专利名称：一种强酸条件下用于afm分析的浸矿杆状细菌的固定方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物固定方法，特别上涉及一种强酸条件下用于AFM分析的浸矿杆状细菌的固定方法。
背景技术：
原子力显微镜(AFM)具有原子级分辨率，可在真空、大气、液体及温控条件下探测，样品可以是导体、非导体，也可以是柔性的、甚至是活体生物样品。它能够表征样品的表面形貌，研究样品的表面性质，在近生理条件下探测分子间作用的动力学过程等，因此AFM受到人们的广泛关注。 AFM主要通过微悬臂上的探针与样品表面的原子相互作用。然而在空气环境中，由于水蒸汽(或者其他气体分子)在针尖和样品表面形成水化膜(或者其他吸附膜)，因此在针尖扫描样品时，针尖-样品间会形成毛细力，毛细力对针尖-样品间的相互作用力有着非常重要的影响。为了消除毛细力的影响，并完全模拟样品的实际环境，常将针尖和样品完全浸于水中(或者其他透明液体中)进行测试。 目前国内外常用戊二醛或者多聚赖氨酸等有机物质来固定游离的生物细胞，用新鲜解离的云母片、玻片或者经过特殊处理的玻片作为基底，最后用接触模式或轻敲模式进行细胞的表面形态观测。但遗憾的是，成像效果还很不理想。这主要是因为细胞膜表面比较柔软，与基底的固定较弱，探针的压力会使探针和细胞表面的接触面积大大增加，从而损伤细胞或造成细胞的漂移。而且这些方法步骤烦琐，增加了操作难度和费用的开支。也有专家用微孔滤膜来固定圆形的生物细胞，但是用滤膜来固定杆状细菌，国内外还没有报道过，而浸矿细菌多为杆状。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简便，经济，而且固定效果高的强酸条件下用于AFM分析的浸矿杆状细菌的固定方法。 为了解决上述技术问题，本发明采用的强酸条件下用于AFM分析的浸矿杆状细菌的固定方法，步骤如下
(1)、过滤器准备 每个直径25毫米的过滤器用纸单个包装，然后常规高压蒸汽灭菌，烘干，备用；
(2)、滤膜准备 将孔径为0. 22微米的滤膜平放于清洁盛器内，用无菌水浸泡，使全部润湿，使用前再用适量无菌水清洗一次；
(3)、制备细菌悬浮液 采用菌浓度为 107个/mL的菌液为过滤液，滤液经过预过滤，以免滤膜堵塞；
(4)、将洗清的湿的滤膜装入过滤器中，过滤器和滤膜没有泄漏；
(5)、过滤
用注射器抽取待过滤液体，装在过滤器进口上，先轻轻推一点点液体，使滤膜湿
润，然后稍用力推进； (6)、原子力显微镜分析。 采用上述技术方案，用于在强酸条件下AFM分析的浸矿杆状细菌的固定方法。采用菌浓度为 107个/mL的菌液为过滤液，孔径为0. 22微米的滤膜(混合纤维素酯微孔滤膜)为固定材料，国产过滤器(直径25毫米)为过滤装置，用一次性医用注射器吸取菌液通过加压过滤。 本发明采用简单的过滤装置就能够把浸矿细菌固定，它结构简单，操作简便，对细菌活性的影响小，无毒性，制得的细菌在PH为2的溶液中细菌漂移率低，固定效果好，稳定性较高，这些大量的降低了工作量和费用，较其它方法更简单易行且针对性强。
图1是本发明的过滤装置结构示意图； 图2是过滤后的滤膜在普通的双目显微镜灯光下显出的轮环；
图3是在普通的双目显微镜下看到的滤膜(图2代表的)。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 实施例1 :固定浸矿细菌氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)
(1)过滤器准备 检查直径25毫米的过滤器2和滤板的边缘和平面有没有毛剌，或不平整的地方已经里面的胶圈，使之平滑。每个过滤器2用纸单个包装，然后常规高压蒸汽灭菌，烘干，备用。 (2)滤膜准备 滤膜为各向同性，不分正反面。将0. 22微米的混合纤维素酯微孔滤膜3(可用与过滤器配套的25毫米的滤膜，也可自己剪成适合大小)平放于清洁盛器内，用无菌水浸泡，使全部润湿，使用前再用适量无菌水清洗一次。
(3)细菌悬浮液制备 原始菌株用无菌的9K培养基培养；pH2.0;12(TC灭菌20min。以Fe2+为培养能源时，添加44. 7g/L的FeS04 7H20 ;以S为培养能源时，添加10g/L硫粉。在30°C ， 170r/min条件下富集培养若干代。 细菌生长到对数生长期时，先用普通定性滤纸过滤。然后，取2mL滤液，在lOOOr/min下离心5min，去除底部固体物，留上清液待用。取适量待用液，用双目显微镜和血球记数板直接记数菌液中的细菌数。菌浓度高于107个/mL —个数量级以上的可稀释后待用。
(4)过滤前准备 将按步骤(2)洗清的湿的0. 22微米的混合纤维素酯微孔滤膜3装入直径25毫米的过滤器2中，检查过滤器2是否有泄漏。用新开启的注射器抽几毫升空气，重新装在过滤器进口处，注入空气，这时就会感到空气反而不能通过过滤器，稍一松手，注射器内芯就会弹回，这就说明过滤器和滤膜没有泄漏。
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(5)过滤 参见图l，因为浸矿细菌不易污染，该方法可在普通台面上操作。用注射器l抽取lmL待过滤菌液，装在过滤器2进口上，先轻轻推一点点液体，使混合纤维素酯微孔滤膜3湿润，然后稍用力推进。过滤完后，稍等3到4分钟，把混合纤维素酯微孔滤膜3取出，再用适量无菌水清洗一次，在滤纸上把多余的水吸掉，滤膜待用。
(6)分析 参见图2和图3，将滤膜的背面(出水面)粘上双面胶，粘于2X2厘米的盖玻片上，再把盖玻片粘在原子力显微镜的操作圆台上，加入适当的灭菌9K，进行表面分析。
权利要求
一种强酸条件下用于AFM分析的浸矿杆状细菌的固定方法，其特征在于步骤如下(1)、过滤器准备直径25毫米的过滤器用纸单个包装，然后常规高压蒸气灭菌，烘干，备用；(2)、滤膜准备将孔径为0.22微米的滤膜平放于清洁盛器内，用无菌水浸泡，使全部润湿，使用前再用适量无菌水清洗一次；(3)、制备细菌悬浮液采用菌浓度为～107个/mL的菌液为过滤液，滤液经过预过滤，以免滤膜堵塞；(4)、将洗清的湿的滤膜装入过滤器中，过滤器和滤膜没有泄漏；(5)、过滤用注射器抽取待过滤液体，装在过滤器进口上，先轻轻推一点点液体，使滤膜湿润，然后稍用力推进；(6)、原子力显微镜分析。
全文摘要
本发明公开了一种强酸条件下用于AFM分析的浸矿杆状细菌的固定方法。本发明采用孔径为0.22微米的滤膜(混合纤维素酯微孔滤膜)为固定材料，国产过滤器(直径25毫米)为过滤装置，用一次性医药注射器通过加压过滤。采用本发明方法固定浸矿细菌在制备过程中，过滤条件和装置对细菌活性的影响小，无毒性，操作简便，制得的细菌在pH为2的溶液中细菌漂移率低，固定效果好，稳定性较高，适用于原子力显微镜(AFM)在强酸条件下分析浸矿细菌。因此本发明可广泛应用于AFM的研究领域，具有良好的应用前景和实用价值。
文档编号C12R1/01GK101718802SQ200910310579
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者周姗, 徐競, 胡岳华, 贺治国, 邱冠周, 顾帼华 申请人:中南大学