专利名称：一种生产长春碱和/或长春新碱的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产长春碱和/或长春新碱的方法，特别涉及一种利用植物细胞 大规模培养和代谢调控技术生产长春碱和/或长春新碱的方法。
技术背景长春花(periwinkle)拉丁名为(CflAara"Ai^ (L) G. Don)是夹竹桃科中生物碱含量较为丰富的一属。长春花生物碱主要有Aspicospermatan型如文多灵 (Vindoline)等、Ibogan型如长春质碱(Catharanthine)等、Corynanthean型如阿玛碱 (Ajmalicine)和蛇根碱(Serpentine)等和Bisindoles型如长春碱(Vinblastine)和长春新碱 (Vincristine)等。五十年代中期， 一些学者在研究长春花植物降血糖作用时分别发现长春花植物 的提取物还具有降低白血球的作用，1958年，加拿大Noble和Beer等共同分离了这 一活性成分，命名为Vinblastine(长春碱)并制备了其硫酸盐。随后美国Lilly公司证 明了长春花粗生物碱和VLB可治疗急性淋巴白血病，同时证明Leurosine(洛诺生) 也具有抗癌作用，随后又发现Leurosidine(长春罗赛定)和Leurocristine(长春新碱)也 有抗癌作用(CuttsJH,etal Cancer Res. 1960, 20: 1023)。后来，药理学家证明长春碱 和长春新碱的抗癌机理是其与微管蛋白结合，阻滞微管蛋白聚合形成微管和诱导微 管解聚，因而使细胞停止在细胞分裂中期而死亡(Cutts JH, et al Cancer Res. 1960, 20: 1023JohnsonlS. Cancer Res. 1960, 20: 1016-1022)。这一发现震动世界，人们迅速开 始研究长春花抗癌活性。随后美国Lily公司证明了长春花粗生物碱可治疗急性淋巴 白血病；长春新碱(Vincristine)具有抗癌作用；并开发了长春花碱和长春新碱，应用 于临床。长春花碱在临床上主要用做治疗何杰金氏病以及绒毛膜癌，对乳腺癌效果 也较好，长春新碱主要用于治疗儿童急性淋巴白血病和髓白血病，它们同时具有光 谱抗癌活性。药理学家证明长春碱和长春新碱的抗癌机理是其与微管蛋白结合，阻 滞微管蛋白聚合形成微管和诱导微管解聚，因而使细胞停止在细胞分裂中期而死亡。至今长春碱和长春新碱仍主要从长春花植物中提取，长春花是该生物碱的唯一 来源植物。由于这两种生物碱在植物体内含量很低，分别为十万分之几和百万分之 几，并无法用化学合成的方法生产，使市场价格非常高。尽管其在临床上有剂量依 赖的神经毒副作用，使其应用受到一定限制。但由于其广泛的临床和其它应用及改 造潜力，药物化学家们仍在努力试图用化学方法合成它们，或进行结构改造以寻求高效低毒的类似物。生物学家也很早便开始研究用植物组织细胞培养的方法来生产这些生物碱(Jian Zhao, Wei Hua Zhu, Qiu Hu. Enhanced catharanthine production in Catharanthus roseus cell cultures by combined elicitor treatment in shake flasks and bioreactors， Enzyme and Microbial Technology. 2001, 28: 673~681; Kutney JP, Awery B, Choi LS, et al. The synthesis and biosynthesis of indole alkaloids, Tetrahedron, 1983, 39, 3781)。自60年代国外就开始研究长春花组织培养生产吲哚生物碱，从70年代末开 始，用此来生产长春花生物碱的研究成为生物工程领域的一个热点，但至目前为止， 仍未能从悬浮培养细胞中获得这两种抗癌生物碱，仅可生产阿玛碱、蛇根碱和长春 质碱，也未能实现工业化生产。发明内容本发明的目的是提供一种生产长春碱和/或长春新碱的方法。本发明所提供的生产长春碱和/或长春新碱的方法，是将长春花多倍体细胞株接 种于合成培养基中，于20 29'C，培养3 7天得到富含长春碱和长春新碱的细胞；所述合成培养基为在基本培养基中添加0 5mg/L植物细胞生长素、0 5mg/L 植物细胞分裂素，30 60 g/L蔗糖、1 50pg/L乙酰辅酶A、 10 40jig/L过氧化氢、 0.1 2pmol/L苯丙三氮唑、10 150mg/L色氨酸、10 110mg/L马钱子苷、10 50mg/L 氯化铈得到的液体培养基。所述方法中，所述长春花多倍体细胞株接种于合成培养基的接种量为200 400g/L。所述方法中，所述合成培养是在80 130rpm/分转速摇培。所述合成培养的温度 优选为25 29'C，所述合成培养的时间可为4-7天。所述方法中，所述长春花多倍体细胞株是将长春花愈伤组织细胞进行多倍体诱 导培养得到的。所述多倍体诱导培养是将长春花愈伤组织细胞用含10-40mg/L秋水 仙碱的基本培养基培养得到长春花多倍体细胞株。所述方法中，所述长春花多倍体细胞株在合成培养之前在20 25。C，避光条件 下扩增培养2 3周；所述扩增培养基为基本培养基中添加0 5mg/L植物细胞分裂素，0 5mg/L植 物细胞生长素，20 60g/L蔗糖得到的固体培养基。所述方法中，所述长春花多倍体细胞株在所述扩增培养之前进行继代培养3代 以上；所述继代培养用培养基为基本培养基中添加20-60g/L蔗糖，1.0-5mg/L植物 细胞生长素和1.0-5mg/L植物细胞分裂素的培养基；所述继代培养的条件为20 25°C，避光条件。所述方法中，所述基本培养基为按照Murashige&Skoog培养基的配方，将其中 的CuS04.5H20和CoCl2.6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗坏血酸 得到的培养基；所述植物细胞分裂素为6 —卞氨基嘌呤或激动素；所述植物细胞生 长素为吲哚乙酸或a—奈乙酸。所述方法中，所述扩增培养基的pH值为5.6 7.0;所述合成培养基的pH值为 5.8 7.0。所述方法中，还包括将所述富含长春碱和长春新碱的细胞用溶剂萃取获得含有 长春碱和长春新碱的粗提物，再经过纯化获得长春碱和/或长春新碱；所述溶剂为体 积百分浓度为95%的乙醇溶液或甲醇溶液。本发明的方法合理地解决了长春花细胞生长与长春碱和长春新碱合成的相互矛 盾，可以在3周内获得300 500g/L新鲜细胞，并利用活细胞作为微反应器，采取 代谢调控技术快速促进长春碱和长春新碱的合成，可以在3 7天内将长春碱和长春 新碱的含量提高到细胞干重的千分之一以上，超过天然植物枝叶的50倍左右。本发 明的方法用长春花细胞培养生产长春碱和长春新碱，可稳定的实现长春碱和长春新 碱的工业化生产，并且其生产成本较低，培养周期短，不受自然环境以及气候的影 响，可以实现周年生产。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。 下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。 实施例1、利用长春花细胞大规模培养生产长春碱和长春新碱1、长春花细胞系的培养 1)长春花愈伤组织的获得将长春花的幼茎作为外植体，用70%的乙醇表面杀菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸钠溶液中二次杀菌10-20分钟，然后用无菌水冲洗三次，取出后在超净工作 台中将幼茎切成2毫米长的茎断，接种到脱分化培养基中，在2000k，12-16小时照 光，25度左右室温下培养3-4周，即可获得白色愈伤组织。再将愈伤组织放在步骤 2)所述继代驯化培养基中继代培养3次以上，同时筛选得到生长速度快，质地松软， 生长量稳定的细胞系。脱分化培养基的配制在MS培养基中，添加吲哚乙酸1.0mg/L，细胞分裂素 6-BA1.0mg/L， 20g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加6.5g/L琼脂，在115"C， O.lMPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面脱分化培养基。2) 长春花愈伤组织的继代驯化培养 '将步骤1)所述诱导形成的愈伤组织细胞系接种在下述继代培养基中进行3次 以上的继代培养，培养条件为2(TC室温，避光条件，培养周期为3周。在继代培养 过程中，筛选出结构疏松以及生长速度较快的愈伤组织进行继代培养；继代驯化培养基的配制在MS培养基的基础上添加1.0mg/L的植物细胞生长 素NAA， 1.0mg/L的植物细胞分裂素6-BA， 20g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂，经1I5°C， O.lMPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板继代驯化培养基。3) 长春花多倍体细胞的诱导在MS培养基中加入10mg/L秋水仙碱(Sigma， C3915),做成液体诱导培养基， 步骤2)获得的结构疏松生长速度较快的愈伤组织接种在该诱导培养基内，在2(TC， 避光，100rpm/分转速的摇床上振荡培养7天。收集细胞后再接种在无秋水仙碱的继 代培养基中，反复驯化培养三次以上，通过生物积累量测定筛选到生长速度更快(生 长速度超过5倍接种细胞量/培养周期)的多倍体细胞系；经细胞醋酸洋红或银染色 后通过显微检测表明，该细胞系为混合多倍体细胞系。4) 长春花多倍体细胞的扩增培养将步骤3)得到的长春花混合多倍体细胞系接种在生长培养基上，在2(TC，黑 暗条件下进行扩增培养3周后，获得接种量IO倍以上的生长旺盛的多倍体细胞；扩增培养基的制备方法为在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养 基的配方，将其中的CuS(V5H2O和CoC^6H2O的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗坏血酸得到的培养基)中，添加2mg/La—萘乙酸(NAA) ， 4mg/升6 —卞 氨基嘌呤(6—BA)和20g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.7，再添加4.5g/L琼 脂，在115"， O.lMPa压力下灭菌15分钟后，制成扩增固体培养基。2、长春碱和长春新碱合成将步骤1扩增培养得到的生长旺盛的长春花多倍体细胞接种到合成培养基内， 接种量为250g/L，在25t:，避光条件，80转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培 养7天得到富含长春碱和长春新碱的细胞。收获细胞，培养液经调整后可返回反应 器继续反复利用。合成培养基在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养基的配方，将 其中的CuS(V5H20和CoClr6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗坏 血酸得到的培养基)中，添加蔗糖30g/L， B引哚乙酸(IAA)0mg/L， 6 —卞氨基嘌呤(6 一BA) lmg/L，用酸或碱将pH值调整到7.0，在115"C， O.lMPa压力下消毒15分钟后冷却处理；冷却后再添加过滤除菌的组合前体(乙酰辅酶A 10pg/L、过氧化氢 10吗/L、苯丙三氮唑O.5nmol/L、色氨酸50mg/L、马钱子苷50mg/L、氯化铈20mg/L)， 用无菌的酸或碱将pH值调整到7.0，制成合成培养基。 3、长春碱和长春新碱的提取将步骤2合成培养得到的富含长春碱和长春新碱的细胞置于提取灌中，经过高 速搅拌(300转/分)破碎，加入lml/g鲜细胞量的体积百分浓度为95%的乙醇溶液， 在室温条件下萃取，然后减压(0.01MP)浓縮获得粗提物，再加入二倍体积的乙酸 乙酯，用硫酸调pH值为8.0后，迅速摇荡，萃取生物碱三次，减压蒸干后获得含有 长春碱和长春新碱的混合物。用高效液相色谱(HPLC)检测该混合物中长春碱和长 春新碱的含量，结果表明，长春新碱的含量达到1.0mg/g细胞干重，长春碱和长春 新碱的总质量含量为细胞干重的0.1 %以上。。实施例2、利用长春花细胞大规模培养生产长春碱和长春新碱 1、长春花细胞系的培养1) 长春花愈伤组织的获得将长春花的节间作为外植体，用70%的乙醇表面杀菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸钠溶液中二次杀菌10-20分钟，然后用无菌水冲洗三次，取出后在超净工作 台中将节间切成2毫米长的茎断接种到脱分化培养基中，在2000k,12-16小时照光， 25度左右室温下培养3-4周，即可获得白色愈伤组织。再将愈伤组织放在步骤2) 所述继代驯化培养基中继代培养3次以上，同时筛选得到生长速度快，质地松软， 生长量稳定的细胞系。脱分化培养基的配制在MS培养基中，添加吲哚乙酸2.0mg/L，细胞分裂素 6-BA2.0mg/L， 30g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加6.5g/L琼月旨， 在115'C， O.lMPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面脱分化培养基。2) 长春花愈伤组织块的继代驯化培养将步骤1)所述诱导形成的愈伤组织细胞系接种在下述继代培养基中进行3次 以上的继代培养，培养条件为2(TC室温，避光条件，培养周期为3周。在继代培养 过程中，筛选出结构疏松以及生长速度较快的愈伤组织进行继代培养；继代培养基的配制在MS培养基的基础上添加2.0mg/L的植物细胞生长素 NAA， 2.0mg/L的植物细胞分裂素6-BA， 30g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂，经U5。C， O.lMPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基。3) 长春花多倍体细胞的诱导在MS培养基中加入20mg/L秋水仙碱(Sigma, C3915),做成液体诱导培养基， 步骤2)获得的结构疏松生长速度较快的愈伤组织接种在该诱导培养基内，在2(TC， 避光，100rpm/分转速的摇床上振荡培养7天。收集细胞后再接种在无秋水仙碱的继 代培养基中，反复驯化培养三次以上，通过生物积累量测定筛选到生长速度更快(生 长速度超过5倍接种细胞量/培养周期)的多倍体细胞系；经细胞醋酸洋红或银染色 后通过显微检测表明，该细胞系为混合多倍体细胞系。4)长春花多倍体细胞的扩增培养将步骤3)得到的长春花混合多倍体细胞系接种在扩增培养基上，在25。C，黑 暗条件下进行扩增培养2周后，获得接种量10倍以上的生长旺盛的多倍体细胞；扩增培养基的制备方法为在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养 基的配方，将其中的CuS(V5H2O和CoC1^6H2O的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗坏血酸得到的培养基)中，添加0mg/La—萘乙酸(NAA) ， lmg/L激动 素(KT)和25g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到6.0，再添加5g/L琼脂，在 115"， O.lMPa压力下灭菌15分钟后，制成扩增固体培养基。2、 长春碱和长春新碱合成将步骤1扩增培养得到的长春花多倍体细胞接种到合成培养基内，接种量为 200g/L，在26"C，避光条件，100转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培养5天得 到富含长春碱或长春新碱的细胞。收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反 复利用。合成培养基在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养基的配方，将 其中的CuS(V5H20和CoCl2*6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗坏 血酸得到的培养基)中，添加蔗糖40g/L， a—萘乙酸(NAA)0.5mg/L， 6 —卞氨基嘌 呤(6—BA) lmg/L，用酸或碱将pH值调整到6.0，在115。C， 0.1MPa压力下消毒15 分钟后冷却处理；冷却后再添加过滤除菌的组合前体(乙酰辅酶A5pg/L、过氧化氢 20|ig/L、苯丙三氮唑0.1pmol/L、色氨酸10mg/L、马钱子苷10mg/L、氯化钸10mg/L)， 用无菌的酸或碱将pH值调整到6.0，制成合成培养基；3、 长春碱和长春新碱的提取将步骤2合成培养得到的富含长春碱和长春新碱的细胞置于提取灌中，经过高 速搅拌(300转/分)破碎，加入lml/g鲜细胞量的体积百分浓度为95%的甲醇溶液， 在室温条件下萃取，然后减压(0.01MP)浓縮获得粗提物，再加入二倍体积的乙酸 乙酯，用硫酸调pH值为8.0后，迅速摇荡，萃取生物碱三次，减压蒸干后获得含有 长春碱和长春新碱的混合物。用高效液相色谱(HPLC)检测该混合物中长春碱和长春新碱的含量，结果表明，结果表明，长春新碱的含量达到1.1mg/g细胞干重，长 春碱和长春新碱的总质量含量为细胞干重的0.11%以上。实施例3、利用长春花细胞大规模培养生产长春碱和长春新碱1、长春花细胞系的培养1) 长春花愈伤组织的获得将长春花的叶片作为外植体，用70%的乙醇表面杀菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸钠溶液中二次杀菌10-20分钟，然后用无菌水冲洗三次，取出后在超净工作 台中将叶片延叶脉切成0.5厘米见方的小块接种到脱分化培养基中，在2000bc，12-16 小时照光，25度左右室温下培养3-4周，即可获得白色愈伤组织。再将愈伤组织放 在步骤2)所述继代驯化培养基中继代培养3次以上，同时筛选得到生长速度快， 质地松软，生长量稳定的细胞系。脱分化培养基的配制在MS培养基中，添加吲哚乙酸3.0mg/L，细胞分裂素 6-BA3.0mg/L， 40g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加6.5g/L琼月旨， 在115X:， O.lMPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面脱分化培养基。2) 长春花愈伤组织块的继代驯化培养将步骤1)所述诱导形成的愈伤组织细胞系接种在下述继代培养基中进行3次 以上的继代培养，培养条件为2(TC室温，避光条件，培养周期为3周。在继代培养 过程中，筛选出结构疏松以及生长速度较快的愈伤组织进行继代培养；继代培养基的配制在MS培养基的基础上添加3.0mg/L的植物细胞生长素 NAA， 3.0mg/L的植物细胞分裂素6-BA， 40g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂，经115°C ， O.lMPa 压力下消毒15分钟后经冷却制成平板继代驯化培养基。3、长春花多倍体细胞的诱导在MS培养基中加入30mg/L秋水仙碱(Sigma， C3915),做成液体诱导培养基， 步骤2)获得的结构疏松生长速度较快的愈伤组织接种在该诱导培养基内，在2(TC， 避光，100rpm/分转速的摇床上振荡培养7天。收集细胞后再接种在无秋水仙碱的继 代培养基中，反复驯化培养三次以上，通过生物积累量测定筛选到生长速度更快(生 长速度超过5倍接种细胞量/培养周期)的多倍体细胞系；经细胞醋酸洋红或银染色 后通过显微检测表明，该细胞系为混合多倍体细胞系。4)长春花多倍体细胞的扩增培养将步骤3)得到的长春花混合多倍体细胞系接种在扩增培养基上，在22t:，黑 暗条件下进行扩增培养3周后，获得接种量10倍以上的生长旺盛的多倍体细胞；扩增培养基的制备方法为在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养 基的配方，将其中的CuSCV5H20和CoCl2*6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗坏血酸得到的培养基)中，添加lmg/L卩引哚乙酸(IAA) ， 0mg/L6 —卞氨 基嘌呤(6—BA)和30g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到6.5，再添加5g/L琼脂， 在115X:， O.lMPa压力下灭菌15分钟后，制成扩增固体培养基。
2、 长春碱和长春新碱合成将步骤1扩增培养得到的生长旺盛的长春花多倍体细胞接种到合成培养基内， 接种量为250g/L，在27t:，避光条件，90转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培 养6天得到富含长春碱和长春新碱的细胞。收获细胞，培养液经调整后可返回反应 器继续反复利用。合成培养基在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养基的配方，将 其中的CuSCV5H20和CoCl2'6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗坏 血酸得到的培养基)中，添加蔗糖50g/L， a —萘乙酸(NAA) lmg/L，激动素(KT) lmg/L，用酸或碱将pH值调整到6.5，在115"， O.lMPa压力下消毒15分钟后冷 却处理；冷却后再添加过滤除菌的组合前体(乙酰辅酶A5pg/L、过氧化氢30)ig/L、 苯丙三氮唑l|imol/L、色氨酸100mg/L、马钱子苷100mg/L、氯化铈30mg/L)，用无 菌的酸或碱将pH值调整到6.5，制成合成培养基；
3、 长春碱和长春新碱的提取将步骤2合成培养得到的富含长春碱和长春新碱的细胞置于提取灌中，经过高 速搅拌(300转/分)破碎，加入lml/g鲜细胞量的体积百分浓度为95%的乙醇溶液， 在室温条件下萃取，然后减压(0.01MP)浓縮获得粗提物，再加入二倍体积的乙酸 乙酯，用硫酸调pH值为8.0后，迅速摇荡，萃取生物碱三次，减压蒸干后获得含有 长春碱和长春新碱的混合物。用高效液相色谱(HPLC)检测该混合物中长春碱和长 春新碱的含量，结果表明，长春新碱的含量达到1.0mg/g细胞干重，长春碱和长春 新碱的总质量含量为细胞干重的0.1%以上。实施例4、利用长春花细胞大规模培养生产长春碱和长春新碱 1、长春花细胞系的培养 1)长春花愈伤组织的获得将长春花的叶片作为外植体，用70%的乙醇表面杀菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸钠溶液中二次杀菌10-20分钟，然后用无菌水冲洗三次，取出后在超净工作 台中将叶片延叶脉切成0.5厘米见方的小块接种到脱分化培养基中，在2000k,12-16小时照光，25度左右室温下培养3-4周，即可获得白色愈伤组织。再将愈伤组织放 在步骤2)所述继代驯化培养基中继代培养3次以上，同时筛选得到生长速度快， 质地松软，生长量稳定地细胞系。脱分化培养基的配制在MS培养基中，添加吲哚乙酸4.0mg/L，细胞分裂素 6-BA4.0mg/L， 45g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加6.5g/L琼脂， 在115'C， O.lMPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面脱分化培养基。2) 长春花愈伤组织块的继代驯化培养将步骤1)所述诱导形成的愈伤组织细胞系接种在下述继代培养基中进行3次 以上的继代培养，培养条件为2(TC室温，避光条件，培养周期为3周。在继代培养 过程中，筛选出结构疏松以及生长速度较快的愈伤组织进行继代培养；继代培养基的配制在MS培养基的基础上添加4.0mg/L的植物细胞生长素 NAA， 4.0mg/L的植物细胞分裂素6-BA， 50g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂，经115°C， O.lMPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基。3) 长春花多倍体细胞的诱导在MS培养基中加入35mg/L秋水仙碱(Sigma， C3915)，做成液体合成培养 基，步骤2)获得的结构疏松生长速度较快的愈伤组织接种在该合成培养基内，在 20°C，避光，100rpm/分转速的摇床上振荡培养7天。收集细胞后再接种在无秋水仙 碱的继代培养基中，反复驯化培养三次以上，通过生物积累量测定筛选到生长速度 更快(生长速度超过5倍接种细胞量/培养周期)的多倍体细胞系；经细胞醋酸洋红 或银染色后通过显微检测表明，该细胞系为混合多倍体细胞系。4) 长春花多倍体细胞的扩增培养将步骤3)得到的长春花混合多倍体细胞系接种在扩增培养基上，在24。C，黑 暗条件下进行扩增培养2.5周后，获得接种量10倍以上的生长旺盛的多倍体细胞；扩增培养基的制备方法为在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养 基的配方，将其中的CuS(V5H20和CoClr6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗坏血酸得到的培养基)中，添加Omg/La—萘乙酸(NAA) ， 0.5mg/L 6 — 卞氨基嘌呤(6—BA)和40g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加5g/L琼 脂，在115'C， O.lMPa压力下灭菌15分钟后，制成扩增固体培养基。2、长春碱和长春新碱合成将步骤1扩增培养得到的生长旺盛的长春花多倍体细胞接种到合成培养基内， 接种量为300g/L，在28'C，避光条件，120转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培 养5天得到富含长春碱或长春新碱的细胞。收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反复利用。合成培养基在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养基的配方，将 其中的CuS(V5H20和CoCV6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗坏 血酸得到的培养基)中，添加蔗糖40g/L，吲哚乙酸(IAA) lmg/L，激动素(KT) 2mg/L， 用酸或碱将pH值调整到5.8，在115°C， O.lMPa压力下消毒15分钟后冷却处理； 冷却后再添加过滤除菌的组合前体(乙酰辅酶A40吗/L、过氧化氢40吗/L、苯丙三 氮唑1.5pmol/L、色氨酸150mg/L、马钱子苷50mg/L、氯化铈20mg/L)，用无菌的 酸或碱将pH值调整到5.8，制成合成培养基。3、长春碱和长春新碱的提取将步骤2合成培养得到的富含长春碱和长春新碱的细胞置于提取灌中，经过高 速搅拌(300转/分)破碎，加入lml/g鲜细胞量的体积百分浓度为95%的乙醇溶液， 在室温条件下萃取，然后减压(0.01MP)浓縮获得粗提物，再加入二倍体积的乙酸 乙酯，用硫酸调pH值为8.0后，迅速摇荡，萃取生物碱三次，减压蒸干后获得含有 长春碱和长春新碱的混合物。用高效液相色谱(HPLC)检测该混合物中长春碱和长 春新碱的含量，结果表明，长春新碱的含量达到1.1mg/g细胞干重，长春碱和长春 新碱的总质量含量为细胞干重的0.11%以上。实施例5、利用长春花细胞大规模培养生产长春碱和长春新碱 1、长春花细胞系的培养1) 长春花愈伤组织的获得将长春花的幼茎作为外植体，用70%的乙醇表面杀菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸钠溶液中二次杀菌10-20分钟，然后用无菌水冲洗三次，取出后在超净工作 台中将幼茎切成2毫米长的茎断，接种到脱分化培养基中，在2000bc,12-16小时照 光，25度左右室温下培养3-4周，即可获得白色愈伤组织。再将愈伤组织放在步骤 2)所述继代驯化培养基中继代培养3次以上，同时筛选得到生长速度快，质地松软， 生长量稳定地细胞系。脱分化培养基的配制在MS培养基中，添加吲哚乙酸5.0mg/L，细胞分裂素 6-BA5.0mg/L， 50g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加6.5g/L琼月旨， 在115'C， O.lMPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面脱分化培养基。2) 长春花愈伤组织块的继代驯化培养将步骤1)所述诱导形成的愈伤组织细胞系接种在下述继代培养基中进行3次 以上的继代培养，培养条件为2(TC室温，避光条件，培养周期为3周。在继代培养过程中，筛选出结构疏松以及生长速度较快的愈伤组织进行继代培养；继代培养基的配制在MS培养基的基础上添加5.0mg/L的植物细胞生长素 NAA， 5.0mg/L的植物细胞分裂素6-BA， 60g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂，经115°C， O.lMPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基。3) 长春花多倍体细胞的诱导在MS培养基中加入40mg/L秋水仙碱(Sigma， C3915),做成液体诱导培养基， 步骤2)获得的结构疏松生长速度较快的愈伤组织接种在该诱导培养基内，在2(TC， 避光，100rpm/分转速的摇床上振荡培养7天。收集细胞后再接种在无秋水仙碱的继 代培养基中，反复驯化培养三次以上，通过生物积累量测定筛选到生长速度更快(生 长速度超过5倍接种细胞量/培养周期)的多倍体细胞系；经细胞醋酸洋红或银染色 后通过显微检测表明，该细胞系为混合多倍体细胞系。4) 长春花多倍体细胞的扩增培养将步骤3)得到的长春花混合多倍体细胞系接种在扩增培养基上，在23"，黑 暗条件下进行扩增培养3周后，获得接种量10倍以上的生长旺盛的多倍体细胞；扩增培养基的制备方法为在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养 基的配方，将其中的CuS04，5H20和CoCl2'6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗坏血酸得到的培养基)中，添加5mg/La—萘乙酸(NAA) ， 5mg/L6 —卞 氨基嘌呤(6—BA)和50g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到6.5，再添加5g/L琼 脂，在115。C， O.lMPa压力下灭菌15分钟后，制成扩增固体培养基。2、 长春碱和长春新碱合成将步骤1扩增培养得到的生长旺盛的长春花多倍体细胞接种到合成培养基内，接种量为350g/L，在29'C，避光条件，130转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培 养4天得到富含长春碱或长春新碱的细胞。收获细胞，培养液经调整后可返回反应 器继续反复利用。合成培养基在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养基的配方，将 其中的CuS(V5H20和CoCV6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗坏 血酸得到的培养基)中，添加蔗糖50g/L，吲哚乙酸(IAA)5mg/L， 6 —卞氨基嘌呤(6 一BA) 3mg/L，用酸或碱将pH值调整到6.5，在115"C， O.lMPa压力下消毒15分 钟后冷却处理；冷却后再添加过滤除菌的组合前体(乙酰辅酶A3(Vg/L、过氧化氢 20吗/L、苯丙三氮唑2pmol/L、色氨酸50mg/L、马钱子苷110mg/L、氯化铈40mg/L)， 用无菌的酸或碱将pH值调整到6.5，制成合成培养基。3、 长春碱和长春新碱的提取将歩骤2合成培养得到的富含长春碱和长春新碱的细胞置于提取灌中，经过高速搅拌(300转/分)破碎，加入lml/g鲜细胞量的体积百分浓度为95%的甲醇溶液， 在室温条件下萃取，然后减压(0.01MP)浓縮获得粗提物，再加入二倍体积的乙酸 乙酯，用硫酸调pH值为8.0后，迅速摇荡，萃取生物碱三次，减压蒸干后获得含有 长春碱和长春新碱的混合物。用高效液相色谱(HPLC)检测该混合物中长春碱和长 春新碱的含量，结果表明，长春新碱的含量达到1.05mg/g细胞干重，长春碱和长春 新碱的总质量含量为细胞干重的0.11 %以上。实施例6、利用长春花细胞大规模培养生产长春碱和长春新碱 1、长春花细胞系的培养1) 长春花愈伤组织的获得将长春花的幼茎作为外植体，用70%的乙醇表面杀菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸钠溶液中二次杀菌10-20分钟，然后用无菌水冲洗三次，取出后在超净工作 台中将幼茎切成2毫米长的茎断，接种到脱分化培养基中，在20001x，12-16小时照 光，25度左右室温下培养3-4周，即可获得白色愈伤组织。再将愈伤组织放在步骤 2)所述继代驯化培养基中继代培养3次以上，同时筛选得到生长速度快，质地松软， 生长量稳定地细胞系。脱分化培养基的配制在MS培养基中，添加吲哚乙酸5.0mg/L，细胞分裂素 6-BA5.0mg/L， 50g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加6.5g/L琼脂， 在115t， O.lMPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面脱分化培养基。2) 长春花愈伤组织块的继代驯化培养将步骤1)所述诱导形成的愈伤组织细胞系接种在下述继代培养基中进行3次 以上的继代培养，培养条件为20。C室温，避光条件，培养周期为3周。在继代培养 过程中，筛选出结构疏松以及生长速度较快的愈伤组织进行继代培养；继代培养基的配制在MS培养基的基础上添加5.0mg/L的植物细胞生长素 NAA， 5.0mg/L的植物细胞分裂素6-BA， 60g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂，经115°C， O.lMPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基。3) 长春花多倍体细胞的诱导在MS培养基中加入40mg/L秋水仙碱(Sigma， C3915),做成液体诱导培养基， 步骤2)获得的结构疏松生长速度较快的愈伤组织接种在该诱导培养基内，在2(TC， 避光，100rpm/分转速的摇床上振荡培养7天。收集细胞后再接种在无秋水仙碱的继 代培养基中，反复驯化培养三次以上，通过生物积累量测定筛选到生长速度更快(生长速度超过5倍接种细胞量/培养周期)的多倍体细胞系；经细胞醋酸洋红或银染色 后通过显微检测表明，该细胞系为混合多倍体细胞系。 4)长春花多倍体细胞的扩增培养将步骤3)得到的长春花混合多倍体细胞系接种在扩增培养基上，在25'C，黑 暗条件下进行扩增培养2.5周后，获得接种量10倍以上的生长旺盛的多倍体细胞；扩增培养基的制备方法为在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养 基的配方，将其中的CuSOf5H20和CoCl2*6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗坏血酸得到的培养基)中，添加3mg/La—萘乙酸(NAA) ， 2mg/L6 —卞 氨基嘌呤(6—BA)和40g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到6，再添加5g/L琼脂， 在115'C， O.lMPa压力下灭菌15分钟后，制成扩增固体培养基。2、 长春碱和长春新碱合成将步骤1扩增培养得到的生长旺盛的长春花多倍体细胞接种到合成培养基内， 接种量为400g/L，在28"C，避光条件，120转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培 养5天得到富含长春碱或长春新碱的细胞。收获细胞，培养液经调整后可返回反应 器继续反复利用。合成培养基在改良的MS培养基(按照Murashige&Skoog培养基的配方，将 其中的CuS04'5H20和CoCl2'6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗坏 血酸得到的培养基)中，添加蔗糖60g/L， a—萘乙酸(NAA)0.5mg/L， 6 —卞氨基嘌 呤(6—BA)0mg/L，用酸或碱将pH值调整到6，在115X:， O.lMPa压力下消毒15分 钟后冷却处理；冷却后再添加过滤除菌的组合前体(乙酰辅酶A 5pg/L、过氧化氢 30吗/L、苯丙三氮唑l|iimol/L、色氨酸100mg/L、马钱子苷60mg/L、氯化铈50mg/L)， 用无菌的酸或碱将pH值调整到6，制成合成培养基。3、 长春碱和长春新碱的提取将步骤2合成培养得到的富含长春碱和长春新碱的细胞置于提取灌中，经过高 速搅拌(300转/分)破碎，加入lml/g鲜细胞量的体积百分浓度为95%的乙醇溶液， 在室温条件下萃取，然后减压(0.01MP)浓縮获得粗提物，再加入二倍体积的乙酸 乙酯，用硫酸调pH值为8.0后，迅速摇荡，萃取生物碱三次，减压蒸干后获得含有 长春碱和长春新碱的混合物。用高效液相色谱(HPLC)检测该混合物中长春碱和长 春新碱的含量，结果表明，长春新碱的含量达到1.03mg/g细胞干重，长春碱和长春 新碱的总质量含量为细胞干重的0.11 %以上。
权利要求
1、一种生产长春碱和/或长春新碱的方法，是将长春花多倍体细胞株接种于合成培养基中，于20～29℃，培养3～7天得到富含长春碱和长春新碱的细胞；所述合成培养基为在基本培养基中添加0～5mg/L植物细胞生长素、0～5mg/L植物细胞分裂素，30～60g/L蔗糖、1～50μg/L乙酰辅酶A、10～40μg/L过氧化氢、0.1～2μmol/L苯丙三氮唑、10～150mg/L色氨酸、10～110mg/L马钱子苷、10～50mg/L氯化铈得到的液体培养基。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述长春花多倍体细胞株接种 于合成培养基的接种量为200 400g/L。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述合成培养是在80 130rpm/ 分转速摇培。
4、 根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述长春花多倍体细 胞株是将长春花愈伤组织细胞进行多倍体诱导培养得到的。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述长春花多倍体细胞株在合 成培养之前在20 25°C，避光条件下扩增培养2 3周；所述扩增培养基为基本培养基中添加0 5mg/L植物细胞分裂素，0 5mg/L 植物细胞生长素，20 60g/L蔗糖得到的固体培养基。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述长春花多倍体细胞株在所 述扩增培养之前进行继代培养3代以上；所述继代培养用培养基为基本培养基中添 加20-60g/L蔗糖，1. 0-5mg/L植物细胞生长素和1. 0-5mg/L植物细胞分裂素的培养 基；所述继代培养的条件为20 25X:，避光条件。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述多倍体诱导培养是将长春 花愈伤组织细胞用含10-40mg/L秋水仙碱的基本培养基培养得到长春花多倍体细胞 株。
8、 根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于所述基本培养基 为按照Mumshige&Skoog培养基的配方，将其中的CuS04 5H20和Co Cl2 6H20的 添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗坏血酸得到的培养基；所述植物细胞 分裂素为6 —卞氨基嘌呤或激动素；所述植物细胞生长素为U引哚乙酸或a—奈乙 酸。
9、 根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述扩增培养基的pH值为5.6 所述合成培养基的pH值为5.8 7.0。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述方法中，还包括将所述富 含长春碱和长春新碱的细胞用溶剂萃取获得含有长春碱和长春新碱的粗提物，再经 过纯化获得长春碱和/或长春新碱；所述溶剂为体积百分浓度为95%的乙醇溶液或 甲醇溶液。
全文摘要
本发明公开了一种生产长春碱和/或长春新碱的方法。该方法是将长春花多倍体细胞株接种于合成培养基中，于20～29℃，培养3～7天得到富含长春碱和长春新碱的细胞；所述合成培养基为在基本培养基中添加0～5mg/L植物细胞生长素、0～5mg/L植物细胞分裂素，30～60g/L蔗糖、1～50μg/L乙酰辅酶A、10～40μg/L过氧化氢、0.1～2μmol/L苯丙三氮唑、10～150mg/L色氨酸、10～110mg/L马钱子苷、10～50mg/L氯化铈得到的液体培养基。本发明的方法用长春花细胞培养生产长春碱和长春新碱，可稳定的实现长春碱和长春新碱的工业化生产，并且其生产成本较低，培养周期短，不受自然环境以及气候的影响，可以实现周年生产。
文档编号C12P17/18GK101333512SQ200810117768
公开日2008年12月31日 申请日期2008年8月5日 优先权日2008年8月5日
发明者云 刘, 郭志刚 申请人:清华大学