微芯片大容量pcr与集成实时ce检测的制作方法

专利名称：：微芯片大容量pcr与集成实时ce检测的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于进行大容量聚合酶链反应(PCR)和集成毛细管电泳(CE)检测的微流控装置。
背景技术：
：通常将微流控PCR定义为尺寸极小的，例如500至0.5范围内的腔室中的PCR。存在具有各种加热体系的微流控系统，例如区域加热、外热器、集成电阻、焦耳加热和红外辐射，不过这些加热体系要求外部检测。这意味着在反应结束时，必须用物理方法将一部分样品从PCR腔室中移出，并通过诸如凝胶电泳或毛细管电泳等手段在系统外部进行分析。该类型的操作的实例记载于Cheng等，NucleicAcidsRes,24(2),p.380-385(1996);Kopp和Manz,Science,280(5366)p.1046-8(1998);OdaAnalChem,70(20)，p.4361-4368(1998);和Chen等，AnalChem,77(2):p.658-666(2005)中。要求外部检测的体系与实时检测功能不相容，这是因为这样的体系需要移出大部分的PCR反应溶液用于外部测定。其他的检测方法使用光学检测，这涉及嵌入染料如SYBRGreen(参见Rasmussen等，Biochemica，1998(2):p.8-111998)，或荧光探针如Taqman探针(参见Kalinina,O.等，NucleicAcidsRes,25(10),p.1999-2004(1997);Belgrader，R等，Science,284(5413),p.449-450(1999);Belgrader，P.等，AnalChem,75(14)，p.3446-3450(2003);和Northrup,M.A.等，AnalChem,70(5),p.918-922(1998))。SYBRGreen染料是高特异性的双链DNA结合染料，用于检测在PCR循环中积聚的DNA产物。尽管这些检测方法均可用于实时PCR扩增，但是嵌入染料与Taqman探针技术之间的区别在于嵌入颜料检测方法不具有特异性。它将检测所有的双链DNA，包括非特异性PCR产物如引物-二聚物形式。鉴于此，使用嵌入染料的PCR扩增往往需要熔解曲线分析以区分所需的PCR产物和非特异性PCR扩增。相反，Taqman探针PCR检测方法具有高度的特异性，因为荧光信号的产生取决于探针和所需的PCR产物之间的特异性杂交。不过，与SYBRGreen染料不同，Taqman探针PCR检测方法需要合成分别用于不同系列的探针，受到可用于探针标记的荧光染料局限性的限制(例如，受到不同颜色的染料的数目的限制)，并且需要昂贵的试剂。PCR的替代性检测方法是进行反应产物的电泳法DNA尺寸分离。该方法使得所需的反应产物与所有其他来源的DNA或污染物分离而被鉴别。许多具有外部检测的微流控PCR系统涉及DNA大小筛分，或者通过凝胶，或者利用毛细管电泳，因为其具有特异性而且不需要靶标特异性探针的合成。
发明内容提供一种用于核酸扩增和检测的微流控系统。所述系统包括具有用于扩增核酸的量的腔室的基板；布置在所述基板上的孔；连接所述基板中的所述孔与所述腔室以允许溶液流过所述腔室的流道；和一个或多个设置在所述基板并与所述腔室连接以用于分离检测所述腔室中的扩增的所述核酸的一部分的分离通道。将所述腔室、所述流道和所述一个或多个分离通道构造成使所述腔室和所述流道组合的流体流动阻力比所述一个或多个分离通道中的流体流动阻力小约103倍或更多，或小约103倍约109倍，或小约103倍约107倍，或小约104倍约106倍。术语流体流动阻力或水力流动阻力表示对于压力驱动性流动的阻力，可定义为压差除以流率的比率。所述系统还可包括热循环装置或其他部件以进行分离。此外，提供一种用于核酸扩增和检测的微流控系统，该系统包括具有用于扩增核酸的量的腔室的基板；布置在所述基板上的孔；连接所述基板中的所述孔与所述腔室以允许溶液流过所述腔室的流道；和一个或多个设置在所述基板并与所述腔室连接以用于分离检测所述腔室中的扩增的所述核酸的一部分的分离通道，其中所述一个或多个分离通道的组合体积比所述腔室和所述流道的组合体积小超过100倍或更多，或小约100倍约1000倍，或小约300倍约1000倍。所述系统还可包括热循环装置或光学读数控制装置以进行分离和DNA的量化。此外，提供一种用于核酸扩增和检测的微流控装置，该装置包括具有用于扩增核酸的量的腔室的基板；设置在所述基板中的孔；连接所述基板中的所述孔与所述腔室以允许溶液流过所述腔室的流道；和一个或多个设置在所述基板中并与所述腔室连接以用于分离检测所述腔室中的扩增的所述核酸的一部分的分离通道，其中所述一个或多个分离通道的尺寸小于所述流道和所述腔室中的每一个的尺寸，以致一个或多个分离通道中的流体流动阻力起到代替阀门的作用。此外，提供一种用于核酸扩增和检测的方法，所述方法包括下列步骤(1)提供微流控装置，所述装置包括用于扩增核酸的量的腔室、孔和与所述孔和所述腔室连接以允许溶液流过所述腔室的流道，以及一个或多个与所述腔室连接的分离通道；(2)在所述腔室中放置核酸溶液；(3)扩增放置在所述腔室中的所述核酸；(4)将扩增的所述核酸的一部分从所述腔室引入所述一个或多个分离通道中；(5)通过所述一个或多个分离通道分离扩增的所述核酸的一部分；和(6)检测分离的所述核酸。将步骤(3)(6)重复一次以上用于实时检测，或将步骤(3)重复一次以上然后将步骤(4)(6)执行一次用于终点检测。所述方法还可包括(8)基于收集的数据对所述核酸的存在量进行量化。因此，所述装置和方法适于实时以及终点PCR检测。核酸分离可使用电动方法进行。术语电动通常理解为表示溶液或分子响应电场的运动。其包括电泳，即离子或带电分子在电场中的运动，或电渗，即本体溶液致的运动。核酸分离可以在电泳占主导地8位的条件下进行，并且核酸具有由于存在筛分基质所致的尺寸依赖性迁移率。不过，也存在其他的分离核酸的方法，而且可用于微流控系统或装置。例如，通过利用质谱分离DNA片段已经完成DNA测序(美国专利5691141号；Koster等，NatureBiotech.Vol.14,p.1123(1996))，并且记载了很多微流控与质谱的联用(例如，参见美国专利5872010、6803568和7105812)。分离核酸的其他方法依赖于与固定探针的杂交，例如Lenigk等(Anal.Biochem.Vol.311，p.40(2002))所描述的。术语"分离"使用其一般意义，除非对其做进一步的限定。本发明的其他特征的一部分将在随后的说明中进行阐述，一部分将通过该说明而得到理解，或者可以通过实施本发明而获知。本发明的特征可以由在所附权利要求书中具体指出的要素和组合而实现并获得。应当理解，前述的一般性说明和下列的详细说明对于所要求保护的本发明都仅是示例性和解释性的，而非限制性的。结合于此并构成本说明书一部分的了本发明的实施方式，并与说明一同用于解释本发明的原理。此外，本说明书中提及的所有参考文献均以引用的方式并入本文。图1(A)1(E)是单一基板上的具有PCR-CE能力的微流控芯片的制造方法的描述例。图2是本发明的微流控系统的实施方式。图3是本发明的微流控系统的另一个实施方式。图4是本发明的微流控装置的另一个实施方式。图5显示了通过使用本发明的微流控装置的实施方式形成的示例性实时PCR生长曲线。图6显示了本发明的微流控装置的实施方式的示例性CE分离图。图7描述了本发明的微流控装置的另一个实施方式。图8(A)(F)显示了使用本发明的微流控装置的实施方式的终点PCR检测结果。图9显示了使用本发明的微流控装置的实施方式的终点PCR检测的另一个结果。具体实施例方式下面具体论述本发明的实施方式(示例性实施方式)，其实例描述在附图中。在可能的情形下，在整个附图中使用相同的附图标记指代相同的或相似的部件。本发明的实施方式中，可将微流控系统构造为具有下列特征PCR腔室可具有约1pl约100]ul，约10inl约75pl，或约25pl约50jil的体积以提供用于DNA扩增的高灵敏度。作为实例，如果能够可靠地扩增的最小拷贝数为10，则在10pl的体积中灵敏度的极限是每^一个拷贝体。在100pl的体积中，极限灵敏度是每)il100个拷贝体，即低100倍。另一个特征是设置用于对PCR腔室的内容物进行热循环的系统从而实现充分的DNA扩增。又一个特征是所述系统具有与PCR腔室连接的尺寸足够小的通道网。可将称为分离通道的通道网构造为具有比PCR腔室更小的内体积，从而便于分析腔室中所容纳的核酸的非常少的一部分。分离通道的组合体积可以比PCR腔室与流道的组合体积小约100倍或更多，或小约100倍约1000倍，或小约300倍约1000倍。此外，保持通道尺寸较小以确保这些通道的流体流动阻力远高于PCR腔室和其他通向该腔室的通道。通过使流动阻力的比例在约103以上，或约103约109，或约103约107，或约104约106的极高的范围内，可在通道中实现没有任何阀门或塞子的门功能。在另一个特征中，可将通道网用于电泳法DNA尺寸分析。为进行该尺寸分析，可采用单一跨通道拓扑从而以DNA筛分基质充满通道。又一个特征是整个系统的制造在单一的--次性基板中进行。避免使用阀门或塞子有其优点。存在微流控阀门需要比此处描述的系统更为复杂的制造程序，其具有数个更多的层和对齐要求。这导致将具有阀门的系统制造为一次性装置通常较昂贵。此外，微流控阀门可能受到死体积和漏流的影响。使用塞子或凝胶阀，如Koh等(Anal.Chem.，Vol.75,p.4591(2003))所述，可能不符合成本效益，且保存期有限。此外，通过交叉连接的凝胶塞进行的核酸输送较慢，导致分析需要更长的时间。结果，可能仅适用于执行终点分析，而非实时PCR量化。通过主要使用电泳力来输送核酸，可将PCR腔室中非常少的一部分核酸移出以用于分析，而不必移出腔室中溶液的相似部分。即使移出极少量的溶液，如10pl，例如Slepnev(美国专利第7，081，339号)中所描述的，也可能导致损失PCR腔室中的相当一部分的核酸，因此可能造成难以进行实时分析。微流控芯片中的大PCR腔室可以与小毛细管电泳(CE)分离通道组合以使分离通道的流体流动阻力充分大于大PCR腔室的流体流动阻力。可以计算获得高质量分离所需的分离通道中的阻力与PCR腔室的阻力之比。对于获得用于设计PCR-CE芯片的阻力比的估计范围的示例性计算，假定压差AP驱动溶液沿着分离通道进出PCR腔室。压差AP可描述如下其中，4。壶,.是PCR腔室的流体流动阻力，^,^是PCR腔室的体积。为简化计算，所述腔室的流体阻力近似包括流道(即非CE分离通道)的阻力；因此，下面无论何时提及腔室的阻力，均假定包括流道的阻力。流率可表示为损失的腔室体积部分除以分析时间其中，込/^W是通过该腔室的流率，/是损失的该体积的分数。依据这些变量，流体流动阻力凡/^^可规定为=^=腊。。，在分离通道中，流动阻力方程式同样表示为■vepC，其中，化印是分离通道的流体流动阻力，是通过该通道的流率。该方程式是如图2或图3中所示的大多数系统的简化，因为通常具有多个与PCR腔室连接的分离通道。此处做此简化作为获得流体阻力比的量级范围的一个实例。考虑系统的实际通道拓扑，例如，其可计算为各个通道部分的串联和并联，可以更加精确地计算流体阻力凡ep和流率g"，但为了计算的目的，假定简单的系统近似于更复杂的情形。分离通道的最大流率可由某个允许的溶液位移限定。该最大位移Ax可依据分离的物种的带宽限定。压力引发的流动将导致这些带的分散。为了避免大大增加分离的分散，可将Ax设定为比带宽小至少2倍或更多。在分析PCR产物所需的典型的微流控DNA分离中，取决于通道的宽度，带宽为大约100微米。因此，估计Ax为10微米50微米。如果通道的横截面积为a，则最大允许流率e:r可表示为^"t一,保流动低于该值所需的通道中的最小流动阻力iC"(最小分离通道,.邵阻力)可规定为W緒"二A尸^"""/'"'p_Ax爿压差和分析时间通常未知或不固定。因此有用的是依据分离通道阻力与PCR腔室的阻力的比率表达最小分离通道阻力的要求尺.Ax爿该表达式因此限定了使得PCR腔室与一组用于CE分离的通道能够无阀联接所需的最低流动阻力比。流动阻力比的估计范围可基于该等式给出。对于高灵敏度PCR，需要较大的体积。例如，为了检测浓度为100CFU/ml的病原体，需要至少数十微升的体积以确保存在至少一个病原体。示例性的腔室体积为25^a。可将可损失但基本上不会影响检测的分数假定为约0.1;该分数是一个实例，虽然越低越好，不过在一些情况中可以容忍更大分数的损失。因此，据估算，以上表达式中的分子的示例性值为2.5inl。微流控通道的横截面可以在很宽的范围内变化，但是在微流控领域中其例如从约10)im变化至约100pm;因此对于本实例，选择30pmx30pm的平均尺寸。选择以上讨论的Ax的值的范围为平均30pm。分母中的体积的所得值为2.7xl(T、1，因此比率近似表达为凡=105显然，该值取决于各种假设，最明显的是分离通道横截面的假定值。如果允许横截面的尺寸为10nm100pm的范围，则得到下列阻力比的范围10410e另外，其他参数均有可能的范围，例如/可以为0.020.2，L^可以为10nl100Ml。如果考虑这些进一步的变化源，则可能的范围延伸至<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>上述范围是基于如上所述的许多假设的实例。范围的上限或下限根据如何限定各参数可进一步增大或减小。例如，可进一步调整各参数以增大上限至约io9。设计微流控系统的标准也可基于体积比而非流动阻力比。例如，假设分离通道和大体积腔室(假定流道的体积包括在腔室体积之内以简化计算)均具有与以计算为目的的纵横比相差不多的横截面纵横比。该假定对于大体积腔室(例如，深宽比可以为101)可能并不完全准确，但为了获得体积比的量级计算，该假定仍然有效(例如，对于上述10:1的比率，校正因子也只有约4倍)。流动阻力如下表示=—i=aZ)4其中丄是长度，^是动力粘度，D表示横截面尺寸(如直径)。对于圆形通道，数值因子《等于128&。因此，流动阻力比可改写如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>同样，体积比可记为:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>因此，两个比率的关系如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>此外，对于量级的计算，假定长度比和粘度比均约等于1。于是体积;于阻力比的平方根，对于阻力比中104106的范围，体积比的范围io3因此，装置中分离通道的总组合体积可以比PCR腔室和流道的总组合体积小100倍1000倍，从而允许在CE和PCR之间没有相互影响的条件下对来自PCR腔室的样品进行CE分析。分离通道中的粘度可以较高，这些通道的长度可以较长。在这样的情况中，体积比的计算可适当下调合适的量。制造这样的系统需要制得具有大不相同的尺寸的通道。PCR腔室的尺寸取决于其所需体积，其可以根据用途而改变。腔室的体积可设定为约1jil约100pl，约10nl约75jil，或约10nl约50jid，或约10fi1约25|il。因此，例如对于体积为25Ml的腔室，腔室的尺寸可以为10mmx5mmx50(^m。为避免其他尺寸变得过大，理想的是深度可以为至少约500pm。不过，腔室的尺寸并不限于上述尺寸，可将其适当变化并构造以获得所需体积。用于电泳分离和检测的通道的尺寸可以小得多；例如，它们可以具有20pmx20pm的横截面。通道网的深度可减小至5微米7微米以增大流动阻力比。以上的尺寸仅仅是实例，并不限于这些尺寸。只要PCR腔室和通道网的尺寸差异足以确保这些通道中的流体流动阻力与PCR腔室及其通路或流道中存在的阻力的比率为约103以上，或约103约109，或约103约107，或约104约106，则实际尺寸可以适当变化。也就是说，可相对于PCR腔室适当地设定流道的尺寸以获得所需的流体流动阻力。聚合物，如聚甲基丙烯酸甲酯或环烯烃聚合物适合于制造在同一基板中具有不同尺寸的微流控结构体，并适合于使得到的基板可一次性使用。具有不同通道尺寸的聚合微流控装置可通过下列如图1(A)1(E)中所示的方法制造。如图1(A)所示，选择双面抛光的硅晶片110，其具有的厚度等于所需的深通道，例如500pm600nm。然后，在硅的一侧通过光刻形成图案，该图案用于浅通道。该图案可以是光致抗蚀剂、二氧化硅和/或氮化硅的组合，作为用于下一步骤的掩蔽层。然后，用高长径比等离子体蚀刻，如深反应离子蚀刻(DR正)(图1(A))来蚀刻浅通道120。也可使用其他刻蚀技术，不过DRIE可用于在晶片中产生深且陡的孔和沟。将晶片110翻转，在硅的另一侧通过光刻形成图案，该图案用于深通道130，与另一侧的蚀刻图案对齐。这需要一些对齐方法，如使用红外光以透过硅晶片IIO观察。用高长径比等离子体蚀刻，如DRIE(图1(B))蚀刻穿透硅晶片。由此在硅晶片110中深通道130的位置处形成开口。然后，使硅晶片110与未形成图案的硼硅酸盐玻璃晶片140阳极粘接(图1(C))。然后，通过电镀产生硅/玻璃晶片的镍反向复制品150(图1(D))。该复制品150称为电铸品150。电铸品150用于压塑模具或模压聚合物基板160(图1(E))。随后在合适的位置处对聚合物基板160钻孔以制造孔，并切削边缘以制造微流控芯片，该微流控芯片可以与其他材料层压或压力/温度粘结。密封通道的一种方法是以薄聚合物膜层压。作为选择，聚合物微流控芯片中的大体积部件如PCR腔室220可以通过其他方法制造，例如在通过模塑或模压制得浅分离通道之后进行CNC加工。该方法较慢，因为必须对每一个装置进行重复，但是具有使得大体积部件的设计更为灵活的有利之处。在晶片110上进行深度蚀刻以制造将形成体积为例如约25pi的PCR腔室的电铸品150的一部分。图2显示了微流控系统的一个实施方式。可制得聚合物芯片210，其PCR腔室220的深度为500(im，面积为50mm2，或7mmx7mm见方。其他尺寸也是可以的，深度、宽度和高度可根据所需的腔室的体积适当地控制。另外，腔室具有通路或流道230，其将腔室与流动孔240连接以允许腔室充满适宜的溶液。PCR腔室220也可直接或间接地连接于与流动孔240隔开的分离通道。分离通道是通称，除了其它之外，还包括可用于引入一部分扩增的DNA的充样通道250，和与充样通道250相交(交叉区)并且可用于进行电泳分离从而检测扩增的DNA的尺寸的CE通道200。图2中仅示出了一个充样通道250和一个CE通道200，但是可将芯片构造为具有多于一个的每种通道。可将分离通道(如充样通道250和CE通道200)的内体积设计为比PCR腔室220和流道230的组合体积小100倍以上，或小约100倍约1000倍，或小约300倍约1000倍。PCR腔室220及其流道230的尺寸以及充样通道250和CE通道200的尺寸可以这样改变从而使得这些通道中的流体流动阻力与PCR腔室220及其流道230中存在的流体流动阻力的比率为约103以上，或约103约109，或约103约107，或约104约106。通过使充样通道250和CE通道200的流体阻力高于PCR腔室220的流体阻力，可实现用于通道的门功能而不必具有阀门或塞子。聚合物芯片210还设置有用于读取并处理来自聚合物芯片210的信号的光学读数控制装置270，和用于使PCR腔室220热循环的热循环装置280。充样通道250在其未与PCR腔室220连接的对端与点样孔260连接。点样孔260可起到电接点的作用，用于引入和/或注射DNA。CE通道200的对端与各自的CE孔300连接。CE孔300可起到电泳用电接点的作用。这种配置避免了将电极放置在通过流道230与PCR腔室220连接的两个流动孔240中。流动孔240需要具有足够大的组合体积以填充腔室220。在以上的设计中，点样孔260与流动孔240保持分离，并与电源连接以向电极提供电压。CE孔300也与流动孔240保持分离，并与电源连接以向电极提供电压。这种布置便于在温度周期变化的过程中密封流动孔。此外，可以选择性地在PCR腔室的每一端设置流阻器290以避免周期循环时腔室与孔之间的超流量。图3显示了微流控系统的另一个实施方式。聚合物芯片310具有PCR腔室320，其与通向流动孔340的流道330连接。除了流道330之外，PCR腔室320还直接或间接地与分离通道连接。分离通道包括末端通向点样孔360的充样通道350，和与充样通道350相交(交叉区)并且其末端各自通向CE孔395的CE通道390。图3中仅示出了一个充样通道350和一个CE通道390，但是可将芯片构造为具有多于一个的每种通道。该设计比前一实施方式更紧凑，因此制造更为经济，因为可以由单一的电铸品制得更多的芯片。制约因素可能是需要将分离通道(即，充样通道350和CE通道390)与PCR腔室320充分隔开以确保用于PCR的温度循环不会干扰分离。如同之前的实施方式，分离通道(充样通道350和CE通道390)的组合体积可以比PCR腔室320和流道330的组合体积小100倍以上，或小约100倍约1000倍，或小约300倍约1000倍。PCR腔室320及其流道330的尺寸以及充样通道350和CE通道390的尺寸可以这样改变从而使得这些通道中的流体流动阻力与PCR腔室320及其流道330中存在的流体流动阻力的比率为约103以上，或约103约109，或约103约107，或约104约106。通过使充样通道350和CE通道390的流体阻力高于PCR腔室320的流体阻力，可实现用于通道的门功能而不必具有阀门或塞子。聚合物芯片310还设置有用于读取并处理来自聚合物芯片310的信号的光学读数控制装置370，和用于使PCR腔室320热循环的热循环装置380。PCR腔室的其他可能的部件是一些内部支撑结构，用于避免层压膜在具有较大的覆盖面积时下垂。例如，如图4所示，实施方式显示出内部支撑结构体400放置在PCR腔室410中以支撑层压膜不致松垂。此处的支撑结构体400是腔室410中的矩形边角处的四个结构体和中心处的第五支撑结构体，其中PCR腔室在其最宽处具有5.4mm的宽度，0.5mm的深度，总体积为25pl。此处提供的尺寸均是实例，并不限制所述腔室。结构体400在腔室的底部及放置于腔室410上的层压膜处连接。支撑结构体的尺寸、个数和布局可相对于腔室的尺寸和体积适当地构造以确保不会发生层压膜的松垂。也就是说，支撑结构体可以为-一个或更多个，可以考虑腔室的体积、深度和宽度进行布置以最好地支撑层压膜。支撑结构体的材料可以由与PCR腔室相同的高分子材料构成，不过也可以不同，只要其是惰性的且不与任何布置在腔室中的溶液发生反应即可。以上显示的实施方式中描述的装置设计为用于进行实时PCR-CE，因为在扩增的过程中，可以通过聚合物芯片中集成的CE元件取出并分析几个DNA样品。移出的DNA部分是如此的少以致不会明显影响PCR过程。如果如同在DNA分离的通常情况下那样，抑制分离通道中的电渗流，则DNA完全通过电泳移动，而不从PCR腔室中移出任何体积。可以对每一个PCR循环采集样品并进行分析，或每隔一个PCR循环采集样品并进行分析。这是可能的，因为微流控芯片中的PCR循环通常需要15秒60秒，最快的微流控DNA分离约为60秒或更快。另外，采集样品的时间间隔可以短于分离所需的时间，因为可以同时分离多个样品。可以多点取样的事实意味着在扩增的最后也可以进行单点取样(终点PCR-CE)。使用诸如实施方式中所描述的装置等用于微芯片PCR与实时CE检测的装置时涉及的方法可以如下执行该方法涉及图2和图3中所示的示例性系统。用DNA筛分基质填充微芯片210或310的浅电泳的CE通道200或390。也可将该基质充分涂布在通道壁上以抑制电渗流，该基质可具有相当高的粘度，例如约10厘泊20厘泊，有助于减少任何压力引发的流动，并增大通道与PCR腔室之间的流体流动阻力比。所述基质还可以包含适宜的嵌入染料如溴化乙锭、CyberGreen、Evergreen或Syto染料用于检测DNA片段。然后，用包含样品以及所有PCR试剂(包括任何所需的酶)的混合物填充PCR腔室220或320。此外，密封PCR流动孔240或340，并将芯片放置在温度循环系统中。然后，在扩增的过程(每一个循环，或每隔一个循环)中，在发生通过温度循环进行的扩增的同时，在图2的情况中对电泳点样孔260施加电压，或在图3的情况中对孔360施加电压，从而将DNA的一部分从PCR腔室中引入充样通道250或350。然后，通过对CE孔300或395施加电压，经过交叉区将该DNA部分注射到CE通道200或390中。此外，分离DNA，并在距离交叉区适当的距离处进行检测。可对分离域和分离长度进行优化以快速分离相对少的双链DNA片段。然后，在每次分离时，鉴别对应于所需PCR扩增子的峰，并根据高度或面积计算其尺寸。然后，以得到的峰尺寸作为循环次数的函数作图，并利用这些数据确定样品中存在的耙标DNA的原始量。典型的单一PCR循环包括三个步骤变性、引物结合或退火和DNA合成或延伸。在变性过程中，首先将起始混合物加热至约94。C96。C以用于分离双链DNA模板。DNA变性后，将混合物冷却至约55t:以使引物结合至其分离链上的互补序列。引物限定了被复制的DNA的两端。然后将混合物加热至约72'C的温度，以使DNA聚合酶催化模板链上的退火引物的延伸，该循环重复一次或更多次。在一些情况中，单一PCR循环仅包括两个步骤变性，和引物结合与DNA合成的组合。在该情况中，首先将起始混合物加热至约94°C96°C以用于分离双链DNA模板。变性后，使混合物冷却至限定的温度(约60°C70°C)以使引物结合至其分离链上的互补序列并使DNA聚合酶催化模板链上的退火引物的延伸，该循环重复一次或更多次。可以在较低的温度进行PCR扩增。例如，反应混合物中包含脯氨酸等添加剂以降低模板DNA的变性温度。例如，低温循环PCR可通过约75'C的低变性温度和约55'C的引物退火和延伸温度进行。在另一实例中，DNA可以在不需要热循环的条件下扩增。例如，DNA模板通过称为解旋酶的酶分离，而不是通过加热分离。因此DNA可以在单一温度下扩增而无需使用热循环。通过施加合适的电压将在腔室中反应的反应样品的一部分(如DNA扩增子)注射到分离通道中，该操作不是在结束通过PCR温度循环进行的扩增之后进行而是在通过PCR温度循环进行扩增的过程中进行。注射入分离通道的PCR扩增子在分离通道内分离。然后，检测分离的PCR扩增子。此外，这些注射步骤、分离步骤和检测步骤重复一次或更多次。收集重复检测过程时得到的数据，然后基于收集的数据对存在的核酸的量进行量化，由此可以确定存在于样品中的靶标核酸的原始量。例如，核酸的存在量的量化可通过计算阈值循环而确定。作为一个实例，下面将描述使用图2中的PCR芯片210进行的PCR-CE试验。试验中所用的试剂是BSA溶液(100pg/ml);BCG基因组DNA，106拷贝体/|^;rTaqDNA聚合酶，5U/|il;IOXPCR缓冲液；50mMMgCl2;10mMdNTP;IS—F10正向引物，CTCACCTATGTGTCGACCTG，5pM;禾卩IS—R8反向引物，GGTCGAGTACGCCTTCTTG,5pM。PCR反应溶液(28pl)包含IXPCR缓冲液；0.4mMdNTP;3mMMgCl2;250nM正向引物；250nM反向引物；1iulBCG基因组DNA(105拷贝体)；禾口1UrTaqDNA聚合酶。以包含嵌入染料的聚二甲基丙烯酰胺凝胶基质充满PCR-CE芯片210的CE通道200，将28fil的反应混合物从一个孔240充填到PCR芯片210中。随后用热循环装置-热循环器280夹住充满PCR试剂和凝胶的PCR芯片。通过放置在芯片210上并密封覆盖芯片210的歧管装置(manifolddevide)对所有的孔施加30psi的压力以抑制PCR循环过程中的蒸发。在2008年5月18日提交的PCT/US2008/06266中更详细地描述了所述歧管装置，该申请要求2007年5月15日提交的美国临时申请第60/938,171号的优先权，这两篇专利的全部内容均通过引用的方式并入本文。使用下列循环方案进行PCR:lx96。C，30秒；禾卩40x96°C，15秒、62°C，15秒和72。C，30秒。通过在14、16、18、20、22、25和30循环时在点样孔260之间施加电压，引导来自腔室220的PCR产物样品移入充样通道250中。然后，通过在CE孔300之间施加电压，将PCR产物样品注入CE通道200中以进行分离，并通过光学读数控制装置270进行分析。使用PCR混合物中的内标(100bpDNA)对PCR产物的峰面积进行归一化，并相对于循环次数作图以绘成PCR生长曲线，如图5中所示。图6显示了在靶标PCR产物样品(200bp)开始具有可检测性时第18个循环的CE分离的电泳图谱。总时间为1小时。己知有各种方法用于计算实时PCR中的相对定量。例如，为对DNA的量进行量化，美国专利第6,942,971号描述了这样的程序存储限定核酸序列的生长曲线的信号值、确定生长曲线的导数并计算与导数的特性有关的循环次数或时间值。在Yuan等，BMCBioinformartics7:85(2006)中，作者提供了实时PCR数据的统计分析以对生成的DNA的量进行量化。在Pfaffl,NucleicAcidResearch,vol.29,No.9(2001)中，作者描述了用于实时PCR的相对定量的新的数学模型。任何这些方法和本领域中已知的其他方法均可用于对实时PCR中核酸的量进行量化。在另一个实施方式中，显示了终点PCR检测。如图7所示，用于PCR与CE检测的微流控芯片600具有宽度均约为30的多个通道605，和深度约为500的PCR腔室610。基本上，具有孔18的芯片600的尺寸与图2中显示的尺寸相同。为进行终点PCR检测，首先以分离凝胶充满通道，分离凝胶由pH为8的200mMTAPS缓冲液、2%的聚二甲基丙烯酰胺筛分基质和溴化乙锭二聚物荧光染料构成。然后，以包含所有PCR反应所需试剂(引物、酶、缓冲剂、氯化镁、dNTP's)的PCR缓冲液以及不同拷贝数的靶标物充填腔室610。靶标物是质粒DNA的200bp片段。以PCR缓冲液充满连接在腔室610和充样电极孔5之间的通道605。所有的通道和腔室均被充满后，以分离凝胶或标记物或PCR缓冲液充满各孔。然后将芯片600放置在热循环装置(未示出)上，该装置由与加热器和冷却装置连接的扁平铜板构成。通过歧管装置(在PCT/US2008/06266中描述)对所有的孔同时施加37psi的压力。将热循环设定为40个循环，具有如下定时变性15秒、退火20秒和延伸15秒。总循环时间为2100秒。PCR循环后，缓慢释放压力。热循环之后，进行芯片毛细管电泳。使用插入的铂电极在孔中施加电压，同时用荧光显微镜进行光学检测。入射光来自532nm的绿色二极管激光器，激发滤波片在610士35nm处。来自PCR腔室的样品在电泳作用下移向孔8，同时与来自孔3的DNA尺寸标记物(100bp和700bp)混合。同时，来自孔1和7的电流也导向交叉点以限制在该交叉点的样品。在下一步骤中，将DNA从孔7导向孔1以进行分离，而后拉电流(pull-backcurrent)维持在来自孔8和3的充样下表显示了用于CE分离的施加电压和电流口步骤12345678充填140-3uAOuA-15uAOuA-30uAOuA-3uA2100V分离451900VOuA3uAOuAOuAOuA800V3uA图8(A)(F)显示了如上所述进行的一系列试验的CE结果，在PCR缓冲液中具有不同的靶标DNA的原始拷贝数105、104、103、102、10和O(对照)拷贝数。结果表明得自10个原始拷贝体的扩增的产物仍然具有可检测性。如图9所示，该试验具有10个拷贝体(表中的"IO一天数2")，在随后一天进行重复。扩增峰尽管小得多但仍然能够检测。基于分别进行的校准试验，该试验中的各峰幅值可用来估计DNA浓度。本示例性微流控装置和其他装置的浓度确定结果显示在下表中。如图8(A)(F)和图9中所示，PCR运行之后，从芯片中取出样品，并用Agilent2100Bioanalyzer进行分析，该仪器可用于确定各峰的浓度。对于同一个PCR，在也记录了DNA浓度的Cepheid，sSmartCycler⑧上进行另一个对照试验。组合结果显示在下表中。表.使用不同的装置和检测的PCR产物的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>结果表明，微流控芯片的灵敏度即使不优于其他检测装置，也与其他检测装置相当。结果的变化可以由每次稀释时实际存在的拷贝数的统计学波动来解释。每次扩增后存在的DNA的量化级对于所有的方法均相似，关于靶标物的原始拷贝数均为单调增加。可对如上所述的设计和方法添加许多变化和可能的附加特征。一个实例是通过使用超大体积孔进行样品与PCR混合物的芯片上混合。该实例涉及到使用外部吸液管将待分析的样品和包含引物、酶和核苷的PCR预混试剂(PCRmastermix)连续地放入孔中。这样的孔需要至少与PCR腔室一样大的体积，在约10微升约100微升的范围内。另一个实例是来自PCR反应的DNA样品与筛分标准物的芯片上混合。这样做需要增加容纳DNA标准物或标记物的额外的孔，和连接该孔与PCR腔室220及注射交叉点之间的通道部分的通道。来自PCR腔室的DNA样品与DNA标准物的混合比可由对分离孔260和另外的DNA标记物孔施加的电压或电流来控制。考虑到此处公开的本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方式对于本领域的技术人员将是显而易见的。本说明书和实施例旨在被视为仅仅是示例性的，本发明的真实范围和要旨将由下列权利要求表示。权利要求1.一种用于核酸扩增和检测的微流控系统，所述系统包括具有用于扩增核酸的量的腔室的基板；多个布置在所述基板上的孔；连接所述基板中的所述孔与所述腔室以允许溶液流过所述腔室的流道；和一个或多个设置在所述基板中的分离通道，所述分离通道连接所述腔室和其他孔以用于分离并检测所述腔室中的扩增的所述核酸的一部分，其中，将所述腔室、所述流道和所述一个或多个分离通道构造成使所述腔室和所述流道组合的流体流动阻力比所述一个或多个分离通道中的流体流动阻力小至少103倍。2.如权利要求1所述的微流控系统，所述系统还包括热循环装置，所述装置用于在所述腔室中进行核酸扩增。3.如权利要求1所述的微流控系统，其中，所述一个或多个分离通道中的流体流动阻力与所述腔室和所述流道中的流体流动阻力的比率为约103约109。4.如权利要求1所述的微流控系统，所述系统还包括光学读数控制装置，所述装置用于通过光学方法检测来自电泳分离的所述核酸部分的信号并处理所述信号。5.—种用于核酸扩增和检测的微流控系统，所述系统包括具有用于扩增核酸的量的腔室的基板；布置在所述基板上的孔；连接所述基板中的所述孔与所述腔室以允许溶液流过所述腔室的流道；禾口一个或多个设置在所述基板中并与所述腔室连接以用于分离和检测所述腔室中的扩增的所述核酸的一部分的分离通道，其中，所述一个或多个分离通道的组合体积比所述腔室和所述流道的组合体积小至少100倍。6.如权利要求5所述的微流控系统，所述系统还包括热循环装置，所述装置用于在所述腔室中进行核酸扩增。7.Ar"i+T7-"lffi^PrrFtd2+rVn^/r、、,力厶*FJlCJH々:fe二X"/^Tl+工/yW1X/TU女d、>/71^口、J1讽Y力L:Til尔-儿，/71^12尔-儿xc光学读数控制装置，所述装置用于通过光学方法检测来自电泳分离的所述核酸部分的信号并处理所述信号。8.如权利要求5所述的微流控系统，其中，所述一个或多个分离通道的组合体积比所述腔室和所述流道的组合体积小约100倍约1000倍。9.一种用于核酸扩增和检测的微流控装置，所述装置包括具有用于扩增核酸的量的腔室的基板；多个设置在所述基板中的孔；连接所述基板中的所述孔与所述腔室以允许溶液流过所述腔室的流道；禾口一个或多个设置在所述基板中的分离通道，所述分离通道连接所述腔室和其他孔以用于分离并检测所述腔室中的扩增的所述核酸的一部分，其中，所述一个或多个分离通道的尺寸小于所述流道和所述腔室中的每一个的尺寸，使得所述一个或多个分离通道中的流体流动阻力起到代替阀门的作用。10.如权利要求9所述的微流控装置，其中，将所述腔室、所述流道和所述一个或多个分离通道构造成使所述腔室和所述流道组合的流体流动阻力比所述一个或多个分离通道中的流体流动阻力小约103倍或更多。11.如权利要求9所述的微流控装置，其中，将所述腔室、所述流道和所述一个或多个分离通道构造成使所述腔室和所述流道组合的流体流动阻力比所述一个或多个分离通道中的流体流动阻力小约103倍约109倍。12.如权利要求9所述的微流控装置，其中，所述腔室的体积为约10jil约25(il。13.如权利要求9所述的微流控装置，其中，所述一个或多个分离通道的体积比所述腔室和所述流道的组合体积小至少100倍。14.如权利要求9所述的微流控装置，其中，所述一个或多个分离通道的体积比所述腔室和所述流道的组合体积小约100倍约1000倍。15An士T7^ll面老r>fiF^+的ttlr、、志i六壯罢甘出SF^士宜tt;出；&罢:^丄j.^hi入t'j:sco、7//iww'ji/^tqij-j工艰且，六'r，'i丄//1化fu^'r>^且3/于一个的分离通道以形成用于电泳法DNA尺寸分析的通道网。16.—种用于微流控装置的核酸扩增和检测的方法，所述方法包括下列步骤(1)提供微流控装置，所述装置包括用于扩增核酸的量的腔室、孔和与所述孔和所述腔室连接以允许溶液流过所述腔室的流道、以及一个或多个与所述腔室连接的分离通道；(2)在所述腔室中放置核酸溶液；(3)扩增放置在所述腔室中的所述核酸；(4)将扩增的所述核酸的一部分从所述腔室引入所述一个或多个分离通道中；(5)通过所述一个或多个分离通道分离扩增的所述核酸的所述部分；和(6)检测分离的所述核酸，其中，将步骤(3)(6)重复一次以上，或将步骤(3)重复一次以上然后将步骤(4)(6)执行一次。17.如权利要求16所述的方法，其中，所述腔室中放置的所述核酸的扩增通过热循环进行。18.如权利要求16所述的方法，所述方法还包括(8)基于收集的数据对所述核酸的存在量进行量化。19.如权利要求16所述的方法，其中，所述核酸的存在量的量化通过计算阈值循环而确定。20.如权利要求16所述的方法，其中，将所述腔室、所述流道和所述一个或多个分离通道构造成使所述腔室和所述流道组合的流体流动阻力比所述一个或多个分离通道中的流体流动阻力小至少103倍。21.如权利要求16所述的方法，其中，将所述腔室、所述流道和所述一个或多个分离通道构造成使所述腔室和所述流道组合的流体流动阻力比所述一个或多个分离通道中的流体流动阻力小约103倍约109倍。22.如权利要求16所述的方法，其中，所述腔室的体积为约10|^1约25(il。23.如权利要求16所述的方法，其中，所述一个或多个分离通道的体积比所述腔室和所述流道的组合体积小至少100倍。24.如权利要求16所述的方法，其中，所述一个或多个分离通道的体积比所述腔室和所述流道的组合体积小约100倍约1000倍。25.如权利要求16所述的方法，其中，在所述基板中设置多于一个的分离通道以形成用于电泳法DNA尺寸分析的通道网。全文摘要本发明公开了一种微流控装置，所述装置设置有适宜的集成结构以进行大容量PCR和终点或实时毛细管电泳检测。所述微流控装置包括具有用于扩增核酸的量的扩增腔室的基板、布置在所述基板上的孔、连接所述基板中的所述孔与所述腔室以允许溶液流过所述腔室的流道和一个或多个设置在所述基板中并与所述腔室连接以用于分离检测扩增的所述核酸的一部分的分离通道。将所述腔室、所述流道和所述一个或多个分离通道构造成使所述腔室和所述流道的组合的流体流动阻力比所述一个或多个分离通道中的流体流动阻力小至少10³倍。所述微流控装置可实现极高的检测灵敏度，同时具有极高的成本效率。文档编号C12P19/34GK101680013SQ200880019650公开日2010年3月24日申请日期2008年6月11日优先权日2007年6月11日发明者张建平,路卡·布塞申请人:和光纯药工业株式会社