专利名称：一种基于纳米金棒荧光猝灭效应的微流芯片核酸传感方法
技术领域：
本发明属于光子学、材料化学及生物医学工程交叉技术领域，具体涉及一种基于
纳米金棒荧光猝灭效应的微流芯片核酸传感方法。
背景技术：
生物光子学、纳米光子学是近些年新兴的交叉领域学科，将光学方法中无损、快 速、实时探测的优势应用于生命科学及医学领域，同时结合纳米材料技术，降低器件的体积 及成本，从而实现十分微量的生物分子传感探测。将具有特殊光学特性的纳米金棒材料应 用于微流控芯片中，并采用荧光猝灭的方法通过激光扫描光学探测手段进行对DNA/RNA的 探测技术为制作出低成本、高效率、快速实时的生物基因分析芯片提供了可能。
传统的基因芯片常采用将同位素标记或荧光标记探针固定在芯片中的方法，通过 放射影像或荧光强度探测判断核酸序列。这些方法对基因探针制作要求比较高，其芯片制 作成本也较高，探针固定难度较大，结构复杂。采用纳米材料荧光猝灭方法制作的传感芯 片，利用纳米材料方便了核酸的固定，并且荧光猝灭效应其敏感度更高。纳米材料同微流芯 片的结合更减少了样品及探针的用量，降低成本，简化器件结构。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术不足，利用纳米金棒材料快捷方便连接核酸的能 力及其高效的荧光猝灭效应，提出了一种探测DNA杂交的方法。
本发明的方法包括以下步骤 步骤(1)、在微流通道中固定纳米金棒。具体方法是将制作好的纳米金棒溶液以 摩尔比例(1 : 90 110)同牛血清蛋白(BSA)混合搅拌反应1 2小时，静置10 12个 小时完成反应。将反应后的纳米金棒溶液加入微流通道样品池中，使该溶液充满整个微流 通道并静置1 2个小时。连接了牛血清蛋白的纳米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用 而固定在玻璃基底制成的微流通道中。随后用清水冲洗微流通道一次，以去除多余未固定 的纳米金棒。 步骤(2)、待测DNA单链或RNA分子同纳米金棒的连接。具体方法是将未经过任 何标记修饰的待测DNA单链或RNA分子溶液加入微流通道样品池中，使其缓慢通过微流通 道。由于合成的纳米金棒表面包覆物具有强正电性，待测DNA单链或RNA分子可以快速地 连接并附着在纳米金棒表面，并改变纳米金棒的表面电性趋于中性。随后用清水冲洗微流 通道一次，以去除多余的核酸分子。 步骤(3)、将连接有不同寡核苷酸序列的荧光染剂分别加入各微流通道的样品池， DNA杂交缓冲液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入缓冲液池，让荧光染剂和DNA杂交缓 冲液混合流入微流通道，反应0. 5 1. 5个小时。当纳米金棒上的待测DNA单链或RNA分 子序列与该通道中流过的对应寡核苷酸序列互补时，寡核苷酸将与此序列发生杂交，从而 使连接寡核苷酸的荧光染剂在空间距离上靠近纳米金棒，由于纳米金棒高效的荧光猝灭特性，荧光染剂的荧光将被纳米金棒猝灭；而如果纳米金棒上的待测DNA单链或RNA分子序列 与该通道中流过的对应寡核苷酸序列没有互补时，杂交过程不发生，荧光染剂仍可发出明 显的荧光信号。 步骤(4)、将完成反应的微流通道芯片置于激光扫描探测样品台，开启半导体激光 光源，软件控制其扫描过程，每次扫描激光光束通过显微物镜聚焦在微流通道中心位置，通 过激光光束扫描逐条微流通道，由CCD接收每次扫描的各微流通道中荧光信号强度，予以 记录，从而完成对DNA/RNA序列片段的传感侦测。 本发明方法采用纳米金棒材料作为荧光猝灭剂，利用其十分高效的荧光猝灭作 用，同时由于水溶液合成纳米金棒方法简单方便，其材料表面的强正电性有助于核酸的快 速连接；纳米金棒其纳米结构使得传感探测过程微量化，大大地降低了成本同时提高了探 测的敏感度，十分适用于微流控芯片这种结构微型化探测微量分子的器件。结合纳米材料 技术在微流控芯片中的应用，采用激光扫描探测荧光猝灭这种新型的光学手段进行核酸的 传感侦测，有着极大的技术发展应用空间和广阔的市场前景。
图1为荧光猝灭原理示意图；
图2为光学探测装置结构示意图。
具体实施例方式
实施例中实现本发明方法所采用的装置1、多通道微流控芯片。以标准载玻片玻 璃为基底，刻蚀10条50微米宽、50微米深的通道槽，每个通道间距1毫米，随后采用玻璃 键合的方法密封通道，每条通道有样品池、缓冲液池及废液池三个开孔，微流通道经过预处 理后由压电微阀控制其液流方向及速度。2、激光扫描及荧光探测显微光学装置。装置采用 470纳米半导体激光器，激发光功率为5微瓦，水平方向横向和纵向的扫描装置是由两块振 镜控制完成的，振镜的扫描速度和幅度由软件控制。激发光通过在一片二色镜反射，由10 倍物镜聚焦在样品上，样品发出的荧光通过物镜采集，透射过二色镜并通过荧光波长带通 滤波片，在CCD接收记录荧光信号，CCD上不同位置的光点明暗强度对应不同扫描微流通道 中的荧光剂荧光强度。
实施例(一) —种基于纳米金棒荧光猝灭效应的微流芯片核酸传感方法包括如下步骤
步骤(1)、在微流通道中固定纳米金棒。具体方法是将制作好的纳米金棒溶液以 摩尔比例(1 : 90)同牛血清蛋白(BSA)混合搅拌反应1小时，静置10个小时完成反应。将 反应后的纳米金棒溶液加入微流通道样品池中，使该溶液充满整个微流通道并静置1个小 时。连接了牛血清蛋白的纳米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用而固定在玻璃基底制成 的微流通道中。随后用清水冲洗微流通道一次，以去除多余未固定的纳米金棒。
步骤(2)、待测DNA单链或RNA分子同纳米金棒的连接。具体方法是将未经过任 何标记修饰的待测DNA单链或RNA分子溶液加入微流通道样品池中，使其缓慢通过微流通 道。由于合成的纳米金棒表面包覆物具有强正电性，待测DNA单链或RNA分子可以快速地 连接并附着在纳米金棒表面，并改变纳米金棒的表面电性趋于中性。随后用清水冲洗微流通道一次，以去除多余的核酸分子。 步骤(3)、将连接有不同寡核苷酸序列的荧光染剂分别加入各微流通道的样品池， DNA杂交缓冲液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入缓冲液池，让荧光染剂和DNA杂交缓 冲液混合流入微流通道，反应0. 5个小时。当纳米金棒上的待测DNA单链或RNA分子序列 与该通道中流过的对应寡核苷酸序列互补时，寡核苷酸将与此序列发生杂交，从而使连接 寡核苷酸的荧光染剂在空间距离上靠近纳米金棒，由于纳米金棒高效的荧光猝灭特性，荧 光染剂的荧光将被纳米金棒猝灭；而如果纳米金棒上的待测DNA单链或RNA分子序列与该 通道中流过的对应寡核苷酸序列没有互补时，杂交过程不发生，荧光染剂仍可发出明显的 荧光信号。 步骤(4)、将完成反应的微流通道芯片置于激光扫描探测样品台，开启半导体激光 光源，软件控制其扫描过程，每次扫描激光光束通过显微物镜聚焦在微流通道中心位置，通 过激光光束扫描逐条微流通道，由CCD接收每次扫描的各微流通道中荧光信号强度，予以 记录，从而完成对DNA/RNA序列片段的传感侦测。
实施例(二 ) —种基于纳米金棒荧光猝灭效应的微流芯片核酸传感方法包括如下步骤
步骤(1)、在微流通道中固定纳米金棒。具体方法是将制作好的纳米金棒溶液以 摩尔比例(1 : 100)同牛血清蛋白(BSA)混合搅拌反应1.5小时，静置11个小时完成反 应。将反应后的纳米金棒溶液加入微流通道样品池中，使该溶液充满整个微流通道并静置 1.5个小时。连接了牛血清蛋白的纳米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用而固定在玻璃 基底制成的微流通道中。随后用清水冲洗微流通道一次，以去除多余未固定的纳米金棒。
步骤(2)、待测DNA单链或RNA分子同纳米金棒的连接。具体方法是将未经过任 何标记修饰的待测DNA单链或RNA分子溶液加入微流通道样品池中，使其缓慢通过微流通 道。由于合成的纳米金棒表面包覆物具有强正电性，待测DNA单链或RNA分子可以快速地 连接并附着在纳米金棒表面，并改变纳米金棒的表面电性趋于中性。随后用清水冲洗微流 通道一次，以去除多余的核酸分子。 步骤(3)、将连接有不同寡核苷酸序列的荧光染剂分别加入各微流通道的样品池， DNA杂交缓冲液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入缓冲液池，让荧光染剂和DNA杂交缓 冲液混合流入微流通道，反应1个小时。当纳米金棒上的待测DNA单链或RNA分子序列与 该通道中流过的对应寡核苷酸序列互补时，寡核苷酸将与此序列发生杂交，从而使连接寡 核苷酸的荧光染剂在空间距离上靠近纳米金棒，由于纳米金棒高效的荧光猝灭特性，荧光 染剂的荧光将被纳米金棒猝灭；而如果纳米金棒上的待测DNA单链或RNA分子序列与该通 道中流过的对应寡核苷酸序列没有互补时，杂交过程不发生，荧光染剂仍可发出明显的荧 光信号。 步骤(4)、将完成反应的微流通道芯片置于激光扫描探测样品台，开启半导体激光 光源，软件控制其扫描过程，每次扫描激光光束通过显微物镜聚焦在微流通道中心位置，通 过激光光束扫描逐条微流通道，由CCD接收每次扫描的各微流通道中荧光信号强度，予以 记录，从而完成对DNA/RNA序列片段的传感侦测。
实施例(三) —种基于纳米金棒荧光猝灭效应的微流芯片核酸传感方法包括如下步骤
步骤(1)、在微流通道中固定纳米金棒。具体方法是将制作好的纳米金棒溶液以 摩尔比例(1 : 110)同牛血清蛋白(BSA)混合搅拌反应2小时，静置12个小时完成反应。 将反应后的纳米金棒溶液加入微流通道样品池中，使该溶液充满整个微流通道并静置2个 小时。连接了牛血清蛋白的纳米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用而固定在玻璃基底制 成的微流通道中。随后用清水冲洗微流通道一次，以去除多余未固定的纳米金棒。
步骤(2)、待测DNA单链或RNA分子同纳米金棒的连接。具体方法是将未经过任 何标记修饰的待测DNA单链或RNA分子溶液加入微流通道样品池中，使其缓慢通过微流通 道。由于合成的纳米金棒表面包覆物具有强正电性，待测DNA单链或RNA分子可以快速地 连接并附着在纳米金棒表面，并改变纳米金棒的表面电性趋于中性。随后用清水冲洗微流 通道一次，以去除多余的核酸分子。 步骤(3)、将连接有不同寡核苷酸序列的荧光染剂分别加入各微流通道的样品池， DNA杂交缓冲液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入缓冲液池，让荧光染剂和DNA杂交缓 冲液混合流入微流通道，反应1. 5个小时。当纳米金棒上的待测DNA单链或RNA分子序列 与该通道中流过的对应寡核苷酸序列互补时，寡核苷酸将与此序列发生杂交，从而使连接 寡核苷酸的荧光染剂在空间距离上靠近纳米金棒，由于纳米金棒高效的荧光猝灭特性，荧 光染剂的荧光将被纳米金棒猝灭；而如果纳米金棒上的待测DNA单链或RNA分子序列与该 通道中流过的对应寡核苷酸序列没有互补时，杂交过程不发生，荧光染剂仍可发出明显的 荧光信号。 步骤(4)、将完成反应的微流通道芯片置于激光扫描探测样品台，开启半导体激光 光源，软件控制其扫描过程，每次扫描激光光束通过显微物镜聚焦在微流通道中心位置，通 过激光光束扫描逐条微流通道，由CCD接收每次扫描的各微流通道中荧光信号强度，予以 记录，从而完成对DNA/RNA序列片段的传感侦测。
以下对本发明内容作进一步说明。 如图1所示，基于纳米金棒荧光猝灭效应的DNA传感的原理结构是将纳米金棒8 表面修饰牛血清蛋白7，利用牛血清蛋白7的物理粘附能力将纳米金棒8固定于微流芯片 通道2中。未知待测核酸分子4注入微流通道，由于纳米金棒表面强正电性，待测核酸分子 4吸附于纳米金棒8表面。连接有荧光染剂6的A序列的寡核苷酸3和B序列的寡核苷酸 5(A与B为两种不同序列的寡核苷酸)随同缓冲液一起分别注入不同通道的微流管。杂交 反应发生后，寡核苷酸3与待测DNA单链或RNA分子中某片段因序列互补而杂交，导致荧光 染剂6与纳米金棒8空间距离很近，在激发光1的激励下，荧光染剂6发出的荧光被猝灭； 寡核苷酸5与待测DNA单链或RNA分子中没有互补序列片段，不能发生杂交，因而荧光染剂 6距离纳米金棒8的空间距离比较远，在激发光1的激励下，荧光染剂6发出明显的荧光信 号9。 如图2所示，半导体激光光源发出470纳米5微瓦的激光光束，经过二色镜，发射 后通过横向振镜10进行横向扫描，横向振镜10每扫描摆动一下光束聚焦点由一条微流通 道移到相邻的另一条微流通道，实现不同微流通道的快速扫描；纵向振镜11实现纵向扫 描，在横向振镜10完成一次完整横向扫描后，纵向振镜11摆动一次，实现同条微流通道中 不同位置的扫描探测，起多次测量保证准确度、降低误差的作用。激励光束经过两个振镜后
通过io倍的显微物镜聚焦在微流芯片的微流通道上，微流通道中产生的荧光同样由显微物镜收集，激励光与产生荧光为同一光路，荧光信号透射过二色镜后，经由带通滤波片，最 后在CCD上进行接收记录。 微流芯片上的微流通道管有三处开孔，分别为样品池，缓冲液池及废液池。
权利要求
一种基于纳米金棒荧光猝灭效应的微流芯片核酸传感方法，其特征在于该方法包括如下步骤步骤(1)、在微流通道中固定纳米金棒，具体方法是将制作好的纳米金棒溶液以摩尔比例1∶90～110同牛血清蛋白混合搅拌反应1～2小时，静置10～12个小时完成反应；将反应后的纳米金棒溶液加入微流通道样品池中，使该溶液充满整个微流通道并静置1～2个小时；随后用清水冲洗微流通道一次；步骤(2)、待测DNA单链或RNA分子同纳米金棒的连接，具体方法是将未经过任何标记修饰的待测DNA单链或RNA分子溶液加入微流通道样品池中，使其缓慢通过微流通道；合成的纳米金棒表面包覆物具有强正电性，待测DNA单链或RNA分子可以快速地连接并附着在纳米金棒表面，并改变纳米金棒的表面电性趋于中性；随后用清水冲洗微流通道一次；步骤(3)、将连接有不同寡核苷酸序列的荧光染剂分别加入各微流通道的样品池，DNA杂交缓冲液加入缓冲液池，让荧光染剂和DNA杂交缓冲液混合流入微流通道，反应0.5～1.5个小时；当纳米金棒上的待测DNA单链或RNA分子序列与该通道中流过的对应寡核苷酸序列互补时，寡核苷酸将与此序列发生杂交，从而使连接寡核苷酸的荧光染剂在空间距离上靠近纳米金棒，由于纳米金棒高效的荧光猝灭特性，荧光染剂的荧光将被纳米金棒猝灭；而如果纳米金棒上的待测DNA单链或RNA分子序列与该通道中流过的对应寡核苷酸序列没有互补时，杂交过程不发生，荧光染剂仍可发出明显的荧光信号；步骤(4)、将完成反应的微流通道芯片置于激光扫描探测样品台，开启半导体激光光源，控制其扫描过程，每次扫描激光光束通过显微物镜聚焦在微流通道中心位置，通过激光光束扫描逐条微流通道，由CCD接收每次扫描的各微流通道中荧光信号强度，予以记录，从而完成对DNA/RNA序列片段的传感侦测。
全文摘要
本发明涉及一种基于纳米金棒荧光猝灭效应的微流芯片核酸传感方法。传统方法对探针要求高，制作成本高。本发明首先将纳米金棒固定在微流通道中，其次将待测核酸分子溶液加入微流通道样品池中使其缓慢通过微流通道，然后将连接有不同寡核苷酸序列的荧光染剂分别加入各微流通道的样品池，DNA杂交缓冲液加入缓冲液池，让连接有寡核苷酸序列的荧光染剂和DNA杂交缓冲液混合流入微流通道，反应0.5～1.5个小时。最后将微流通道芯片置于激光扫描探测样品台，扫描的各微流通道中荧光信号强度，完成对DNA/RNA序列片段的传感侦测。本发明方法降低了成本同时提高了探测的敏感度，适用于微流控芯片这种结构微型化探测微量分子的器件。
文档编号C12Q1/68GK101709327SQ20091015512
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月2日 优先权日2009年12月2日
发明者何赛灵, 李心, 钱骏 申请人:浙江大学