专利名称：一种利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用木质纤维素原料同步糖化发酵生产能源酒精的方法，尤其涉及一 种利用造纸工业的废弃物——废纸浆为原料，利用纤维素酶同步糖化发酵生产酒精的方 法，属于微生物发酵生产领域。
背景技术：
随着全球石油价格的不断上涨，能源酒精的生产量也不断增加。木质纤维素原料被认 为是能源酒精可持续生产的唯一可再生原料。然而，目前几乎所有的能源酒精都是以淀粉 或糖类农作物为原料生产的。因此，不可避免地存在与食品原料竞争的局面，而且无法满 足对能源酒精持续增长的需求。最新研究表明，以玉米酒精为代表的淀粉酒精生产技术所 产生的温室气体与汽油相当。解决这些挑战最有希望的途径就是纤维素酒精生产。原材料 成本是纤维素酒精生产的第一位成本，在目前纤维素酒精生产还无法产业化的背景下，以 工业废弃物——废纸浆为原料进行同步糖化发酵生产能源酒精具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种利用废纸浆发酵生产能源 酒精的方法,该方法以废纸浆发酵生产能源酒精不仅省去了纤维素发酵生产酒精过程中的 成本占第一位的原材料和预处理费用，具有经济可行性，而且可以变废为宝，解决造纸工 业的环境污染问题。本发明通过如下技术方案实现。
一种利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，包括如下步骤
(1) 酵母种子液制备低温保存的酒精酵母经试管斜面、摇瓶和种子罐逐级放大， 制得细胞数大于106个/1111的酵母醪液；其中种子培养基采用YPD培养基；
(2) 发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中废纸桨添加量为纤维素10 60 g/L，
玉米浆添加量为1 10 g/L，硫酸镁添加量为0.1 2 g/L;将发酵培养基在115 130℃下 灭菌30 120分钟；
(3) 同步糖化发酵按照8 20FPU/g纤维素添加葡聚糖酶和8 20 IU/g纤维素 添加e -葡萄糖苷酶到经灭菌并冷却至30 37℃的发酵培养基中，同时将制备好的酵母种 子液以5% 10%接种量接种至发酵培养基中，厌氧同步糖化发酵，发酵温度为30 37℃; 发酵12 60小时后，补加废纸浆和上述比例的玉米浆以及酶，使72 96小时酵母醪酒精 含量达到40g/L以上，终止发酵； (4)蒸馏脱水对发酵醪进行蒸馏和脱水，即得能源酒精。
上述利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法中，步骤(1)所述低温为-2(TC， -80"或 者-196"C;所述酵母醪液的细胞数为1()S个/ml;
上述利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法中，所述YPD培养基配方为:酵母粉10 g/L, 蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L;斜面时添加1.5%琼脂；该培养基初始pH为4.5 7.0。
上述利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法中，步骤(1)中所采用的酒精酵母是 Sacc/wramyces Cewv/w'ae。步骤(3)中所述葡聚糖酶为Spezyme CP或者AccelleraseTM， Genencor International, Inc，所述P -葡萄糖苷酶为Novozyme 188;该两种酶采用0.22 P m 膜过滤除菌。
本发明中的废纸浆是造纸工业的废弃物，含有颗粒细小的纤维素和半纤维素，具有较 大的比表面积，有利于酶解糖化，不需预处理即可用于同步糖化发酵，而且具有负成本的 特点。因此，利用本发明所述的方法可以成功利用纤维素原料——废纸浆发酵生产能源酒 精，酵母醪酒精含量达到4% (w/v)以上，省去了纤维素发酵生产酒精过程中的第一位 的原材料和预处理成本，而且可以变废为宝，解决造纸工业的环境污染问题，具有极大的 示范和推广价值。
本发明所述的方法具有以下优点
1. 发酵生产能源酒精的原料是造纸工业废弃物——废纸浆，含有颗粒细小的纤维素 和半纤维素，具有较大的比表面积，有利于酶解糖化，不需预处理即可用于同步糖化发酵， 而且具有负成本的特点。
2. 采用葡聚糖酶和e-葡萄糖苷酶进行废纸桨的糖化，可以降低酶的用量，从而降低
生产成本。
3. 采用同步糖化和发酵工艺，不但简化了工艺，节省了投资成本，而且可以有效地 解除糖化产物对酶的抑制效应。
4. 采用流加工艺，可以有效地提高发酵醪酒精浓度，降低下游工艺的生产成本。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式
作进一步说明。 实施例1
利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，具体过程如下
(1)种子制备-80°(:保存的酒精酵母Sacc/wrowyc" CewWw'ae经试管斜面、摇瓶
逐级放大，制得细胞数达到1()S个/ml的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵 母粉10 g/L,蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L;斜面时添加1.5%琼脂；培养基初始pH为5.5;
(2) 发酵培养基制备及原料灭菌100 ml血清瓶中装液量为50 ml，初始培养基中 废纸浆添加量为纤维素10 g/L，玉米浆lg/L;硫酸镁0.1g/L;自然pH值。以胶塞和铝 盖封瓶，115'C灭菌60分钟;
(3) 同步糖化发酵按照8 FPU/g纤维素添加葡聚糖酶(Accellerase , Genencor International, Inc)禾卩8 IU/ g纤维素添加e-葡萄糖苷酶(Novozyme 188)到灭菌冷却至 3(TC的发酵培养基中，同时将制备好的酵母种子液以5%接种量接种至发酵培养基中，厌 氧同步糖化发酵，温度控制3(TC，摇床搅拌转速200 r/min，自然pH;发酵12小时左右 时，将发酵液转移至含有废纸浆纤维素40g/L，玉米浆4g/L以及酶的血清瓶中，48小时 时将发酵液再转移至含有废纸浆纤维素40g/L，玉米浆4g/L以及酶的血清瓶中，96小时 酵母醪酒精含量达到43 g/L;
(4) 蒸馏脱水对发酵醪进行蒸馏和脱水，即得能源酒精。
实施例2
利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，具体过程如下
(1) 种子制备-80卩保存的酒精酵母&cc/wraw_yc" Ce^wWae经试管斜面、摇瓶 逐级放大，制得细胞数达到10S个/ml的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵 母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L;斜面时添加1.5%琼脂；培养基初始pH为5.5;
(2) 发酵培养基制备及原料灭菌100 ml血清瓶中装液量为50 ml，初始培养基中 废纸浆添加量为纤维素60g/L，玉米浆6g/L;硫酸镁0.6 g/L;自然pH值。以胶塞和铝 盖封瓶，13(TC灭菌30分钟；
(3) 同步糖化发酵按照20 FPU/g纤维素添加葡聚糖酶(GC 220， Genencor Intemational,Inc)禾P20IU/g纤维素添加e-葡萄糖苷酶(Novozyme 188)到灭菌冷却至 37'C的发酵培养基中，同时将制备好的酵母种子液以10%接种量接种至发酵培养基中， 厌氧同步糖化发酵，温度控制37'C，摇床搅拌转速200 r/min，自然pH;发酵48小时左 右时，将发酵液转移至含有废纸浆纤维素40g/L，玉米浆4g/L以及酶的血清瓶中，96小 时酵母醪酒精含量达到48 g/L;
(4) 蒸馏脱水对发酵醪进行蒸馏和脱水，即得能源酒精。
实施例3
利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，具体过程如下
(1) 种子制备-80°<:保存的酒精酵母Sflcc/zarcw^c^ CerevWae经试管斜面、摇瓶 逐级放大，制得细胞数达到10S个/ml的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵 母粉10 g/L,蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L;斜面时添加1.5%琼脂；培养基初始pH为7.0;
(2) 发酵培养基制备及原料灭菌100 ml血清瓶中装液量为50 ml，初始培养基中 废纸浆添加量为纤维素40g/L，玉米浆4g/L;硫酸镁0.4g/L;自然pH值。以胶塞和铝 盖封瓶，121'C灭菌45分钟；
(3) 同步糖化发酵按照10 FPU/g纤维素添加葡聚糖酶(Spezyme CP， Genencor International, Inc)和10IU/g纤维素添加P-葡萄糖苷酶(Novozyme 188)到灭菌冷却至 33'C的发酵培养基中，同时将制备好的酵母种子液以10%接种量接种至发酵培养基中， 厌氧同步糖化发酵，温度控制33'C，摇床搅拌转速200 r/min，自然pH;发酵36小时左 右时，将发酵液转移至含有废纸浆纤维素50 g/L，玉米浆5g/L以及酶的血清瓶中，96小 时酵母醪酒精含量达到45% g/L;
(4) 蒸馏脱水对发酵醪进行蒸馏和脱水，即得能源酒精。 实施例4
利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，具体过程如下
(1) 种子制备-20°0保存的酒精酵母Sacc/ araw;;ce;j Ce"Ww'ae经试管斜面、摇瓶 逐级放大，制得细胞数达到10S个/ml的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵 母粉10 g/L,蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L;斜面时添加1.5%琼脂；培养基初始pH为4.5;
(2) 发酵培养基制备及原料灭菌5L反应器中装液量为3.0L，初始培养基中废纸浆 添加量为纤维素50g/L，玉米浆4g/L;硫酸镁0.4g/L;自然pH值。灭菌前搅拌30min，
使纸桨分散，urc灭菌60分钟；
(3) 同步糖化发酵按照20FPU/g纤维素添加葡聚糖酶(Spezyme CP， Genencor International, Inc)和20 IU/g纤维素添加P-葡萄糖苷酶(Novozyme 188)到灭菌冷却至 37'C的发酵培养基中，同时将制备好的酵母种子液以10%接种量接种至发酵培养基中， 厌氧同步糖化发酵，温度控制37'C，搅拌转速160r/min，自然pH;发酵30小时左右时， 流加废纸浆纤维素70 g/L，玉米桨5 g/L以及相应的酶，96小时酵母醪酒精含量达到59 g/L;
(4) 蒸馏脱水对发酵醪进行蒸馏和脱水，即得能源酒精。
实施例5
利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，具体过程如下
(1) 种子制备-80卩保存的酒精酵母5^c/wraw少c^y Cerev/w'ae经试管斜面、摇瓶 逐级放大，制得细胞数达到1()S个/ml的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵 母粉10 g/L,蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L;斜面时添加1.5%琼脂；培养基初始pH为5.5;
(2) 发酵培养基制备及原料灭菌30L反应器中装液量为18L，初始培养基中废纸 浆添加量为纤维素50 g/L，玉米浆4 g/L;硫酸镁0.4 g/L;自然pH值。灭菌前搅拌30min， 使纸浆分散，121'C灭菌60分钟；
(3) 同步糖化发酵按照15 FPU/g纤维素添加葡聚糖酶(Spezyme CP， Genencor International,Inc)和15IU/g纤维素添加P-葡萄糖苷酶(Novozyme 188)到灭菌冷却至 37'C的发酵培养基中，同时将制备好的酵母种子液以10%接种量接种至发酵培养基中， 厌氧同步糖化发酵，温度控制37'C，搅拌转速250r/min,自然pH;发酵36小时左右时， 流加废纸浆纤维素60 g/L，玉米浆5 g/L以及相应的酶，96小时酵母醪酒精含量达到53 g/L;
(4) 蒸馏脱水对发酵醪进行蒸馏和脱水，即得能源酒精。
实施例6
利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，具体过程如下
(1) 种子制备-196°(:保存的酒精酵母&"/^0附;;￡^<^^^^经试管斜面、摇瓶 逐级放大，制得细胞数达到K)8个/ml的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵 母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L;斜面时添加1.5%琼脂；培养基初始pH为5.5;
(2) 发酵培养基制备及原料灭菌100L反应器中装液量为60L，初始培养基中废纸 浆添加量为纤维素40 g/L，玉米浆4 g/L;硫酸镁0.4 g/L;自然pH值。灭菌前搅拌30min， 使纸浆分散，12rC灭菌60分钟；
(3) 同步糖化发酵按照10FPU/g纤维素添加葡聚糖酶(Spezyme CP， Genencor International, Inc)和10IU/g纤维素添加e-葡萄糖苷酶(Novozyme 188)到灭菌冷却至 37'C的发酵培养基中，同时将制备好的酵母种子液以5%接种量接种至发酵培养基中，厌 氧同步糖化发酵，温度控制37。C，搅拌转速200 r/min，自然pH;发酵36小时左右时， 流加废纸浆纤维素50 g/L，玉米浆5 g/L以及相应的酶，96小时酵母醪酒精含量达到47 g/L;
(4) 蒸馏脱水对发酵醪进行蒸馏和脱水，即得能源酒精。
权利要求
1、一种利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，包括如下步骤(1)酵母种子液制备低温保存的酒精酵母经试管斜面、摇瓶和种子罐逐级放大，制得细胞数大于106个/ml的酵母醪液；其中种子培养基采用YPD培养基；(2)发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中废纸浆添加量为纤维素10～60g/L，玉米浆添加量为1～10g/L，硫酸镁添加量为0.1～2g/L；将发酵培养基在115～130℃下灭菌30～120分钟；(3)同步糖化发酵按照8～20FPU/g纤维素添加葡聚糖酶和8～20IU/g纤维素添加β-葡萄糖苷酶到经灭菌并冷却至30～37℃的发酵培养基中，同时将制备好的酵母种子液以5％～10％接种量接种至发酵培养基中，厌氧同步糖化发酵，发酵温度为30～37℃；发酵12～60小时后，补加废纸浆和上述比例的玉米浆以及酶，使72～96小时酵母醪酒精含量大于40g/L，终止发酵；(4)蒸馏脱水对发酵醪进行蒸馏和脱水，即得能源酒精。
2、 根据权利要求1所述的利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，其特征在于步骤(l) 所述低温为-20。C， -80°<:或者-196°(:。
3、 根据权利要求1所述的利用废纸桨发酵生产能源酒精的方法，其特征在于步骤(l) 所述酵母醪液的细胞数为1()S个/ml。
4、 根据权利要求1所述的利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，其特征在于步骤(l) 所述YPD培养基配方为酵母粉10g/L,蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L;斜面时添加1.5% 琼脂；该培养基初始pH为4.5 7.0。
5、 根据权利要求1所述的利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，其特征是步骤(1) 中所采用的酒精酵母是Sofc由ra亭^ Ce固to。
6、 根据权利要求1所述的利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，其特征是步骤(3) 中所述葡聚糖酶为Spezyme CP或者Accellerase， Genencor International, Inc，所述P -葡萄 糖苷酶为Novozyme 188;该两种酶采用0.22 n m膜过滤除菌。
7、 根据权利要求1 5任一项所述的利用废纸桨发酵生产能源酒精的方法，其特征是 步骤(3)所述72 96小时酵母醪酒精含量为40 60g/L。
全文摘要
本发明公开了一种利用废纸浆发酵生产能源酒精的方法，包括酵母种子液制备，发酵培养基制备及灭菌，同步糖化发酵和蒸馏脱水等过程。同步糖化发酵步骤中，发酵12～60小时后，补加废纸浆和玉米浆以及酶，使72～96小时酵母醪酒精含量达到40g/L以上，终止发酵。本发明中的废纸浆是造纸工业的废弃物，含有颗粒细小的纤维素和半纤维素，具有较大的比表面积，有利于酶解糖化，不需预处理即可用于同步糖化发酵，而且具有负成本的特点。因此，以废纸浆发酵生产能源酒精不仅省去了纤维素发酵生产酒精过程中的成本占第一位的原材料和预处理费用，具有经济可行性，而且可以变废为宝，解决造纸工业的环境污染问题。
文档编号C12R1/865GK101358213SQ200810198428
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者朱明军, 梁世中 申请人:华南理工大学