专利名称：在植物中通过调节ZmPKT的产量增强的制作方法
技术领域：
本发明涉及遗传学和分子生物学领域。更具体地，本发明涉及在植物中调节转录
和改善产量的组合物和方法。
背景技术：
借助常规育种法的谷粒产量改善已经在玉米中几乎达到一个平台期。随后自然 要探索可能用来获得进一步产量提高的备选、非常规方法。由于玉米中的收获指数已经 在过去百年左右对谷粒产量选择的期间基本上保持不变，产量改善已经因提高每单位土地 面积的总生物量生产而实现(Sinclair等人(1998)Crop Science 38 :638—643 ;Duvick 等人(1999)CropScience 39 :1622-1630 ;和Tollenaar等人(1999)Crop Science39 : 1597-1604)。这种提高的总生物量已经通过增加植物密度实现，这导致适应性表型变更，如 叶片角减小和玉米穗状花序大小降低，前者导致减少对下部叶子的遮蔽并且后者可能提高 收获指数(Duvick等人，(1999) CropScience 39 :1622-1630)。 ZmPKT (ZmPTK-具有TPR重复序列的玉米蛋白激酶)属于含有TPR的蛋白激酶家 族，它们在包括稻属、拟南芥属(arabidopsis)和大豆在内的植物中发现。ZmPKT以中等水 平表达在多种组织中，所述的组织包括营养组织(叶)和繁殖组织(玉米穗、玉米穗状花 序、谷粒)。ZmPKT编码具有两个保守结构域(PK)蛋白激酶结构域(PS50011)和(T)三 角四肽重复结构域(Tetratricop印tide r印eat domain)TPR的植物蛋白。具蛋白激酶结 构域的酶属于一个庞大的蛋白质家族，所述蛋白质共有丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶 均具备的一个保守性催化核心。TPR(三角四肽重复结构域) 一般含有大约34个氨基酸， Blatch和Lassie (1999) BioEssays 21:932-939。 TPR结构域参与包括蛋白质-蛋白质相 互作用在内的多种功能；参与分子伴侣、细胞周期、转录和蛋白质转运复合体。TPR基序的 数目在蛋白质之间是变化的。5个至6个串联重复序列产生一个具有两亲性通道的右手螺 旋结构，其中认为所述的两亲性通道容纳靶蛋白的a-螺旋。已经提出TPR蛋白优选地与 WD-40重复序列蛋白质相互作用。在多种情况下，几个TPR蛋白似乎聚集成如在几种细胞周 期蛋白依赖性激酶中所观察到的多蛋白复合体。TPR基序可能代表一种已经由不同的蛋白 质采纳并适应于特定功能的远古蛋白质-蛋白质相互作用模块(Blatch和Lassie (1999) BioEssays21 :932-939)。 当前对ZmPKT基因的研究表明该基因统计显著地影响植物组织生长。我们的数据 证实组成型地过量表达ZmPKT基因对植物中几种重要的产量性状产生强烈的正效应。
本领域需要可以使用此类序列来调节植物中植物生长和产量的方法和组合物。
发明简述 提供了用于调节花器官发育、叶形成、趋光性、顶端优势、果实发育、根发端和用于 提高植物中产量的组合物和方法。所述组合物包括ZmPKT序列。本发明的组合物包含选自 SEQ ID NO :1和2的氨基酸序列和核苷酸序列及其变体和片段。 在用于目的植物中表达的DNA构建体中提供了编码ZmPKT基因的核苷酸序列。还 提供了包含本发明序列的表达盒、植物、植物细胞、植物部分和种子。在具体的实施方案中，多核苷酸与组成型启动子有效连接。 提供了用于调节植物或植物部分中ZmPKT序列的水平的方法。所述方法包括将包 含本发明的ZmPKT序列、蛋白激酶(PK)结构域或三角四肽重复(TPR)结构域的异源多核苷 酸导入植物或植物部分。可以提高或降低ZmPKT多肽的水平。此方法可以用来提高植物中 的产量；在一个实施方案中，该方法用来提高谷类中的谷粒产量。
附图简述
图1提供了几个来自玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻 (0ryza sativa)和大豆(Glycine max)的ZmPKT序列的比对。下划线的氨基酸(SEQ ID NO :5)代表共有的蛋白激酶结构域(PS50011)，而双下划线的氨基酸(SEQ ID NO :6)代表共 有的三角四肽重复结构域(TPR)，其中所述的TPR参与包括蛋白质-蛋白质相互作用在内的
多种功能；参与分子伴侣、细胞周期、转录和蛋白质转运复合体。
发明详述 现在将参考附图在下文中更充分地描述本发明，其中显示了一些，但非全部的本 发明实施方案。实际上，这些发明可以以多种不同形式体现并且不得解释为限于本文中所 述的实施方案；相反，提供了这些实施方案，从而本公开内容将满足适用的法律要求。
这里所述的本发明的众多修改和其他实施方案将是得益于在前面描述和相关附 图中所展示教导的这些发明所涉及领域的技术人员可想起的。因此，应当理解所述发明不 意图限于所公开的具体实施方案并且修改和其他实施方案将意图被包含于所附权利要求 书的范围中。尽管本文中使用了具体术语，不过它们仅在一般性和描述性意义上使用并且 其目的不在于限制。
I.概述 提供在植物中促进花器官发育、根发端及产量和用于调节叶形成、趋光性、顶端优 势、果实发育等的方法和组合物。本发明的组合物和方法通过调节植物中至少一种ZmPKT 多肽或具有本发明ZmPKT多肽的生物学活性变体或片段的多肽的水平导致植物或作物产
量改善。 II.组合物 本发明的组合物包含参与调节转录的ZmPKT多核苷酸和多肽及其变体和片段。 ZmPKT编码具有两个保守结构域(PK)蛋白激酶结构域(PS50011)和(T)三角四肽重复结 构域TPR的植物蛋白。ZmPKT中的TPR结构域(SEQ ID NO :4)对应于ZmPKT (SEQ ID NO :2) 的氨基酸位置第371至482位氨基酸残基，而本文中命名为"PK结构域"(SEQ ID NO :3)的 一个独立但高度保守的结构域对应于ZmPKT (SEQ ID NO :2)的氨基酸位置第69至134位氨 基酸残基。"对应于"意指对于每个结构域的所提到的氨基酸位置涉及所提到SEQ ID NO的 氨基酸位置并且意指包含这些结构域的多肽可以通过使用标准比对方法比对所述多肽与 所提到SEQ ID NO :而找到。 如本文中所用，"ZmPKT"或"ZmPKT"序列包含编码具有PK和/或TPR结构域或 该PK和/或TPR结构域的生物学活性变体或片段的多肽的多核苷酸或具有PK和/或TPR 结构域或该PK和/或TPR结构域的生物学活性变体或片段的多肽。见，例如Jurata和 Gill (1997)Mol. Cell. Biol. 17 :5688-98和Franks等人(2002) Development 129 :253-63。
在一个实施方案中，本发明提供了包含如SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的分离的ZmPKT多肽及其片段和变体。还提供了包含SEQ ID NO :1中所示核苷酸序列的多核苷酸和 包含编码PK结构域(SEQ ID NO :3)或TPR结构域(SEQ ID NO :4)的多核苷酸的序列。在 一些实施方案中，本发明的多核苷酸包含编码PK结构域和TPR结构域这两者的序列。
本发明包括分离的或基本上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。"分离的"或"纯 化的"多核苷酸或蛋白质或其生物学活性部分基本上或实质上不含这样的组分，其中所述 组分通常伴随或与该多核苷酸或蛋白质相互作用，如在该组分天然存在环境中所发现的那 样。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质通过重组技术产生时基本上不含其他细胞材 料或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。最佳地，"分离的"多核 苷酸不含在衍生该多核苷酸的生物的基因组DNA中天然分布于该多核苷酸侧翼(即位于 该多核苷酸的5'或3'端)的序列(最佳地是蛋白质编码序列)。例如，在多个实施方案 中，这种分离的多核苷酸可以含有在衍生该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然分布于该 多核苷酸侧翼的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或O. lkb的核苷酸序列。基本上不含 细胞材料的蛋白质包括具有小于约30%、20%、10%、5%或1% (干重)杂质蛋白的蛋白质 制品。当重组地产生本发明的蛋白质或生物学活性部分时，培养基最佳地出现小于约30%、 20%、10%、5%或1% (干重)的化学前体或非目的蛋白质化学品。 ZmPKT结构域或ZmPKT多核苷酸及其所编码蛋白质的片段和变体也被本发明的方 法和组合物包括。"片段"意指多核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分。多核苷酸的片段 可以编码仍保留天然蛋白生物学活性并且因而调节转录的蛋白质片段。例如，多肽片段将 包含PK结构域(SEQ IDN0:3)或TPR结构域(SEQ ID NO :4)。在一些实施方案中，该多肽 片段将包含PK结构域和TPR结构域这两者。备选地，用于抑制ZmPKT序列或使其沉默(即 降低表达水平)的片段不需要编码蛋白质片段，但仍将保留抑制此靶序列表达的能力。另 外，用作杂交探针的片段通常不编码仍保留生物学活性的蛋白质片段。因此，核苷酸序列的 片段可以具有至少约18个核苷酸、约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、以及 多达编码本发明蛋白质的全长多核苷酸。 编码PK结构域、TPR结构域和/或ZmPKT多肽的多核苷酸的片段将编码至少15、 25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、675、700、725、750、775、 800、825个连续氨基酸或多达全长PK或TPR结构域或ZmPKT蛋白(即SEQ ID NO :2)中存 在的氨基酸总数。用作杂交探针、PCR引物或用作抑制构建体的PK或TPR结构域或ZmPKT 多核苷酸的片段一般不需要编码ZmPKT蛋白或ZmPKT结构域的生物学活性部分。
可以通过如下方式制备包含PK或TPR结构域或ZmPKT蛋白的多肽的生物学活性 部分，即通过分离ZmPKT多核苷酸的一部分，表达ZmPKT蛋白的编码部分(例如通过体外重 组表达)并评估ZmPKT蛋白的该编码部分的活性。作为ZmPKT核苷酸序列的片段或作为包 含TPR和PKT结构域的多核苷酸序列的片段的多核苷酸包含了至少16、20、50、75、100、150、 200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1， 000、1， 100、1， 200、1， 300、 1， 400、1， 500、1， 600、1， 700、1， 800、1， 900、2， 000、2， 050、2， 100、2， 150、2， 200、2， 250、 2， 300、2， 350、2， 400、2， 450、2， 500个连续核苷酸或多达全长TPR和PK结构域中或ZmPKT多 核苷酸(即SEQ ID N0:l，1984个核苷酸)中存在的核苷酸数目。"变体"意指基本上相似的序列。对于多核苷酸而言，变体包含一个或多个核苷酸 在天然多核苷酸内部一个或多个内部位点处的缺失和/或添加和/或一个或多个核苷酸在天然多核苷酸中一个或多个位点处的置换。如本文中所用，"天然"多核苷酸或多肽分别包
含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸而言，保守性变体包括这些序列，其
中所述序列因遗传密码的简并性而编码ZmPKT多肽之一或TPR和PK结构域的氨基酸序列。
可以使用熟知的分子生物学技术鉴定天然存在的等位基因变体，例如用下文说明的聚合酶
链反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸也包括合成方式衍生的多核苷酸，例如通过位点
定向诱变产生、不过仍编码包含TPR或PK结构域(或这两者)的多肽或能够调节转录或能
够降低(即抑制或沉默)ZmPKT多核苷酸之表达水平的ZmPKT多肽的那些多核苷酸。通常，
本发明的特定多核苷酸的变体将与该特定核苷酸具有如通过本文其他地方描述的序列比
对程序和参数所确定的至少约40% 、45% 、50% 、55% 、60% 、65% 、70% 、75% 、80% 、85%、
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性。 本发明的特定多核苷酸(即参照多核苷酸)的变体也可以通过比较在变体多核苷
酸所编码的多肽与这种参照多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数进行评价。因
此，例如公开了一种分离的多核苷酸，其编码与SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO :2的多肽具有
给定序列同一性百分数的多肽。可以使用在本文其他地方描述的序列比对程序和参数计算
任意两个多肽之间的序列同一性百分数。在本发明任意给定的多核苷酸配对通过比较由所
述多核苷酸编码的两个多肽所共有的序列同一性百分数而进行评价的情况下，这两个编码
的多肽之间的序列同一性百分数是至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、
80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性。"变体"蛋白质意指从天然蛋白中通过在该天然蛋白中一个或多个内部位点处缺 失或添加一个或多个氨基酸和/或在该天然蛋白中一个或多个位点处置换一个或多个氨 基酸而衍生的蛋白质。由本发明包括的变体蛋白质是有生物学活性的，即它们继续具有该 天然蛋白的想要的生物学活性，即如本文中所述调节转录。此类变体可以例如因遗传多态 性或因人操作产生。本发明的ZmPKT蛋白的生物学活性变体或TPR或PK结构域的生物学 活性变体将与ZmPKT蛋白的氨基酸序列或共有的PK(SEQ ID NO :5)和TPR(SEQ ID NO :6) 结构域的氨基酸序列具有如通过本文其他地方描述的序列比对程序和参数所确定的至少 约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性。本发明的ZmPKT蛋白的或PK或TPR结 构域的生物学活性变体可以与该蛋白质具有少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个，如6-10 个，少至5个，少至4、3、2个或甚至1个氨基酸残基的不同。 本发明的多核苷酸可以按照多种方式进行改变，所述的方式包括氨基酸置换、缺 失、截短和插入。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，可以通过在DNA中突变 来制备ZmPKT蛋白或TPR PK结构域的氨基酸序列变体和片段。用于诱变和多核苷酸变更 的方法是本领域熟知的。见，例如，Kunkel， (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol. 154 :367-382 ;美国专利号4,873， 192 ;Walker 禾口 Gaastra编著 (1983)， Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,纽约)以及其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物学活性的 适宜氨基酸置换的指导可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found. ， Washington, D. C.)的模型中找到，所述文献在本文中引用作为参考。保守性置换，如将一个氨基酸交换为具有相似特性的另一个氨基酸，可以 是最佳的。 因此，本发明的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突变形式。同样，本发明 的蛋白质包括天然存在的蛋白质以及其改变和修饰的形式。此类变体将继续具有想要的活 性(即，调节转录或降低靶ZmPKT序列的表达水平的能力)。在具体的实施方案中，将于编 码该变体的DNA中产生的突变未使该序列不符合可读框并且不产生可能产生二级mRNA结 构的互补性区域。见，EP专利申请
发明者L·纽曼, O·丹尼莱夫斯卡亚, W·B·布鲁斯 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司