专利名称：可用于保护肝脏及/或降脂肪的枇杷叶细胞的萃取物及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明是关于枇杷叶细胞的萃取物于保护肝脏及/或降脂肪的应用，以及该萃取 物的制备方法。
背景技术：
枇杷的学名为Eriobotrya japonica，中文古名为芦橘，又名金丸或芦枝，其是蔷 薇科中的苹果亚科的一个属，为常绿小乔木。目前研究显示枇杷叶具有降低体脂肪、抗发 炎、抗肿瘤、降血糖及改善异常代谢的疗效，相关说明可参考日本专利公开第2006104182 号，其内容并于此处以供参考。此外，业经文献确认，枇杷叶中的三萜酸(triterpene acid)成分具有抗发炎 及抗肿瘤的活性(请参考Biol. Pharm. Bull. 28 (10)，1995-1999 (2005))；于美国专利US 6，908，632B1中，揭露枇杷萃取物中的科罗索酸(corosolic acid，为一种三萜酸)具有调 控血糖的功能。由上述文献可知，枇杷中的三萜酸成分对于许多疾病皆具有疗效。经发现，除枇杷之外，三萜酸(例如委陵菜酸(tormentic acid)、山香二烯 酸(hyptadienic acid)、山楂酸(maslinic acid)及科罗索酸等)亦可自其它植物中 获得，且具其它生物活性。举例来说，于美国专利US 6，784，206B2中，教示大花紫薇 (Lagerstroemia speciosa)或巴拿巴(Banaba)叶中的科罗索酸可应用于减肥及调控血 糖；倭客木科(Vochysia divergens)中的委陵菜酸成分可用以减缓神经性或发炎性疼痛 (请参考 European Journal of Pharmacology, 453 (2002), 203-208)；此外，山楂酸则具有 降血糖的效用(请参考 Biol. Pharm. Bull. 30 (11) 2075-2078 (2007))。尽管三萜酸可自不同植物中萃取而得，但其于天然植物中的含量极低，若欲自天 然植物中制得三萜酸，以因应市场需求，则必须种植大量的植物，且需要繁复的纯化步骤及 使用大量的溶剂、活性碳与纯化树脂，从而增加制造成本。业界已积极研发制备三萜酸的方法，例如利用组织培养枇杷叶细胞的方式(请 参考Wiytochemistry，59，315-323 (2002))，但其提升三萜酸含量的效果有限。于WO 2007/004827A1中，则教示一种制备科罗索酸的方法，其是以二阶段培养枇杷叶或大花紫薇 叶细胞的方式，获得高含量的科罗索酸。然而，该方法须先筛选具有高产能的细胞株，并于 培养液中添加诱导剂，且须经二阶段的培养步骤，不但工艺相当复杂且制造成本高，而且仅 能提升科罗索酸的含量，而无益于其它三萜酸含量的提升。因此，一种可方便且大量地生产 三萜酸的方法是迫切需要的。本发明是针对上述需求所为的研究，本申请发明人通过于枇杷叶细胞的培养液 中，添加枇杷叶细胞萃余物的方式，可大幅提升培养所得枇杷叶细胞的三萜酸的含量。此 外，本申请发明人另发现，枇杷叶细胞的萃取物具有保护肝脏的效果，且萃取物中的委陵菜 酸与山香二烯酸活性成分亦可用于降脂肪。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于保护肝脏的枇杷叶细胞的萃取物，其包含下 式⑴化合物
权利要求
1.-种用于保护肝脏的枇杷叶细胞的萃取物，其包含下式(1)化合物
2.根据权利要求1所述的萃取物，其特征在于，包含一种或多种下列化合物
3.根据权利要求1所述的萃取物，其特征在于，包含下列化合物
4.根据权利要求1所述的萃取物，其特征在于，其用于保护由化学物质所引起的肝损 伤或抑制肝纤维化。
5.根据权利要求4所述的萃取物，其特征在于，该化学物质是四氯化碳、乙醇或硫乙酰胺。
6.根据权利要求1所述的萃取物，其特征在于，包含至少约60重量％的具有式(1)的 化合物，以萃取物的干重计。
7.根据权利要求1所述的萃取物，其特征在于，包含至少约75重量％的具有式(1)的 化合物，以萃取物的干重计。
8.根据权利要求1所述的萃取物，其特征在于，包含至少约80重量％的具有式(1)的 化合物，以萃取物的干重计。
9.根据权利要求1所述的萃取物，其特征在于，包含至少约85重量％的具有式(1)的 化合物，以萃取物的干重计。
10.一种制备根据权利要求1至9中任一项所述的枇杷叶细胞的萃取物的方法，包含a)于一培养液中培养一枇杷叶细胞，其中该培养液包含一枇杷叶细胞萃余物及该枇杷 叶细胞；以及b)萃取步骤a)所培养的枇杷叶细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤a)中的枇杷叶细胞是经以下步骤得到1)取一具有伤口的枇杷种子苗的叶片，并待伤口长出愈伤组织细胞；以及2)取出该愈伤组织细胞并加以培育。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，以该培养液的总量计，步骤a)中的枇杷 叶细胞萃余物的用量为约0. 5ppm至约20ppm。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，以该培养液的总量计，步骤a)中的枇杷 叶细胞萃余物的用量为约Ippm至约5ppm。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其特征在于，步骤a)中的枇杷叶细胞 萃余物是经以下步骤制得I)取一枇杷叶细胞，并使用浓度为约80体积％至约100体积％的乙醇萃取该枇杷叶细胞；II)浓缩步骤I)的经萃取的产物，以获得一第一浓缩物；III)使用浓度为约40体积％至约60体积％的甲醇溶解该第一浓缩物，收集一第一未 溶解部分；以及IV)使用浓度为约70体积％至约95体积％的甲醇溶解该第一未溶解部分，收集一第二 未溶解部分，以制得该枇杷叶细胞萃余物。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤I)中的枇杷叶细胞是经以下步骤 制得1)取一具有伤口的枇杷种子苗的叶片，并待伤口长出愈伤组织细胞；以及2)取出该愈伤组织细胞并加以培育。
16.根据权利要求14所述的方法，其中该步骤I)的乙醇的浓度为约90体积％至约98 体积％，该步骤III)的甲醇的浓度为约45体积％至约55体积％，且该步骤IV)的甲醇的 浓度为约80体积％至约90体积％。
17.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其特征在于，步骤b)包含以下步骤bl)使用浓度为约80体积％至约100体积％的乙醇萃取步骤a)所培养的枇杷叶细胞；b2)浓缩步骤bl)的经萃取的产物，以获得一第二浓缩物；b3)使用浓度为约40体积％至约60体积％的甲醇溶解该第二浓缩物，收集一第三未溶 解部分；b4)使用浓度为约70体积％至约95体积％的甲醇溶解该第三未溶解部分并加以过滤， 收集滤液；以及b5)视需要浓缩该滤液。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，该该步骤bl)的乙醇的浓度为约90体 积％至约98体积％，该步骤b3)的甲醇的浓度为约45体积％至约55体积％，且该步骤b4) 的甲醇的浓度为约80体积％至约90体积％。
19.一种用于保护肝脏的医药组合物，包含一有效量的根据权利要求1至9中任一项所 述的萃取物。
20.根据权利要求19所述的医药组合物，其特征在于，其是用于保护由化学物质所引 起的肝损伤或抑制肝纤维化。
21.根据权利要求20所述的医药组合物，其特征在于，该化学物质是四氯化碳、乙醇或 硫乙酰胺。
22.一种用于保护肝脏的医药组合物，包含一有效量的根据权利要求10至18中任一项 所述的方法所制得的萃取物。
23.根据权利要求22所述的医药组合物，其特征在于，其是用于保护由化学物质所引 起的肝损伤或抑制肝纤维化。
24.根据权利要求23所述的医药组合物，其特征在于，该化学物质是四氯化碳、乙醇或 硫乙酰胺。
25.一种使用根据权利要求1至9中任一项所述的萃取物于制造药剂的应用，其特征在 于，该药剂是用于保护肝脏。
26.根据权利要求25所述的应用，其特征在于，该药剂是用于保护由化学物质所引起 的肝损伤或抑制肝纤维化。
27.根据权利要求沈所述的应用，其特征在于，该化学物质是四氯化碳、乙醇或硫乙酰胺。
28.一种使用根据权利要求10至18中任一项所述的方法所制得的萃取物于制造药剂的应用，其特征在于，该药剂是用于保护肝脏。
29.根据权利要求观所述的应用，其特征在于，该药剂是用于保护由化学物质所引起 的肝损伤或抑制肝纤维化。
30.根据权利要求四的应用，其中该化学物质是四氯化碳、乙醇或硫乙酰胺。
31.一种用于降脂肪及/或保护肝脏的医药组合物，包含有效量的具有下式(4)及/或 式(5)的化合物
32.根据权利要求31所述的医药组合物，其特征在于，该式(4)及式( 的化合物是来 自枇杷叶。
33.根据权利要求31所述的医药组合物，其特征在于，其是用于减肥、治疗高三酸甘油 脂血症、保护由化学物质所引起的肝损伤、或抑制肝纤维化。
34.根据权利要求33所述的医药组合物，其特征在于，该化学物质是四氯化碳、乙醇或 硫乙酰胺。
35.一种用于降脂肪的枇杷叶细胞的萃取物，包含具有下式(4)及/或式(5)的化合物
36.根据权利要求35所述的萃取物，其特征在于，其是用于减肥或治疗高三酸甘油脂血症。
37.根据权利要求35所述的萃取物，其特征在于，包含至少约3重量％的具有式(4)及 /或的化合物，以萃取物的干重计。
38.根据权利要求35所述的萃取物，其特征在于，包含至少约4重量％的具有式(4)的 化合物，以萃取物的干重计。
39.根据权利要求35所述的萃取物，其特征在于，包含至少约5重量％的具有式(4)的 化合物，以萃取物的干重计。
40.根据权利要求35所述的萃取物，其特征在于，包含至少约20重量％的具有式(5) 的化合物，以萃取物的干重计。
41.根据权利要求35所述的萃取物，其特征在于，包含至少约30重量％的具有式(5) 的化合物，以萃取物的干重计。
42.根据权利要求35所述的萃取物，其特征在于，包含至少约40重量％的具有式(5) 的化合物，以萃取物的干重计。
43.一种制备具有下式(4)及/或式(5)的化合物的方法，其特征在于，包含利用根据 权利要求10至18中任一项所述的方法以制备一枇杷叶细胞的萃取物，以及进行一纯化步 骤以得到式⑷及/或式(5)的化合物
44.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，该纯化步骤包含进行一高效能液相层析。
45.一种使用具有下式(4)及/或式(5)的化合物或其医药可接受盐或酯于制造药剂的应用
46.根据权利要求45所述的应用，其特征在于，该药剂是用于减肥、治疗高三酸甘油脂 血症、保护由化学物质所引起的肝损伤、或抑制肝纤维化。
47.根据权利要求45所述的应用，其特征在于，该化学物质是四氯化碳、乙醇或硫乙酰胺。
48.一种使用枇杷叶细胞的萃取物于制造药剂的应用，其特征在于，该萃取物包含具有 下式⑷及/或式(5)的化合物
49.根据权利要求48所述的应用，其特征在于，该药剂是用于减肥或治疗高三酸甘油 脂血症。
全文摘要
本发明是一种可用于保护肝脏及/或降脂肪的枇杷叶细胞的萃取物及其制备方法与用途。该萃取物及其医药组合物包含式(1)化合物该枇杷叶细胞的萃取物可应用于制造药剂。
文档编号C12N5/04GK102048851SQ20091020676
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月9日 优先权日2009年11月9日
发明者何惠雅, 吴金滨, 林文川 申请人:臻里生物科技股份有限公司