专利名称：微流体和纳米流体装置、系统和应用的制作方法
微流体和纳米流体装置、系统和应用 交叉参考 本申请要求2007年2月5日提交的美国临时申请号60/899， 630 "微流体 禾口纟内米流体装置、系统禾口应用(Microfluidic and nanofluidic devices, systems, anda卯lications)"的优先权，通过引用将该申请全文纳入本文。
有关联邦资助的研究的声明 本发明在以下 一 项或多项政府资助下完成国防部授予的计划号 W911SR-04-P-0047、 NIH授予的资助号5R01HG003583、 HSARPA授予的合同号NBCHC050133、 HSARPA授予的命令号TTA-1-0014(协议号W81XWH-04-9-0012)。政府享有本发明的某些权 利。
背景技术：
过去，已经开发了设计不同的各种微流体装置，其目的常常是降低生物分析方法 中对样品体积的要求、将多个步骤整合成自动化的过程、整合样品制备和分析、以及将样品 的整个体积和各个步骤联系起来。 在没有按标准控制外形尺寸形状因素，上游和下游外部接口的特性，以及内部微 流体通路的长度、横截面形状和直径的情况下，这类微流体装置常常互不相容，并且与现有 的上游纯化和下游分析装置不相容。 尽管显微制造技术取得的进展使得可能在微升，甚至纳升或皮升水平进行分析， 但首先获得的许多生物和环境样品的体积远远高于现有微流体分析装置的分析水平。
模块化微流体技术可以将移动的样品结合到微芯片上。虽然微流体领域的焦点 是将多种功能整合到单个装置，但已通过另一种在多个装置上模块化地整合多种功能的 方法达到该目的。这种模块化的理念基于以下技术，即简单地将两个连接器插接在一起 以连接毛细管阵列(美国专利号6，551，839 ;美国专利申请号11/229,065 ;美国专利号 6， 190， 616 ;美国专利号6， 423， 536 ;美国专利申请号09/770， 412 ;美国专利号6， 870， 185 ; 美国专利申请号10/125,045 ;美国专利申请号10/540,658 ;美国专利申请号10/750， 533 ; 美国专利申请11/138， 018 ;通过引用将它们全文纳入本文)。除产生连接器外，阵列间的接
口也产生真正的死容积为零的阀和路由选择器。本申请提供如何连接和断开含流体线路的 微芯片与其他毛细管微芯片或阵列的指南，开发包含两个、三个或多个微芯片的新型微芯
片设计，提供新功能，包括组分收集、新应用和设备设计。这种新技术称为模块化纳米流体 (nanofluidic)技术，在模块化纳米流体技术中使用微芯片则称为"模块化微流体微芯片" 或"模块化微芯片"。 模块化微流体微芯片在生命科学和医学中具有许多应用。模块化微芯片产生的装 置可进行单项功能或局部聚集的群组功能。通过停靠两个微型装置和转移经加工的样品产 生更复杂的过程。例如， 一个微型装置可进行PCR扩增并清除一系列靶DNA，第二微型装置 可进行循环测序反应，并可连接于进行DNA序列分析的第三装置。相似地，在蛋白质组学应 用中，一个装置可进行第一维度的分离，第二装置进行第二正交分离。以"即插即用"方式 连接装置的能力允许以不同速率、循环次数或通量独立进行这些过程。可准备多组模块化微芯片并在酒店中培育(incubated in hotels)。当样品制备过程中的一个步骤完成时，可 将下一步骤的模块化微芯片停靠、加载和(如果需要)移动到酒店，以便进行下一个步骤。 当样品制备完成后，模块化微芯片可与高通量CAE微芯片、质谱仪、流式细胞仪或其他分析
设备接口相连。 模块化方法能够让大规模装置如自动化装置和机器人与纳米级样品制备和分析 一同工作。现有机器人系统能够满足模块化操作的精确定位需求，这种精度需求远远低于 微电子工业的需求。目前，分级(stage)和步进电动机目前的定位精度能够达到小于lym， 大于5 i！ m的定位精度是相当常见的。模块化微芯片可影响广泛自动化能力，直接加速纳米 装置的发展和使用。 模块化微流体方法可将基于微芯片的技术与自动化系统组合起来，产生完全自动 化纳米样品制备方法并将其与许多类型的分析联系起来的技术平台。在本发明中，提供如 何将本发明应用于开发DNA序列样品制备和分析、AFLP分析、PCR分析、MLVA分析、循环测 序、用于基因分型的DNA片段分析和DNA测序的片段分析的例子。 在本发明中，提供如何连接微量级和纳米级装置以及如何在微芯片上进行样品制 备和分析的指南。我们也教导如何连接行使专门化功能的不同微芯片，这些功能包括微芯 片阀、反应器、流体移动、混合、进行不同的生化反应和分析方法。
发明内容
—方面，本发明提供包含以下组件的微流体装置微流体层、致动层和夹在它们中 间的弹性体层，其中所述微流体层包括至少三个微流体通道，它们在连接点(nexus)处汇 合，并且被中断所述至少三个微流体通道中流体流动的间断面分隔开；致动层包括至少一 个开口于阀室的致动通道，所述阀室位于所述连接点的反面；其中移动所述弹性膜能调节 经过所述至少三个微流体通道的流体流动，从而形成隔膜阀。在一个实施方式中，所述弹性 膜同时调节经过所述至少三个微流体通道的流体流动。在另一实施方式中，所述弹性膜防 止经过所述至少三个微流体通道的流体流动。在另一实施方式中，所述弹性膜不完全抑制 经过所述至少三个微流体通道的流体流动。在另一实施方式中，隔膜阀还包括通路层(vias layer)。在另一实施方式中，向所述至少一个致动通道施加压力或真空造成弹性膜调节经 过所述间断面的流体流动，从而形成至少一个三通道阀。在另一实施方式中，该膜天然地关 闭该阀，向该膜施加真空使该膜偏离阀座，从而打开该阀。在另一实施方式中，所述微流体 层包括朝向该膜的表面，所述表面具有沟槽，按压该膜时，沟槽形成微流体通道。在另一实 施方式中，所述微流体层包括内部微流体通道，这些通道与开口于连接点上的层中的孔相 交。在另一实施方式中，所述致动层包括朝向该膜的表面，所述表面具有沟槽，按压该膜时， 沟槽形成致动通道。在另一实施方式中，所述致动层包括开口于阀室上的内部致动通道。在 另一实施方式中，至少三个微流体通道以Y形汇合在连接点上。在另一实施方式中，多个所 述隔膜阀由 一个致动通道致动。 另一方面，本发明提供包含以下组件的微流体装置微流体层、致动层和夹在它们 中间的弹性体层，其中所述微流体层包括第一和第二微流体通道，它们在连接点处汇合， 并且被中断所述第一和第二微流体通道之间但不沿所述第二通道的流体流动的间断面分 隔开；致动层包括至少一个开口于阀室的致动通道，所述阀室位于所述连接点的反面；其中移动所述弹性膜能调节横跨所述至少三个微流体通道的流体流动，从而形成隔膜阀。在 一个实施方式中，所述第二微流体通道中的流体流动不受所述弹性膜的调节。在另一实施 方式中，弹性膜防止横跨至少一个微流体通道的流体流动。在另一实施方式中，弹性膜不完 全抑制横跨至少一个微流体通道的流体流动。在另一实施方式中，所述隔膜阀还包括阀层。 在另一实施方式中，向所述至少一个致动通道施加压力或真空造成所述弹性膜调节横跨至 少一个间断面的流体流动。在另一实施方式中，至少两个微流体通道以T形汇合在连接点 上。在另一实施方式中，多个隔膜阀由一个致动通道致动。在另一实施方式中，第二通道形 成具有确定容积的环，并包括预定容积的容积式泵。在另一实施方式中，通过打开隔膜阀和 用泵进行多次冲程将预定体积的液体泵送到微结构装置的第一通道中。 另一方面，本发明提供包含以下组件的微流体装置微流体层、致动层和夹在它们 中间的弹性膜层，其中所述微流体层包括微流体通道；所述致动层包括至少一个开口于 阀室的致动通道，该阀室沿微流体通道排布；无论是否移动弹性膜，流体都会沿通道流动， 但移动所述弹性膜能调节沿所述通道的流体流动，从而形成隔膜阀。在一个实施方式中，通 过增加或减少所述至少一个微通道的横截面积，该弹性膜能调节流体流动。在另一实施方 式中，该隔膜阀还包括通路层。在另一实施方式中，向至少一个致动通道施加压力或真空造 成所述弹性膜调节横跨至少一个间断面的流体流动。在另一实施方式中，提供在隔膜阀处 包含产生磁场的磁体的微流体装置。在另一实施方式中，所述磁体选自永磁体、电磁体或稀 土磁体。在另一实施方式中，在邻近所述隔膜阀的地方，至少一个微通道的通路形成星形或 嵌套星形。 另一方面，本发明提供包含第一微流体装置和第二微流体装置的系统第一微流 体装置包含包含入口 、出口 、泵和至少一个第一功能组件的第一微流体线路，所述第一功 能组件选自反应器、捕获区、温度循环区、热区、冷区、分离通道、分析线路、混合器、珠加工 单元或磁体，其中将泵构造成能够通过所述线路泵送流体； 第二微流体装置包含多个各自含有入口和出口的第二微流体线路，和至少一个 不同于第一功能组件的功能组件；其中所述第一和第二组件被构造成与多个位置配合，其 中在每个位置上第一线路的出口与第二线路之一的入口相匹配，以便使流体从第一线路流 动到匹配的第二线路中。在一个实施方式中，所述第一微流体装置还包括经构造能以电学 方式移动流体、分子、化学物质或颗粒的电极。在另一实施方式中，所述第二微流体装置还 包括分析区。在另一实施方式中，所述第二微流体装置还包括捕获区。在另一实施方式中， 与所述第一微流体装置相比，所述第二微流体装置是可移动的。在另一实施方式中，所述第 二微流体装置的流体输入将流体从所述第一微流体装置递送至多个微流体通道。在另一实 施方式中，所述第一微流体装置的流体输出将流体从多个微流体通道递送至所述第二微流 体装置的所述流体输入。在另一实施方式中，通过电泳方式将流体、分子、化学物质或颗粒 从所述第一微流体装置的所述流体输出移动到所述第二微流体装置的所述流体输入。另一 方面，本发明提供包括以下步骤的方法a)在权利要求26的第一微流体装置的微流体线路 中，对第一个样品进行第一项操作；b)配合权利要求26所述的第一和第二微流体装置以使 所述第一线路的输出与所述第二微流体线路的第一个线路的入口相匹配；c)在操作后，将 第一个样品从第一线路移动到第二线路的第一个线路中；d)在所述第二线路的第一个线 路中对接受的第一个样品进行第二项操作；e)在所述第一微流体线路中对第二样品进行第一项操作；f)配合所述第一和第二微流体装置以使所述第一线路的输出与第二微流体 线路的下一个不同线路的入口相匹配；g)在操作后，将第二个样品从所述第一线路移动到 所述第二线路的下一个线路中；和h)在所述第二线路的第一个线路中对第一反应样品进 行第二项操作。在一个实施方式中，提供包括在第一线路中再对至少一个样品重复进行步 骤e)-h)的方法，其中将各样品移动到多个第二线路的下一个不同线路中。在另一实施方 式中，第一项操作包括将样品与试剂混合。在另一实施方式中，在短于第二项操作的时间中 进行第一项操作。 另一方面，本发明提供一种制备微流体装置的方法，所述方法包括联结多层，形 成多个微通道和隔膜阀；其中所述多层夹在一起；其中所述多层中的至少两层选自弹性 膜、致动层、微流体层；阀层、散热器、通路层、界面层和覆盖层。在一个实施方式中，所述多 层中的至少一层是粘附层。在另一实施方式中，所述多层通过粘附层联结在一起。在另一 实施方式中，所述多层通过至少一个夹具联结在一起。在另一实施方式中，通过降低阀处的 压力或温度，将所述多层联结在一起，除了隔膜阀的位置。在另一实施方式中，在阀上选择 性设置涂层，将所述多层联结在一起，除了隔膜阀的位置。在另一实施方式中，所述涂层可 去除。 另一方面，本发明提供包含以下组件的微流体装置a)微流体通道；b)沿温度高 于环境温度的通道布置的第一温度区；C)沿温度低于环境温度的通道布置的第二温度区； 和d)沿通道布置并经构造将液体泵送到第一和第二温度区的容积式泵。在一个实施方式 中，提供包含与至少一个温度区热偶合的微流体环的微流体装置。在另一实施方式中，在至 少两个不同的温度区之间泵送至少一个微流体通道中的样品至少两次。在另一实施方式 中，通过不能混溶的流体从所述至少一个三阀泵中分离样品。在另一实施方式中，至少一个 隔膜阀安置在温度区。 另一方面，本发明提供分析样品的方法，所述方法包括在权利要求41所述的微 流体装置中加热或冷却核酸序列；分析所述核酸序列。在一个实施方式中，所述分析包括测 序、连接或聚合酶链反应扩增、转录、翻译或偶联的转录和翻译。在另一实施方式中，核酸选 自基因组DNA、线粒体DNA、 mRNA、 tRNA、 rRNA、 siRNA。在另一实施方式中，所述分析包括将 至少一个衔接子与所述核酸序列连接。在另一实施方式中，所述衔接子包括独特的核酸序 列标识物。在另一实施方式中，独特的核酸序列标识物用作内部质控标准。在另一实施方 式中，所述分析包括连接于珠的单个核酸序列的结合。在另一实施方式中，提供包括扩增核 酸序列的方法。 另一方面，本发明提供包含以下组件的微流体装置包含微流体通道的微流体层， 其中所述通道包括至少一个紧弯曲(tight bend)，其包含两个互相连接并形成锐角的通道 节段；和在紧弯曲区域产生磁场的磁场生成装置，其中流经该紧弯曲的顺磁性颗粒被磁场 所阻滞。在一个实施方式中，提供包含多个紧弯曲的微流体装置。 另一方面，本发明提供包含以下组件的微流体装置包含微流体通道的微流体层， 其中所述通道依次包括第一、第二和第三区域，其中所述第二区域的横截面面积大于所述 第一和第三区域；和在所述第二区域产生磁场的磁场生成装置，其中流经所述第二区域的 顺磁性颗粒被磁场所阻滞。 另一方面，本发明提供在微流体装置上进行生物分子分析的方法，所述方法包括在微流体装置上的第一反应室中混合生物分子和试剂，以产生第一反应混合物；将该反应 混合物移动到所述装置上的反应区并进行反应，以产生产物混合物；将产物混合物移动到 所述装置上的某区域并将产物捕获到该区域中的顺磁性捕获颗粒上；将所述颗粒和捕获产 物移动到所述装置中施加磁场的捕获室中，以将捕获颗粒和产物保留在捕获室中；在捕获 室中洗涤颗粒；将所述颗粒和产物移动到所述装置上的端口中，以便从所述装置取出产物。 在一个实施方式中，生物分子选自核酸(DNA或RNA)、蛋白质、糖、细胞或脂质。在另一实施 方式中，所述反应是核酸扩增反应。在另一实施方式中，所述扩增是等温扩增。在另一实施 方式中，所述扩增包括对混合物进行热循环。在另一实施方式中，提供了包括在反应混合物 或产物混合物上进行第二反应的方法。 另一方面，本发明提供包含以下组件的微流体装置a)多个微流体反应线路，各 线路包括至少两个经构造能接受样品或者可由其取出样品的端口 ；至少一个经构造能通 过所述线路泵送流体的泵，至少一个包括进行化学或生化反应的装置的反应室；和至少一 个包括捕获颗粒的装置的捕获室；b)至少一个与多个微流体线路流体连通并经构造能向 各个线路递送样品或试剂流的分配端口 ；其中多个线路经构造能对递送至每个线路的端口 之一的多种不同材料平行进行操作。在一个实施方式中，构造反应室，以便用热泵加热或冷 却。在另一实施方式中，捕获室位于磁场中，磁场经构造能阻滞顺磁性颗粒在捕获室中的移 动。在另一实施方式中，所述泵是容积式泵。
通过引用纳入本文。 通过引用将本说明书中提到的所有发表物和专利申请纳入本文，就好像将各篇单 独的发表物或专利申请特别和单独地通过引用纳入本文那样。
所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发 明的特征和优点，这些详述包括利用本发明原理的说明性实施方式和附图
图1显示泵在微芯片上，由输入区域至输出区域移动流体的应用。
图2显示由气动装置致动的微量级片内阀(MOV)。 图3中，上图显示自吸性MOV泵，中上图显示路由选择器，中下图显示混合器，下图 显示在通道中捕获珠。 图4显示用五个阀制备流体线路的应用，微芯片上的两个泵共享一个阀。
图5显示将微芯片上的两束流体混合并移动至反应器的可编程微流体线路。
图6显示将两束液流混合并将混合的液流移动至边缘的可编程微流体线路，在边 缘处该微芯片可与另一过程偶联。 图7显示由边缘输入样品、随着液流进入微型阀而混合样品和将它们移动到反应 器的可编程微流体线路，所述反应器可以是MOV阀。 图8显示混合和加载连接于边缘的反应器的可编程微流体线路。 图9显示可以由两室向反应器移动样品，然后将样品或产物移动到边缘以便进一
步加工或分析的可编程微流体线路。 图IO显示由反应器向可能进行第二工序，如另一生化或化学反应的位置移动样 品的可编程微流体线路。
图11显示在各装置上进行不同功能的两个装置。
图12显示分析装置可通过模块化微流体连接偶联于样品制备微芯片的情况。
图13显示使用模块化微流体连接的微芯片，其中一个或两个微芯片具有电极。
图14显示一个装置上有捕获区，以便在该区域浓縮、纯化或捕获样品，并将其传 递给第二装置。 图15显示各自具有捕获区的两个通道。 显示具有捕获区的装置A，所述捕获区连接于具有多个分析通道的装置B。 图17显示具有多个电极的装置，所述电极连接于具有捕获区的装置。 图18显示将图17的装置连接于具有两个或多个分离通道的装置。 图19中，上图显示MBI-026微芯片上8通道线路中的一个线路，其包括基于M0V
的混合、热循环反应和基于珠的样品清除；下图显示完整的玻璃MBI-026微芯片。 图20显示MBI-026微芯片的阅读长度和信噪比。 图21显示自动化微芯片和微量滴定板。 图22显示一种装置，即使用免疫磁性分离(MS)和压力驱动液流分配磁珠并将生 物物质浓縮和纯化到珠上的样品捕获和纯化模块(SCPM)。 图23显示构建称为'Y-阀'的MOV微型阀的改进方法，所述Y-阀具有三相连接。
图24显示MOV流通阀，其中两束或多数液流可汇集在一起。 图25比较了微型阀不位于连接点的情况(左图)和通过如图24所示的流通阀与 另 一通道连接以消除死容积的实施方式。 图26显示使用具有改进的顺磁性颗粒捕集特征的微流体线路。 图27显示改变微流体通道的横截面面积，以减慢流动并改进通过磁力、光学和其
它方法进行的颗粒捕集。 图28显示通过打开MOV微型阀改变微流体通道的横截面面积，以减慢流速和改善 通过磁力、光学和其它方法进行的颗粒捕集。 图29显示用MOV Y联结件将储库和其它流体来源连接于多个通道。 图30显示利用流通阀递送试剂或样品，以最大程度减小交叉点的死容积，在需要
时通道在交叉点上可互不连通。 图31显示含有微型阀如MOV微型泵的环。 图32显示在紧凑设计中集成多种功能的可编程微流体线路。 图33显示混合型塑料微芯片。 图34显示使用星形加工设计和检测器的紧凑设计中集成了多种功能的可编程微 流体线路。 图35显示机械夹紧的微芯片的设计。 图36显示机械夹紧的微芯片的照片，上图从上方拍摄，下图从下方拍摄。
图37显示机械夹紧的微芯片的布局。 图38显示使用转移带或涂有粘合剂的材料的微芯片的组件。 图39显示由粘合的层构成的微芯片。 图40显示阀与粘合的层的局部放大图。 图41显示包含加热器和散热器的粘合剂层叠微芯片。
图42显示塑料层叠微芯片，其包含可由可编程启动装置控制的通常关闭的阀。
图43显示塑料层叠微芯片，其包含可由可编程启动装置控制的通常开通的阀。
图44显示四层阀。 图45显示为珠清除制造的掩模设计顶视图和塑料微芯片。 图46显示可以用塑料或其它材料制造的微芯片上方的设计，下图是丙烯酸微芯 片的照片。 图47显示使用MOV泵将样品在热区和冷区之间移动。 图48显示使用MOV泵将样品在三个温度区之间移动。 图49显示在不通过泵的情况下，在热区和冷区之间移动样品。 图50显示在多通道热循环装置中的温度区之间移动多种样品以提高通量。 图51显示在具有清除通道的多通道热循环装置中的温度区之间移动多种样品以
提高通量。 图52显示两个微型阀中的两种温度的循环。
图53显示三个微型阀中的三种温度的循环。
图54显示微型阀中的三种温度的往复。 图55显示NBP超级焦磷酸领lj序(NanoBioPr印SuperPyroSequencing)
(NanoBioPr印sPs)过程的工作流和工艺的详细描述。 图56显示42个连接微芯片的NanoBioPi^pSPS连接模块。 图57显示96通道毛细管盒。 图58显示两个用于连接的可编程微流体线路。 图59显示使用可编程微流体线路的96个连接线路的微芯片。 图60显示捕集在星形捕获区的磁珠。 图61显示emPCR扩增的示意图。 图62显示使用循环水的热循环器。 图63显示多路闭锁微型阀装置。 图64显示在emPCR模块中进行的热循环。 发明详述 —方面，本发明提供有关使用可编程微流体线路和装置加工生化或化学样品的指 南。在一些实施方式中，微流体过程与毫升或厘升级的输入物或样品相联系。公开了其它 化学或生化过程以及多种过程的集成。在一些实施方式中，教导了有关不同设计的微型阀 的显微制造。 在某些实施方式中，本发明微流体装置包括微流体层、致动层和夹在它们中间的 弹性膜。流体层包括经调整能允许液体流动的流体通道。在某些实施方式中，流体通道位 于接触弹性膜的微流体层的表面。在此实施方式中，可将开通通道、沟或槽蚀刻到该层表面 内。在其它实施方式中，通道可以在该层的内部，例如是暗道、管道或管线的形式。内部通 道可通过表面通向该通道的孔与该层表面连通。在一种制备方法中，两个或多个亚层可相 互抹除，以便在两个亚层匹配时至少一个亚层包含形成封闭通道的沟槽。在此实施方式中， 亚层之一包含开口于表面，如端口或连接点的孔，以允许横跨阀流动。本发明隔膜阀移动确 定体积的液体。三个一组设置时，隔膜阀可用作隔膜泵，它用作容积式泵。本发明的模块化装置可包含使模块相互移动的器件(如步进电动机)，以使它们配合和匹配横跨不同模块 的流体通道(例如顺次设置的)。通过使快速活性的模块横跨较慢活性的模块移动，以使快 速模块将样品递送至较慢模块的各线路中，从而协调快速活性和较慢活性。第一个单个样 品可在许多较慢通道之间分配，或者可将许多不同样品递送至各个第二线路中。
另一方面，利用微结构在微芯片上移动流体。在一些实施方式中，三个或多个阀可 产生用于移动流体的泵(包括但不限于:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18U9 或20个阀)。在一个实施方式中，所述阀是隔膜阀。隔膜阀可通过致动可形变结构产生。 在一些实施方式中，隔膜阀包括阀座。在一些实施方式中，隔膜阀可允许或阻止通道，如微 通道中的流体流动。在其它实施方式中，产生的隔膜阀无阀座。在一些实施方式中，通过改 变通道的横截面积，隔膜阀可控制流体通过微通道的流动速度。在另一实施方式中，隔膜阀 不完全抑制流体流动，换言之，该阀在开通和关闭位置均允许一部分流体流动。图l显示在 微芯片A上，泵由输入区域至输出区域移动流体的应用。 在另一实施方式中，利用微结构移动包含感兴趣分析物的流体。在一个实施方式 中，分析物是颗粒。其中，颗粒包括蛋白质、肽、朊病毒、毒素、感染性生物体(包括但不限 于细菌、病毒、真菌)、细胞(包括但不限于血细胞、白细胞、NK细胞、血小板、皮肤细胞、 颊(cheek)细胞、精细胞、滋养层、巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞)、核酸(如DNA和RNA，包 括但不限于mRNA、 rRNA、 tRNA、 siRNA、线粒体DNA、染色体DNA、基因组DNA和质粒)、细胞 成分(包括但不限于核、染色体、核糖体、内体、线粒体、液泡、叶绿体和其他胞质片段)、糖
(包括但不限于多糖、纤维素或壳多糖)和脂质(包括但不限于胆固醇、甘油三酯)。在 另一实施方式中，利用微结构移动包含感兴趣分析物的流体，所述感兴趣分析物包括例如
分子或化学物质(包括但不限于二氧芑、PCB、重金属、有机磷酸酯、雌激素模拟物、rBST、
药物代谢物、致癌物或致畸物)。 另一方面，将微结构用于样品捕获和纯化，例如显微分离、微型阀、微型泵和微型 路由选择器，纳米流体控制和纳米级生化。在一个实施方式中，利用微结构使复杂工作流 小型化和自动化(图2)。在一个实施方式中，微量级片内阀(MOV)阀、泵和路由选择器以 及操作它们的设备包括纳米生物处理器(NanoBioProcesso. r)平台。在另一实施方式中， 所述微芯片包括具有一个或多个功能组件的微结构，所述组件包括但不限于反应器、捕获 区、温度循环区、热区、冷区、分离通道、分析线路、混合器、珠加工单元、散热器、珀耳帖装置 (peltier device)和磁体。在一些实施方式中，捕获区可包括连接于基材的结合部分，包 括但不限于抗体、Fc片段、Fab片段、凝集素、多糖、受体配体、DNA序列、PNA序列、siRNA 序列或RNA序列。在另一实施方式中，微结构的一个或多个区域可包括珠，例如磁力反应性 珠。在一些实施方式中，所述珠可包括结合部分，包括但不限于抗体、Fc片段、Fab片段、凝 集素、多糖、受体配体、DNA序列、PNA序列、siRNA序列或RNA序列。在一些实施方式中，磁 力反应性珠的尺寸小于600nm，如590nm、580nm、570nm、560nm、550nm、540nm、530nm、520nm、 510nm、500nm、490nm、480nm、470nm、460nm、450nm、440nm、430nm、420nm、410nm、400nm、 390nm、380nm、370nm、360nm、350nm、340nm、330nm、320nm、310nm、300nm、290nm、280nm、 270nm、260nm、250nm、240nm、230nm、220nm、210nm、200nm、190nm、180nm、170nm、160nm、 150nm、140nm、130nm、120nm、110nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm或 10nm。在一些实施方式中，磁力反应性珠包含铁化合物。在一个实施方式中，磁力反应性珠是铁氧体珠。 在一些实施方式中，磁珠的直径为10-1000nm、20-800nm、30-600nm、40-400nm或 50-200nm。在一些实施方式中，磁珠的直径大于10nm、50nm、 100nm、200nm、500nm、 lOOOnm或 5000nm。磁珠可以是干燥的或悬浮于液体中。可通过本领域已知的任何方式将流体样品与 含磁珠的第二液体介质混合，这些方式包括2005年9月15日提交的题为"流体递送的方法 和系统(Methods and Systems for Fluid Delivery)"的美国序列号[未指定]所述的方 式。 在一些实施方式中，当样品中的分析物(如感兴趣或不感兴趣的分析物)是铁磁 体或具有磁性时，可利用磁场将这类分析物与一种或多种其它分析物(如感兴趣或不感兴 趣的分析物)或不含分析物的样品分隔或分离开。例如，将第一分析物偶联于特异性结合 第一分析物的抗体，其中所述抗体也偶联于磁珠。当含有第一分析物-磁珠复合物和第二 分析物的分析物混合物进入磁场时，捕获第一分析物_磁珠复合物，而其它细胞继续迁移 通过该磁场。然后，可通过移除磁场释放第一分析物。 磁场可位于本文所述微结构的外部或内部。外部磁场是来源位于本文所述装置 (如微芯片、隔膜阀、通道、阻挡物)以外的磁场。内部磁场是来源位于本文所述装置内部 的磁场。在一些实施方式中，通过电磁体或永磁体，如稀土磁体产生磁场。在一些实施方式 中，磁体是可移动的，并且可相对于微结构移动。 在一些实施方式中，当需要分离的分析物(如感兴趣或不感兴趣的分析物)不是 铁磁体或不具有磁性时，可将磁珠偶联于选择性结合这类分析物的结合部分。结合部分的 例子包括但不限于凝集素、多肽、抗体、核酸等。在优选实施方式中，结合部分是选择性结 合感兴趣分析物(如红细胞、癌细胞、精细胞、细胞核、染色体、白细胞、上皮细胞、细菌、病 毒或真菌)的抗体或抗体片段(如Fab、Fc、sfv)。因此，在一些实施方式中，磁珠可用抗体 (优选单克隆抗体)修饰。 可在接触样品之前将磁性颗粒偶联于本文所述的任何一种或多种微结构，或可在 将样品递送至装置前将磁珠与样品混合。 在一些实施方式中，本文所述系统包括含有能够改变捕获或未捕获的分析物的磁 性的试剂(如磁珠)的储库。该储库优选流体偶联于本文所述的一种或多种微结构。例如， 在一些实施方式中，磁性储库偶联于大小_微通道，在其它实施方式中，磁性储库偶联于捕 获区。 试剂的确切性质取决于分析物的性质。示范性试剂包括氧化或还原过度金属的物 质，氧化或还原血红蛋白的试剂，能够结合分析物的磁珠或能够螯合、氧化或结合铁或其它 磁性材料或颗粒的试剂。所述试剂可用于改变分析物的磁性，以赋予或提高其磁场吸引性、 赋予或提高其磁场排斥性、或消除磁性以使分析物不受磁场影响。 对磁场作出反应的磁珠可用于本发明的装置和方法。所需颗粒是可通过化学反
应、物理吸附、缠结或静电作用对其表面化学进行化学或物理修饰的颗粒。 在一些实施方式中，可通过本领域已知的任何方式将捕获部分结合于磁珠。例子
包括化学反应、物理吸附、缠结或静电作用。结合于磁珠的捕获部分取决于目标分析物的性
质。捕获部分的例子包括但不限于蛋白质(如抗体、亲和素和细胞表面受体)、带电或不
带电的聚合物(如多肽、核酸和合成聚合物)、疏水或亲水性聚合物、小分子(如生物素、受体配体和螯合剂)、糖和离子。可使用这类捕获部分特异性结合细胞(如，细菌、病原体、胎 儿细胞、胎儿血细胞、精细胞、癌细胞和血细胞)、细胞器(如细胞核)、病毒、肽、蛋白质、糖、 聚合物、核酸、超分子复合物、其它生物分子(如有机或无机分子)、小分子、离子，或它们的 组合(嵌合物)或片段。 —旦改变分析物的磁性后，可用其相对于样品其它组分分离或富集分离物。分离 或富集可包括利用磁场将所需分析物吸引至磁场而进行正选择、或可通过将不感兴趣的分 析物吸引至磁场而进行负选择。在两种情况下，可收集含有所需分析物的分析物群体以便 进行分析或进一步加工。 在一些实施方式中，将微结构用于分析至少一种分子、颗粒或化学物质的分析方 法。在一个例子中，分析核酸。分析包括但不限于连接或聚合酶链反应扩增、转录、翻译、 偶联的转录和翻译。在另一个例子中，标记的结合部分结合于目标分析物(如细胞、蛋白 质、细胞片段或核酸)。其中，结合部分包括但不限于抗体、抗体片段、受体、受体配体、凝 集素、多糖或核酸。其中，标记包括但不限于荧光标记(包括但不限于FITC、PE、德克萨斯 红(TexasRED)、赛博绿(Cyber Green) 、J0E、FAM、HEX、TAMRA、R0X、阿莱克萨(Alexa)488、阿 莱克萨532、阿莱克萨546、阿莱克萨405或其他荧光团)、放射性标记(包括但不限于P32、 4或(:14)、荧光蛋白(包括但不限于GFP、 RFP或YFP)、量子点、金颗粒、银颗粒、生物素、珠 (包括但不限于磁珠或聚苯乙烯珠)。 在一些实施方式中，公开了转运、加工和分析样品的MOV泵、阀和路由选择器。外 部致动的气动型片内阀、泵和路由选择器可在10nL至10i! L的操作体积下控制流体流动， 所述操作体积包括但不限于10nl、 1 lnl、 12nl、 13nl、 14nl、 15nl、 16nl、 17nl、 18nl、 19nl、 20nl、21nl、22nl、23nl、24nl、25nl、26nl、27nl、28nl、29nl、30nl、35nl、40nl、45nl、50nl、 55nl、60nl、65nl、70nl、75nl、80nl、85nl、90nl、95nl、100nl、110nl、120nl、130nl、140nl、 150nl、160nl、170nl、180nl、190nl、200nl、250nl、300nl、350nl、400nl、450nl、500nl、 550nl、600nl、650nl、700nl、750nl、800nl、850nl、900nl、950nl、1000n1、1. 1 ii 1、1. 2ii 1、 1. 3ii 1、1. 4ii 1、1. 5ii 1、1. 6ii 1、1. 7ii 1、1. 8ii 1、1. 9ii 1、2. Oii 1、2. 5ii 1、3. Oii 1、3. 5ii 1、 4. Oii 1、4. 5ii 1、5. Oii 1、5. 5ii 1、6. Oii 1、6. 5ii 1、7. Oii 1、7. 5ii 1、8. Oii 1、8. 5ii 1、9. Oii 1、 9.5ii 1、10.0ii l(参见Grover，W.H.等，2003. Sensors and Actuators B89 :315-323 ;美国 专利申请号10/750， 533 ;美国专利申请号10/540， 658 ;通过引用将其全文纳入本文)。
在一个实施方式中，MOV阀和泵将两个玻璃微流体层与与聚二甲基硅氧烷(P匿S) 可形变膜层和气动层合并起来，聚二甲基硅氧烷(P匿S)可形变膜层能打开或关闭阀，气动 层能使膜发生形变并致动阀(图2)。蚀刻在玻璃流体晶片上方的微流体通道是不连续的， 通过"通路晶片"和微流体通道通向通常是关闭的阀座(图2，上图)。通过常规级真空和 压力源将真空施加于气动移动室时，通常关闭的PDMS膜从阀座抬起以打开该阀(图2，中 图)。图2的下图显示阀的顶视图，比例尺与上方二图相同。在另一实施方式中，自吸性MOV泵(图3，上图)通过协调三个或多个阀的操作产 生，并可产生双向的流动。在另一实施方式中，路由选择器由三个或多个MOV阀制成(图3， 中上图)。在另一实施方式中，MOV混合器(图3，中下图)能快速混合样品和试剂。在另 一实施方式中，MOV装置精巧地与磁珠一起工作，以泵送或捕集珠组(图3，下图)。
通常关闭的MOV阀、泵和路由选择器持久耐用、容易制造、成本低、可用于密集阵列且具有较低的死容积。在微芯片，如纳米生物处理器微芯片上不难制造MOV阀、泵和路由 选择器的阵列。在一个实施方式中，微芯片上的所有MOV阀、泵和路由选择器均可在利用单 个膜的简单生产工艺中同时产生，所述膜包括例如如特氟龙、硅酮弹性体、聚二甲基硅氧烷 (P匿S)、聚酰亚胺、迈拉、胶乳、氟化橡胶、聚碳酸酯、丙烯酸、伞塔橡胶(sant即rene)、聚氨 酯或丁钠橡胶的片层。这种技术能够在微芯片上产生复杂的微型和纳米流体线路。
在制造方法的一方面，公开了微流体结构。在一个实施方式中，将多层材料夹在一 起形成完整的微流体结构以制造该结构。在一个实施方式中，使用粘合剂将这些层结合在 一起(图38-41)。在另一实施方式中，通过至少一个夹具，包括但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45或50个夹具将这些层结合在一起(图 35和36)。在另一实施方式中，通过粘合剂和夹具或销的组合将这些层结合在一起。在一个 实施方式中，所述夹在一起的多层材料包括选自下组的至少三层顶层、微流体层、通路层、 界面层、膜层、气动层、底层、散热器层、加热器层、致动层和阀层。在另一实施方式中，所述 层由一个以上的基板组成。例如，可用于产生微型阀的基板包括但不限于石英、玻璃(如 硼硅玻璃，包括但不限于派热克斯玻璃、硼浮玻璃(borofloat)、康宁(Corning) 1737)、 硅和塑料(包括但不限于丙烯酸、聚碳酸酯、液晶聚合物、聚甲氧基丙烯酸甲酯(PMMA)、 Zeonor、聚烯烃、聚丙烯和聚硫醇)。在另一例子中，可用作膜的基材包括但不限于特氟 龙、硅酮弹性体、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰亚胺、迈拉、胶乳、氟化橡胶、聚碳酸酯、丙烯 酸、伞塔橡胶、聚氨酯和丁钠橡胶。在另一例子中，可用作粘合剂的基材包括但不限于转移 带、涂有粘合剂的带，如硅酮基、丙烯酸或其他材料的薄片或薄膜。 在一些实施方式中，所述微结构包括多个微通道。在一些实施方式中，所述微通道 具有相同的宽度和深度。在其它实施方式中，所述微通道具有不同的宽度和深度。在一个 实施方式中，微通道的特征是通道宽度大于递送至微结构的样品中感兴趣分析物的平均大 小。在另一实施方式中，微通道的宽度等于或大于由样品分离的最大的分析物(如最大的 细胞)。例如，在一些实施方式中，微结构中微通道的宽度大于50、60、70、80、90、100、110、 120、130、140、150微米。在一些实施方式中，微通道的宽度小于100、90、80、70、60、50、40、 30或20微米。在一些实施方式中，微结构中的微通道的深度大于50、60、70、80、90、100、 110、120、130、140、150微米。在一些实施方式中，微通道的深度小于100、90、80、70、60、50、 40、30或20微米。在一些实施方式中，微通道的侧壁互相平行。在另一些实施方式中，微通 道的顶面和底面相互平行。在另一些实施方式中，微通道包括具有不同横截面的区域。在 一些实施方式中，微通道的横截面形状为楔形(cheese wedge)，其中楔形的尖端指向下游。
在一些实施方式中，微通道或微结构作为槽或沟蚀刻到基板中。在一些实施方式 中，可以通过基板钻、镗、切或蚀刻出洞。在其它实施方式中，基板中形成的微通道是封闭在 微芯片单层基板内的暗道或孔。 在一些实施方式中，用标准照相平版技术形成微结构。例如，可利用照相平版技术 在绝缘体上的硅(SOI)晶片上产生有凸起的光刻胶图案。S0I晶片由500iim厚的Si(100) 晶片上1 y m厚的Si02层之上的100 ii m厚的Si (100)层构成。为了优化光刻胶粘附，可在 涂布光刻胶之前使SOI晶片接触六甲基二硅氮烷的高温蒸汽。UV敏感型光刻胶旋涂在晶片 上，9(TC烘烤30分钟，通过铬接触掩模接触UV光300秒，在显影器中显影5分钟，再于90°C 烘烤30分钟。可根据光刻胶的特性和厚度改变工艺参数。铬接触掩模的图案转印到光刻胶上，并决定了微结构的几何形状。 形成与微结构相同的光刻胶图案后，开始蚀刻。Si(^可用作蚀刻过程的终止剂。也 可控制蚀刻在给定深度时停止，而不用终止剂层。在等离子体蚀刻机中，将光刻胶图案转移 到100iim厚的Si层上。可利用多重深蚀刻实现一致的微结构。例如，使该基板接触富氟 的等离子体流SF615秒，然后将该系统切换到富含碳氟化合物的等离子体流C4F810秒，以便 在所有表面上涂上一层保护膜。在随后的蚀刻循环中，接触离子轰击优选清除水平表面上 的聚合物，重复该循环多次，直到(例如)达到Si02层。 为了将结合部分与凸起表面偶联，可以使该基板接触氧等离子体，然后进行表面 修饰产生二氧化硅层，将结合部分与其连接。然后，用蒸馏的去离子水冲洗该基板两次，空 气干燥。将样品浸没在新鲜制备的2% v/v 3-[(2-氨基乙基)氨基]丙基三甲氧基硅烷的 水溶液中30秒，以便将硅烷固定在暴露的玻璃上，然后再用蒸馏的去离子水洗涤。在氮气 中干燥该基板并烘烤。接下来，将该基板浸入磷酸缓冲盐水配制的2. 5% v/v戊二醛溶液 中，室温下静置1小时。然后，再次冲洗该基板，并浸入蒸馏的去离子水配制的0. 5mg/mL结 合部分，如抗-CD71的溶液中，室温下静置15分钟，以便将结合物质偶联于凸起。然后，用 蒸馏的去离子水冲洗该基板，在70%乙醇中浸没过夜以灭菌。 除上述方法以外，还可利用多种技术将结合部分固定在微结构的区域和装置表面 上。出于简便和成本的考虑，可选择简单的物理吸附在表面上。另一种方法可使用以各种 结合部分官能化的自身组装的单层(如金上的硫醇)。根据所结合的结合部分和用于制造 该装置的材料，可采用其它方法。本领域已知表面修饰方法。此外，某些细胞可能优选结合 未改变的材料表面。例如，一些细胞可以优选结合带正电、带负电或疏水性表面或某些聚合 物中存在的化学基团。 微结构装置可由不同材料构成，包括但不限于派热克斯玻璃、硼浮玻璃、康宁 1737、硅丙烯酸(silicon acrylic)、聚碳酸酯、液晶聚合物、聚甲氧基丙烯酸甲酯(PMMA)、 Zeonor、聚烯烃、聚苯乙烯、聚丙烯和聚硫醇。根据材料的选择，可采用不同的制造技术。该 装置可利用热模凹凸印刷技术由塑料，如聚苯乙烯制成。凸起和必需的其它结构凹凸印刷 到塑料中，以产生底面。然后，可将顶层粘结于底层。注模是可用于产生这类装置的另一种 方法。也可利用软印刷术由塑料产生整个室，或者可产生部分微结构，然后粘结成到玻璃基 材上产生封闭的室。另一种方法包括使用环氧化物铸造技术，通过使用UV或温度可固化的 环氧化物在具有所需结构的阴刻拷贝的主板上产生凸起。也可利用激光或其它类型的显微 机械加工方法产生流动室。可用于制造该装置的其他合适的聚合物是聚碳酸酯、聚乙烯和 聚(甲基丙烯酸甲酯)。此外，可利用诸如钢和镍等金属，通过(例如)传统金属机械加工 方法制造本发明装置。可利用三维制造技术(如立体印刷术)制造单件形式的装置。本领 域已知其他制造方法。
混合流体 _ 公开了在微芯片和毛细管上混合流体的能力。图4显示用五个阀制备流体线路的 应用，一个阀为微芯片上的两个泵所共享。术语流体的含义包括但不限于只有一种组分的 简单流体，混合物，含有珠、颗粒、凝胶和本领域技术人员已知的其他材料的液体，气体和其 他基质。线路可由两个输入区域移动流体，混合它们并将混合物递送到微芯片A的输出区域。可通过包含两个或多个阀(包括MOV阀或其他阀)的泵移动单束液流。液流可含有样 品、试剂、缓冲剂和其他组分。阀可以对可形变结构产生致动作用，改变温度和压力。可利 用MOV和其他微型阀将两束(图3，中下图)或更多束液流(图3，中上图)合并。在一个 实施方式中，M0V阀为自吸性并且在电脑控制下，它们可能在两个方向上驱动，可通过简单 地运行这两个共同连接的泵将样品从标记为输出的区域移动到标记为输入的两个区域，利 用同一线路将样品分成两束液流。 图5显示在微芯片上混合两束液流和移动至反应器。在一些实施方式中，反应器 可位于M0V阀内，以改善用于检测的光学距离、面积体积比、热控制和其他优点。在以下例 子中，公开了用具有微型阀，如M0V阀、泵和路由选择器的微芯片进行反应的其它方法。
图6说明两束液流的混合，以及混合的液流流动至边缘，并在边缘与另一过程偶 联。可利用MOV阀完成混合。 图7说明由边缘输入样品，随着液流在微型阀中混合而混合样品，将它们移动 到可以是偏转膜产生的MOV阀或室的反应器，膜可以是，例如弹性膜，如聚二甲基硅氧烷 (PDMS)。 也可用M0V阀混合三束或多束液流(图3，中上图)，并移动到反应器中(图8)。 液流可含有液体、颗粒、磁珠、纳米颗粒、胶体、气体和其他材料。MOV阀能够容易地操作磁性
和其它性质的珠和颗粒，以及流体。
微芯片上的反应 _ —方面，可将样品移动至反应室(图8)，它由蚀刻通道、微型阀、小瓶、流动室、毛 细管、储库或本领域技术人员熟知的其它结构构成。可利用MOV阀产生包括两束或多数液 流以进行不同生化反应的微芯片。然后，可在反应器中询问样品。这可包括但不限于光学 传感，如LIF、吸光度、化学发光、表面等离振子共振。 图9说明使用两个联接的泵将样品移动至反应器，然后将样品或产物移动至边 缘，以便进行下述的进一步加工或分析。术语样品包括但不限于含有感兴趣分析物的流 体，由单个化合物或元素组成的材料，复杂样品如体液，气溶胶，混合物，生物或化学物质， 包括DNA、 RNA、微小RNA、蛋白质、脂质、多糖、细胞壁、小分子和生物样品的所有其它生物组 分，含有微珠或颗粒的流体。另外，可将样品与一种或多种试剂混合，然后递送至微结构。
图10说明将两个样品从边缘移动至反应器，然后移动至可进行第二项过程，如另 一生化或化学反应的位置。也可利用该位置输出样品，利用微流体装置将样品移动至进行 吸取或其它动作的机器人。需要时，可利用珠，包括磁珠移动样品。
两种或多种过程的集成 _ 在另一方面，模块化微流体停靠和移出延伸至使用两种或多种过程，其中一种或 多种微芯片包含MOV阀、泵和路由选择器。图ll显示装置A制备样品，然后由装置B分析 的实施方式。在一个实施方式中，该装置可以是采用管线、管道或其它装置制备样品的微芯 片或全尺寸装置。在另一优选实施方式中，装置B可以是毛细管、包含毛细管电泳系统或微 芯片毛细管电泳的单独设备；多维凝胶和毛细管电泳；质谱，具有HPLC的多维质谱，ICP，拉 曼光谱，颗粒，纳米颗粒和基于珠的检测，成像，包括荧光、IR、光学或本领域技术人员熟知的任何其它分析系统。如图6所示，在装置A上加工前，液流或流体可位于储库中，或如图11所示来自边缘或其它地方。以此方式，可利用具有样品制备功能如反应、路由选择、样品清除的微芯片，微芯片A，通过许多方式制备样品，这些方式包括PCR、循环测序、夹心试验、等温核酸扩增、等速电泳、等电聚焦、杂交、亲和捕获或本领域技术人员熟知的其它方法。然后，可将样品移动到装置B，装置B可以是可分析制备样品的微芯片、质谱仪、分析装置或包含分离装置的其它检测器。 图12显示分析装置可通过模块化微流体连接偶联于样品制备微芯片的情况。然后，可通过M0V泵、外压泵、电渗流、磁性分离或其它方法将样品从装置A移动到装置B。
在一个实施方式中，可整合电极，以通过电位移动样品，如电泳。图13显示了一种构型。在一个实施方式中，以第一方向移动感兴趣的分析物。在另一实施方式中，以第二方向移动不感兴趣的分析物。在一些实施方式中，可使用多个电极。在一个例子中，可以在反应器中加工样品，然后泵入某区域，在该区域通过电位将样品从装置A移动到分析装置B中。当两个装置被移动到相近位置时，可包括直接物理接触、通过小缺口紧密接触或通过连接器或接口实现的远距离接触，可实现上述操作。可在装置B上使用一个或多个电极以完成该线路，从而产生电场，将样品或样品组分移动到装置B中。在另一实施方式中，连接于装置B的下游装置中存在其它电极。在另一实施方式中，连接于装置B的储库中存在一个或多个电极(图13)。 在另一实施方式中，还可利用MOV微型泵或其它装置将样品移动到可能连接有捕获部分或结合部分的捕获区。在一些实施方式中，捕获区可用于诸如杂交、亲和捕获或本领域技术人员已知的其它方法。在另一实施方式中，捕获区可包括非特异性捕获手段，如疏水或亲水性质，固相提取、金属结合、吸附、非共价相互作用、共价作用、光诱导的结合或其它手段，以捕获感兴趣或不感兴趣的分析物(图14)。在一个实施方式中，微芯片A和装置B可作为模块化微流体装置一起移动。在一个实施方式中，捕获区可用作注射到分析装置，例如毛细管电泳(CE)设备、具有CE的微芯片、毛细管阵列电泳(CAE)的区域。然后，微芯片A可移动到微芯片B附近，微芯片B可具有以下功能，包括但不限于毛细管阵列电泳(CAE)、质谱、HPLC、PCR、等温核酸扩增、等速电泳、等电聚焦、杂交、亲和捕获。在另一实施方式中，捕获区可用于浓縮样品或纯化样品，然后移动到第二装置，第二装置可进行其它样品制备或分析。 在一个例子中，两个装置，如微芯片相互接触或接近。图15显示各自具有捕获区的两个通道。然后，通道可将样品移动到装置B附近。接着可施加电位，以将样品从注射区移动到装置B中。在足够电压下，样品可'跳过'缺口。如果需要，样品可定量地注射到装置B上。可调整通道数量，以使装置A所具有的通道数量远大于装置B并进行重复注射，或者装置A的通道数量可少于装置B。在优选实施方式中，装置B是包含CAE分离通道的微芯片。在一个实施方式中，装置B可包含分离毛细管，在一个实施方式中，分离毛细管可通过模块化微流体接口联接。在2D分离中，当第一维是装置A中的等电聚焦时，可重复去除装置B，可将微芯片A中的一部分样品注射到微芯片B上的多个微通道中。图16说明具有捕获区的装置A，捕获区连接于具有多个微通道的装置B，该装置可用于分析物的分析，如CAE、质谱、HPLC。 在一个实施方式中，将样品注射到微芯片中使用"双T"注射器。虽然随着样品移动通过双T，双T确定了双T之间的小塞子，但随着样品从储库到废液的电泳，可发生分离。(Liu S，Ren H，Gao Q，Roach DJ，Loder RT Jr，Armstrong TM，Mao Q，Blaga I，Barker DL，Jovanovich SB.在多通道微芯片上进行的自动化平行DNA测序(Automated parallel DNAsequencing on multiplechannel microchips). Proc Natl Acad Sci USA. 2000年5月9日；97(10) :5369-74)。 在另一实施方式中，在一个装置中构造分离通道，而在第二个装置上构造注射器。在一些实施方式中，可停靠和移出这两个装置。 在一个实施方式中，在单独的毛细管、微芯片或其它装置上将样品移动到捕获区。图17显示的装置可能是右侧具有捕获区的微芯片。首先，可通过M0V阀泵送移动样品，然后，施以电场以移动未捕获的分析物和纯化样品。在一个实施方式中，随后，将具有捕获区的微芯片移动到分离装置，如图18所示，解吸后，可注射全部样品。可通过改变温度、化学手段、光学解吸或本领域技术人员熟知的其它方法进行解吸。
在微芯片上集成用于样品制备和清除的工艺 _ —方面，可将MOV技术应用于许多领域如DNA测序、生物防御、法医学、蛋白质组学和细胞生物学，进行基于微芯片的样品制备和分析。在一个实施方式中，可利用MOVE技术进行自动化的循环核酸测序和清除，例如桑格测序法(Sanger sequencing)。图19中，上图显示MBI-026微芯片上8通道线路中的一个线路，其包括基于MOV的混合、热循环反应和基于珠的样品清除；下图显示完整的玻璃微芯片。已经利用MBI-026在改良的MegaBACE DNA分析设备上证明Phred 15数据的1， 000个碱基上的阅读长度(图20)，其中利用片内集成的循环测序和清除，以制备Ready-to-Inject 测序样品。通过在MBI-026微芯片上进行PowerPlex 16 STR反应，MBI能进行用于法医学的16-plex STRPCR扩增。MBI-026微芯片的许多元件，即MOV混合器、泵和阀均可用于各种应用。 —方面，采用纳米生物处理器技术的MBI-026微芯片的操作可使用一个或多个机器人实现自动化(图21)。在一个实施方式中，在软件控制下的机器人用固定的尖端或探针将样品从微量滴定板移动到接口装置中所含的微芯片(如MBI-026)上。在一个实施方式中，微芯片与可具有加热或冷却微芯片的功能的装置接口相连。加热装置可包括连接于微芯片的电阻加热器，如图19所示。在其它实施方式中，用位于微芯片以外的电阻加热器、使用不同温度的空气或气体、使用红外加热、珀耳帖/热电加热、与不同温度的流体相接触或通过其它方式加热微芯片。在一些实施方式中，用空气或其他气体(如制冷剂)、珀耳帖装置、与液体(如制冷剂)接触或本领域技术人员已知的其它方式冷却微芯片。
与大体积样品接口 _ —方面，微流体装置，如微芯片直接或间接连接于为微流体装置制备样品的装置。样品可以是浓縮和/或纯化的。 在一个实施方式中，用流体技术加工环境气溶胶，以制备样品进行进一步的微芯片样品制备和分析。图22显示一种装置，即使用免疫磁性分离(IMS)和压力驱动液流分配磁珠并将生物物质浓縮和纯化到珠上的样品捕获和纯化模块(SCPM)。在一个实施方式中，从珠上洗脱制备的样品，将洗脱液移动到下游装置如微芯片中，或者将珠移动到下游装置中。在一个实施方式中，可将珠引入微芯片以便进行小型化的实时PCR和/或微量级毛细 管阵列电泳(yCAE)。在一些实施方式中，可振荡混合样品、试剂和珠的振荡混合器可用于 微芯片(图22)。在另一实施方式中，通过致动作用移动磁体，以便在微结构中捕集和释放 磁珠(如顺磁性珠)。 在一个实施方式中，硬件可由软件，如MBI的DevLinkTM软件或嵌入软件操作。 DevLink限定了一组标准化自动架构的通信和命令协议，与其它软件开发方法相比，它更简 单、更有弹性且更快捷。 DevLink执行框架基于横跨多种操作系统、开发语言和通信协议的核心技术。软件 驱动器将该系统的单个智能组件打包，大大縮短了从头开发系统软件一般所需的时间。集 成基于COM或.NET的多系统模块(泵、阀、温度控制器、1/0控制器等)的操作是直接的。 DevLink提供了通过产品发布和维护进行原型制作的专业质量软件开发系统。
Y-阀 _ 在另一方面，可利用MOV技术产生可导向三个或更多个微通道的流体的阀。在一 个实施方式中，路由选择器可使用具有或不具有阀座的微型阀。图23显示构建称为'Y-阀' 的MOV微型阀的方法，所述Y-阀具有三相连接。图23中，黑色代表流体，白色代表阀座。可 通过本领域技术人员熟知的许多方法制造阀座，这些方法包括照相平版、凹凸印刷、注模和 其它显微制造方法。当Y-阀出于关闭位置时，阀座将该阀内相交的三个通道分离开。开放 式，该图中的三个通道互相连通。阀开放时阀室的体积增加，关闭时阀室的体积縮小。这种 体积改变引起液体移动，有助于混合一起进入该阀的液体。在图23所示的实施方式中，可 以存在两个流入液体的入口通道和一个出口通道，或者一个入口和两个出口。
流通阀 _ 另一方面，可将如图2所示的MOV阀调整成两束或多束液体汇合的流通阀。图24 所示的流通阀称为'T-阀'，在该例子中，关闭时(如左图所示)，允许液体由上至下流过垂 直通道，而与水平通道隔离开。如图24的右图所示，该阀开放时，流体可从垂直通道移动到 水平通道中或从水平通道移动到垂直通道中。 图25说明连接三个通道的流体连接之间的差异。左侧，标准MOV阀位于三路连接 的左边。右侧显示流通阀。常规MOV阀和流通阀均可用于调节流动或作为泵的一部分，但 流通阀中死容积被消除，而常规MOV阀中，阀至通道交叉点的区域是死容积。
此种类型的阀中，通道数量也可能变化。图24所示的例子中显示，一个通道通过 该阀， 一个通道终止于该阀。在另一实施方式中，可设计包含多个使流体通过该阀的通道和 /或多个终止于封闭阀的通道的微结构。
在微芯片和其它流体装置上操作磁珠
星形和嵌套星形捕获装置 _ 另一方面，随着磁珠通过通道结构，将它们捕获。在一个实施方式中，在磁场边缘 捕获磁珠最有效。在一个实施方式中，设计微通道结构，使通道多次通过磁场边缘，从而利 用该特点。在图26中，粗线条代表通道结构，细线条代表磁体。在此实施方式中，该系统的捕获效率取决于多种因素，包括但不限于流过通道的流体施加在珠上的剪切力和磁体施 加的力。在一个实施方式中，流速较高时，在与磁体相交的每个通道区段中只能捕获一定数 量的珠。通道中捕获珠后，它们占据固定体积的空间，显著减小了通道的横截面面积，从而 提高流体速度和剪切力。达到或超过这种平衡时，其它珠沿着通道被推至下一个磁场边界。 与具有单个磁场边界交叉的设计相比，具有多个磁场边界交叉的微通道设计能在通道中捕
获更多的珠。 在一些实施方式中，磁体可以是电磁体或永磁体，包括但不限于稀土磁体、固定 和可移动的磁体。 在一个实施方式中，具有多个锐角的微通道设计可用于运行热循环。在另一实施 方式中，具有多个锐角的结构长度可用于混合。当液体一起进入微流体系统时，层流可保持 液体的分离。具有多个锐角和许多弯曲的结构使得能够通过扩散实现混合。将图26的左 图中的线路压縮成右图中所示的嵌套星形或许多其他构型。嵌套星形占据的空间小于完整 星形。 通过改变微型阀的横截面面积捕获珠 _ 另一方面，可通过改变捕获区的几何形状以提高横截面积，而更有效地捕获珠，图 27。竖直线代表通道，黑色圆圈代表磁体。随着通道流过磁场，可增加通道的宽度或深度。 出于数种原因，横截面面积改变后能更有效地捕获珠。与正常通道截面积的给定流速相比， 横截面面积增加导致流速下降。流速越慢，意味着将珠退出捕获区的力越小。除速度较慢 以外，体积增加给予流体以路径，以环绕在此部分捕获的珠周围。具体形状可显著不同。它 也可与星形和嵌套星形结构联合使用。横截面积增加也可实现许多不同功能，包括反应室 或热循环室。
在阀中捕获珠 _ 另一方面，阀中的珠捕获(图28)利用与上述实例中通过增加通道横截面积进行 捕获相同的构思。微型阀允许改变其通道横截面。关闭时，通道的横截面保持均一贯穿。阀 开放时，阀处的通道横截面面积明显增加，实际上阀的开放在微流体通道中产生空间。随着 磁性颗粒或顺磁性颗粒通过开口阀移动，液流减慢，磁体可捕集颗粒。适当地平衡磁力时， 关闭该阀可释放顺磁性颗粒。可通过重复地开放和关闭该阀去除顺磁性颗粒。也可通过 使与珠作用较佳的流体通过以提高曳力，或通过改变团块(bolus)中的空气和液体实现释 放。 试剂分布 _ 另一方面，宏观世界和微流体装置之间的接口常常是难以解决的问题之一。虽然
微流体装置在试验中可使用只有纳升或皮升的试剂体积，但一般需要将大得多的体积连接
于测定装置。在分离装置中，虽然只注射和加工纳升或皮升体积，但该装置可能需要接触较
大体积的样品以加载此种较小体积。也优选最大程度降低通道中的试剂总量，以最大程度
减小死容积。 共同试剂储库
_ 在另一方面，图29显示了一种共同试剂储库，其中位于中央的储库提供两条通
道。在这种情况下，刚好充满储库底部所需的最小体积在两条通道之间共享，因此供应两条
通道所需的总体积小于两条通道连接于两个独立的储库的设计。在此例中，用y_阀将两条
供应通道各自进一步分成两条通道。该y-阀分离进入它的三条通道。该分离帮助降低通道
中可能由蒸发、毛细管作用或其他来源引起的不良流动引起的污染。在此实施方式中，覆盖
孔底所需的单个无法使用的体积在四条通道中共享，从而降低此系统所需的流体总量。从
单个孔中引出的通道数量和用交叉点或阀将通道分开的倍数基本上是无限的。该系统可以相反方向使用，以收集废液。在图29所示的例子中，如果液流朝向储
库，四条通道可将废液移动到单个储库中。优点是需要清空的废液储库较少。该储库也可
含有电极并将四条通道连接于电位，或含有真空以便通过y阀或其他阀调节的四条通道吸
出材料。 试剂递送系统 _ 在另一方面，利用流通阀递送试剂或样品，以最大程度减小交叉点的死容积，在需 要时通道在交叉点上可互不连通(图30)。这种安排的优点是用一组共有阀泵送链内的所 有试剂。使用一组共有的泵送阀能降低改变不同泵送阀时引入的混合试剂比例的变化。
试剂环 _ 在另一方面，微结构包括试剂环中的三个阀以及第四个阀流通阀，试剂环中的三 个阀用作微型泵以使流体在环内循环，而流通阀允许将额外材料移动到该环内或移出该环 外(图31)。可使用多个流通阀。使用该环可连续循环最小体积。 该系统也可用于洗脱掉样品。循环洗脱溶液以及捕获材料将为洗脱掉样品和捕获 材料周围的高样品浓度区域扩散开提供更多时间，使得能够洗脱较高浓度。
集成设计 _ 在另一方面，使用包含微结构的系统进行化学和生物反应。在一个实施方式中，对 DNA测序、法医学和其他应用而言，如图32所示，在阀和试剂递送系统中将共用的试剂储库 与珠捕获集成。可将三个样品加载到样品储库80中。然后，可通过检修阀IO将来自共用试 剂储库70的试剂泵送到流通阀20中。可通过使用，例如阀10、30、40和50或将外部压力 用于微型阀IO进行泵送，从而调节流动。流通阀20打开时，达到样品储库80的样品，并可 将样品泵送到流通液流中，通过微型阀30和微型阀40进入反应室60。如果进行热循环，则 可关闭微型阀40和50以分离反应室。图32显示的反应室为通道；反应室也可以在阀中， 或者在阀或通道或其他流体组件之间移动。可使用装置内泵送或装置外泵送进行移动，在 优选实施方式中，可对微型阀进行变成，以便以所需方式导向流动，以便集成生化反应，产 生也可以是测定的反应。可以在装置上测定产物，或者可移动到另一个装置进行测定。
然后，图32所示装置可进行第二个反应。在一个实施方式中，反应可以是进行生 化或化学反应以进一步加工样品的珠基反应。可以在该装置上询问该反应，或将其移动到 另一装置进行测定。
在另一实施方式中，对该装置变成，以集成用于DNA测序应用的多步反应。在共有 的试剂储库70中装入循环测序试剂，与含有DNA的样品混合后装入样品储库80中，在一个 实施方式中，样品是准备测序的PCR、质粒或其他核酸扩增产物。可通过可编程流体装置，用 微型阀将含有样品和循环测序试剂的混合物移动到反应室60中，在此处用热循环进行循 环测序反应。然后，可将循环测序产物移动到产物储库90中，以便从装置中移出进行进一 步加工，或者在优选实施方式中，将循环测序产物移动到储库中，将珠如艾克(Agencourt) SPRI珠加入循环测序产物中，进行合适化学反应以使所需循环测序产物结合于珠，以便将 产物与保留在溶液中的盐和未掺入染料标记的终止剂或引物分离。本领域技术人员可明显 看出，与循环测序产物结合于珠不同的是，上述过程可反向进行，其中循环测序产物留在溶 液中，盐和未掺入染料结合于珠。所用术语珠包括但不限于颗粒、顺磁性颗粒、纳米颗粒、凝 胶、具有亲和捕获特性或非特异性特性的凝胶。如果储库80中包含珠和循环测序产物，则 通过微型阀20和30将合并的混合物泵送到可能有开口并且附近具有固定或可移动的磁体 的微型阀40中。随着液流在开通的微型阀中减慢，捕获顺磁性珠如SPRI珠，在磁场中捕获 珠。可将流体如乙醇加入储库中，然后加工该珠并去除不良杂质，如盐和掺入染料标记的反 应物。然后，可将珠泵送到产物储库90中。在循环测序中，易于在单独装置如具有分离功能 的CAE或微芯片上分析产物。本领域技术人员明显了解，不同储库可具有其他构型，可将一 种样品加入储库70中，可将多种试剂加入储库80中，以在一种样品上进行三种不同反应。
在另一实施方式中，利用该装置进行连接测序或合成测序。珠可保持在采用激光 诱导的荧光、拉曼光谱、等离振子共振或其它方法的检测器可询问的构型中。在此实施方式 中，珠可保持在反应室32中，通过微型泵移动的反应物经过珠，在此处发生荧光标记反应， 并用检测器读出读数。然后，可通过泵送其它流体以洗涤珠，从而去除反应物，例如焦磷酸 测序(pyrosequencing)、合成测序、连接测序或其它测序化学方法。然后，可利用装置上的 微型泵去除试剂或利用微型阀调节试剂流动，加入下一试剂，以进行下一轮测序。可通过磁 力、光学捕集或其它能量方法或通过物理限制捕集在围堰结构中，而保持珠。(美国专利号 7，312，611，通过引用全文纳入本文)。在一个实施方式中，微结构包括能够利用一个或多个 围堰结构在微型化水平有效交换或捕集珠的片内包装反应器床设计。在一个实施方式中， 各珠可进行反应，或者如目前的焦磷酸测序中所用，一些珠可具有额外反应物。
在另一实施方式中，可保持珠，一些珠有意不进行反应以改进检测。通过物理稀 释所需信号物理分离具有信号的珠与其它珠，以便光学分离具有待询问DNA样品的珠的信 号，从而获得改进。这将通过控制来自其它珠的信号改进反应的信噪比，以便操纵通道或室 中的串话。例如，如果每个具有DNA的珠中加入不含待测序的DNA样品的相同大小的100 个珠，那么每IOO个珠有一个信号，这会改善串话。还可有其它稀释比例。
在另一实施方式中(图33)，将共有的试剂储库70、样品储库80和产物储库90以 及微型阀10、20、30和40的元件重新排列，以使用星形捕获产生可进行反应的装置，然后用 磁珠或其它珠或其它纯化方法清除反应产物。图33显示与图32不同的也可进行DNA测序 的设计。可将样品加入储库180中，将循环测序试剂加入储库170中，通过微型阀110、115、 120和130混合，移动到室160中进行循环测序或其它反应。可利用储库185将珠加入反应 产物，然后将反应产物移动到星形捕获线路140中进行磁力捕获。可通过加入不同溶液，例 如SPRI化学溶液或其它珠基化学溶液进行洗涤，将该溶液通过捕集的珠，以去除不良产物如盐或未掺入的染料。 在另一实施方式中，集成设计能够运行各种过程。可以将两种试剂精确地混合在
一起，对混合物进行反应，并清除该反应的产物。由于该系统能在两个储库之间主动泵送流 体，所以可将额外试剂供应给该反应。这种设计非常紧凑，并且具有每个线路使用较小空间
的优点，能够包装到微芯片中，以便切掉一部分以改进微芯片产率和性能。 在另一实施方式中，图32和33说明生化和化学反应的偶联，如循环测序和化学反
应所述，如SPRI清除。本领域技术人员可明显看出，可使用装置上的微型阀集成不同的生
化和化学反应。在法医应用中，可以在包含可编程微型阀的装置上进行短串联重复(STR)
反应，使用STR反应如PowerPlex 16以扩增DNA和珠清除来纯化反应物。 可以在可编程微流体线路中进行体外转录反应、翻译反应或偶联的转录和翻译翻
译，以分别测定DNA或RNA。可用其测定加入的额外材料如微小RNA、抑制剂、候选药物、化
学物质或待测其它材料的影响。可将其用于筛选所加材料对转录、翻译或偶联的转录和翻
译翻译的影响。在一个实施方式中，偶联的转录和翻译翻译产生能量收集产物。在另一实
施方式中，加入检测器105，以监测可编程微流体线路中的反应。 用直线设计显示图32和33所示设计，但本领域技术人员应理解，也可采用其 它设计如放身寸状设计。("Roach， D. ， R丄oder， T. Armstrong, D. Harris, S. Jovanovich 禾口 R. Johnston.机器人微通道生物分析装置(Roboticmicrocha騰l bioanalytical instrument) 2003年9月30日，美国专利6， 627， 446";"Roach， D. ，R. Loder， T. Armstrong, D. Harris, S. Jovanovich和R. Johnston.机器人微通道生物分析装置(Robotic microcha騰l bioanalytical instrument). 2004年7月20日，美国专利6， 764， 648，，， "Roach， D. ， R. Loder， T. Armstrong, D. Harris, S. Jovanovich禾口 R. Johnston.填充禾口清洁 用于生物分析的微芯片中的通道和进入端口的设备和方法(A卯aratus and Method for Filling and CleaningCha皿els and Inlet Ports in Microchips Used for Biological Analysis) ，2004年9月7日，美国专利6， 787， lll"，将所有文献全文纳入本文)。在一个实 施方式中，微型阀可利用化学或生化过程进行反应，以加工材料，由样品产生产物。该产物 由化学或生化组合物构成，可产生能量、储存能量或使用储存图样以可控方式转化能量。
公开了如何借助化学或生化过程的集成在反应或加入反应的材料中产生产物或 测定组分，以测定一些材料属性。术语"材料"的含义包括但不限于物质或能量，在一个实 施方式中，产生由荧光、发光或其它电磁波谱的其它变型组成的光线，以测定该反应。在一 个例子中，可编程微流体线路可进行由检测器如激光诱导的荧光检测器检测核酸的反应， 如实时PCR、质谱或本领域技术人员熟知的其它方式，或对蛋白质而言是可测定反应物催化 的化学或生化转化的反应。在一个实施方式中，该装置可通过化学或生化方式将能量储存 在物料(bulk)或图样中，以便以可用方式，如视觉或光学方式储存能量。该装置可以是被 动的或可编程的，以改变其行为。可用其改变信号产生，其方式为通过化学或生化转化改变 光学特性或其它特性。其可用作条件传感器，鉴定物理对象、转化物质和能量的报道物。
可利用该储库将可编程微流体线路连接于其它上游或下游装置。可使用机器人吸 取或转移流体，或者模块化微流体连接可直接连接于其它微流体装置。
微流体芯片组装法_热粘结的膜 _
在一个方面，微流体芯片(微芯片)由两层玻璃或塑料热粘结在一起形成。 一些 医学试验片使用粘合剂(一般是带形)将具有通道的塑料层与分成一个或多个塑料和/或 粘合剂层的其它特征粘结起来形成。 在一个实施方式中，可编程微流体线路可由芯片上的包含MOV微型阀的特征和相 关特征制成。(下文中，我们使用"阀"指代任何这种类型的特征。)在图2所示的实施方 式中，所用堆叠物包含具有蚀刻的微流体通道和钻孔的两个粘结玻璃层、PDMS膜层和其中 蚀刻气动通道以便为隔膜提供致动压力的玻璃层。在这种结构中，PDMS适度地自身粘结于 玻璃，但可在阀中与玻璃局部分离，经处理可降低其在阀中的粘性。也可能是三层结构。
在一个实施方式中，气动致动微型阀用塑料材质制造。随着微流体和气动层的材 料改变为塑料，PDMS膜不再具有使用与玻璃相同结构时的足够粘性，必须开发一种新方法。
在一个实施方式中，用热和压力组装全塑料芯片，以便同时将微流体层、膜和气动 层热粘结在一起。需要小心地控制这一过程，以保证在除阀区域以外的区域，层强烈粘结， 在阀区域不施加压力以防止膜与微流体层粘结-如果时间、温度和压力正确。在整个芯片 上获得均一粘结且在微型阀中不发生粘结可能是一项挑战。 图34说明混合塑料微芯片的一个例子。在本发明的另一实施方式中，用一种或多 种方法使膜热粘结于微流体层。各方法通过将阀中的温度保持在粘结温度以下，而加热其 余区域并压在微流体层上，而避免膜阀中粘结。辅助这种方法的一项因素是膜可以制备得 相当薄(如25微米)，而阀的直径一般为l-3mm。这使得能够使用将热施加于去除匹配阀 图样的图案的加热板的方法。为了从侧边到达阀的中心，用于粘结的热必须经过相当于到 达膜和微流体层界面的距离20倍或更多倍的距离。这使得可能在加热粘结区域的同时保 持阀区域足够冷却，使其不发生粘结。不应粘结的阀座的相关区域也可以是用涂层，包括照 相平版掩模、消减蚀刻(subtractive etch)、化学气相淀积法和本领域技术人员熟知的其 它方法修饰的表面。也可通过局部冷却使不应粘结的阀座的相关区域保持不同温度，或者 加热微流体和膜层的组件可去除阀区域，以使各阀的局部区域接受较少热量，从而无法达 到其Tg且无法粘结。 在一个实施方式中，通过包括以下步骤的方法将膜粘附于微流体层(l)使用切 成所需形状的加热板或辊。以使其只在需要粘结的区域，一般是除阀区域以外的任何地方 接触芯片组件；(2)使用激光选择性加热所需区域。在此方法中，可能需要一层能透过激光 波长，而另一层无法透过激光波长。以此方式，使激光能量被材料之间的界面吸收，这正是 我们最想要的。可使用额外的坚硬透明层向界面施加压力。或者，可使用"透明焊接"方 法。在该方法中，用特殊化合物涂布界面，所述化合物经设计能吸收容易通过可能是全透明 的新皮层的激光波长；(3)用高能IR光源，并用掩模遮蔽不需要粘结的区域。只加热暴露 的区域；(4)超声焊接。根据所用材料，可通过将准备粘结(或不粘结)的表面选择性暴露 于紫外光和/或等离子体以改变其粘结温度，而任选地改进这些加热方法。
在另一实施方式中，可将气动致动构建到使用微芯片的设备中，在该设备中微芯 片保持一定位置以便致动阀膜。该方法中如何制备和粘附气动层的方法有很大弹性。 一些 实施方式是(1)通过转移带或双面带(例如通过激光切割或冲切)切割气动通道，将带粘 附于覆盖膜，然后将此组件粘附在微流体/膜组件上，或者首先将该带粘附在微流体/膜组 件上，然后加上覆盖膜；(2)研磨、雕刻或注模形成塑料气动块，以使通道不完全一致。使用液体粘合剂将其粘结于微流体/膜组件；(3)通过带的粘合剂侧研磨或雕刻气动图案。(4) 使用机械夹紧方法使微流体/膜组件靠在气动组件上。在这种情况下，气动组件可能是芯 片的一部分或设备的一部分，正如所期望的那样；(5)将气动块热念介导微流体/膜组件 上。需要注意，可为气动组件选择低熔点材料，以避免损伤微流体/膜组件。
在一个例子中，提供制备塑料微流体芯片的手段。可选择材料，以使样品仅暴露于 一种材料。如果支持板处于冷却温度，那么微流体层在粘结过程中可保持冷却，从而避免收 縮。有一种产生所需热的方法可供选择。气动层的材料和粘附方法的选择有很大弹性。它 并不昂贵。它不需要开发重大新技术。它保证沿微流体通道的良好粘结，即使在气动通道 穿过处。在现有的三层同时粘结方法中，有可能在这些位置缺少压力而妨碍良好粘结，导致 通道泄漏。 机械夹紧的微芯片 _ 在另一方面，通过机械粘结层以便在不结合的部分产生密封，从而制造微流体芯 片。 在一个实施方式中(图35)，机械夹紧的芯片允许使用各种膜层，而无需发现各种 材料的粘结技术。该实例含有具有不同特性需求的层。微流体和气动层均需要保持小特征 的能力，膜层需要作为MOV阀操作，膜和微流体层必须与化学或生物测定相容。机械夹紧使 得可能在不引入额外材料如粘合剂的情况下构建这一部分。对准不同层，并将它们机械夹 紧在一起。图36显示以此方式制备的芯片的照片。
降低对准需求的夹紧芯片 _ 在此实施方式中(图37)，下述两层中含有需要对准的精细特征气动层以及微流 体和阀层。微流体层中的特征可通过许多方法粘结于密封层，因为它们均可由相同材料制 成。可将特征，如脊和通道安置在微流体和气动层上，以帮助密封于膜层。气动层与膜机械 夹紧到组装的微流体和阀层上。在此设计中需要夹紧的区域縮小降低了容差累积并简化了 微芯片的制造。 粘合剂层叠微流体芯片 _ 另一方面，公开了层叠微芯片。MOV微流体芯片一般含有隔膜阀和相关特征，如泵、 路由选择器和可变容积室(下文中，我们使用"阀"指代任何这种类型的特征)，其中使用玻 璃制造刚性层，使用PDMS制造隔膜层的膜。将玻璃_玻璃界面热粘结，膜的固有特性能提 供将其粘结于玻璃的足够粘合力，无须使用粘合剂。 在许多应用中，可能需要用塑料替代玻璃以降低微流体芯片的成本。迄今为止， PDMS对塑料不具有足以耐受操作阀的压力的固有粘合力。另外，PDMS对气体的渗透性可能 使保持关闭的阀中形成气泡。这些气泡可能对芯片的性能有害。 在一些实施方式中，用粘合剂粘结层，以制备微流体芯片(美国专利号6， 803， 019 和美国专利号6， 176， 962，通过引用将其全文纳入本文)。 在一个实施方式中，微流体芯片中的不同层用粘合剂粘结，在一些实施方式中，在 一些或所有粘合剂层中形成特征，如通道。与粘合剂-层叠微流体结构中其它工作的关键差异是包含阀特征和相关结构。该构思的实施方式的两个例子见图38和图39。在图38所 示的第一个实施方式中，微流体层、界面层和气动层由转移带制成，转移带具有切通(例如 通过激光切割)的合适的通道和孔。其他层被制成塑料薄片，它们也可具有切通的合适特 征。因此，多个层可由转移带制成。 在另一实施方式中(图39)，在玻璃晶片中蚀刻通道，并将其热粘结于玻璃通路 层，用两个粘合剂层以不同顺序组装，从而构建微芯片。使用可能是转移带的多个粘合剂层 实现这种方式安排。微流体层可以是热粘结的塑料或用其他材料通过其他成型方法和/或 其他粘结方法制成。 在另一实施方式中，图40说明通过粘合剂层叠构建的阀的局部放大图。通过气动 层中的通道将压力施加于阀室时，膜变形，直到其压住两个通路，密封它们以防止一个微流 体通道中的流体通过该阀流向其他通道。施加于阀室的真空将膜拖离通路开口，使流体从 一个微流体通道流向另 一个。 在另一实施方式中，粘合剂层叠方法能容许设计中出现较大的弹性。对于可集成 到设计中的内容有少数限制。例如，图41说明内建加热器和散热器的粘合剂层叠芯片。不 同实施方式加入电极、光学组件、其他温度控制组件，如热管或散热器、传感器、印刷标志。 由于不需要加热或只需要适度加热以固化粘合剂，所以这些类型的添加物对其无损伤，但 它们必须耐受或免受用于层叠工艺的压力。 粘合剂层叠构建是一种便宜的产生微流体芯片的方式。材料的选择有很大弹性。 不难由库存购得许多种类的膜和转移带。该芯片可保持相当薄，以便于进行热控制。如果 足够薄，它可能具有足够弹性以便以巻的形式储存。各层中的特征可以是激光切割的、喷水 切割的或冲切的，视需要而定。它们都是快速和富有弹性的方法，因此可快速完成原型制作 和少量生产。可以用较短的研制周期作出设计改变。存在实施该方法的必需技术，有多个 供应商能够提供这种组件。可快速实现大规模生产。容易实施其中一层或多层由不同技术 生产的混合构建。如果需要，界面粘合剂可制备得相对较厚，以形成通常完全开发的阀。这 种阀不需要真空源。可用压力关闭它，撤去压力时该阀开放，膜回到最小应力位置(平坦)。 容易加入额外的功能，如加入加热器、散热器、光学组件等。
集成到塑料微流体装置上的阀阵列 _ 在本发明的一个方面，三层相同的塑料层叠获得微流体芯片。 一个实施方式见图 42。相同塑料的粘结参数是温度和压力。在正确条件下，除了发誓上的区域，膜将永久地粘 结于上板(微流体)和下板(致动)，当压力条件不同时，如果向阀室施加真空则塑料膜向 下移动，向阀室施加压力则塑料膜向上移动。压力条件在阀区域不同，因为在该区域它不接 触底面致动层，由于阀室该区域在层压或按压期间经受较小的压力。当恒定的温度施加于 整个装置或组件时，对接触阀的材料施加的压力较小，在调节温度时这将防止粘结，因此只 在压力转移至膜时发生粘结。这是通常关闭的阀。在另一实施方式中，通常开放的阀可通过 在层压过程中调节微流体通道中的压力高于阀室而制成。如图43所示，在装置冷却后获得 凹陷的膜。致动此阀只需要压力。在没有电能的情况下可获得压力，此阀在可携带设备中 可能很有价值。对于这些三层结构，空气通道不能穿过两个以上的微流体通道，反之亦然， 因为膜在通道下方不会粘结(此处无压力)。这可能妨碍多通道装置中联接阀。
在另一实施方式中，在四层结构中可使用相交的空气和微流体通道。图44显示这 种结构的横截面。此阀通常是关闭的，需要压力和真空来致动。也可产生通常开放的阀，只 需要压力来致动。 在另一实施方式中，提供可选择性沉积在阀座上、粘结完成后去除的可图案化材 料，例如，与粘结温度相容的光刻胶如Shipley 1818、水溶性聚合物的丝网印刷、光敏化合 物如UV活化的聚丙烯酰胺(R印roGel， GE健康护理公司(GE Healthcare))。另一实施方 式通过改变修饰区域的熔化温度，例如通过在需要选择性粘结的区域UV激活塑料如聚碳 酸酯，而修饰一些区域的表面特性。在另一实施方式中，通过液体如乙腈，优选包含聚乙二 醇和丙二醇粘性液体，以破坏膜与阀座的粘结。
塑料微芯片中用于珠清除的线性阀阵列 _ 在另一方面，为珠清除方案设计线性阀阵列。例如，图45的上图显示掩模设计，下 图显示此种丙烯酸三层芯片的照片。装置由两块1. 5mm厚的丙烯酸平版和0. 04mm的丙烯 酸薄膜构成。在各个1. 5mm平板中铣削微流体通道(蓝色)和致动通道(红色)(0. 25mm 宽和O. lmm深)。在两块丙烯酸平板中钻出通导孔。将用于交叉点温度控制的特殊通道切 成一块平板。对准丙烯酸夹心结构，放置在平坦化(planarizing)托盘上，盖上玻璃板，并 用加热板按压。在IO(TC和1顿压力下进行层压。通过连续泵送检测该芯片3天。没有观 察到泵失效。 在图46中，提供用于法医应用的三层丙烯酸芯片的设计和照片。该芯片将样品与 珠溶液混合，在大阀内使珠样品浓縮，将清洁样品与PCR试剂混合，进行PCR扩增和PCR后 清除。芯片尺寸是30mmX30mm。该通道的宽度为0. 25mm，深度为0. 15mm。扩增通道可保持 约1. 5 ii L。微芯片的工作过程如下。气动线211致动微型阀210和220。气动线212致动 微型阀215。气动线213致动微型阀250和255。气动线214致动微型阀276。气动线216 致动微型阀240。气动线217致动微型阀230。气动线219致动微型阀246。将具有粘附 于磁珠的材料的样品加载到储库280中，储库280连接于微型阀220。通过微型阀220、230 和245泵送可将样品移动到微型阀240中，微型阀240是开放的并配有磁场以捕集珠。用 加载到储库275中的洗涤缓冲液洗涤珠，这一过程由微型阀276控制，由微型阀276、230和 245泵送，洗液进入废液池247。然后，可用洗脱剂充满储库275，纯化样品由珠洗脱到与下 游过程相容并通过微型阀246泵送的缓冲液中。在微型阀255上，用微型阀210、215和255 由储库270加入反应混合物，随着流入反应器260，与所述的洗脱样品混合。如果进行热循 环过程，如PCR或循环测序，则可关闭阀250和255。反应后，将样品泵出到储库290中。
根据各种样品制备方案，如样品浓縮、热循环(循环测序或PCR反应)、等温反应和 样品纯化来设计这些实例。塑料多层层压可提供具有阀和泵的低成本的一次性复杂芯片。 在许多应用领域，如法医学和分子诊断领域需要这些一次性芯片。 一次性芯片可使该设备 更简单，没有制备和清洁步骤。使用通常开放的阀不需要真空泵或压力泵。可通过加压筒
提供致动压力，整个设备的动力要求可能相当低。
在阀中快速移动流体和反应 _ 另一方面，微结构在两个或多个不同空间位置之间快速移动流体。有许多方法进行PCR、循环测序和其它目的的热循环反应。它们通常可分为两类。首先，反应组分位于温 度随时间变化的小室内。其次，在两个或更多个位置上保持温度恒定，将反应组分从一个位 置移动到另一个位置，在各位置上与温度平衡。我们可以将它们分别称为"时间"和"空间" 循环。 迄今为止，在微流体应用中进行时，使用空间循环的那些通常提供曲折通过温度 区的流体通道，它们通常以恒定速度强迫反应流体单向流过该通道。通常通过微流体结构 外部的装置施加产生的压力而产生流动。 在一个实施方式中，在单独步骤中，通过一个或多个泵在不同温度的区域之间移 动反应组分以进行热循环。该泵可以位于外部，但在优选实施方式中，该泵位于对反应组分 进行热循环的微流体芯片内部。 一个实施方式见图47。在此方法中，利用我们的MOV泵之 一在热区和冷区之间移动样品。为了简明起见，该图仅说明一个双温度系统。但本发明不 限于此，很容易将该构思扩展到三个温度或更多温度。 例如，图48显示实施三温度循环的方式。在本文中，用芯片内泵通过三个温度区 移动样品。在这种情况下，温度区在不同的通道体积上延伸。就恒速泵送而言，样品暴露于 每种温度的时间与各区中通道的体积成正比。相反，就芯片内泵送而言，很容易在独立动作 中移动样品。以此方式，可以将温度区制备得较小，恰好够包含样品即可。然后，仅对该泵致 动较短时间，以将一个区域的样品移动到下一个区域，可通过泵致动动作之间的时间确定 在各温度的停留时间。这使得温度循环概况的调整富有弹性，而不用重新设计通道或加热 器。需要注意，样品可被不可混溶的流体包围，以放置其扩散开。因此，通过此种可编程微 流体线路激活团块和微乳剂，可用检测器检测团块和微乳剂，以进行实时反应或终点反应， 例如在团块和微乳剂中进行实时PCR。对于较高通量的系统，可能需要使用如图50所示的 管线结构。 图49显示另一实施方式，其中在不通过泵的情况下在热区和冷区之间移动样品， 从而消除与泵中材料的相互作用以及死容积引起的样品损失。再一次，不可混溶的流体可 用于不同大小的样品，以帮助保持其不发生扩散。不一定具有如本文所示的两个完整的三室泵。 如果需要再次使用这些特征，可能需要洗涤或冲洗后再次使用，以防止交叉污染。 如图51所示的反应室的一部分，可为这些功能加入额外特征，以清洁室。
在另一实施方式中，如图52所示的双温度循环的阀和图53所示的三温度循环的 阀，温度区位于与阀相同的位置。在此实施方式中，可通过关闭含有反应组分的阀同时打开 目标温度区中的阀，将反应组分一起从一个区域转移到另一个区域。 一部分反应组分将留 在通道中，因此无法达到所需的温度，这是不想要发生的情况。但通过适当调节阀和通道的 大小，可将该部分保持得很小。该实施方式的优点是样品不可能移动太多或太少，因此不能 适当地位于温度区。阀中的反应可以在三层微型阀中进行，其中弹性体或阀膜变形产生空 间，或者在四层微型阀中在通路中进行反应。 图54显示三室循环的另一实施方式。在这种实施方式中，用圆周旋转(circular rotation)泵送液体。这保证没有样品重复地停留在通道中，但相对于阀容积增加了通道容 积。 在一些实施方式中，对温度区中的阀而言不一定需要实际产生密封。只有阀打开和关闭时的容积改变比较重要。 一个选项是省去阀座，以使该通道允许通过热循环区域进 行连续流动。这在开始充填芯片和反应组分移动到热循环区域的过程中有优势。在充填过 程中，除一个阀以外，用必需的最小试剂体积使所有阀保持关闭。如果阀具有座，那它们应 该开放以便充填。如果观察到反应组分到达循环区域的远端，则芯片充满。
在一些实施方式中，需要在具有一项或多项以下特征的装置中进行热循环快速 温度转变；稳定、精确的温度；轻量小包装；一次性反应容器；小反应体积；低动力要求；自 动混合样品和试剂；可编程地控制温度概况(温度和时间)；可适应一系列样品大小(纳升 和更大)；可适应一系列样品数量(每个装置l个样品至几百个样品或更多样品)；低操作 成本；通过该装置移动反应组分的压力要求低。 在一个实施方式中，微结构热循环是可移动或手持式的。在另一实施方式中，该微 结构热循环器不是电池供电的。在一个实施方式中，用固定区域加热方法保持动力要求相 当低，并用微型泵在温度区之间移动流体。在另一实施方式中，用微型阀控制含有分析物、 颗粒、纳米颗粒、乳剂、微乳剂、试剂和其组合的流体。
微芯片中的反应和它们在文库构建和分析中的应用 _ 传统桑格鸟枪测序法包括昂贵、费力、费时的体内克隆、选择、集落分离和扩增步 骤。大的基因组研究中心已经用机器人自动化岛将许多这些过程自动化。目前正在开发或 被一些公司，如ABI、Solexa和454早期应用的下一代技术可通过对小的分子集合体进行反 应而提供成本明显较低的测序。同时，这些技术-以及其他技术如超级焦磷酸测序和单分 子测序_将大大改变样品制备的要求和方法。 454公司目前开发了用皮升反应对单个珠进行的小型化形式的焦磷酸测序 法，该方法在"皮升滴定板(Picotiter plate)"中进行，通过乳液相PCR产生鸟枪 模板(Margulies M，等，在显微制造的高密度皮升反应器中进行基因组测序(Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors). Nature,2005年9 月15日；437(7057) :376-80，电子公开2005年7月31日)。每个四小时运行在每轮测序 中产生约25M碱基，平均阅读长度约为108。将支持各轮的样品制备方法与许多手工步骤联 合。通过乳液PCR(emPCR)，将DNA衔接子加入珠上的剪切的DNA文库、纯化的单链DNA和由 单个分子扩增的DNA中。乳液PCR能够用常规热循环器在单个管道内产生几百万至几十亿 单独区室。Dressman等已用乳液PCR产生附连于磁性颗粒的克隆的PCR扩增子(Dressman D， Yan H， Traverso G， Kinzler KW， Vogelstein B.将单个DNA分子转化到荧光磁性颗 粒中以检测禾口列举遗传变异(Transforming single DNAmolecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration ofgenetic variations)， Proc Natl Acad Sci USA. 2003年7月22日；100 (15) :8817-22.电子公开于2003年7月11 日)禾口 (Diehl F， Li M， He Y， Kinzler KW， VogelsteinB， Dressman D. BEAMing :在油包水 乳液中的微粒上进行单分子PCR(BEAMing :single-molecule PCR on microparticles in water-in-oilemulsions) ，Nat Methods. 2006年7月；3(7) :551-9.)并开发了扩增复杂文 库的方法(Williams R， Peisajovich SG， Miller 0J， Magdassi S， Tawfik DS， Griffiths AD.通过乳液PCR扩增复杂基因文库(Amplification of complex gene libraries byemulsion PCR) ， Nat Methods. 2006年7月;3(7) :545-5)。在珠上产生克隆文库的方法大约耗时2天，许多操作用专门设备进行，产生约375bp的珠。样品制备已成为G20通量的 主要限速步骤。在没有完全自动化的情况下，每天不可能增加超过IOO倍以上的珠产量来 测序人基因组。为了将454样品制备扩展到从头测序中，哺乳动物和其他复杂基因组需要 快速分级克隆策略，并且每天需要加工成百上千个文库。可将相同的样品制备方法应用于 通过连接进行的SOLiD测序。 在一个方面，利用小型化的样品制备方法，通过使用显微制造结构、微流体和磁性 分离以及改进的emPCR使文库加工成珠文库的过程自动化。可构建需要激活自动化分级测 序法的大致平行的珠文库。例如，用携带足够DNA模板进行焦磷酸测序的每个克隆微球， 每45分钟可产生4， 032个单个文库。在一些实施方式中，利用一个通道至能够加工多达 一百万单个序列的成百上千个微通道构建装置。 虽然实例描述DNA焦磷酸测序，但DNA分析法可以是其它反应，例如合成测序，如 通过Solexa、Helicos、连接反应如艾克/应用生物系统(AppliedBiosystems)连接反应测 序，以及其它DNA分析法。 除产生DNA测序文库以外，可进行相同方法以制备DNA文库或样品，用于其它DNA 分析、RNA分析、蛋白质分析、糖分析、脂质分析和其他生物分子的分析。这些样品包括通过 对体外DNA-RNA-蛋白质系统进行编程产生的样品，如偶联的转录_翻译系统、对生物分子 进行修饰的系统和这些系统的产物。相似地，该方法可扩展至化学文库和合成的生物分子 文库。 也可利用该方法在装置如微芯片上进行分子生物学反应。 在以下实施例中，将连接用于许多实施例。除连接反应外，本领域技术人员不难观 察到，可进行所有生化和化学反应，例如，限制性(酶切反应)、DNA修饰、聚合、DNA-蛋白质 结合和其它生化反应，以及加成、裂解、环化、縮合和其它化学反应。 在用于构建微珠基体外乳液相PCR文库的流体系统中自动化的珠基克隆和扩增 _ —方面，珠基克隆和扩增方法和实施可以基于自动化设备，以加速对大量序列的 加工。例如，每天可将128， 000个输入BAC或其它文库加工成250， 000， 000个珠，用于对 人大小的基因组进行超级焦磷酸测序(SPS)。图55是对工作流和工艺的高水平描述。用 术语"超级焦磷酸测序"描述NBpSPs(NanoBioPr印sPs)中产生的珠的读数，其中珠所含的 DNA文库由单个模板拷贝制成。在其它实施方式中，可将不同的化学反应施加于额外的工 作流，以便在团块、乳液和微乳液中进行实时PCR。也可能进行本发明所述的其它生化反 应。NanoBioPr印SPS'平台是合并制备DNA测序应用样品的珠基化学反应的一个例子。 在一些实施方式中，可使基因表达、蛋白质表达和其它实施方式适应珠基反应和流体反应 (美国专利号6， 190,616 ;美国专利号6， 423， 536 ;美国申请号09/770,412 ;美国专利号 6， 870， 185 ;美国申请号10/125， 045 ;美国申请号11/229， 065 ;通过引用将其全文纳入本 文)。在一些实施方式中，例如，在超级焦磷酸测序实例中分析不可混溶的流体或微乳液中 的样品团块。这是教导如何将生化和化学过程偶联和用微流体装置进行多步反应的本发明 的另一个例子。本领域技术人员明白，模块化微流体连接能够移动如本文所述产生的样品。
在一个实施方式中，NanoBioPr印SPS每45分钟可输入4， 023个末端削平的文库， 在连接模块中，在42个微芯片上进行4， 023个纳米级单个连接以连接关键衔接子，每个芯片有96个通道。然后，连接模块汇集文库并将单个片段结合到单个珠上。emPCR模块使用 乳液相PCR(emPCR)产生珠基DNA文库，用于超级焦磷酸测序。 在一个实施方式中，单通道微芯片可进行连接，已开始开发规模可调的硬件微芯 片和软件，以便将连接模块的微芯片部分完全自动化。如下所述的'珠风暴(BeadStorm)' 装置可重悬、混合、加工、结合和移动磁性和非磁性珠。在emPCR过程中，公开了用于单个 emPCR通道的容纳至多和超过100mL emPCR反应和其它工作流部分的硬件；其它实施方式 可采用额外通道，它们也属于本发明范围。可使用强大的全尺寸步骤来产生高质量的珠文 库。 在一个实施方式中，NanoBioPr印超级焦磷酸测序(NanoBioPr印SPS)过程(图 55)将文库加工自动化，以连接衔接子、构建单链DNA文库和进行乳液相PCR(emPCR)，从而 产生具有DNA片段的克隆群体的珠、塑料、聚苯乙烯、玻璃或其他珠，所述DNA片段衍生自细 菌人工染色体(BAC) 、 BAC-等效文库、逆转录产物、单个样品、全基因组扩增、汇集样品如环 境样品，包括用于监测的气溶胶收集器，包括生物防御应用(统称为文库)。最终产物DNA 珠文库能提供超级焦磷酸测序读出设备，以便在一天内完整地从头进行哺乳动物量级的基 因组测序。 在本实施例中，NanoBioPr印SPS过程每轮、每45分钟从1072 384孔微量滴定板输 入4， 032个单个文库，这些文库被预剪切至1， 000碱基对左右的群体，进行末端削平和磷酸 化。因此，NanoBioPr印SPS每天加工128，000个文库，产生至多250，000，000个珠。产生的 珠数量可调。各珠将携带至多1， 000bp的扩增子，每天足以产生60B碱基的序列数据_相 当于每天覆盖10倍人类量级的基因组。NanoBioPr印SPS设备例教导了前端样品制备的有 效和高效装置，它能产生用于超级焦磷酸测序的鸟枪文库，用于从头和再测序方案以及可 与本发明所述的生化和化学过程结合的其它微珠和微乳剂过程。 在另一实施方式中，NanoBioPr印SPS设备集成两个模块，如图55所示。连接模
块输入片段化、大小分级和末端削平的文库，(1)将独特衔接子结合于片段末端，(2)修复 连接反应产生的3'缺口，和(3)变性以产生单链(SS)DNA文库，以便输入第二模块即乳液 PCR(emPCR)模块。emPCR模块(1)在使单个DNA分子结合于单个珠的条件下用结合的捕获 探针将SS文库退火到珠上，(2)进行emPCR以在珠上扩增DNA， (3)将双链DNA变性产生覆 盖有SS扩增文库片段的玻璃珠，和(4)使用退火引物，通过另一磁珠捕获由空珠中富集含 有DNA的珠。将最终SS珠文库送入超级焦磷酸测序设备中，以便进行测序和分析。
NanoBioPi^pSPS连接模块 _ 在一个方面，提供包括基本平行的基于微芯片的设备的装置，所述设备利用MOV 阀、泵和路由选择器将每轮4， 032对不同的衔接子单独连接到4， 032个不同的削平片段的 文库的过程自动化，后续一起进行缺口修复和变性，产生钥匙编码的(key-coded)单链文 库。NanoBioPr印SPS连接模块可由42个微芯片组成，各微芯片具有96条通道(图56)。 通过在每个片段上连接两个衔接子，微芯片的各个通道具有单个片段文库。描述了一种 NanoBioPr印SPS微芯片，它能同时为96个文库添加衔接子。
将文库加载到微芯片上 _
在一个实施方式中，可使用间隔9mm的毛细转移管阵列，将微量滴定板，如384孔 板中的文库转移到微芯片上，一次96个样品(图57)，所述毛细转移管阵列称为毛细管盒。 可采用较低和较高量的毛细管。图58显示用于反应的96通道毛细管盒的照片。在这个 NanoBioPr印SPS例子中，毛细管的长度可刚好浸入微量滴定板孔中，其宽度刚好被毛细管 作用充满。由微量滴定板充满后，通过机器人将转移毛细管盒转移到微芯片的96个输入孔 中，其具有8X 12形式的96个连接线路，间隔9mm。将毛细管盒简单清洁后，再用于充满下 一个微芯片。我们以前已建立毛细管盒和清洁台。
衔接子连接反应 _ 在一个实施方式中，微芯片或其他装置可利用压力或真空，或电力驱动的离心或 本领域技术人员熟知的其他力从毛细管阵列移动样品。例如，连接于输入孔的96各芯片内 MOV泵可将文库泵送到微芯片中，如图59和60所示。在含有96种单独的连接混合物的M0V 混合器中混合样品，并将样品泵送到纳米连接反应室中(图58)，在其中培育，例如5分钟。 这能产生连接于输入剪切的文库样品DNA的衔接子混合物。图58显示两个连接反应线路， 而图59显示96通道NanoBioPr印SPS的掩模设计。 在一个实施方式中，各衔接子可具有钥匙(key)，如用于在测序后鉴定文库的六个 碱基(条件是4， 032个文库中的每组单独用超级焦磷酸测序分析法进行分析，可通过简单 地分开反应器进行)。衔接子含有巢式PCR和测序引物位点、3'钝端和5'突出端海对中 的一个衔接子的5'端具有生物素。由于6个碱基长度的序列产生4， 096个单独的钥匙，并 且42个具有96个通道的微芯片装置需要4， 032个单独的钥匙，所以其余可用的64个钥匙 在每个NanoBioPr印SPS运行中合并进行质量控制，以监测最优性能。连接后，各连接片段 的一端含有PCR引发位点、测序引物位点和六个核苷酸长度的钥匙序列，另一端具有PCR和 测序引发位点以及钥匙序列，连接片段中还含有削平的插入物基因组文库DNA。
在一个实施方式中，连接后，首先由一个微芯片收集96个独特编码的文库，然后 收集所有42个微芯片，加入20个质量控制钥匙序列，一组是"正常"测序难度的十种对照 序列，还有难度增加的五种对照序列，以及五种具有挑战性的对照序列，其中包括所有四个 均聚物运行轮次。 在一个实施方式中，可使用诸如800nL的反应室，进行其他体积如400-200nL的反 应。384通道微芯片将形成用42个微芯片每天可加工(例如)512，000个文库的连接模块， 与额外的微芯片或设备成线性比例。 在一个实施方式中，一个衔接子通过，例如生物素-链霉亲和素连接与磁珠预结 合将产生每个末端具有不同衔接子的珠结合片段，以便在连接后用磁力操纵4， 032个反 应。在微芯片中，MOV微型泵通常与珠一起使用，用磁体将珠捕获在通道中(图61)。
缺口修复 _ —个方面，连接后，可汇集装置中来自所有微芯片的珠(或文库)，如果在珠上，则 由磁场捕集在5mL修复反应器中。用于样品捕获和制备模块(为生物防御应用开发)的珠 涡旋和磁珠致动装置产生称为珠风暴装置的装置，该装置在温度控制室中分配、混合和捕 集磁珠悬浮液。所有连接的衔接子末端的缺口将由Bst DNA聚合酶修复。缺口修复后，如果DNA尚未连接于珠，则加入预先洗涤和平衡的链霉亲和素珠，修复的DNA通过结合于一组 衔接子的生物素连接。洗涤珠，以去除未连接的片段和衔接子，加入碱变性的另一组8个有 钥匙的单链QC序列。将释放的单链移动到emPCR模块中，弃去磁性微球。修复反应和变性 步骤应花费约40分钟的时间，每轮以单一批次完成。上游连接模块微芯片被再生，在修复 反应正在进行的过程中即可开始另一轮反应。 在 一 个实施方式中，可利用安捷伦(Agilent) 2100或类似装置或者在 NanoBioPr印SPS设备中评估文库的质量。自动化可产生均一文库，导致可省去此点上的质 量检查。如果必要，可将单通道CE组件加入连接模块中。
NanoBioPi^pSPS emPCR模块 _ 在一个方面，NanoBioPr印SPS emPCR模块将DNA结合于光学透明的捕获珠，以便 检测下游测序反应，在至多lOOmL的体积内制备热循环乳液PCR(emPCR)，使得到的扩增子 变性，分离含有DNA的珠，如图61所示。
结合于DNA捕获珠 _ 在一个方面，连接模块中制备的连接有引物和钥匙序列的SS DNA将退火至含有互 补DNA捕获引物的聚苯乙烯或其他珠。珠的制备独立于该装置。在25mL MBI珠风暴处理 器中将溶液加热至8(TC，然后以IO度为单位逐步降低温度，从而使模板退火。逐步降温和 保持时间可单独优化。在此步骤中可加入另外8个有钥匙的单链QC序列。
乳液相PCR扩增 _ —个方面，emPCR反应是热循环反应，乳液被破坏，具有扩增的双链产物的珠被纯 化。可以用约30mL PCR反应混合物按比例扩大至42个微芯片，每轮总体积为100mL。因 为emPCR步骤的总时间约为6小时，这包括8个45分钟的运行轮次，所以需要9个平行的 emPCR反应器，各自能够加工lOOmLemPCR反应以满足本实施例中的通量要求。
4， 032个文库的各emPCR运行轮次的样品将流入lOOmL试管中，通过emPCR反应器 运行；或者，也可在两个平板之间进行emPCR。 一旦在预处理室中将聚合酶热激活，则将样 品移动到共同反应室中，其将同时循环至多9个大体积的PCR反应。在此步骤中加入最终 12个有钥匙的QC序列珠。 在一个实施方式中，emPCR最初可以在常规的96孔微量滴定板中进行，而设计了 8个平行的emPCR反应器。在大体积热循环中，在一个实施方式中，三个具有选择阀的循环 水浴可产生能够加工大体积且具有优秀的温度调节功能的热循环设备。以前已建立该设备 (图62)，它能够快速进行热循环_因为水的优异的传热性能_以便良好地适用于循环测序 和PCR。软件可控制所述三个循环水浴，并操作选择循环的水和温度的全尺寸阀。乳液化学 可产生足够体积的但分散乳液，每种微乳液产生1， 000个碱基长度的片段。除使用三种循 环水源外，可通过循环不同温度的空气或液体改变温度。在简单的实施方式中，主要可使用 设置为三种不同温度的三个吹风机快速改变样品的温度。热空气可重复循环，通过运行恒 定温度的加热器或吹风机保持固定温度。
富集单链DNA珠
_ 在一个方面，可收集具有单链DNA的珠，然后用磁力拖拉(pull-up)富集，例如通过Margulies等所述的方法，该方法包括(1)用我们的定制装置替代MPC-S， (2)用沉降或过滤替代离心步骤，以改变缓冲液和洗涤珠，和(3)根据光学珠，而非琼脂糖珠的密度调节步骤。为了由乳液收集emPCR珠，可向PCR扩增的emPCR溶液中异丙醇，混合该溶液，用注射泵强迫该溶液通过筛分滤器。洗涤该滤器，移动到珠风暴中，其中加入含有O. 1%吐温的退火缓冲液并对扩增的DNA进行碱变性。培育后，可通过沉降浓縮含有单链DNA的珠，去除上清液，加入退火缓冲液。洗涤后，加入磁力捕获珠，通过拉下操作(pull-down)纯化具有单链DNA的珠，去除上清液和未结合的珠，加入解链溶液以破坏杂交。捕集磁珠，同时去除包含具有单链模板DNA的富集珠的上清液。然后，NanoBioPr印SPS可输出汇集和有钥匙的纯化文库，该文库可立即用于超级焦磷酸测序。
42个微芯片的连接装置和emPCR模块和集成 _ 在一个方面，连接模块可由l个扩展至42个微芯片和自锁阀，自锁阀如下所述，用于设计42个微芯片的装置。在非集成工作流中，可使用单个微芯片连接模块和单个通道emPCR模块的工作流来处理人衍生的癌细胞系文库。单个连接模块微芯片和下游过程可与单通道流通的lOOmL emPCR热循环器集成，以制备每轮运行能够加工96个文库的自动化的集成原型。 在一个实施方式中，为了完成NanoBioPr印SPS，可将42个微芯片的连接模块与9通道emPCR模块整合，如本发明所公开。微芯片连接模块可以通过物理途径或软件，在实验线路板上与单通道emPCR模块整合。完整的42微芯片连接模块可与9通道emPCR模块建造和整合在一起。可优化完全集成的NanoBioPr印SPS，并在超级焦磷酸测序装置上分析样品，以便通过(例如)焦磷酸测序、合成测序、连接测序或本领域技术人员已知的其它方法进行DNA测序，以获得能够在一天内完成人从头测序的系统。 在一个实施方式中，连接模块可由l个微芯片扩展至42个微芯片。可使用自锁阀控制42个微芯片，并开始设计完整的系统硬件。在一个实施方式中，使用以芯片内气动多路分配器独立控制的自锁微流体阀结构(图63)。这些结构基于气动MOV阀并取决于其通常关闭的性质。短至120ms的真空或压力脉冲足以将这些自锁阀保持开放或关闭状态数分钟。此外，芯片内多路分配器只需要n个气动输入来控制2(n-l)个独立的自锁阀。已示范由三阀和四阀线路组成的自锁阀(W. H. Grover， R. H. C. Ivester， E. C. Jensen和R. A. Mathies. 2006 ，用微流体逻辑结构对自锁气动阀进行开发和多路控制(Deve 1 opmentandmultiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidiclogicalstructures)，芯片实验室(Lab-on-a-chip).电子公开)。该技术将成排螺线管(banksof solenoid)有效移动到微芯片上，并降低成本和复杂性。 在一个实施方式中，可用自锁阀建立气动控制的NanoBioPr印微芯片，例如用于42个微芯片。毛细管盒转移机制将机器人系统与毛细管盒接口相连，以便用2， 500个阀加载4个微芯片的装置。 在一个实施方式中，例如，emPCR模块可在一个通道中处理100mL。可建立具有三个不同独立热循环区域的高容量循环热循环器(如图64所示)。需要9个单独的100mLemPCR反应器来共享主循环热循环器，它们将连续进行相同的循环方案。预处理室可适应与聚苯乙烯或其它珠的结合并制备乳液，然后调节温度以适应快速气动需要。后处理室能够满足后处理要求，例如破坏乳液和提取物。所有三个热循环室可共享大量循环水；加入4t:和其它所需温度的水；这只是另一个循环水浴和三个全尺寸COTS阀和螺线管。工程计算、研究和实验可确定循环均一性要求所容忍的反应的表面体积比和深度(mm)的影响，以确定反应器的最优形状，即长粗管状、卵形管状或平行板状，并用确定性能的科学实验加以验证。可以在珠风暴模块中分离携带扩增子的珠和空珠，作为超级焦磷酸测序或其它分析方法之前的最终步骤。可以在软件控制下整合实施装置的硬件。 例如，在非集成工作流中，可使用单个微芯片连接模块和单个通道emPCR模块加工人细胞系文库。可以用GS20试剂和步骤手工进行对照处理。 在另一实施方式中，可按比例增加NanoBioPr印SPS，完全整合连接模块和emPCR模块。可通过本领域熟知方式建立完整的42个微芯片的连接模块。例如，(l)可制造塔以保持微芯片，(2)建立能操作自锁的MOV阀、泵和路由选择器的微芯片控制器，(3)可显微制造和测试NanoBioPr印机器人平台和第一组42个微芯片，和(4)可整合和测试42个微芯片的连接模块。平行地，可改进珠风暴设计以加工汇集的样品。可扩展emPCR模块，以便由连接模块保持9个运行轮次。可利用454GS20和超级焦磷酸测序优化emPCR的性能。42微芯片连接模块可连接于完全扩展的emPCR模块，并根据已经开发的单微芯片-单通道装置优化过程。利用所述的NanoBioPr印SPS，可完成10%的完整人基因组或完整的人从头测序。 虽然本文介绍和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员可明显看出，这些实施方式仅以实例的方式提出。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和取代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。所附权利要求书确定本发明范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同形式均为本发明所覆盖。
权利要求
一种微流体装置，其包括微流体层、致动层和夹在它们中间的弹性体层，其中微流体层包括至少三个微流体通道，它们在连接点处汇合，并且被中断所述至少三个微流体通道中流体流动的间断面分隔开；致动层包括至少一个开口于阀室的致动通道，所述阀室位于所述连接点的反面；和其中移动所述弹性膜能调节经过所述至少三个微流体通道的流体流动，从而形成隔膜阀。
2. 如权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述弹性膜同时调节经过所述至少 三个微流体通道的流体流动。
3. 如权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述弹性膜防止经过所述至少三个 微流体通道的流体流动。
4. 如权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述弹性膜不完全抑制经过所述至 少三个微流体通道的流体流动。
5. 如权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述隔膜阀还包括通路层。
6. 如权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，向所述至少一个致动通道施加压力 或真空造成所述弹性膜调节经过所述间断面的流体流动，从而形成至少一个三通道阀。
7. 如权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述膜天然地关闭该阀，向所述膜施 加真空使所述膜偏离阀座，从而打开该阀。
8. 如权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述微流体层包括朝向所述膜的表 面，所述表面具有沟槽，按压所述膜时，沟槽形成所述微流体通道。
9. 如权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述微流体层包括内部微流体通道， 这些通道与开口于连接点上的层中的孔相交。
10. 如权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述致动层包括朝向所述膜的表 面，所述表面具有沟槽，按压所述膜时，沟槽形成所述致动通道。
11. 如权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述致动层包括开口于阀室上的内 部致动通道。
12. 如权利要求6所述的微流体装置，其特征在于，所述至少三个微流体通道以Y形汇 合在连接点上。
13. 如权利要求1所述的微流体装置，包括由单个致动通道致动的多个所述隔膜阀。
14. 一种微流体装置，其包括微流体层、致动层和夹在它们中间的弹性体层，其中所述微流体层包括第一和第二微流体通道，它们在连接点处汇合，并且被中断所述第 一和第二微流体通道之间但不沿所述第二通道的流体流动的间断面分隔开；所述致动层包括至少一个开口于阀室的致动通道，所述阀室位于所述连接点的反面；和其中移动所述弹性膜能调节经过所述至少三个微流体通道的流体流动，从而形成隔膜阀。
15. 如权利要求14所述的微流体装置，其特征在于，所述第二微流体通道中的流体流 动不受所述弹性膜调节。
16. 如权利要求14所述的微流体装置，其特征在于，所述弹性膜防止经过所述至少一 个微流体通道的流体流动。
17. 如权利要求14所述的微流体装置，其特征在于，所述弹性膜不完全抑制经过所述 至少一个微流体通道的流体流动。
18. 如权利要求14所述的微流体装置，其特征在于，所述隔膜阀还包括阀层。
19. 如权利要求18所述的微流体装置，其特征在于，向所述至少一个致动通道施加压 力或真空造成所述弹性膜调节经过至少一个间断面的流体流动。
20. 如权利要求18所述的微流体装置，其特征在于，所述至少两个微流体通道以T形汇 合在连接点上。
21. 如权利要求14所述的微流体装置，包括由单个致动通道致动的多个所述隔膜阀。
22. 如权利要求14所述的微流体装置，其特征在于，所述第二通道形成具有确定容积 的环，并包括预定容积的容积式泵。
23. —种方法，包括通过打开所述隔膜阀和用泵进行多次冲程将预定体积的液体泵送 到权利要求22所述装置的第一通道中。
24. —种微流体装置，其包括微流体层、致动层和夹在它们中间的弹性体层，其中 所述微流体层包括微流体通道；致动层包括至少一个开口于阀室的致动通道，所述阀室沿所述微流体通道布置；禾口 无论是否移动弹性膜，流体都会沿通道流动，但移动所述弹性膜能调节沿所述通道的 流体流动，从而形成隔膜阀。
25. 如权利要求24所述的微流体装置，其特征在于，所述弹性膜通过增加或减少所述 至少一个微通道的横截面积来调节流体流动。
26. 如权利要求24所述的微流体装置，其特征在于，所述隔膜阀还包括通路层。
27. 如权利要求24所述的微流体装置，其特征在于，向所述至少一个致动通道施加压 力或真空造成所述弹性膜调节经过至少一个间断面的流体流动。
28. 如权利要求24所述的微流体装置，还包括在隔膜阀产生磁场的磁体。
29. 如权利要求28所述的磁体，其特征在于，所述磁体选自永磁体、电磁体或稀土磁体。
30. 如权利要求24所述的微流体装置，其特征在于，在邻近所述隔膜阀的地方，至少一 个微通道的通路形成星形或嵌套星形。
31. —种系统，其包括 第一微流体装置，其包含第一微流体线路，包括入口 、出口 、泵和至少一个第一功能组件，第一功能组件选自反 应器、捕获区、温度循环区、热区、冷区、分离通道、分析线路、混合器、珠加工单元或磁体，其 中构造所述泵以便通过所述线路泵送流体；禾口第二微流体装置，其包含多个第二微流体线路，各线路包含入口 、出口和至少一个不同于第一功能组件的功能 组件；构造所述第一和第二组件以配合多个位置，其中在各位置上，第一线路的出口与第二线路之一的入口相配合，以允许流体从所述第一线路流入所述配合的第二线路中。
32. 如权利要求31所述的系统，其特征在于，所述第一微流体装置还包括经构造能以 电学方式移动流体、分子、化学物质或颗粒的电极。
33. 如权利要求31所述的系统，其特征在于，所述第二微流体装置还包括分析区。
34. 如权利要求31所述的系统，其特征在于，所述第二微流体装置还包括捕获区。
35. 如权利要求31所述的系统，其特征在于，与所述第一微流体装置相比，所述第二微 流体装置是可移动的。
36. 如权利要求31所述的系统，其特征在于，所述第二微流体装置的所述流体输入将 流体从所述第一微流体装置递送至多个微流体通道中。
37. 如权利要求31所述的系统，其特征在于，所述第一微流体装置的所述流体输出将 流体从多个微流体通道递送到所述第二微流体装置的所述流体输入中。
38. 如权利要求32所述的系统，其特征在于，通过电泳方式将所述流体、分子、化学物质或颗粒从所述第一微流体装置的所述流体输出移动到所述第二微流体装置的所述流体 输入中。
39. —种方法，其包括a) 在权利要求26所述的第一微流体装置的第一微流体线路中，对第一样品进行第一 操作；b) 使配合权利要求31所述的第一和第二微流体装置，以使所述第一线路的输出与所 述第二微流体线路的入口相配；c) 在所述操作后，将所述第一样品从所述第一线路移动到所述第二线路的第一个线路中；d) 在所述第二线路的第一个线路中对所接受的第一样品进行第二操作；e) 在所述第一微流体线路中对第二样品进行第一操作；f) 使配合所述第一和第二微流体装置，以使所述第一线路的输出与所述第二微流体线 路的下一个不同线路的入口相配；g) 在所述操作后，将第二样品从所述第一线路移动到所述第二线路的下一个线路中；和h) 在所述第二线路的第一个线路中对第一反应样品进行第二操作；
40. 如权利要求39所述的方法，还包括在第一线路中再对至少一个样品重复进行步骤 e)-h)，其中将各样品移动到多个第二线路的下一个不同线路中。
41. 如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述第一操作包括将样品与试剂混合。
42. 如权利要求39所述的方法，其特征在于，进行所述第一操作消耗的时间短于所述 第二操作。
43. —种制备微流体装置的方法，所述方法包括 联结多层，形成多个微通道和隔膜阀； 其中所述多层夹在一起；其中所述多层中的至少两层选自弹性膜、致动层、微流体层、阀层、散热器、通路层、界面层和覆盖层。
44. 如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述多层中的至少一层是粘合剂层。
45. 如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述多层通过粘合剂层联结在一起。
46. 如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述多层通过至少一个夹具联结在一起。
47. 如权利要求43所述的方法，其特征在于，通过降低阀处的压力或温度，将所述多层 联结在一起，除了隔膜阀的位置。
48. 如权利要求43所述的方法，其特征在于，通过在所述阀上选择性设置涂层，将所述 多层联结在一起，除了隔膜阀的位置。
49. 如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述涂层是可去除的。
50. —种微流体装置，其包括a) 微流体通道；b) 沿温度高于环境温度的通道布置的第一温度区；c) 沿温度低于环境温度的通道布置的第二温度区；禾口d) 沿通道布置并经构造将液体泵送到第一和第二温度区的容积式泵。
51. 如权利要求50所述的微流体装置，还包括与至少一个温度区热偶合的微流体环。
52. 如权利要求50所述的微流体装置，其特征在于，在至少两个不同的温度区之间泵 送至少一个微流体通道中的样品至少两次。
53. 如权利要求50所述的微流体装置，其特征在于，用不可混溶的流体由所述至少一 个三阀泵分离所述样品。
54. 如权利要求50所述的微流体装置，其特征在于，至少一个隔膜阀位于温度区中。
55. —种分析样品的方法，其包括在权利要求41所述的微流体装置中加热或冷却核酸序列；禾口 分析所述核酸序列。
56. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述分析包括测序、连接或聚合酶链反应 扩增、转录、翻译或偶联的转录和翻译。
57. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述核酸选自基因组DNA、线粒体DNA、 mRNA、 tRNA、 rRNA、 siRNA。
58. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述分析包括将至少一个衔接子连接于 所述核酸序列。
59. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述衔接子包括独特的核酸序列标识物。
60. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述独特的核酸序列标识物用作内部质 控标准。
61. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述分析包括连接于珠的单个核酸序列 的结合。
62. 如权利要求61所述的方法，还包括扩增所述核酸序列。
63. —种微流体装置，其包括包含微流体通道的微流体层，其中所述通道包括至少一个紧弯曲，其包含两个互相连 接并形成锐角的通道节段；禾口在所述紧弯曲区域产生磁场的磁场生成装置， 其中流经所述紧弯曲的顺磁性颗粒被磁场所阻滞。
64. 如权利要求63所述的微流体装置，包括多个紧弯曲。
65. —种微流体装置，其包括包含微流体通道的微流体层，其中所述通道依次包括第一、第二和第三区域，其中所述 第二区域的横截面面积大于所述第一和第三区域；禾口 在所述第二区域产生磁场的磁场生成装置，禾口 其中流经所述第二区域的顺磁性颗粒被磁场所阻滞。
66. —种在微流体装置上进行生物分子分析的方法，所述方法包括 在微流体装置上的第一反应室中混合生物分子和试剂，以产生第一反应混合物； 将所述反应混合物移动到所述装置上的反应区并进行反应，以产生产物混合物； 将所述产物混合物移动到所述装置上的某区域并将产物捕获到该区域中的顺磁性捕获颗粒上；将所述颗粒和捕获产物移动到处于磁场内的装置的捕获室中，以将捕获颗粒和产物保 留在所述捕获室中；在所述捕获室中洗涤颗粒；将所述颗粒和产物移动到所述装置上的端口中，以便从所述装置取出产物。
67. 如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述生物分子选自核酸、蛋白质、糖、细胞 或脂质。
68. 如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述反应是核酸扩增反应。
69. 如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述扩增是等温扩增。
70. 如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述扩增包括对所述混合物进行热循环。
71. 如权利要求66所述的方法，还包括对所述反应混合物或产物混合物进行第二反应。
72. —种微流体装置，其包括a) 多个微流体反应线路，各线路包括i) 至少两个经构造能接受样品或者可由其取出样品的端口 ；ii) 至少一个经构造能通过所述线路泵送流体的泵，iii) 至少一个包括进行化学或生化反应的装置的反应室；禾口iv) 至少一个包括捕获颗粒的装置的捕获室；b) 至少一个与多个微流体线路流体连通并经构造能向各个线路递送样品或试剂流的 分配端口 ；其中多个线路经构造能对递送至每个线路的端口之一的多种不同材料平行进行操作。
73. 如权利要求72所述的方法，其特征在于，构造所述反应室，以便用热泵加热或冷却。
74. 如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述捕获室位于磁场中，磁场经构造能阻 滞顺磁性颗粒在捕获室中的移动。
75. 如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述泵是容积式泵。
全文摘要
本发明公开了集成的可编程微流体线路，以实现加工生化和化学反应物体物以及整合这些反应物的实际应用。在一些实施方式中，合并了生化反应工作流或化学工作流。公开了微型阀如具有Y阀和流通阀的可编程微流体线路。在一些实施方式中，本发明微型阀用于混合流体，这可能是整合过程的一部分。这些过程包括混合样品和将反应物移动到模块化微流体设备的边缘或储库中，使用捕获区，和注入单独装置上的分析装置中。在一些实施方式中，使用星形和嵌套星形设计，或通过改变微型阀中通道的横截面面积捕获珠。还公开用固定温度在温度区之间移动样品，以及通过微型泵移动样品。
文档编号C12M3/02GK101715483SQ200880003896
公开日2010年5月26日 申请日期2008年2月5日 优先权日2007年2月5日
发明者A·R·保伦凯, I·I·布拉加, J·霍恩, M·万格博, M·范恩古延, S·乔瓦诺维齐, W·D·尼尔森 申请人:微芯片生物工艺学股份有限公司