专利名称：一种新鲜肉苁蓉经生物催化转化生产毛蕊花糖苷的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用新鲜肉苁蓉经生物催化转化生产毛蕊花糖苷单体化合物的方法。
背景技术：
肉苁蓉(HerbaCistanches)是多年寄生草本植物，为著名的补益中药，具有益精气、补肾助阳和延缓 衰老等功效。现代分析表明，肉苁蓉的主要活性成分为苯乙醇苷类、苯甲醇苷类、环烯醚萜苷类、木 脂素苷类、低聚糖类衍生物、D-甘露醇和甜菜碱等。苯乙醇苷类(Phenylethanoid Glycosides, Ph Gs) 包括松果菊苷(Echinacoside)、毛蕊花糖苷(Acteoside)等活性物质，通过肠内菌代谢研究发现，苯 乙醇苷主要成分松果菊苷在胃肠道中运动过程需经大肠内微生物酶催化转化为毛森花糖苷的代谢通 道，是导致口服后生物利用度与疗效存在显著差异的主要因素。毛蕊花糖苷单体化合物具有小分子和 低极性的特征，在药物吸收中展示良好的吸收率和特殊的药理活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种以新鲜肉苁蓉为原料，通过系统工艺处理和工业固定化酶反应器进行催 化转化生产毛蕊花糖苷单体化合物的方法。
本发明的方法是，利用新鲜肉苁蓉为原料，通过细胞破碎、浆液提取工艺及高温灭酶工艺处理， 将灭酶后的肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，通过p-葡萄糖苷酶工业酶制剂固定化酶作为生物催化 剂，催化水解底物中松果菊苷使葡萄糖基配体末端断裂、定向转化为高活性的毛蕊花糖苷单体化合物， 再通过分离提纯工艺，及浓縮、干燥工艺，收获毛蕊花糖苷单体化合物；催化反应过程温度为38°C 60°C， pH为4.0 5.8，时间为4h 8h，催化反应过程反应物中的|3-葡萄糖苷酶活力为2U/g 1000U/g; 通过调整分离提纯工艺条件，收获的毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量可达50% 90%。
本发明方法的具体步骤包括
1、 挑选新鲜肉苁蓉肉质茎，置于水洗槽中用冷水或工业纯净水漂洗；捞起后，置于通常工业破碎
碾磨装置中将肉苁蓉肉质茎破碎碾磨，加入工业纯净水或经预冷的工业纯净水洗涤碎裂细胞成为肉灰
蓉破碎细胞浆状物；然后采用通常工业压滤机压滤或工业离心机分离，获取肉苁蓉细胞浆液；可再将 滤渣经一次至数次(一般为1 3次)分别加入工业纯净水或经预冷的工业纯净水， 一次至数次经通常 工业破碎碾磨机进一步碾磨成浆状物，还可同时采用通常工业超声波提取装置对破碎细胞进行提取， 再经工业压滤机压滤或工业离心机分离进一步获取肉苁蓉细胞桨液；将破碎碾磨和分离工艺过程肉欢 蓉破碎细胞浆状物及细胞浆液控制在2(TC以下(一般为4 20'C)低温环境；
2、 通过通常工业加热装置将步骤1得到的肉苁蓉细胞桨液进行高温灭酶，或进行工业超高温瞬时 灭酶；将灭酶后的肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，采用通常固定化酶工业生产中的吸附法固定方式获得的(3-葡萄糖苷酶工业酶制剂固定化酶作为生物催化剂，经通常工业固定化酶反应器进行间断式 或连续式催化反应，催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蔬 花糖苷单体化合物；催化反应过程温度为38。C 6(TC，最佳温度为42。C 48。C; pH为4.0 5.8,最佳 pH为4.5 5.3;.时间为4h 8h，最佳时间为5h 6h，催化反应过程反应物中的p-葡萄糖苷酶活力为 2U/g 1000U/g，最佳酶活力为25U/g 150U/g;经测定，催化反应过程反应物中的松果菊苷转化为毛 蕊花糖苷单体化合物的转化率达78% 95%
3、 将经步骤2反应后的反应液，采用通常工业超滤膜分离，选择性筛分及截留除去多糖、蛋白质 等大分子杂质以及微粒和亚微粒等杂质；再采用通常工业纳滤膜分离，选择性筛分及截留除去氨基酸、 D-甘露醇、甜菜碱等小分子杂质；还可再采用通常工业大孔树脂吸附分离工艺，或/和采用通常工业层 析柱分离纯化工艺，或/和采用通常模拟移动床色谱分离系统工艺或通常多功能色谱分离工艺进一步分 离纯化；通过调整以上分离提纯工艺条件，可获得不同纯度的毛蕊花糖苷单体化合物提取液；
4、 将步骤3获得的毛蕊花糖苷单体化合物提取液，通过通常工业真空浓縮工艺或工业薄膜蒸发浓 縮工艺，获得固形物含量为30% 50%的浓縮物；再通过工业喷雾干燥工艺，或通常的其它工业干燥 方法，获得毛蕊花糖苷单体化合物的粉状物或干燥物。收获的毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量 可达50% 90%。
本发明方法涉及的新鲜肉苁蓉原料，可以是新收获(未经冷藏或冷冻保鲜)的新鲜肉欢蓉肉质茎，
或者是置于工业冷藏库保鲜的新鲜肉苁蓉肉质茎，或置于工业冷冻库冷藏的新鲜肉灰蓉肉质茎；或者 是上述新鲜肉苁蓉肉质茎的切片或碎料。
本发明所述的肉苁蓉是符合《中华人民共和国药典》2005年版收载的列当科植物肉欢蓉C/sto恥/2e (ie鮮"co/a Y.C.Ma或管花肉灰蓉C7加"c/ze励w/ora (Schrenk) Wight。
本发明方法涉及的采用工业冷藏库保鲜的库温一般为rc i3匸，最佳的冷藏库保鲜库温为4'C
l(TC;采用工业冷冻库冷藏的库温一般为-52i: -l(rC，最佳的冷冻库冷藏的库温为-36'C -18。C;采 用的置于水槽中的冷水水温为rC 20'C，最佳的冷水水温为4'C 1(TC;每次加入工业纯净水或经预 冷的工业纯净水的添加量为肉苁蓉破碎细胞或滤渣的100% 400% (重量比)，最佳添加量为200%
300% (重量比)；经预冷的工业纯净水水温为rc 2o'c,最佳水温为4。C 10'C。
本发明方法涉及的工业生产中的吸附法固定方式获得固定化酶，通常是将(3-葡萄糖苷酶工业酶制
剂酶液与吸附剂接触，再经洗涤除去不吸附的酶液便可以制得固定化酶；包括物理吸附法、离子吸附 法；吸附剂包括微孔玻璃、羟基磷灰石、赛珞玢、大孔型合成树脂、特种陶瓷、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、AmberliteIRA-93、 IRA-410、 IRA-900、 Dowex-50、 Amberlite CG-50、 IRC-50、 IR-120，
可选用通常国外及国内商品。
本发明方法涉及的(3-葡萄糖苷酶工业酶制剂，包括p-葡萄糖苷酶及富含(3-葡萄糖苷酶的纤维素酶、 植物提取复合酶、植物水解复合酶。
本发明方法涉及的高温灭酶的温度一般为75'C 10(TC，时间一般为3min 0min;超高温瞬时灭 酶的温度一般为135'C 141。C。本发明方法涉及的工业固定化酶反应器可以是通常工业搅拌罐式反应器、固定化床反应器或流化 床反应器。
本发明方法涉及的超滤膜的相对分子质量为1000 4500，最佳的相对分子质量为1500 3500;纳 滤膜相对分子质量为200 300，最佳的相对分子质量为250 280;超滤膜选用CA或CTA、 PAN、 PS、 PSA、 PES、 PVDF、 PEK、 SPS的系列膜型号；纳滤膜选用4040-UHT-ESNA或8540-UHY-ESNA、 ESNA-FREE650、 ESNA-FREE1700、 NTR7450HG、 NTR729HG、 NF-CA膜、NF-CA巻式元件及中空 纤维件的系列膜型号；大孔吸附树脂选用XAD、 Diaion、 SP、 Posapak及Chromosorb及非离子型高分 子吸附剂AB-8、 CHA-III、 CAD-40、 DlOl、 D301、 D296、 D396R、 D4006、 D4020、 D3520、 DA201、 DM301、 D130、 GDX104、 HPDIOO、 HPD450、 HPD500、 HPD600、 HPD8、 H107、 JD-KW、 LD601、 LD605、 ME-1、 ME-2、 ME-3、 NKA-2、 NKA-9、 R-A、 S8、 SIP、 WLD及X-5型系列型号；模拟移动 床色谱分离系统及多功能色谱分离系统，可以选用MB、 MD、 ME、 MF制备型色谱分离层析仪、SMBC 实验型、SMBC中试型、XZ12E-4L型、XZ20Z-2L型及SMBC工业化连续制备色谱型的色谱分离系统。 本发明方法涉及的超滤膜、纳滤膜、大孔吸附树脂、非离子型高分子吸附剂、工业层析柱、移动床色 谱分离系统、多功能色谱分离系统，可选用通常国外及国内商品。
本发明方法涉及的工业真空浓縮工艺或工业薄膜蒸发浓縮工艺的温度一般为42'C 8(TC，最佳温 度为45'C 65'C;采用的工业喷雾干燥工艺的干燥塔进风温度一般为125°C 285°C，最佳进风温度为 135。C 185。C。
本发明方法涉及的其它工业干燥的方法包括通常工业滚筒干燥、或气流干燥、流化床干燥、微波 真空干燥、微波干燥、真空干燥或热风循环干燥，干燥温度一般为50 10(TC，最佳为58 80'C。
本发明方法生产的毛蕊花糖苷单体化合物的粉状物或干燥物，可直接用于医药原料，或作为化妆 品原料，也可作为原料或复方原料生产口服液、胶囊剂、片剂、颗粒剂、冲剂、丸剂或袋泡茶等功能 性保健食品。本发明方法的推广实施，将使肉苁蓉这一名贵的中药更好地造福于人类的健康。
本发明方法中涉及的各种量的百分比(％),除了另有说明外，均为重量百分比。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一
1、 挑选置于库温为4'C的工业冷藏库保鲜的新鲜肉灰蓉肉质茎，置于水洗槽中用冷水漂洗，冷水 水温为18'C，捞起后，置于工业破碎碾磨装置中将肉苁蓉肉质茎破碎碾磨，加入工业纯净水洗涤破碎 细胞成为肉苁蓉破碎细胞浆状物，水的加入量为破碎细胞重量的300%;然后采用工业压滤机压滤，获 取肉苁蓉细胞浆液；经检测，破碎碾磨和分离工艺过程肉苁蓉破碎细胞浆状物及细胞浆液温度为2(TC;
2、 通过工业微波加热装置将肉苁蓉细胞浆液进行高温灭酶，温度为100'C，时间为3min;将灭酶 后的肉双蓉细胞浆液作为催化反应底物，采用通常工业生产中的物理吸附法羟基磷灰石作为吸附剂的
6固定方式，获得|3-葡萄糖苷酶固定化酶作为生物催化剂，经通常固定化床反应器进^连续式催化反应， 催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蕊花糖苷单体化合物； 催化反应过程温度为46'C, pH为4.9，每批次催化反应时间为5.5h,连续进行催化反应10批次；催化 反应过程反应物中的(3-葡萄糖苷酶活力为10U/g;经检测，底物中松果菊苷转化为毛蕊花糖苷单体化 合物的转化率达94%;
3、 将上述催化反应后的反应液采用相对分子质量为4000的超滤膜分离，再采用相对分子质量为 250的纳滤膜进行纳滤，然后采用AB-8型的工业大孔吸附树脂进行吸附分离，并经工业层析柱分离纯 化工艺分离提纯，再采用XZ12E-4L型多功能色谱分离系统进一步分离提纯，获得较高纯度的毛蕊花 糖苷单体化合物提取液；
4、 将上述提取液通过工业真空浓縮工艺，温度为6(TC,获得固形物含量为42%的浓縮物；进一 步通过工业真空干燥工艺，干燥温度为58'C，获得毛蕊花糖苷单体化合物的干燥物；经分析测定，所 收获的干燥物中(以干物质计)，毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量为87.5%。
实施例二
1、 挑选置于库温为io'c的工业冷藏库保鲜的新鲜肉苁蓉肉质茎，置于水洗槽中用冷水漂洗，冷水
水温为4'C，捞起后，置于工业破碎碾磨装置中将肉苁蓉肉质茎破碎碾磨，加入经预冷至水温为4'C的 工业纯净水洗涤破碎细胞成为肉灰蓉破碎细胞浆状物，水的加入量为破碎细胞重量的200%;然后采用 T.业离心机分离，获取肉苁蓉细胞浆液；并再将滤渣加入工业纯净水，水的加入量为滤渣重量的200 %,经通常工业破碎碾磨机进一步碾磨成浆状物，并采用超声波提取装置对破碎细胞进行提取，再经 丄业离心机分离进一步获取肉欢蓉细胞浆液；经检测，破碎碾磨和分离工艺过程肉苁蓉破碎细胞浆状 物及细胞浆液温度为18'C;
2、 通过工业加热装置将肉苁蓉细胞桨液进行高温灭酶，温度为10(TC,时间为5min;将灭酶后的 肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，采用通常工业生产中的物理吸附法赛珞玢作为吸附剂的固定方式， 获得P-葡萄糖苷酶固定化酶作为生物催化剂，经通常工业固定化反应器进行连续式催化反应，催化水 解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蕊花糖苷单体化合物；催化反 应过程温度为45'C， pH为4.5，每批次催化反应时间为6.0h，连续进行催化反应12批次，催化反应过 程反应物中的P-葡萄糖苷酶活力为29U/g;经检测，底物中松果菊苷转化为毛蕊花糖苷单体化合物的 转化率达95%;
3、 将上述催化反应后的反应液采用相对分子质量为300的纳滤膜进行纳滤，然后采用XAD型的 工业大孔吸附树脂进行吸附分离，并经工业层析柱分离纯化工艺提纯，再采用XZ20Z-ZL型多功能色 谱分离系统进一步分离提纯，获得较高纯度的毛蕊花糖苷单体化合物提取液；
4、 将上述提取液通过工业薄膜蒸发浓縮工艺，温度为55°C,获得固形物含量为45%的浓縮物； 进一步通过工业滚筒干燥工艺，干燥温度为55'C，获得毛蕊花糖苷单体化合物的干燥物；经分析测定， 所收获的干燥物中(以干物质计)，毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量为89.9%。实施例三
1、 挑选置于库温为-52'C的工业冷冻库冷藏的新鲜肉苁蓉肉质茎，置于水洗槽中用工业纯净水漂 洗，捞起后，置于工业破碎碾磨装置中将肉苁蓉肉质茎破碎碾磨，加入工业纯净水洗涤破碎细胞成为 肉苁蓉破碎细胞浆状物，水的加入量为破碎细胞重量的400%;然后采用工业压滤机压滤，获取肉灰蓉 细胞桨液；经检测，破碎碾磨和分离工艺过程肉苁蓉破碎细胞浆状物及细胞浆液温度为18°C;
2、 通过工业加热装置将肉苁蓉细胞浆液进行高温灭酶，温度为95'C，时间为10min;将灭酶后的 肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，采用通常工业生产中的物理吸附法大孔型合成树脂作为吸附剂的 固定方式，获得(3-葡萄糖苷酶固定化酶作为生物催化剂，经通常工业流化床反应器进行连续式催化反 应，催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蕊花糖苷单体化合 物；催化反应过程温度为42'C， pH为4.9，每批次催化反应时间为5h，连续进行催化反应8批次，经 检测，催化反应过程反应物中的p-葡萄糖苷酶酶活力为2U/g;经检测，底物中松果菊苷转化为毛蕴花 糖苷单体化合物的转化率达81.2%;
3、 将上述催化反应后的反应液采用相对分子质量为4500的超滤膜分离，再采用相对分子质量为 250的纳滤膜进行纳滤，然后采用NKA-2型的工业大孔吸附树脂进行吸附分离，并经工业层析柱分离 纯化工艺进一步分离提纯，获得较高纯度的毛蕊花糖苷单体化合物提取液；
4、 将上述提取液通过工业真空浓縮工艺，温度为60°C，获得固形物含量为41%的浓縮物；进一 步通过工业喷雾千燥工艺，干燥塔进风温度为185'C,获得毛蕊花糖苷单体化合物的粉状物；经分析测 定，所收获的粉状物中(以干物质计)，毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量为76.3%。
实施例四
1、 挑选置于库温为13'C的工业冷藏库保鲜的新鲜肉苁蓉肉质茎，置于水洗槽中用冷水漂洗，冷水 水温为13°C，捞起后，置于工业破碎碾磨装置中将肉苁蓉肉质茎破碎碾磨，加入经预冷至水温为2'C 的I业纯净水洗涤破碎细胞成为肉欢蓉破碎细胞浆状物，水的加入量为破碎细胞重量的100%;然后采 用丁业压滤机压滤分离，获取肉苁蓉细胞浆液；并将滤渣经2次分别加入工业纯净水，水的加入量为 滤渣重量的300%，再经通常工业破碎碾磨机进一步碾磨成浆状物，再经工业压滤机压滤分离进一步获 取肉苁蓉细胞浆液；经检测，破碎碾磨和分离工艺过程肉苁蓉破碎细胞浆状物及细胞浆液温度为18°C;
2、 将上述获得获得的肉苁蓉细胞浆液进行工业超高温瞬时灭酶，温度为138'C;将灭酶后的肉欢 蓉细胞浆液作为催化反应底物，采用通常工业生产中的离子吸附法DEAE-葡聚糖凝胶作为吸附剂的固 定方式，获得p-葡萄糖苷酶固定化酶作为生物催化剂，经通常工业搅拌罐式反应器进行连续式催化反 应，催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蕊花糖苷单体化合 物；催化反应过程温度为47'C， pH为5.0,每批次催化反应时间为5.0h，连续进行催化反应16批次， 催化反应过程反应物中的(3-葡萄糖苷酶活力为3.5U/g;经检测，底物中松果菊苷转化为毛蕊花糖苷单 体化合物的转化率达88.1%;
3、 将上述催化反应后的反应液采用相对分子质量为1000的超滤膜分离，再采用相对分子质量为 300的纳滤膜进行纳滤，然后采用CAD-40型的工业大孔吸附树脂进行吸附分离，并经工业层析柱分离
8纯化工艺进一步分离提纯，获得较高纯度的毛蕊花糖苷单体化合物提取液；
4、将上述提取液通过工业薄膜蒸发浓縮工艺，温度为60°C，获得固形物含量为48%的浓缩物； 进一步通过工业滚筒干燥工艺，干燥温度为55'C，获得毛蕊花糖苷单体化合物的干燥物；经分析测定， 所收获的干燥物中(以干物质计)，毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量为87.6%。
实施例五
1 、挑选置于库温为-18'C的工业冷冻库冷藏的新鲜肉苁蓉肉质茎，置于水洗槽中用工业纯净水漂 洗，捞起后，置于工业破碎碾磨装置中将肉苁蓉肉质茎破碎碾磨，加入工业纯净水洗涤破碎细胞成为 肉苁蓉破碎细胞浆状物，水的加入量为破碎细胞重量的250%;然后采用工业压滤机压滤，获取肉苁蓉 细胞浆液；经检测，破碎碾磨和分离工艺过程肉苁蓉破碎细胞浆状物及细胞浆液温度为15°C;
2、 通过工业加热装置将肉苁蓉细胞浆液进行高温灭酶，温度为85'C，时间为10min;将灭酶后的 肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，采用通常工业生产中的离子吸附法IRC-50作为吸附剂的固定方式， 获得卩-葡萄糖苷酶固定化酶作为生物催化剂，经通常工业搅拌罐式反应器进行连续式催化反应，催化 水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蕊花糖苷单体化合物；催化 反应过程温度为45'C, pH为4.1，每批次催化反应时间为6h,连续进行催化反应4批次，催化反应过 程反应物中的(3-葡萄糖苷酶活力为70U/g;经检测，底物中松果菊苷转化为毛森花糖苷单体化合物的 转化率达93.3%;
3、 将上述催化反应后的反应液采用相对分子质量为3500的超滤膜分离，再采用相对分子质量为 250的纳滤膜进行纳滤，然后采用DM301型的工业大孔吸附树脂进行吸附分离，并经工业层析柱分离 纯化[:艺进一步分离提纯，获得较高纯度的毛蕊花糖苷单体化合物提取液；
4、 将上述提取液通过工业真空浓縮工艺，温度为56°C，获得固形物含量为30%的浓縮物；进一 步通过工业真空干燥工艺，干燥温度为56'C,获得毛蕊花糖苷单体化合物的干燥物；经分析测定，所 收获的干燥物中(以干物质计)，毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量为87.2%。
实施例六
1、 挑选置于库温为l(TC的工业冷藏库保鲜的新鲜肉苁蓉肉质茎，置于水洗槽中用冷水漂洗，冷水 水温为8'C，捞起后，置于工业破碎碾磨装置中将肉苁蓉肉质茎破碎碾磨，加入经预冷至水温为l(TC 的工业纯净水洗涤破碎细胞成为肉苁蓉破碎细胞浆状物，水的加入量为破碎细胞重量的200%;然后采 用工业压滤机压滤，获取肉苁蓉细胞浆液；并将滤渣再加入经预冷至水温为l(TC的工业纯净水，水的 加入量为滤渣重量的100%,经通常工业破碎碾磨机进一步碾磨成浆状物，再经工业压滤机压滤分离进 一步获取肉苁蓉细胞浆液；经检测，破碎碾磨和分离工艺过程肉苁蓉破碎细胞浆状物及细胞浆液温度 为12°C;
2、 通过工业加热装置将肉苁蓉细胞浆液进行高温灭酶，温度为100'C，时间为4min;将灭酶后的 肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，采用通常工业生产中的离子吸附法IRC-120作为吸附剂的固定方 式，获得植物水解复合酶固定化酶作为生物催化剂，经通常工业搅拌罐式反应器进行间断式催化反应，催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蕊花糖苷单体化合物； 催化反应过程温度为48'C， pH为4.9，催化反应时间为6h，催化反应过程反应物中的p-葡萄糖苷酶活 力为100U/g;经检测，底物中松果菊苷转化为毛蕊花糖苷单体化合物的转化率达84.2%;
3、 将上述催化反应后的反应液采用相对分子质量为4000的中空纤维超滤膜分离，再采用相对分 子质量为200的纳滤膜进行纳滤，然后采用X-5型的工业大孔吸附树脂进行吸附分离，并经工业层析 柱分离纯化工艺进一步分离提纯，获得较高纯度的毛蕊花糖苷单体化合物提取液；
4、 将上述提取液通过工业薄膜蒸发浓縮工艺，温度为70°C，获得固形物含量为38%的浓縮物； 进一步通过工业滚筒干燥工艺，干燥温度为60'C，获得毛蕊花糖苷单体化合物的干燥物；经分析测定， 所收获的干燥物中(以干物质计)，毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量为76.2%。
实施例七
1、 挑选置于库温为4'C的工业冷藏库保鲜的新鲜肉苁蓉肉质茎，置于水洗槽中用冷水漂洗，冷水 水温为15'C，捞起后，置于工业破碎碾磨装置中将肉苁蓉肉质茎破碎碾磨，加入工业纯净水洗涤破碎 细胞成为肉苁蓉破碎细胞桨状物，水的加入量为破碎细胞重量的100%;然后采用工业压滤机压滤，获 取肉苁蓉细胞浆液；经检测，破碎碾磨和分离工艺过程肉苁蓉破碎细胞浆状物及细胞浆液温度为19'C;
2、 通过工业微波加热装置将肉苁蓉细胞浆液进行高温灭酶，温度为95'C,时间为4min;将灭酶 后的肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，采用通常工业生产中的物理吸附法羟基磷灰石作为吸附剂的 固定方式，获得(3-葡萄糖苷酶固定化酶作为生物催化剂，经通常固定化床反应器进行连续式催化反应， 催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蕊花糖苷单体化合物； 催化反应过程温度为52'C， pH为4.8，每批次催化反应时间为7h，连续进行催化反应11批次，催化 反应过反应物中的(3-葡萄糖苷酶活力为900U/g;经检测，底物中松果菊苷转化为毛蕊花糖苷单体化合 物的转化率达83.4%;
3、 将上述催化反应后的反应液采用相对分子质量为2000的超滤膜分离，再采用相对分子质量为 250的纳滤膜进行纳滤，并经工业层析柱分离纯化工艺进一步分离提纯；获得较高纯度的毛蕊花糖苷单 体化合物提取液；
4、 将上述提取液通过工业真空浓縮工艺，温度为60'C，获得固形物含量为40%的浓縮物；进一 步通过工业真空干燥工艺，干燥温度为58'C，获得毛蕊花糖苷单体化合物的干燥物；经分析测定，所 收获的干燥物中(以干物质计)，毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量为65.4%。
实施例八
1、挑选置于库温为8'C的工业冷藏库保鲜的新鲜肉苁蓉肉质茎，置于水洗槽中用冷水漂洗，冷水 水温为14°C，捞起后，置于工业破碎碾磨装置中将肉苁蓉肉质茎破碎碾磨，加入经预冷至水温为6'C 的工业纯净水洗涤破碎细胞成为肉苁蓉破碎细胞浆状物，水的加入量为破碎细胞重量的300%;然后采 用工业离心机分离，获取肉苁蓉细胞浆液；并再将滤渣分别经2次加入工业纯净水，经通常工业破碎 碾磨机进一步碾磨成浆状物，再经工业离心机分离进一步获取肉灰蓉细胞浆液；经检测，破碎碾磨和分离工艺过程肉苁蓉破碎细胞浆状物及细胞浆液温度为14°C;
2、 通过工业加热装置将肉苁蓉细胞浆液进行高温灭酶，温度为10(TC，时间为3min;将灭酶后的 肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，采用通常工业生产中的离子吸附法DEAE-纤维素作为吸附剂的固 定方式，获得纤维素酶固定化酶作为生物催化剂，经通常流化床反应器进行连续式催化反应，催化水 解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蕊花糖苷单体化合物；催化反 应过程温度为53'C， pH为5.2，每批次催化反应时间为8h,连续进行催化反应7批次，催化反应过程 反应物中的(3-葡萄糖苷酶活力为22U/g;经检测，底物中松果菊苷转化为毛蕊花糖苷单体化合物的转 化率达69.3%;
3、 将上述催化反应后的反应液采用相对分子质量为4000的超滤膜分离，再采用相对分子质量为 300的纳滤膜进行纳滤，然后采用R-A型的工业大孔吸附树脂进行吸附分离；获得较高纯度的毛蕊花 糖苷单体化合物提取液；
4、 将上述提取液通过工业薄膜蒸发浓縮工艺，温度为6(TC，获得固形物含量为40%的浓縮物； 进一步通过工业滚筒干燥工艺，干燥温度为65'C,获得毛蕊花糖苷单体化合物的干燥物；经分析测定， 所收获的干燥物中(以干物质计)，毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量为52.2%。
实施例九
1 、挑选置于库温为-36'C的工业冷冻库冷藏的新鲜肉苁蓉肉质茎，置于水洗槽中用工业纯净水漂 洗，捞起后，置亍工业破碎碾磨装置中将肉苁蓉肉质茎破碎碾磨，加入工业纯净水洗涤破碎细胞成为 肉苁蓉破碎细胞浆状物，水的加入量为破碎细胞重量的200%;然后采用工业压滤机压滤，获取肉苁蓉 细胞浆液；经检测，破碎碾磨和分离工艺过程肉苁蓉破碎细胞浆状物及细胞浆液温度为irC;
2、 通过工业加热装置将肉苁蓉细胞浆液进行高温灭酶，温度为10(TC,时间为8min;将灭酶后的 肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，采用通常工业生产中的离子吸附法DEAE-葡聚糖凝胶作为吸附剂 的固定方式，获得p-葡萄糖苷酶固定化酶作为生物催化剂，经通常固定化床反应器进行连续式催化反 应，催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蕊花糖苷单体化合 物；催化反应过程温度为4(TC， pH为4.6,每批次催化反应时间为4.5h,连续进行催化反应13批次， 催化反应过程反应物中的(3-葡萄糖苷酶活力为21U/g;经检测，底物中松果菊苷转化为毛蕊花糖苷单 体化合物的转化率达65.6%;
3、 将上述催化反应后的反应液采用相对分子质量为3500的超滤膜分离，再采用相对分子质量为 250的纳滤膜进行纳滤；获得毛蕊花糖苷单体化合物提取液；
4、 将上述提取液通过工业真空浓縮工艺，温度为60'C，获得固形物含量为38°/。的浓缩物；进一 步通过工业喷雾干燥工艺，干燥塔进风温度为1S5'C，获得毛蕊花糖苷单体化合物的粉状物；经分析测 定，所收获的粉状物中(以干物质计)，毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量为50%。
实施例十
1、挑选置于库温为13'C的工业冷藏库保鲜的新鲜肉苁蓉肉质茎，置于水洗槽中用冷水漂洗，冷水水温为6'C，捞起后，置于工业破碎碾磨装置中将肉苁蓉肉质茎破碎碾磨，加入经预冷至水温为4'C的 工业纯净水洗涤破碎细胞成为肉苁蓉破碎细胞浆状物，水的加入量为破碎细胞重量的100%;然后采用 ]::业离心机分离，获取肉苁蓉细胞浆液；并再将滤渣加入工业纯净水，水的加入量为滤渣重量的100 %,经通常工业破碎碾磨机进一步碾磨成浆状物，再经工业离心机分离进一步获取肉苁蓉细胞浆液； 经检测，破碎碾磨和分离工艺过程肉欢蓉破碎细胞浆状物及细胞浆液温度为18°C;
2、 将上述获得的肉苁蓉细胞桨液进行工业超高温瞬时灭酶，温度为138°C;将灭酶后的肉苁蓉细 胞浆液作为催化反应底物，采用通常工业生产中的离子吸附法IR-120作为吸附剂的固定方式，获得(3-葡萄糖苷酶固定化酶作为生物催化剂，经通常工业搅拌罐式反应器进行间断式催化反应，催化水解去 掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蕊花糖苷单体化合物；催化反应过 程温度为60°C， pH为4.8，催化反应时间为4h,催化反应过程反应物中的(3-葡萄糖苷酶活力为500U/g; 经检测，底物中松果菊苷转化为毛蕊花糖苷单体化合物的转化率达78%;
3、 将上述催化反应后的反应液采用相对分子质量为1500的超滤膜分离，再采用SP大孔树脂吸附 分离提纯，并经相对分子质量为300的纳滤膜进行纳滤，获得较高纯度的毛蕊花糖苷单体化合物提取 液；
4、 将上述提取液通过工业薄膜蒸发浓縮工艺，温度为55°C，获得固形物含量为42%的浓缩物； 进一步通过工业滚筒干燥工艺，干燥温度为59'C，获得毛蕊花糖苷单体化合物的干燥物；经分析测定， 所收获的干燥物中(以干物质计)，毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量为50.2%。
1权利要求
1.一种利用新鲜肉苁蓉原料经生物催化转化生产毛蕊花糖苷单体化合物的方法，通过细胞破碎、浆液提取工艺及高温灭酶或超高温瞬时灭酶工艺处理，将灭酶后的肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，以β-葡萄糖苷酶工业酶制剂固定化酶作为生物催化剂，催化水解底物松果菊苷使葡萄糖基配体末端断裂、定向转化为高活性的毛蕊花糖苷单体化合物；再通过分离提纯工艺，及浓缩、干燥工艺，收获毛蕊花糖苷单体化合物；催化反应过程温度为38℃～60℃，pH为4.0～5.8，时间为4h～8h，催化反应过程反应物中的β-葡萄糖苷酶活力为2U/g～1000U/g。
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征是该方法的具体步骤包括(1) 挑选新鲜肉苁蓉肉质茎，置于水洗槽中用冷水或工业纯净水漂洗；捞起后，置于通常工业破 碎碾磨装置中将肉灰蓉肉质茎破碎碾磨，加入工业纯净水或经预冷的工业纯净水洗涤破碎细胞成为肉 苁蓉破碎细胞浆状物；然后采用通常工业压滤机压滤或工业离心机分离，获取肉苁蓉细胞浆液；将破 碎碾磨和分离工艺过程肉苁蓉破碎细胞浆状物控制在2(TC以下低温环境；(2) 通过通常工业加热装置将步骤1得到的肉苁蓉细胞浆液进行高温灭酶或超高温瞬时灭酶；将 灭酶后的肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，采用通常固定化酶工业生产中的吸附法固定方式，获得 的(3-葡萄糖苷酶工业酶制剂固定化酶作为生物催化剂，经通常工业固定化酶反应器进行催化反应，催 化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配体末端的一个葡萄糖基、定向转化为毛蓝花糖苷单体化合物；催 化反应过程温度为38°C 60°C， pH为4.0 5.8，时间为4h 8h，催化反应过程反应物中的(3-葡萄糖 苷酶活力为2U/g 1000U/g;(3) 将经步骤2反应后的反应液，采用通常工业超滤膜分离，选择性筛分及截留除去多糖、蛋白 质大分子杂质以及微粒和亚微粒杂质；再采用通常工业纳滤膜分离，选择性筛分及截留除去氨基酸、 D-甘露醇、甜菜碱小分子杂质；获得毛慈花糖苷单体化合物提取液；(4) 将步骤3获得的毛蕊花糖苷单体化合物提取液，通过通常工业真空浓縮工艺或工业薄膜蒸发 浓縮工艺，获得固形物含量为30% 50%的浓縮物；再通过工业喷雾干燥工艺，或通常的其它工业干 燥方法，获得毛蕊花糖苷单体化合物的粉状物或干燥物。
3. 按照权利要求1或2所述的方法，其特征是催化反应过程温度为42'C 48'C; pH为4.5 5.3; 时间为为5h 6h，催化反应过程反应物中的p-葡萄糖苷酶活力为25U/g 150U/g。
4. 按照权利要求2所述的方法，其特征是步骤(1)中再将滤渣经一次至数次加入工业纯净水或 经预冷的工业纯净水， 一次至数次经通常工业破碎碾磨机进一步碾磨成浆状物，再经:工:业压滤机压滤 或工业离心机分离进一步获取肉灰蓉细胞浆液。
5. 按照权利要求2所述的方法，其特征是步骤(1)中所述的水洗槽中的冷水水温为TC 2(TC。
6. 按照权利要求2或4所述的方法，其特征是步骤(1)中所述的加入工业纯净水或经预冷的工 业纯净水的量每次为肉苁蓉破碎细胞或滤渣重量的100% 400%，经预冷的工业纯净水水温为1'C 2crc。
7. 按照权利要求1或2所述的方法，其特征是所述的p-葡萄糖苷酶工业酶制剂，包括卩-葡萄糖苷 酶、纤维素酶、植物提取复合酶或/和植物水解复合酶。
8. 按照权利要求1或2所述的方法，其特征是所述的高温灭酶温度为75'C 10(TC，时间为3min lOmin;超高温瞬时灭酶温度为135°C 141°C。
9. 按照权利要求2所述的方法，其特征是步骤(2)中所述的超滤膜的相对分子质量为1000 4500， 纳滤膜相对分子质量为200 300。
10. 按照权利要求2所述的方法，其特征是步骤(3)中再采用通常工业大孔树脂吸附分离工艺， 或/和采用通常工业层析柱分离纯化工艺，或/和采用通常模拟移动床色谱分离系统工艺或通常多功能色 谱分离工艺进一步分离纯化。
11. 按照权利要求2所述的方法，其特征是步骤(4)中所述的工业真空浓縮工艺或工业薄膜蒸发 浓縮工艺的温度为42。C 8(TC;工业喷雾干燥工艺的干燥塔进风温度为125'C 285'C;其它工业干燥 的方法的干燥温度为5(TC 10(TC。
全文摘要
本发明提出一种新鲜肉苁蓉经生物催化转化生产毛蕊花糖苷的方法。本发明方法利用新鲜肉苁蓉为原料，通过细胞破碎、浆液提取等系统工艺及高温灭酶工艺处理，将灭酶后的肉苁蓉细胞浆液作为催化反应底物，通过β-葡萄糖苷酶工业酶制剂固定化酶作为生物催化剂，进行间断式或连续式催化反应，催化水解底物中的松果菊苷使其葡萄糖基配体末端断裂、定向转化为高活性的毛蕊花糖苷单体化合物，再通过分离提纯工艺及浓缩、干燥工艺，收获毛蕊花糖苷单体化合；通过调整分离提纯工艺条件，收获的毛蕊花糖苷单体化合物纯度百分比含量可达50％～90％。毛蕊花糖苷单体化合物具有小分子和低极性的特征，在药物吸收中展示良好的吸收率和特殊的药理活性。
文档编号C12P19/00GK101629201SQ200910041649
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月4日 优先权日2009年8月4日
发明者昕 刘, 刘小卓, 励 古, 青 季, 招淑燕, 卉 曹, 熊文婷, 田晓玲 申请人:中山大学;新疆学者医药有限公司;广州绿色盈康生物工程有限公司