一种利用竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法

专利名称：一种利用竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
一种利用竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶(SOD)的方法，属于生物工程 技术领域。本发明涉及利用竹黄菌株幼/ra^ sp. SUPER-H168保藏号为CCTCC M 207104，通过液态发酵获得SOD。
背景技术：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)是一种能够清除超氧阴 离子自由基的酶，在生物体抗氧化系统中占有重要地位，广泛存在于动物、植 物、所有好氧微生物及少数厌氧微生物体内。SOD能够提高人体对自由基损伤 的抵抗力，以及对自由基诱发因子的抵抗力，具有明显的抗衰老，增强对超负 荷的适应力，具有抗炎、抗肿瘤等作用，尤其是对风湿性关节炎、老年黑斑具 有显著防治效果，目前已经广泛应用于医疗、食品、日用品及保健等方面。SOD 主要从动物血液(如猪血或者牛血)中提取(袁烨.超氧化物歧化酶的制备方法 [P].申请号，02147888.0， 2002-12-19;徐文中，阎家麒.超氧化物歧化酶大规模 生产新工艺[P].申请号，01144922.5， 2001-12-24)，产量受到很大限制，且容易 受到原料来源、安全性及质量不稳定等因素的影响。由于动物、植物特别是动 物血液来源困难，而微生物可以人工培养，有利于实现工业化生产。根据目前 报道，已经可以通过微生物发酵法生产SOD，但主要为胞内酶(刁治民，姚银 霞，张文静.酵母菌SOD发酵条件的研究[J].青海师范大学学报(自然科学版)， 2002， 4: 48-51;杨明琰，郭爱莲，沈俭，等.高产SOD酵母菌的诱变选育及发酵 条件研究[J].食品科学，2005，26(10):147-150)，提取工艺较为繁琐。
竹黄是一种药用真菌，其发酵主要产物为竹红菌素等茈醌色素，具有很高 药用价值和保健功效。竹黄发酵生产SOD具有发酵周期短，发酵液中SOD活 力较高，且能同时生产茈醌色素，开发前景广阔。
目前能够产生SOD的菌株比较少，主要为一些酵母，且为胞内酶，需要破 壁后才能提取分离，操作成本高，不利于大规模生产制备。

发明内容
本发明的目的针对当前问题，利用竹黄菌株幼z'ra^ sp. SUPER-H168保藏号 为CCTCC M 207104通过液态发酵获得SOD。本发明采用液态发酵生产SOD， 通过物理方法或者化学方法剌激菌丝体产SOD，使SOD产量得到提高。
本发明的技术方案 一种竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，以竹黄 菌株幼/ra/a sp. SUPER-H168为出发菌株，该菌株保藏号为CCTCC M 207104， 已在中国专利ZL 200710132510.4公开，液态发酵培养基组成为碳源5-50 g/L，氮源5-50 g/L， K2HP04 2國4 g/L, MgS04 7H20 0.1-0.4 g/L， NaCl l-3g/L,马铃薯 汁0-200 g/L;在光照发酵罐内装入发酵罐体积60%-70%的培养基，灭菌冷却后 接入竹黄菌，接种量为5%-10%，起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度 为24-32。C，发酵周期为2-5天；
在发酵过程中通过添加表面活性剂、烷烃化合物、H202或进行光照，以提
高超氧化物歧化酶SOD的产量，最终发酵液中SOD活力达10-800 U/mL; 经检测胞内也有少量SOD，达0.1-5 U/mL;
在发酵过程中同时菌体会生成茈醌色素，产量达0.3-1.1 g/L，其中竹红菌甲 素占90%-93%,竹红菌乙素占2%-6%。
所述的产SOD碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖
或乳清。
所述的产SOD氮源为(NH4)2S04、 NH4Cl、 NH4N03、 NaN03、蛋白胨、酵 母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆粉或豆饼粉。
所述的通过添加11202，以采用氧化胁迫的方法提高SOD产量发酵开始后 的0-40小时，往发酵液中添加11202使发酵液中11202浓度达0.1-40 nmol/L，随 后的发酵不再补加11202。
所述的通过光照方法提高SOD产量光照强度为1000-15000 Lux，光照从 发酵开始后的5-40小时开始，持续时间为80-115小时。
所述的添加表面活性剂以提高SOD的产量，所添加表面活性剂选用Tween 20、 Tween40、 Tween 60、 Tween80、 Triton X-100、 TritonX-114、 TritonX-116、 Triton X-405、 TX画4、 TX画6、 TX-9、 TX-IO、 AEO-3、 AEO國7、 AEO-9、 一乙醇 胺、二乙醇胺或三乙醇胺，添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中表 面活性剂的质量浓度达0.1%-2% (w/w)，随后的发酵不再补加表面活性剂。
所述的添加垸烃以提高SOD的产量，所添加烷烃选用庚烷、辛烷、癸烷、 十二垸、十四烷或十六垸，添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中烷 烃的质量浓度达1%-10% (w/w)，随后的发酵不再补加烷烃。
SOD酶活的测定方法是基于SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光照下的还原作 用。SOD活力测定方法和SOD活力定义详见Chin-Wen Lin， Jeng-Huh Yang and Lieh《hi Su (1997) The extraction and properties of superoxide dismutase from porcine blood Chin-Wen Lin, Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su， Meat Science, 46(3):303-312.
茈醌色素的产量采用液相色谱法测定，详见Xiao-Hui Lianga, Yu-Jie Cai， Xiang-Ru Liao, Kang Wu， Lei Wang, Da國Bing Zhang and Qiang Meng (2009). Isolation and identification of a new hypocrellin A-producing strain Shiraia sp SUPER-H168. Microbiological Research 164(1): 9-17.
4本发明有如下特征
(1) 用于SOD发酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、 乳糖、半乳糖或乳清。氮源可以是(NH4)2S04、 NH4Cl、 NH4N03、 NaN03、蛋白 胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆粉或豆饼粉。马铃薯汁既可以补充碳源也 可以补充氮源，马铃薯汁200 g/L是指称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块， 加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤得到滤液，所有滤液加入到培养基中，培 养基终体积为1000 mL。
(2) 竹黄菌发酵SOD可采用光照机械搅拌和光照气升式发酵罐。对于机 械搅拌发酵罐，搅拌转速为70-150 r/min，通风量1:0.1-1:0.5 v/v/m。对于气升式 发酵罐，通风量为1:0.3 - l丄5 v/v/m。通风量数值与单位说明1:0.5 v/v/m指1 个体积的发酵液每分钟通0.5体积的无菌空气。所述发酵罐内的光源为荧光灯。 发酵罐体积为5-500L，结合本领域的基本常识可根据生产情况调整发酵罐大小。
(3) 竹黄菌生产超氧化物歧化酶(SOD)的过程，伴随着如下所示的三种 母核为基本结构的茈醌色素的生成，其中主要是竹红菌甲素。同时该菌可产生 以此三种母核结构进行基团修饰的多种茈醌类化合物。可在2, 3， 6， 7, 11, 12， 17, 18， 26, 28， 29， 30， 32, 36, 37， 45, 46， 53， 55, 56, 58， 62， 63, 71, 72位置修饰上各种 化学基团，如CH3、 OCH3、 COCH3、 CH(OH)CH3、 CHO、 OH、 H等，这些化 学基团之间还可以进一步形成更为复杂的结构。随着发酵条件的不同，各茈醌 色素的产量和比例会有所不同。<formula>formula see original document page 5</formula>
伴随SOD产生的菲醌色素母核
(4)竹黄菌生产超氧化物歧化酶(SOD)的过程，伴随着茈醌色素的生成。 茈醌色素可在发酵过程中产生活性中间体(超氧阴离子自由基、羟基自由基、 单线态氧)，对生物体具有一定杀伤能力。这就意味着竹黄在发酵过程中受到 氧胁迫作用，菌株会以生成SOD的机制来清除氧自由基等以抵抗氧胁迫。为了 提高SOD的产量，本发明通过添加11202，以采用氧化胁迫的方法提高SOD产 量。发酵开始后的0-40小时，往发酵液中添加^1202使发酵液中11202浓度达0.1-40 pmol/L，随后的发酵不再补加H202。(5) 为了提高SOD的产量，本发明在发酵过程中增加光照，以使菲醌色 素在光照条件下产生更多的氧自由基，从而使竹黄菌产生更多的SOD用来清除 氧自由基。光照强度可为1000-15000 Lux。光照从发酵开始后的5-40小时开始， 持续时间为80-115小时。
(6) 为了提高SOD的产量，本发明通过添加表面活性剂，以改善竹黄细 胞膜的通透性。发酵过程中添加的表面活性剂主要有Tween 20、 Tween 40、 Tween60、 Tween80、 Triton X-IOO、 TritonX-114、 TritonX-116、 Triton X隱405、 TX-4、 TX-6、 TX-9、 TX-10、 AEO-3、 AEO-7、 AEO-9、 一乙醇胺、二乙醇胺、 三乙醇胺。添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中表面活性剂的质量 浓度达0.P/。-2。/。(w/w),随后的发酵不再补加表面活性剂。结果表明所有表面活 性剂对于SOD的产量均有促进作用，其中Tween 60添加量为0.8%的效果最好。
(7) 为了提高SOD的产量，本发明通过添加烷烃类化合物，以使发酵过 程中产生的茈醌色素更易于由胞内进入发酵液体系统，从而能更好地刺激菌体 生产SOD。添加的烷烃主要有庚垸、辛烷、癸烷、十二烷、十四烷、十六烷 等。添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中烷烃的质量浓度达1%-10%
(w/w)，随后的发酵不再补加烷烃。结果表明所有烷烃对于SOD的产量均有 促进作用，其中十四烷效果最好，添加量在2%-3% (W/W)时效果较好。
本发明的有益效果竹黄是一种药用真菌，其发酵主要产物为竹红菌素等 茈醌色素，具有很高药用价值和保健功效。竹黄发酵生产SOD具有发酵周期短， 发酵液中SOD活力较高，且能同时生产菲醌色素，开发前景广阔。
具体实施例方式
实施例1
培养基组成为马铃薯汁200g/L，葡萄糖20g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L， NH4NO310g/L，玉米浆粉12g/L， pH自然，接种量为10%，发酵温度为3CTC， 300L气升式发酵罐，装液量70%，通风量为1:1.5 Wv/m，发酵时间为3天。当 发酵进行24h后，发酵液中加入H202lnmol/L、 Tween 60 0.8%和十四烷2.5%， 并连续给予10000 Lux的光照至发酵结束。在该条件下，发酵液中SOD活力为 800U/mL，胞内为5U/mL。茈醌色素产量为1.14 g/L，其中竹红菌甲素占90%， 竹红菌乙素占5%。
实施例2
培养基组成为果糖20g/L,牛肉膏20g/L，玉米浆粉30g/L， pH自然。接 种量为5%，发酵养温度为24。C， 300L气升式发酵罐，装液量70%，通风量为 1:0.3 v/v/m,发酵时间为5天。不添加表面活性剂、烷烃、H202。不进行光照。 在该条件下，发酵液中SOD活力为10 U/mL，胞内为1 U/mL。菲醌色素产量 为0.31g/L，其中竹红菌甲素占91%，竹红菌乙素占4%。实施例3
培养基组成为马铃薯汁200g/L，乳糖20g/L， NH4NO310g/L，蛋白胨10g/L， pH自然。接种量为10°/。，培养温度为30 °C， 500L机械搅拌发酵罐，装液量 60%，通风量为1:0.5 v/v/m，搅拌转速为150 r/min，发酵时间为4天。当发酵开 始后，发酵液中立即加入Triton X-100 1.5%。在该条件下，发酵液中SOD活力 为321 U/mL，胞内为3 U/mL。茈醌色素产量为0.53 g/L，其中竹红菌甲素占93%， 竹红菌乙素占3%。
实施例4
培养基组成为，蔗糖20g/L， NH4NO310g/L，蛋白胨10g/L， pH自然。接种 量为10%，培养温度为30 °C， 5 L机械搅拌发酵罐，装液量65%，通风量为 1:0.1 v/v/m，搅拌转速为70 r/min，发酵周期为5天。当发酵开始后40小时，加 入癸垸3%。在该条件下，发酵液中SOD活力为15 U/mL，胞内为0.1 U/mL。 茈醌色素产量为0.62 g/L，其中竹红菌甲素占90%，竹红菌乙素占2%。
实施例5
培养基组成为马铃薯汁200g/L，麦芽糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10 g/L，黄豆饼粉10 g/L， pH自然。接种量为10%，培养温度为28 。C， 500L机 械搅拌发酵罐，装液量70%，通风量为1:0.4 v/v/m，搅拌转速为150 r/min，发 酵周期为5天。发酵起始阶段加TX-6 1%,当发酵开始后10小时，连续给予15000 Lux的光照至发酵结束。在该条件下，发酵液中SOD活力为200U/mL，胞内为 4U/mL。茈醌色素产量为0.81 g/L，其中竹红菌甲素占92%，竹红菌乙素占2%。
实施例6
培养基组成为，半乳糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，尿素10g/L， pH自然。接种量为8%，培养温度为30 'C， 60L机械搅拌发酵罐，装液量60%， 通风量为1:0.3 v/v/m，搅拌转速为120r/min，发酵时间为5天。当发酵开始后， 发酵液中立即加入三乙醇胺1%。发酵开始后IO小时，连续给予1500 Lux的光 照至发酵结束。在该条件下，发酵液中SOD活力为620U/mL，胞内为2U/mL。 茈醌色素产量为0.77 g/L，其中竹红菌甲素占93%，竹红菌乙素占3%。
实施例7
培养基组成为，木糖20g/L，酵母膏10g/L，尿素10g/L， pH自然。接种量 为10%，菌龄2天，培养温度为30°C， 60L气升发酵罐，装液量65%，通风 量为1:1.2 v/v/m，发酵时间为5天。当发酵开始后24小时，发酵液中加入AEO-7 1%和癸烷3%。在该条件下，发酵液中SOD活力为700U/mL，胞内为4U/mL。 茈醌色素产量为0.73 g/L，其中竹红菌甲素占90%，竹红菌乙素占6%。
权利要求
1.一种利用竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征在于以竹黄菌株Shiraia sp.SUPER-H168为出发菌株，液态发酵培养基组成为碳源5-50g/L，氮源5-50g/L，K2HPO4 2-4g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.4g/L，NaCl 1-3g/L，马铃薯汁0-200g/L；在光照发酵罐内装入发酵罐体积60％-70％的培养基，灭菌冷却后接入竹黄菌，接种量为5％-10％，起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为24-32℃，发酵周期为2-5天；在发酵过程中通过添加表面活性剂、烷烃化合物、H2O2或进行光照，以提高超氧化物歧化酶SOD的产量，最终发酵液中SOD活力达10-800U/mL；经检测胞内也有少量SOD，达0.1-5U/mL；在发酵过程中同时菌体会生成苝醌色素，产量达0.3-1.1g/L，其中竹红菌甲素占90％-93％，竹红菌乙素占2％-6％。
2、 根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征 在于所述的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖或乳清。
3、 根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征 在于所述的氮源为(NH4)2S04、 NH4Cl、 NH4N03、 NaN03、蛋白胨、酵母膏、牛 肉膏、尿素、玉米浆粉或豆饼粉。
4、 根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征 在于所述的通过添加H202,以采用氧化胁迫的方法提高SOD产量发酵开始后 的0-40小时，往发酵液中添加H202使发酵液中H202浓度达0.1-40 {imol/L，随 后的发酵不再补加11202。
5、 根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征 在于所述的通过光照方法提高SOD产量光照强度为1000-15000 Lux，光照从 发酵开始后的5-40小时开始，持续时间为80-115小时。
6、 根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征 在于所述的添加表面活性剂以提高SOD的产量，所添加表面活性剂选用Tween 20、 Tween40、 Tween60、 Tween 80、 Triton X-100、 TritonX-114、 TritonX-116、 Triton X-405、 TX-4、 TX-6、 TX-9、 TX-10、 AEO-3、 AEO-7、 AEO-9、 一乙醇 胺、二乙醇胺或三乙醇胺，添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中表 面活性剂的质量浓度达0.1%-2% (w/w)，随后的发酵不再补加表面活性剂。
7、 根据权利要求l所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征 在于所述的添加烷烃以提高SOD的产量，所添加垸烃选用庚烷、辛烷、癸垸、 十二垸、十四烷或十六垸，添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中烷 烃的质量浓度达1%-10% (w/w)，随后的发酵不再补加垸烃。
全文摘要
一种利用竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶(SOD)的方法，属于生物工程技术领域。本发明采用竹黄菌株在液态发酵条件下生产SOD，主要为胞外酶。在发酵过程中通过添加H₂O₂、表面活性剂或烷烃可以提高SOD产量，同时光照也可以提高SOD产量。SOD产量最高可达800U/mL，在发酵过程中同时菌体会生成苝醌色素，产量可达1.1g/L，其中竹红菌甲素占90％，竹红菌乙素占5％。竹黄是一种药用真菌，其发酵主要产物为竹红菌素等苝醌色素，具有很高药用价值和保健功效。竹黄发酵生产SOD具有发酵周期短，发酵液中SOD活力较高，且能同时生产苝醌色素；本发明具有良好的工业应用前景。
文档编号C12N9/02GK101638639SQ200910031830
公开日2010年2月3日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者丁彦蕊, 强 孟, 廖祥儒, 张大兵, 梁晓辉, 王亚辉, 蔡宇杰, 魏兆媛 申请人:江南大学