， 72°C 30s，共35个循环；最后72"C延伸7min。将PCR扩增产物进行2X的琼脂糖凝胶电泳。对199头进口澳大利亚荷斯坦奶牛A^基因的PCR扩增均得到一条清晰的282 bp 的DNA片段，部分澳大利亚荷斯坦奶牛个体的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如 图l。图1中，泳道M为DNA分子量标准(100bp ladder Marker);泳道l-9为部分澳 大利亚荷斯坦奶牛的PCR产物。 4、 RFLP检湖lj取8.5pL PCR扩增产物与lpL酶切缓冲液和0.5ul内切酶Eco47I混合均匀，37。C变 性2-3h， 3%凝胶电泳检测。电泳同时对步骤一的步骤4的非瓜氨酸血症非携带者的基 因型RFLP检测阳性对照和瓜氨酸血症非携带者的基因型RFLP检测阳性对照进行电 泳，作为判别对照。对进口的199头荷斯坦奶牛的PCR-RFLP结果共发现两种带型，对应两种基因型， 得到两条带(87bp、 195bp)的基因型，为AA基因型，与非瓜氨酸血症非携带者的 基因型RFLP检测阳性对照带型一致，即为非瓜氨酸血症非携带者；得到三条带(87bp、 195bp、 282bp)的基因型，为AB基因型，与瓜氨酸血症非携带者的基因型 RFLP检测阳性对照带型一致，即为瓜氨酸血症非携带者；部分个体的酶切电泳结果 如图2。图2中，泳道M: DNA分子量标准(100bp ladder Marker);泳道l-8:部分 AA基因型(瓜氨酸血症非携带者)PCR结果，泳道9为部分AB基因型(瓜氨酸血症携带者)PCR结果。PCR-RFLP结果表明，在进口的199头澳大利亚荷斯坦奶牛中， 有5头的基因型为AB，其余的基因型为AA。 5、序列分析将该199头荷斯坦奶牛的282bp PCR产物进行序列分析。测序采用PCR产物直接 测序方法，由上海英骏生物技术有限公司完成。结果表明这些282bpPCR产物序列均 是自GenBank Accession Number NW001492999的5'端第461211位至461492位脱氧核 糖核苷酸；表明所有AA基因型个体(194头)的A^的外显子5的第256位(即GenBank Accession Number NW001492999的自5端第461408位)碱基为C，基因型为纯合，即 非CN携带者(非瓜氨酸血症携带者，序列分析结果如图3所示)；所有AB基因型个 体(5头)的JSS的外显子5的第256位(即GenBank Accession Number NWOO1492999 的自5端第461408位)位碱基同时含有C和T，为杂合基因型，即CN携带者(瓜氨酸 血症携带者，序列分析结果如图4所示)。图3和图4中，箭头所示为点突变碱基，AA 型个体为C碱基，AB型个体为杂合C/T。该测序结果与PCR-RFLP结果一致，说明PCR-RFLP结果准确。该199头进口澳大 利亚荷斯坦母牛中，共有5头CN携带者(基因型为AB,瓜氨酸血症携带者)，194头 非CN携带者(基因型为AA)。对所有母牛个体重复进行PCR-RFLP分析，两次实验结果完全一致，证明本研究 所建立的CN检测方法稳定，结果可靠。序列表<160〉6<210〉1 〈211〉19 〈212〉DNA 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉1ttttcaagac caccctgtt 19〈210〉 2 〈211〉 19 <212〉 腿 <213>人工序列<220〉<223><400〉2catacttggc tccttctcg 19<210> 3 <211> 18 <212> DNA 〈213〉人工序列<220〉<223><400〉3gtgttcattg aggacatc 18<210〉 4 <211> 18 〈212〉 DNA <213〉人工序列〈220〉<223>〈400〉 4ccgtgagaca catacttg 18<210> 5 <211〉 19 <212〉 DNA 〈213>人工序列<220>〈223><400> 5ctcccacagg tgttcattg 19<210〉 6 <211〉 19 <212〉 DNA <213〉人工序列<220〉〈223〉<400〉 6catacttggc tccttctcg 19
权利要求
1、一种筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒，包括PCR引物对和内切酶Eco47I；所述PCR引物对为核苷酸序列为序列表中序列1的脱氧核苷酸和核苷酸序列为序列表中序列2的脱氧核苷酸组成的引物对、核苷酸序列为序列表中序列3的脱氧核苷酸和核苷酸序列为序列表中序列4的脱氧核苷酸组成的引物对或者核苷酸序列为序列表中序列5的脱氧核苷酸和核苷酸序列为序列表中序列6的脱氧核苷酸组成的引物对。
2、 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述PCR引物对为核苷酸序列 为序列表中序列1的脱氧核苷酸和核苷酸序列为序列表中序列2的脱氧核苷酸组成的 引物对。
3、 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括琼脂糖凝 胶电泳试剂或聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒，所述琼脂糖凝胶电泳试剂包括琼脂糖、 50xTAE和溴化乙啶IC存液；所述50xTAE为每L含有Tris碱242g、冰乙酸57.1mL、 0.5mol/L EDTA(pI^8.0)100mL的溶液；所述溴化乙啶贮存液为0.01g/L溴化乙啶溶液。
4、 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括非瓜氨酸 血症携带者的基因型RFLP检测阳性对照和瓜氨酸血症携带者的基因型RFLP检测阳 性对照；所述非瓜氨酸血症携带者的基因型RFLP检测阳性对照为含有87bp和195bp 的DNA片段的溶液；所述瓜氨酸血症携带者的基因型RFLP检测阳性对照为含有 87bp、 195bp和282bp的DNA片段的溶液。
5、 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括PCR反应 试剂盒，所述PCR反应试剂盒包括DNA聚合酶，PCR缓冲液以及dATP， dGTP， dCTP， dTTP的混和物。
6、 根据权利要求l-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于所述牛为荷斯坦 牛或新疆褐牛。
全文摘要
本发明公开了一种筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒。该试剂盒，包括PCR引物对和内切酶Eco47I；所述PCR引物对为核苷酸序列为序列表中序列1的脱氧核苷酸和核苷酸序列为序列表中序列2的脱氧核苷酸组成的引物对、核苷酸序列为序列表中序列3的脱氧核苷酸和核苷酸序列为序列表中序列4的脱氧核苷酸组成的引物对或者核苷酸序列为序列表中序列5的脱氧核苷酸和核苷酸序列为序列表中序列6的脱氧核苷酸组成的引物对。本发明的筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒，使用方法简便、快速、灵敏，检测结果可靠、稳定、准确；用其筛查荷斯坦奶牛瓜氨酸血症携带者，不需要特殊的仪器，适合常规实验室检测的需要。
文档编号C12Q1/68GK101265504SQ20081010206
公开日2008年9月17日 申请日期2008年3月17日 优先权日2008年3月17日
发明者孙东晓, 沅 张, 杨鸣洲 申请人:中国农业大学