运用复合pcr技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法

专利名称：：运用复合pcr技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法
技术领域：
：本发明"运用复合PCR技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法"，属于农作物病害防治和植物检疫
技术领域：
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背景技术：
：卢笋作为一种食药兼用的高档蔬菜，不仅口味鲜美，还是当今世界发现和公认的防癌抗癌效果最好的植物，深受国内外广大消费者的喜爱。我国是世界上最大的芦笋生产国和出口国，主要的芦笋种植区分布在山东、江苏、浙江、山西、福建、河北等省份，生产的芦笋大部分用于出口。腐马素是一组主要由串珠镰刀菌(Fwrar/wwver"c////o/<sfey)和再育镰刀菌(i^yan、wpra/^rartwO等镰刀菌属真菌产生的真菌毒素，具有分布广，毒性强的特点。已成为继黄曲霉素之后的又一个真菌毒素研究的新热点。现已鉴定到28种腐马素类似物(HlywkaandBullerm叫1999)，它们被分为4组，即A、B、C和P组。其中，B组腐马素是野生型菌株中产生量最为丰富的一组。目前已发现的腐马素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4禾BFP1共11种，其中FBI是其主要组分，占75%以上，而且毒性最强。许多证据表明，腐马素对某些牲畜有急性致命毒性及潜在的致癌性，如引起马脑炎、猪肺水肿或大鼠肝癌等，为畜牧业带来很大的损失。流行病学研究也认为，食用腐马素会引起人类食道癌和神经管缺陷，严重威胁食品安全及人类和动物健康。在2003年，国际癌症研究机构(InternationalAgencyofResearchCancer,IARC)估测由串珠镰刀菌产生的腐马素(FBI)为2B组，即可疑人类致癌物。目前，在许多国家如美国、意大利、德国、荷兰、南非和澳大利亚等的戸笋产区，镰刀菌侵染引起的病害己是芦笋上的主要病害，并且己有研究报导了FB1，FB2在田间芦笋上的发生，严重影响戸箅的产量和产品质量。而串珠镰刀菌和再育镰刀菌是戸笋中极为常见的病原真菌，发生非常普遍，并且通常情况下大部分植株在田间感染了致病菌之后无明显症状，一些无明显霉变症状的产品也可能有腐马素污染。中国是世界上已经确认的食品中腐马素的污染与食道癌的发生关系密切的两个国家之一，因此控制芦笋、玉米等食品中腐马素的污染是当务之急，在农业生产和食品安全领域都有非常重要的意义。较全面地了解主要产地中芦笋上腐马素产毒菌株污染情况，建立完善、快捷的腐马素及其产毒株的检测手段和监控机制也势在必行。只有这样才能及时有效地发现和控制有关腐马素的污染，及时采取措施，从而提高我国农产品在国际市场上的质量和信誉，保证国际贸易的顺利进行，保护广大农民的切身利益。传统的腐马素产毒菌株的分类和鉴定方法主要为形态学方法，该法需要较高的专业素质和经验并需要通过菌株分离，培养，纯化，促进产孢等一系列过程，需时约30天，费时费力。在生产实际鉴定应用和科研中，都有较大局限性。随着对腐马素研究的深入，其生物合成途径巳基本阐明，使利用分子生物学方法对腐马素产毒菌株分类和鉴定成为可能。目前分子检测手段大多以分类学基因和腐马素生物合成所必需的聚酮化合物合成酶基因FC/M/为基础的，设计组特异性或属特异性引物进行PCR扩增检测，耗时可縮短到2天。但是，由于分类学基因是基于镰刀菌属内各个种的同源序列设计的，直接揭示菌株种类，而并不能直接揭示待测菌株的产毒性，很可能将未知的腐马素产毒菌株排除在外。而目前扩增直接与腐马素产毒机制相关基因的弓I物是基于巳知产毒菌株Fvw/ZdWo/tfes的^T/AW基因序列设计的，但腐马素的合成是一个比较复杂的过程，多种基因的参与和调节，对于Ff/M/基因的单一检测并不能完全保证结果的可靠性。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种简单、有效、快速的芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法。本发明检测方法，使用分别根据腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FMl//基因和丝氨酸-十六酰基转移酶基因FC/MS设计的引物对rp32/rp33和rp679/rp680，并与镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR—起，通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组。在同一反应体系中检测腐马素产毒菌株，是对仅根据分类学基因及F(/A^基因设计特异性引物检测方法的补充和改进。检测步骤为对待检样品进行菌株分离和纯化；SDS法提取样品模板DNA;经复合PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析可得出检测结果。本发明检测方法不仅可以检测到未知的腐马素产毒菌株而且能同时鉴别所测菌株是否属于镰刀菌属。同时，本方法采用复合PCR技术，多对引物在同一反应体系中同时扩增，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在我国大规模推广。本发明通过以下技术方案实现第一步菌株的分离，纯化将芦笋样品，经清洗、切段、消毒、冲洗、无菌条件下，将样品平铺到PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂)培养基上，置于培养箱中培养；经培养后将不同真菌分别接种到PDA培养基上纯化培养；对纯化了的菌株进行单孢分离，获得单孢培养物，保存备用。第二步改良的SDS法提取样品模板DNA样品中DNA的提取方法采用改良的SDS提取法将菌株培养在50ml的液体酵母培养基中，27'C200rpm/min的振荡条件下培养3-5天；用滤纸过滤，抽滤收集孢子，在液氮中磨成粉，将粉末收集在50ml的试管中；在试管中加入4mlDNA提取液(200mMTris-HClpH=8.5，250mMNaCl，25mMEDTApH=8.0，0.5%(W/V)SDS)并且涡旋使其充分混合；力口入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，涡旋振荡，2500g离心15min;将上清液转移到2ml的离心管中，每支中加上清液90(^1，氯仿900W，13200rpm离心5min;将上层溶液转移到新的2ml试管中，加入RNaseI(终浓度C^lOOpg/ml);37'C培养2-3h;加入等体积的冷的5M氯化锂溶液，轻轻振荡充分混合，在冰上再放置15min;4。C下13200rpm离心lOmin，然后将所有的上清液一起都放在一个50ml的试管中；加入2.5倍体积的100%乙醇，在水和乙醇的交界处形成一层DNA团，然后混合；4'C3000g离心20min，弃取上层清液；加20ml70。/。的冷乙醇，然后在4t:下过夜，让杂质溶解；4。C3C)00g离心20min，弃去上层清液；沉淀在空气中干燥15min，然后加入300-400|il重蒸水,在4'C下溶解过夜；用移液器吸取溶液的办法使其混匀，获得样品模板DNA。模板DNA母液贮存条件为-80°C;使用前稀释成浓度为50ng/pl溶液，存放在-20"C条件下。第三步PCR引物设计使用分别根据聚酮化合物合成酶F[/M/基因、丝氨酸-十六酰基转移酶基因F(7MS设计的引物对rp32/rp33和rp679/rp680和镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR,通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组。其引物序列如下rp32ACAAGTGTCCTTGGGGTCCAGGrp33GATGCTCTTGGAAGTGGCCTACGrp679CGTAGTAGGAATGAGAAGGATGrp680GCAAGCTTTGTGGCTGATTGTCItsFAACTCCCAAACCCCTGTGAACATAItsRTTTAACGGCGTGGCCGC其中rp32/rp33引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出680bp的产物，rp679/rp680引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出920bp的产物，ItsR/ItsF引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出431bp的产物。引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。每管10DU260，储存液浓度25pmol/L，用灭菌双蒸水配制。-20°0:保存备用。第四步复合PCR扩增反应反应体系总体积为25pl，反应物包括2.5^1的10xPCR缓冲液，0.5^1的10MmdNTP，0.5^1的Taq酶，2^1的SDS法提取样品模板DNA，1.2^1的引物卬32/rp33和rp679/rp680和ItsR/ItsF，其余以重蒸水补足。PCR反应条件为预变性温度94'C，时间5min;循环数33;变性温度94'C，时间30s;退火温度53'C，时间45s;延伸温度72'C，时间lmin;终延伸温度72'C，时间10min;保存在4。C。第五步检测结果判定制备3.0n/。的琼脂糖EB凝胶(含EB0.5吗/ml)，取第三步扩增产物10pl点样，同时以DL2000作为分子量对照，电压设置80V(5V/cm)，电泳时间30到50min。电泳结束后，在紫外光下(波长258cm)，用自动凝胶成像系统观察、扫描并储存电泳结果。本发明用于检测芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR方法，与国内外现有方法相比，本发明具有以下的技术优势1)检测准确性高。本方法基于腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶尸t/M7基因、丝氨酸-十六酰基转移酶基因Ff/MS以及镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR，在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株。不仅能用于已知腐马素产毒菌株的检测，对未知的腐马素产毒菌株也能检测到。2)检测效率高。本发明不仅能检测腐马素产毒菌株，而且可以同时鉴别该菌株是否属于镰刀菌属，两种检测，一步完成。3)操作方便快捷。本发明采用复合PCR技术，多对引物在同一反应体系中同时扩增。整个过程简单、快速、高效。4)特异性强。本发明设计的三对引物可特异性检测腐马素产毒菌株，扩增时均无非特异性条带。因此本发明方法实用性强，可满足植物检疫及食品安全检测的需要。图1是本发明的实施例1的实验结果及引物对rp32/rp33，rp679/rp680及ItsR/ItsF复合PCR反应特异性.其中以串珠镰刀菌野生型为阳性对照，以桔青霉为阴性对照。M.DNALadder2000.A:1和17为串珠镰刀菌野生型(WT)，2.ZJNB1-1,3.ZJNB2-1,4.ZJNB3-1,5.ZJNB4-1,6.ZJNB5-1,7.ZJFY1-1,8.ZJFY2-1，9.ZJFY3-1，10.ZJFY4-1,11.ZJFY5-1，12.Z乂02-1，13.2!:5陽1，14.2乂€6-1,15.桔青霉，16.无菌水，18.21乂<:1-1,19.2仅€3隱1，20.21乂€4-1.图2rp32/rp33，rp679/rp680单对引物PCR的敏感性M.DNALadder2000.1-6,8-13孔为串珠镰刀菌野生型的DNA，浓度为10ng，lng，100pg，10pg,lpg.500fg;7,14孔为无菌水对照.图3引物rp32/rp33，rp679/rp680及ItsR/ItsF复合PCR的敏感性M.DNALadder2000.1-5孔为串珠镰刀菌野生型的DNA,浓度为lOng，lng,lOOpg,lOpg,lpg.6孔为无菌水对照.图4HPLC-ELSD法检测FB!的标准曲线及线性方程LnC:FBi的物质的量的自然对数；Lnpeakarea:峰面积的自然对数具体实施例方式实施例1在浙江地区芦笋中分离菌株检测腐马素产毒菌株本实验使用的芦笋材料为食用茎，从浙江省内各种植基地内收集，共16份，其中，宁波5份，富阳5份，新昌6份。第一步菌株的分离、纯化将芦笋样品清洗后切成2cm长小段，70n/。酒精消毒3min，10%次氯酸钠消毒7min，然后用无菌水冲洗3次。无菌条件下，将样品平铺到PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂)培养基上，封口膜封口。置于培养箱中25'C暗培养。统计每个样品在PDA培养基上的菌落，观察真菌的生长，4-5天后在显微镜下观察真菌的性状特征，分出不同的真菌，将其从菌落中挑出，各自接种到PDA培养基上进一步培养。一种真菌接种于一个培养皿内。4-5天后，对纯化了的菌株进行单孢分离。准备3个倒有10inl无菌水的培养皿，用接种针挑取一小块菌丝放入一个培养皿中，用"L"型玻棒搅匀，蘸取少许溶液(l-2滴)溶解在第二个培养皿中，同样方法处理第三个培养皿，得到三个不同数量级浓度的孢子悬浮液。分别从三个不同孢子悬浮液中蘸取少许液体涂在PDA平板上，高浓度一个，中等浓度2个，低浓度3个。25'C暗培养，每隔12h观察一次，若发现有菌落产生则用记号笔从培养皿的反面标记，用解剖针连同培养基一起挑取到新的PDA平板中。即可获得单孢培养物。纯化后菌株于4'C保存备用。如果需要长期保藏，则需要在PDA平板上培养几周。然后，用石蜡封存或用无菌水洗孢子然后保存在15%的甘油中。第二步模板DNA提取1、将菌株培养在50ml的液体酵母培养基中，在27°C,200rpm/min的振荡条件下培养3-5天。2、用Whatman滤纸过滤，抽滤收集孢子，在液氮中磨成粉，将粉末收集在50ml的试管中。3、在试管中加入4mlDNA提取液(200mMTris-HClpH=8.5，250mMNaCl，25mMEDTApH=8.0,0.5%(W/V)SDS)并且涡旋使其充分混合。4、加入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，短时间涡旋振荡，2500g离心15min。5、将上清液转移到2ml的离心管中，每支中加90(Hil，然后加900^1氯仿，13200rpm离心5min。6、将上层溶液转移到新的2ml试管中，加入RNaseI(终浓度C2100ng/ml)。然后在37。C培养2-3h。7、将试管和5M氯化锂溶液在冰上放置15min。8、往试管中加入等体积的冷的5M氯化锂溶液，轻轻振荡充分混合，在冰上再放置15min。9、4'C下13200rpm离心10min，然后将所有的上清液一起都放在一个50ml的试管中。10、加入2.5倍体积的100°/。乙醇，在水和乙醇的交界处形成一层DNA团，然后混合。11、4"C下3000g离心20min,小心地弃取上层清液。12、力n20ml70。/。的冷乙醇，然后在4。C下过夜，让杂质溶解。13、4。C下3000g离心20min,小心地弃去上层清液。14、沉淀在空气中干燥15min，然后加入300-400pl重蒸水，在4。C下溶解过夜。15、用移液器吸取溶液的办法使其混匀。模板DNA母液贮存在-80'C条件下。使用前稀释成浓度为50ng&l溶液，存放在-20'C条件下。第三步引物合成使用引物rp32/rp33，rp679/rp680(Proctoretal.,2004)禾口IstF/IstR(Bluhmetal.,2002)(表1)。引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。每管1ODU260，储存液浓度25nmol/L，用灭菌双蒸水配制。-20°C保存备用。表l本发明中所设计的PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*Proctor，2004;**Bluhm，2002.第四步复合PCR扩增反应复合PCR扩增反应体系为反应体系总体积为25pl，包括2.5^1的lOxPCR缓冲液，0.5pl的10MmdNTP，0.5^1的Taq酶，2^1第二步得到的模板DNA，1.2^1第三步中的引物，其中rp32和rp33各0.15iil，rp679和rp680各0.25pl，ItsF和ItsR各0.2(J。余以重蒸水补足。PCR反应条件为1)预变性温度94。C，时间5min;2)循环数33，变性温度94'C，时间30s:退火温度53'C，时间45s;延伸温度72。C，时间lmin;3)终延伸温度72。C，时间10min;4)保存在4"C。第五步检测结果判定以制备3.0%的琼脂糖EB凝胶(含EB0.5叫/ml)，取第四步扩增产物10pl点样，同时以DL2000作为分子量对照，电压设置80V(5V/cm)，电泳时间30到50min。电泳结束后，在紫外光下(波长258cm)，用自动凝胶成像系统观察、扫描并储存电泳结果。实施结果在所有的16份材料中分离菌株到16个，其中ZJNB3-1，ZJNB4-1，ZJNB5-1，ZJFY1-1，ZJFY2-1，ZJFY3陽1，ZJFY4-1，ZJXC1-1，ZJXC3-1，ZJXC4-1这10个菌株分别产生约920bp(912-939bp)，680bp(670-684bp),431bp的预期片段，这10个菌株与阳性对照野生型串珠镰刀菌产毒株PCR扩增结果相一致，FUM1，FUM8，ITS基因阳性，为腐马素产毒菌株。菌株ZJNB1-1，ZJNB2-1，ZJFY5-1，ZJXC2-1，ZJXC5-1,ZJXC6-1这6个菌株只扩增出ITS条带，说明这些菌株可能是无产毒基因的镰刀菌菌株。阴性对照无条带扩增(图1，表2)。证明引物对rp32/rp33，rp679/rp680，ItsR/ItsF复合PCR反应检测串珠镰刀菌腐马素产毒菌株的特异性良好。并且分离菌株的复合PCR检测结果与单对引物PCR结果一致，也证明了本发明复合PCR方法的特异性和可靠性(表2)。表2芦笋上分离菌株单对引物PCR和复合PCR检测结果.编号产地菌株单对引物PCR复合PCRITS尸腺/ITS1浙江宁波ZJNB1-1—.—+—_2ZJNB2-1一——+—+3Z厠3陽l+++++4ZJNB4-1++++++Z膽5-1++++++6浙江富阳ZJFY1-1++++++ZJFY2-1++++++8ZJFY3-1++++++9ZJFY4-1++++++10ZJFY5-1一—+—一■11浙江新昌ZJXCl國l++++++12ZJXC2-1——+一一+13ZJXC3-1++++++14ZJXC4-1++++++15ZJXC5隱1——+一一+16ZJXC6-1——+一+实施例2:本发明所设计的引物检测腐马素产毒菌株灵敏度及最小检出限的测定第一步引物合成操作步骤同实施例1第三步。第二步模板DNA稀释以无菌水稀释串珠镰刀菌野生型染色体DNA浓度为10ng，lng，100pg，10pg，1pg，第三步复合PCR扩增把第二步稀释的模板DNA直接加入到实施例1第四步中的PCR反应体系中进行复合PCR扩增。第四步检测结果判定同实施例1第五步。实施结果测得引物对rp32/rp33，rp679/rp680的检出限均为为10pg(图2)，未加DNA的水对照结果为阴性，复合PCR检出限为100pg(图3)。实施例3:离体条件下分离菌株的产毒力检测本实验所使用的菌株材料均为前期实验从各地收集的芦等样品上分离的菌株。第一步菌株孢子悬浮液制备取15mlGYP液体培养基(葡萄糖-蛋白胨-酵母提取物)，加入到50ml的三角瓶中，用接种环从保存的野生型串珠镰刀菌(fveW/d"^'J^)或供试菌株的试管中挑出少量菌体放入三角瓶，放在恒温振荡培养箱中200rpm/min，27'C，培养40-48h。取2ml培养液加入到2ml离心管中12000rpm/min离心10min，小心弃去上层液体，加入1ml无菌水，12000rpm/min离心10min，弃去上层清液，再加入lml无菌水，12000rpm/min，10min，倒掉上层清液，重复两次。将下层沉淀溶解在lml无菌水中，制成孢子悬浮液，通过镜检，用无菌水稀释成需要的浓度。第二步产毒培养将上述制备的菌悬液(大约8xl07个野生型菌株的孢子)接种CMK(5g)培养基。充分摇匀，置28'C培养2周，每3-5天摇匀一次以便于培养物的发散。然后置4t冰箱l周，再置于28'C培养1周。表现为三角瓶中充满了白色菌丝。然后以流动蒸汽熏蒸杀菌(100。C,30min)。获后的培养物经粉碎机粉碎后，用冷冻干燥机冻干，密封包装，于-2(TC下保存，待测。空白对照的处理同上。第三步样品前处理准确称取培养物冻干粉10g，放入100ml的三角瓶中，加入25ml乙腈/水(1:1,v/v)，摇床振荡过夜(150rpm，25°C)，用Whatman滤纸真空抽滤，将滤出液(10ml)加入到一个放有300mg已经被甲醇活化5小时的离子交换树脂XAD-4的离心管中。然后先用去离子水，再用4ml100^甲醇清洗XAD-4树脂，毒素会被100%甲醇洗脱下来，洗脱液置于-65'C下冷冻真空干燥，然后溶解在400nl水中。溶液用0.2tmi注射过滤器过滤，然后取滤液IO^d直接用于HPLC-ELSD检测。第四步HPLC-ELSD法测定腐马素测定腐马素组分与含量的方法是在Bojja等(2004)报导的程序基础上做出修改而建立的HPLC-ELSD方法。HPLC流动相A:水/三氟乙酸(trifluoroaceticacid，TFA)(100:0.025v/v)，B:乙腈/TFA(100:0.025，v/v)，按0-5min(0-20%B,100-80%A)，5-10min(20%-40%B,80-60%A)，10-15min(40-80%B,60-20%A)，15-20min(80%B,20%A),20-25min(80-0%B,20-100%A)线性梯度条件。流速是1.0ml/min。ELSD(ELSD2000,Alltech,USA)的条件设置是蒸发光检测器温度45"C，氮气流流速=2.0L/min，灵敏度值为1，撞击器开，在该条件下，信噪比最佳。在定量分析中，用于HPLC-ELSD分析的FB2、FB3、FB4标准溶液(1ngVl)进样量为10pl，FBl标准溶液(10pg4U)用上述相同的方法稀释成4种不同的浓度:25ng4tl，50ng/^il,100ng4d。每种浓度重复分析三次。根据峰面积的自然对数与FB1物质的量的自然对数对应关系得到标准曲线(图4)。通过标准曲线及每样品的峰面积计算样品中腐马素的浓度。实施结果浙江省内芦笋样品上分离的10个菌株均能在离体条件下产生FB1(125-19251jig/g平均值7450.96Ug/g)。某些菌株能产生FB2，FB3和FB4中的一种或多种。产生FB2为14-2171pg/g(平均值671.21ng/g)，产生FB3为74-460pg/g(平均值247.75ng/g)，产生FB4为79-2715Hg/g(平均值698.03ng/g)。10个菌株中有4个(40%)能检测到全部FB1，FB2，FB3和FB4，5个菌株(50%)能检测到FBl,FB2禾口FB4，仅1个菌株只能检测到FBI和FB2(表3)。产毒力测定结果与实施例l中复合PCR结果一致，证明了本发明检测戸笋中腐马素产毒菌株复合PCR实验方法的可靠性。表3芦笋上分离菌株腐马素产毒力的测定<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1、一种运用复合PCR技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法，其特征在于使用分别根据腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因和丝氨酸-十六酰基转移酶基因FUM8设计的引物对rp32/rp33和rp679/rp680和镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR，通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组；在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株；其检测步骤为对待检样品进行菌株分离和纯化；SDS法提取样品模板DNA；复合PCR反应；经电泳、染色、漂洗，用自动凝胶成像系统观察、扫描并储存电泳结果，最后经过谱图分析，得出检测结果。2、根据权利要求1所述的芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于所述菌株的分离和纯化的操作步骤为芦笋样品清洗后切成2cm长小段，70%酒精消毒3min，10%次氯酸钠消毒7min，然后用无菌水冲洗3次；无菌条件下，将样品平铺到PDA培养基上，封口膜封口；置于培养箱中25。C暗培养，统计每个样品在PDA培养基上的菌落，观察真菌的生长，4-5天后在显微镜下观察真菌的性状特征，分出不同的真菌，将其从菌落中挑出，各自接种到PDA培养基上进一步培养；一种真菌接种于一个培养皿内，4-5天后，对纯化了的菌株进行单孢分离，准备3个倒有10ml无菌水的培养皿，用接种针挑取一小块菌丝放入一个培养皿中，用"L"型玻棒搅匀，蘸取少许溶液溶解在第二个培养皿中，同样方法处理第三个培养皿，得到三个不同数量级浓度的孢子悬浮液；分别从三个不同孢子悬浮液中蘸取少许液体涂在PDA平板上，高浓度一个，中等浓度2个，低浓度3个；25。C暗培养，每隔12h观察一次，若发现有菌落产生则用记号笔从培养皿的反面标记，用解剖针连同培养基一起挑取到新的PDA平板中；获得单孢培养物，纯化后菌株于4'C保存备用。3、根据权利要求1所述的芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于所述SDS法提取样品模板DNA，其操作步骤为-1)将菌株培养在50ml的液体酵母培养基中，在27°C，200rpm/min的振荡条件下，培养3-5天；2)用Whatman滤纸过滤，抽滤收集孢子，在液氮中磨成粉，将粉末收集在50ml的试管中；3)在试管中加入4mlDNA提取液并且涡旋使其充分混合；4)加入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，短时间涡旋振荡，2500g离心15min;5)将上清液转移到2ml的离心管中，每支中加900ul，然后加900ul氯仿，13200rpm离心5min:6)将上层溶液转移到新的2ml试管中，力n入RNasel终浓度C^100ng/ml，然后在37。C培养2-3h;7)将试管和5M氯化锂溶液在冰上放置15min;8)往试管中加入等体积的冷的5M氯化锂溶液，轻轻振荡充分混合，在冰上再放置15min;9)4。C下13200rpm离心10min，然后将所有的上清液一起都放在50ml的试管中；10)加入2.5倍体积的100%乙醇，在水和乙醇的交界处形成一层DNA团，然后混合；11)4'C下3000g离心20min，弃取上层清液；12)加20ml70。/。的冷乙醇，然后在4。C下过夜，让杂质溶解；13)4。C下3000g离心20min，弃去上层清液；14)沉淀在空气中干燥15min，然后加入300-40(^1重蒸水，在4'C下溶解过夜；15)用移液器吸取溶液的办法使其混匀，获得样品模板DNA。4、根据权利要求1所述的芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于复合PCR反应所用引物rp32/rp33和rp679/rp680和ItsR/ItsF序列如下rp32ACAAGTGTCCTTGGGGTCCAGGrp33GATGCTCTTGGAAGTGGCCTACGrp679CGTAGTAGGAATGAGAAGGATGrp680GCAAGCTTTGTGGCTGATTGTCItsFAACTCCCAAACCCCTGTGAACATAItsRTTTAACGGCGTGGCCGC其中rp32/rp33引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出680bp的产物，rp679/rp680引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出920bp的产物，ItsR/ItsF引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出431bp的产物。5、根据权利要求1所述的芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于所述复合PCR反应体系为反应体系总体积为25^1，反应物包括2.5^1的10xPCR缓冲液，0.5pl的10MmdNTP，0.5^1的Taq酶，2^1的SDS法提取样品模板DNA，1.2pl的引物rp32/rp33和rp679/rp680和ItsR/ItsF，其余以重蒸水补足。6、根据权利要求5所述的芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于1.2nl的引物中rp32和rp33各0.15ixl，rp679和rp680各0.25|il，ItsF和ItsR各0.2|xl。7、根据权利要求1所述的芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于所述复合PCR反应条件为预变性温度94t:，时间5min;循环数33，变性温度94T:，时间30s;退火温度53。C，时间45s;延伸温度72。C，时间lmin;终延伸温度72。C，时间10min;保存温度4'C。全文摘要一种运用复合PCR技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法，使用分别根据腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因和丝氨酸-十六酰基转移酶基因FUM8设计的引物对rp32/rp33和rp679/rp680和镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR。在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株，不仅可以检测到未知的腐马素产毒菌株，而且能同时鉴别所测菌株是否属于镰刀菌属。采用复合PCR技术，多对引物在同一反应体系中同时扩增，提高了检测的准确性，节约了检测时间，是一种简单、有效、快速的芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法。可以试剂盒的形式大规模推广。文档编号C12Q1/68GK101418338SQ200810120758公开日2009年4月29日申请日期2008年9月11日优先权日2008年9月11日发明者莹周,杜良成,汪俏梅,王建升,佳魏申请人:浙江大学