口服组合物的制作方法

专利名称：口服组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及口服组合物，其用于诸如非酒精性脂肪性肝炎(被称为“NASH”)的肝炎的预防和治疗中的至少之一。
背景技术：
脂肪肝可伴随有肝炎，从而引起肝硬化。即使不饮酒者也可能具有类似于酒精性 脂肪性肝炎的症状。该症状被称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，并作为新的生活方式相关 疾病而和高血压、糖尿病、高脂血症一起受到关注。随着因转向西方饮食(例如高脂饮食)和缺乏身体活动引起的肥胖人群和生活方 式相关疾病患者的数量增多，脂肪肝患者和NASH患者的数量也可能增加。因此，有必要开 发用于治疗NASH的新药、用于抑制NASH发展的抑制剂和/或用于减小NASH发生和NASH 发展的风险的功能性食物，并建立治疗NASH和预防NASH发展的方法。人NASH是通过鉴定人血液的生化和组织病理学特征而确诊的。可以通过将大鼠 血液中的氧分压保持在低水平由大鼠制备NASH病理学动物模型，用于评价功能未知的物 质。非专利文献 1 (Takayama F. et al J. Pharmacological Sci·，100(1)， pp. 164(2006).)详细描述了 NASH病理学动物模型和氧化应激之间的关系。在该文献中， NASH病理学大鼠模型促进了羟基自由基在大鼠肝脏线粒体的产生，这提示可能通过提高大 鼠肝脏线粒体处的羟基自由基清除活性来预防、减轻和治疗NASH。活性氧(ROS)通常作为诸如生活方式相关疾病(例如癌症、白内障、神经病、肾病、 过敏症和糖尿病)的疾病的根源而广为人知。通常，与ROS相关的疾病可通过抗氧化剂得 到有效抑制。非专利文献1公开了利用所制备的与NASH病理学人模型类似的NASH病理学大鼠 模型的实验，在该模型中，肝脏线粒体促进了活性氧自由基的产生，这强烈提示了氧化应激 和NASH之间的关系。如专利文献1(日本未经审查的专利申请公开第2007-215507号)、专利文献 2(日本未经审查的专利申请公开第2004-238519号)和专利文献3 (日本未经审查的 专利申请公开第2004-256478号)中的描述，干燥螺旋藻(例如钝顶螺旋藻(Spirulina Platensis))粉末由于含有作为有效成分的藻青蛋白而已经作为增补剂被食用，并且可以 被广泛用作化妆品和医用产品等的成分。干燥螺旋藻的保健功能可归结于其清除ROS的活性，尤其是清除脂质_过氧化 物 ( 2 ；Vadiraja B. Bhat and K. Μ. Madyastha =Biochem. Biophys. Res. Commum. ,275, pp. 20-25 (2000).)，羟基自由基(参见非专利文献 3 ;Pinero Estrada et al 11 Farmaco.，56，pp. 497-500 (2001) ·)和过氧亚硝酸盐(参见非专利文献 4 ;Vadiraja B.Bhat and K. Μ. Madyastha=Biochem.Biophys. Res. Commum. ，285,pp. 262-266(2001).)等 的活性。
已知干燥螺旋藻制品可作为有效预防和治疗各种疾病的成分。例如，干燥螺 旋藻制品可产生多种作用，例如抑制血液胆固醇的作用(非专利文献5 Joshimitsu Kato et al. , Publication of Japanese Society of Nutrition and Food Science 37 (4)，323-332 (1984).)，减轻高脂血症的作用(非专利文献6 ；Kazuko Iwata et al. , Publication of Japanese Society of Nutrition and Food Science 40(6), 463-467 (1987).)，调节血压的作用(非专利文献 7 ；Kazuko Iwata et al.，Kagawa Education Institute of Nutrition abstract, 21，63—70 (1990))。干燥螺旋藻制品可具 有吸收UV的作用而被应用于护肤药(参见专利文献2)，并具有增强免疫系统的作用和抑制 过敏性炎症的作用(参见非专利文献8 ；Hayashi 0. et al.，J. Nutr. Sci. Vitaminol.，44， 841-851 (1998)和专利文献 3)。如下所述，已提出将干燥螺旋藻制品应用于食品和色素中，并部分实现了实际应 用。干燥螺旋藻制品可应用于食品(参见专利文献1和专利文献4(日本未审查的专利申 请公开第1995-289201号))。如专利文献5 (日本未审查的专利申请公开第2001-190244 号)和专利文献6(日本未审查的专利申请公开第2006-230272号)所提出的，从干燥螺旋 藻制品提取的藻青蛋白可用作食品色素。虽然干燥螺旋藻制品具有高的保健功能，但还没有测定发挥该功能的干燥螺旋藻 制品的自由基清除活性的水平。此外，还没有建立关于干燥螺旋藻制品该发酵产品用于治 疗与活性氧有关的生活方式相关疾病的具体使用的应用。在这种情况下，有必要满足日益提高的对建立将具有高自由基清除活性的干燥螺 旋藻制品应用于治疗生活方式相关疾病(尤其是诸如NASH的肝炎)的方法的需求。

发明内容
应对上述问题完成了本发明，本发明旨在提供用于预防和治疗诸如NASH的肝炎 的口服组合物。为了解决上述问题，本发明的发明人进行了深入的研究，并完成了本发明(1)建 立了具有高自由基清除活性的干燥螺旋藻制品和该制品的制备技术；(2)开发了含有干燥 螺旋藻制品的含螺旋藻合成食品，并(3)阐明了 NASH和干燥螺旋藻制品的自由基清除活性 之间的关系。首先，本发明权利要求1所述的口服组合物的特征在于，利用所述口服组合物用 于肝炎的预防和治疗中的至少之一，并且所述口服组合物包含作为活性成分的螺旋藻。第二，本发明权利要求2所述的口服组合物的特征在于，所述肝炎为NASH。第三，如权利要求1或2所述的权利要求3的口服组合物的特征在于，其包含0. 1 重量％或更多的干燥螺旋藻粉末。第四，如权利要求1-3中任 一项所述的权利要求4的口服组合物的特征在于，其 具有羟基自由基清除活性，通过电子自旋共振谱一自旋捕获法测定的IC5tl值为3000 μ g/ ml-100μ g/ml0当患者口服摄取本发明权利要求1所述的口服组合物时，该口服组合物主要因为 螺旋藻粉末的自由基清除活性而能够预防、减轻和治疗肝炎。当患者口服摄取本发明权利要求2所述的口服组合物时，该口服组合物主要由于螺旋藻粉末的自由基清除活性而能够预防、减轻和治疗NASH。 本发明权利要求3所述的口服组合物能够促进诸如NASH的肝炎的预防、减轻和治疗。本发明权利要求4所述的口服组合物主要由于螺旋藻粉末的自由基清除活性而 能够促进诸如NASH的肝炎的预防、减轻和治疗。最佳实施方式以下将对本发明的最佳实施方式进行说明。本发明的螺旋藻的实例为，例如Spirulina corakiana、卷曲螺旋藻(Spirulina crispurn)、iiMilM· (Spirulina labyrinthiformis)、宽管ilM· (Spirulina laxa)、宽 松螺方 藻(Spirulina laxissima)、大螺方宠藻(Spirulina major)、极大螺方宠藻(Spirulina maxima)、孟氏螺方宠藻(Spirulina meneghiniana)、诺氏螺方宠藻(Spirulina nordstedtii)、 钝顶螺旋藻、为首螺旋藻((Spirulina princ印s)、盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)、纤 细螺旋藻(Spirulina subtilissima)、细丝螺旋藻(Spirulina tenerrima)、威氏螺旋藻 (Spirulina weissii)、坊锤螺方宠藻(Spirulina fusiformis)禾口方胞螺方宠藻(Spirulina jenneri)等。例如，在干燥螺旋藻粉末的制备中，在预定时期将以上列出的螺旋藻的纯培 养种子(seed)干净地培养在含有pH为8-11的碱性水溶液的池中，以培养螺旋藻藻体。分 离、浓缩、清洗、过滤并干燥所获得的螺旋藻藻体，产生干燥螺旋体粉末。所述干燥螺旋藻粉 末作为满足卫生要求并具有自由基清除活性的食品而提供。在本发明的该口服组合物中，所述干燥螺旋藻无需进一步修饰即可使用。为了便 于摄取，可以将所述干燥螺旋藻加工成颗粒剂、微粒剂或片剂。所述干燥螺旋藻可以与着色 剂、香料、调味剂或其它食品添加剂混合。本发明的口服组合物的摄取可以与其它食品相同。本发明并不受给予剂量、给予 方法和给予时期的具体上限和下限以及其它条件的限制。本发明的口服组合物可以以多种 方式摄取，例如短时大剂量摄取或长时小剂量摄取，或者以与其它具有保健功能的物质一 起摄取。但是，本发明并不限于上述方式。例如，该组合物的建议人用剂量可以设定在2g/ 天-IOg/天的范围内。本发明的口服组合物可以由干燥螺旋藻粉末单独制备，或者由干燥螺旋藻粉末和 其它成分(例如常规食品)的混合物制备。在加入到食品中时，干燥螺旋藻粉末相对于食 品的含量为0. 1重量％或更多，优选1. 0重量％或更多，更优选5. 0重量％或更多，从而提 供作为有效预防和减轻NASH的优选食品的本发明口服组合物。但是，在本发明中，食品中 螺旋藻的最大含量并不受具体限制。本发明的口服组合物无需与其它物质组合，而可以单 独使用以产生100% 口服组合物含量的食品。与该口服组合物混合的食品可以是粉末样、液 体样或糊样等。在本发明中，该口服组合物在食品中的含量以及该口服组合物的摄取方式 并不受具体限制，并且可以根据成本、质量要求(例如功能性)以及预防和治疗NASH的要 求(例如病理的种类和程度，开始给予的时间和规定的摄取时长、所组合的物质和其它)适 当确定。本发明的口服组合物可用作这样的组合物，其具有羟基自由基清除活性以用于 预防、减轻和治疗NASH病。所述自由基清除活性可以根据电子自旋共振谱一自旋捕获法 测定的IC5tl值来测定。当IC5tl值在3000yg/ml-100yg/ml的范围内时，所述口服组合物能够有效实现本发明的目的。当IC5tl值小于100yg/ml时，该组合物不足以提供本发 明的目的。当IC5tl值大于3000 μ g/ml时，该组合物由于其过度的自由基清除活性而可 能产生生物学副作用。应该注意，上述各浓度均为在ESR样品溶液中的终浓度。可以相 对于Trolox (水溶性维生素E)的羟基自由基清除活性来评价该口服组合物的羟基自由 基清除活性。相对于Trolox的羟基自由基清除活性，上述羟基自由基清除活性相当于在 0. 14 μ mol-4. Hymol (Trolox当量/mg)范围内的IC5tl值。为了能够安全地用作预防、减 轻和治疗NASH病的自由基清除活性组合物，优选通过ESR测定法测定的本发明口服组合物 的自由基清除活性IC5tl值小于Trolox的自由基清除活性。羟基清除活性大于Trolox的口 服组合物在过量使用时可能产生不可预测的生物学副作用。可以通过下述电子自旋共振谱一自旋捕获法的方式评价本发明口服组合物的羟 基清除活性。采用X-波段ESR装置(可购自JEOL Ltd.的RX-型)作为自由基检测装 置，并且该X-波段ESR装置装配有数字高速扫描器(可购自Radical Research Inc.)和 WIN-RAD 系统 RDA-03W ESR 数据分析仪(可购自 Radical Research Inc.)。采用5，5- 二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO,可购自LABOTEC Co.，Ltd.)或 2- (5，5- 二甲基-2-氧代-2- λ 5-[1，3，2] 二氧磷杂环己烷基-2-基)-2-甲基-3，4- 二 氢-2Η-吡咯 1-氧化物(2- (5，5-Dimethy 1-2-0X0-2- λ 5_[1，3，2] dioxaphosphinan-2-yl) -2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole 1-oxide) (CYPMPO，可购自 Radical Research Inc.) 作为自旋捕获剂。采用以下谱仪参数设定记录ESR谱磁场扫描范围336.5士5mT(含DMPO 的溶液)或331. 5 士 IOmT (含CYPMPO的溶液)；磁场调制0. 079 ；时间常数0. 10秒；扫描 时间1分钟(含DMPO的溶液)或4分钟(含CYPMPO的溶液)；输出功率8· OmW。根据捕 获自由基的DMPO或CYPMPO自旋加合物的ESR谱的相对强度进行评价。
在本发明中，根据IC5tl值(1^/1111，终浓度)确定样品(口服组合物)中的羟基自 由基清除活性，所述IC5tl值表示引起ESR谱强度与不含该组合物的对照溶液相比降低50% 时所述口服组合物的浓度。此外，还根据IC5tl值(yg/ml，终浓度)确定Trolox((士)-羟 基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸，可购自Aldrich Inc.)的羟基自由基清除活性，所述 IC50值表示引起ESR谱强度与不含Trolox的对照溶液相比降低50%时Trolox的浓度。然 后，根据相对于具有相同活性的Trolox的IC5tl值确定所述口服组合物的羟基自由基清除活 性。即，利用Trolox作为参比物质，根据具有与所述样品(由干燥螺旋藻制备的口服组合 物)相同活性的Trolox的化学当量评价所述样品的羟基自由基清除活性。在这种测定法 中，可能通过使与ESR装置、测定方式和试剂纯度等有关的误差最小化而获得客观性高的 高定量数据。如上所述，已经实现了本发明，从而提供了包含作为有效成分的具有高的自由基 清除活性的干燥螺旋藻粉末的口服组合物，用于当口服施用给患者时有效预防、减轻和治 疗 NASH。
实施例下文将参考实施例具体解释本发明。以下实施例目的仅在举例说明本发明。本发 明并不限于以下实施例。<本发明的口服组合物(实施例1)和Trolox的羟基自由基清除活性的测定>
按照实施例1制备本发明的口服组合物。实施例1中的口服组合物含有100%的 螺旋藻粉末含量。对于上述方式制备的实施例1中的口服组合物，通过电子自旋共振(ESR)—自旋 捕获法测定清除游离自由基和活性氧的活性。采用X-波段ESR装置(可购自JEOL Ltd. 的RX-型)作为自由基检测装置，并且该装置装配有数字高速扫描仪(可购自Radical Research Inc.)，用于高速、高灵敏度测定。此外，所述ESR装置与WIN-RAD系统RDA-03W ESR数据分析仪(可购自Radical Research Inc.)连接。采用CYPMPO作为自旋捕获剂。采用以下谱仪参数设定记录ESR谱磁场扫描范围336. 5士5mT (含DMPO的溶液) 或331. 5士 IOmT (含CYPMPO的溶液)；磁场调制0. 079mT ；时间常数0. 10秒；扫描时间1 分钟(含DMPO的溶液)或4分钟(含CYPMPO的溶液)；输出功率8· Omff0所获得的ESR谱 源自产生的捕获样品中的活性氧和游离自由基的DMPO自旋加合物或CYPMPO自旋加合物。 根据自旋加合物的ESR谱中的信号强度测定样品中活性氧和游离自由基的浓度。由于过渡 金属Mn产生用作参比ESR信号的ESR谱，因此可能能够准确测定捕获活性氧和游离自由基 的DMPO自旋加合物(或CYPMPO自旋加合物)相对于Mn的ESR信号强度，从而准确测定活 性氧和游离自由基的浓度。以下对ESR分析进行具体描述。在ESR样品溶液的制备中，向充分补充氮气的200mL磷酸缓冲液(pH7. 8)中加入 100 μ M硫酸亚铁、100 μ M 二乙烯三胺戊乙酸(DETAPAC)、5mM CYPMPO、多个浓度的实施例1 的组合物或Trolox和ΙΟΟμΜ过氧化氢。在所述样品的制备中，提前将除过氧化氢外的上 述物质彼此混合，然后向所产生的溶液中补充过氧化氢，从而通过过氧化氢和铁离子之间 的Fenton反应产生羟基自由基。通过在加入过氧化氢后扫描磁场1分钟开始ESR测量，从 而使用于产生预定量的羟基自由基的反应时间保持恒定。所产生的羟基自由基被ESR样品 溶液中的CYPMPO捕获，形成产生8线ESR谱的自旋加合物(CYPMP0-0H)。通过CYPMP0-0H ESR谱中第四低磁场中的峰和6线Mn ESR谱中第二低磁场中的峰之间ESR谱强度的比较， 根据CYPMPO-OH/Mn的ESR信号的相对强度测定ESR样品溶液中羟基自由基的浓度。测定 含有实施例1的组合物或Trolox的样品溶液中相对于不含实施例1的组合物或Trolox的 对照溶液的CYPMPO-OH/Mn ESR信号的相对强度。根据获得的含有实施例1的组合物的ESR 样品溶液CYPMPO-OH/Mn ESR信号相对强度的变化，测定实施例1中的口服组合物的羟基自 由基清除活性。根据与对照溶液相比引起CYPMPO-OH/Mn ESR信号的相对强度降低50%的实施 例1的该组合物的浓度(ESR样品溶液中的终浓度)，测定实施例1的该组合物的羟基自由 基清除活性为960μ g/ml。根据Trolox的化学当量，所测定的羟基自由基清除活性相当于 0. 43 μ mol Trolox当量/mg。因此，证明实施例1的该组合物具有足以产生高保健功能的 活性。<包含本发明的口服组合物的干燥螺旋藻粉末的各食品的实例(实施例2和3)>为了制备实施例2的口服组合物，将干燥螺旋 藻粉末与分离型调料(dressing)混 合。所述干燥螺旋藻粉末是可购自Spirulina Bio-Lab Co.，Ltd.的螺旋藻粉末。所述分 离型调料是Kewpie Corporation的商业化产品。所产生的制品根据所述分离型调料的含 量而包含不同含量(0. 01重量％、0. 1重量％、1. O重量％和5. O重量％ )的干燥螺旋藻粉 末。
为了制备实施例3的口服组合物，将与实施例2相同的干燥螺旋藻粉末与可商购 的面条混合。所产生的制品根据面条的含量而包含不同含量(0.01重量％、ο. 1重量％、ι. 0 重量％和5. 0重量％ )的干燥螺旋藻粉末。由10个评 价者对实施例2和3的制品进行评价。添加有干燥螺旋藻的分离型调料 和面条均被所有评价者评定为可食用，由此证明本发明在功能评价方面具有优异的性质。然而，该评价揭示，为了产生足够的针对NASH的功效，需要消耗大量的0. 01重 量％制品，由此从功能评价方面证明0.01重量％制品不适合实际应用。该评价揭示，所述 口服组合物需要包含含量为0.1重量％或更多的干燥螺旋藻。<本发明的口服组合物针对NASH的功效>为了评价本发明的口服组合物针对NASH的功效，将本发明的口服组合物施用于 NASH生物学和病理学模型大鼠，所述NASH生物学和病理学模型大鼠是通过使各脂肪肝大 鼠在生物学缺氧条件下荷载氧化应激(OS)而形成的。根据所述大鼠血液的生化变化、肝脏 线粒体的ROS引起的变化和肝脏组织的病理学变化进行所述评价。根据Takayama的方法(参加非专利文献1)，由体重均为180g_200g的6周龄 Wister雄性大鼠制备NASH病理学模型。为了制备脂肪肝大鼠，向自由进食的所述雄性大鼠 施予缺乏胆碱的食物(CDHF，可购自Oriental Yeast Co.，Ltd.)，共4周。4周后继续向所 述大鼠施予CDHF，以保持病理学模型。将所述动物饲养在不透明聚丙烯笼(宽220、长320、高135，可购自Natsume Seisakusho Co. Ltd)中，湿度40% _50%，温度20°C _25°C，12小时/12小时的受控制明暗 循环(AM 8 00亮灯，PM 8:00灭灯)。为了制备在生物学缺氧条件下荷载氧化应激(OS)的各NASH病理学模型大鼠，以 每天将含亚硝酸钠的生理盐水溶液经腹膜内以30mg/kg(体重)施予所述脂肪肝大鼠，共6 周。在该施用期间，每隔两周进行尾静脉血液测试，以确定病理学状况的正常发展。为了评价本发明的口服组合物针对NASH的功效，代替亚硝酸钠溶液，以每天2g/ kg (体重)或每天6g/kg (体重)向所述脂肪肝大鼠口服施予本发明实施例1的口服组合 物，共6周，自由进食。所述施用后，处死大鼠，观察其血液中的生化变化、肝脏线粒体产生的活性氧和游 离自由基(ROS)的量的变化和肝脏组织的病理学变化。参考第1组(CDHF+0S)、第2组(CDHF+0S+2g/kg实施例1的口服组合物)，第3组 (⑶HF+0S+6g/kg实施例1的口服组合物)，解释该实施例。每组使用8只大鼠(η = 8)。利用转氨酶CII-测试Wako (可购自Wako Pure Chemical Industries)测定血菜 中的AST值和ALT值。通过以下步骤检测由肝脏线粒体产生的活性氧和游离自由基(ROS)。通过下腔静 脉向肝脏灌注1. 15%的氯化钾溶液(含5mM苯甲脒)，然后取样。将Ig所取得的肝脏组织 样品加入到三羟甲基氨基甲烷(tris)盐酸缓冲液(pH 7.4，含有0.2511蔗糖和0. IM氯化 钾)中，然后均质化。接着，将所产生的溶液在4°C以3000 Xg离心分离10分钟，获得上清 液。随后，将所获得的上清液在4°C以9000Xg离心分离20分钟，获得沉淀物。利用三羟 甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(PH 7.4，含有0. 25M蔗糖和0. IM氯化钾)离心洗涤所述沉淀物 两次，获得线粒体部分(fraction)。利用Iml三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7. 4，含有0. 25M蔗糖和0. IM氯化钾)稀释14. 28mg各线粒体部分，获得线粒体蛋白浓度为500 μ g/ ml的样品溶液。为了测定所产生的活性氧和游离自由基(ROS)的量，将35μ1所获得的肝脏线粒 体溶液与25 μ 1溶液(含有0. 十二烷基麦芽糖苷、5mM谷氨酸盐、5mM苹果酸盐和200mM 琥珀酸盐)、20 μ 1 4. 6Μ DMPO溶液和20 μ 1 2mM NADH溶液混合，然后在37°C温育5分钟。 温育后，立即利用ESR装置(JESREIX/HR，可购自JEOL Ltd.)测定所述溶液。在所述溶液的ESR测定前，测定DMPO自旋加合物(DMPO-OH)相对于位于腔体内部 的MnO中的Mn2+的ESR谱强度。即，根据相对于Mn2+的ESR谱强度的相对强度(DMP0-0H/ Mn)，测定DMPO自旋加合物的ESR谱强度。利用方差单向分析(ANOVA)和随后的Turkey多重比较检验对ESR谱数据进行统 计学分析，根据“平均值士标准误差”进行评价。通过学生t检验对两组之间的比较进行 分析，显著性水平在5%或低于5%时认为具有显著性。在所述施用后，处死大鼠，观察大鼠血液中的生化变化、肝脏线粒体产生的ROS的 变化和肝脏组织的病理学变化，得到以下结果。对不施予干燥螺旋藻制品(⑶HF+0S)的第1组进行生化测定实验，获得关于施用 前后生化性质变化的以下结果。发现血浆中的AST值(单位/ml)由23 士 2IU/L提高至140 士 7IU/L。发现血浆中的ALT值(单位/ml)由7 士 2IU/L提高至16 士 2IU/L。所述结果表明，由于氧化应激而出现NASH症状。对施予2g/Kg (体重)(CDHF+0S+2g/Kg实施例1)的第2组进行生化测定实验，获 得关于施用2g/Kg(体重)实施例1的口服组合物前后生化性质变化的以下结果。发现血浆中的AST值(单位/ml)由25 士 2IU/L提高至100 士 20IU/L。发现血浆中的ALT值(单位/ml)由8 士 2IU/L提高至14士 3IU/L。上述结果证明，通过施用2g/Kg (体重)本发明实施例1的口服组合物减轻了由于 氧化应激导致的NASH症状。对施予6g/Kg (体重)(CDHF+0S+6g/Kg实施例1)的第3组进行生化测定实验，获 得关于施用6g/Kg(体重)实施例1的口服组合物前后生化性质变化的以下结果。发现血浆中的AST值(单位/ml)由21 士 3IU/L提高至35 士 5IU/L。发现血浆中的ALT值(单位/ml)由7 士 3IU/L提高至10 士 2IU/L。上述结果证明，通过施用6g/Kg (体重)本发明实施例1的口服组合物减轻了由于 氧化应激导致的NASH症状。为了确定肝脏组织的病理学变化，采用苏木精-伊红染色以常规方式对大泡性脂 肪变性进行染色，得到关于大泡性脂肪变性的集聚的以下结果。第1组(⑶HF+0S)，证明具有高度的大泡性脂肪变性且肝细胞排列非常混乱。 第2组(⑶HF+0S+2g/Kg实施例1)，证明具有中等程度的大泡性脂肪变性且肝细胞 排列中等程度混乱。第3组(⑶HF+0S+6g/Kg实施例1)，证明具有小程度的大泡性脂肪变性且肝细胞排 列稍有混乱。以上结果证明，通过施用实施例1的组合物减轻了随NASH发展的肝脏组织中的大泡性脂肪变性和肝细胞的混乱，这与所述组合物的浓度有关。 为了确定肝脏组织的病理学变化，采用三色染色以常规方式对胶原原纤维进行染 色，得到关于胶原原纤维的以下结果。第1组(⑶HF+0S)，证明门区和中央静脉区间具有桥接，且形成了假小叶(F3 F4)。第2组(⑶HF+0S+2g/kg实施例1)，证明门区和中央静脉区间具有轻度桥接。第3组(⑶HF+0S+6g/kg实施例1)，证明门区和中央静脉区周围有纤维化，而没有 桥接。以上结果证明，通过施用实施例1的组合物减轻了随NASH发展的桥接和纤维化， 这与所述组合物的浓度有关。为了确定肝脏组织的病理学变化，采用柏林蓝染色以常规方式检测铁离子，得到 关于铁沉淀引起的染色的以下结果。第1组(⑶HF+0S)，证明在门区和中央静脉区之间具有大量铁沉淀。第2组(⑶HF+0S+2g/kg实施例1)，证明在门区和中央静脉区之间具有轻微铁沉淀。第3组(CDHF+0S+6g/kg实施例1)，证明几乎没有铁沉淀。以上结果证明，通过施用本发明的组合物减轻了随NASH发展的肝脏组织的铁沉 淀，这与所述组合物的浓度有关。利用NASH模型动物的上述结果证明了干燥螺旋藻制品用于针对NASH( —种典型 的生活方式相关疾病)的抗氧化治疗功效。〈使用本发明的口服组合物对肝脏线粒体产生的游离自由基的抑制作用〉进行以下实验，证明本发明的口服组合物在对由于NASH病理学动物模型的肝脏 线粒体中的能量代谢而引起的活性氧和游离自由基的产生的抑制方面的功效。对第1、2和3组大鼠进行以下实验。根据上述Takayama法(参见非专利文献1) 制备NASH病理学模型。从第1、2和3组大鼠获得线粒体部分(参见Egashira T. et al =Toxicology Letter，117，115-119(2000))。即，通过下腔静脉向肝脏灌注1. 15%的氯化钾溶液(含5mM 苯甲脒)，获得肝脏样品。将Ig所述肝脏组织加入到三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(PH 7.4，含有0.2511蔗糖和0.说氯化钾)中，然后均质化。接着，将所产生的溶液在4°C以 3000 X g离心分离10分钟，获得上清液。随后，将所获得的上清液在4°C以9000 X g离心分 离20分钟，获得沉淀物。利用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7.4，含有0.2511蔗糖和 0. IM氯化钾)离心洗涤所述沉淀物两次，获得线粒体部分随后，通过以下方式利用自旋捕获剂DMPO捕获各组中由线粒体产生的活性氧和 游离自由基,获得DMPO 自旋加合物(参见，Yudong Wang et al =Free Radical Biology and Medicine，36 (11)，1434-1443(2004))。通过 ESR i普检测上述 DMPO 自旋加合物。将 DMPO、 线粒体和NADH提前用冰冷却。将其它物质提前在37°C加温。通过向含有5mM三羟甲基氨 基甲烷、0. 25mM蔗糖和0. ImM氯化钾的缓冲液(pH 7.4)中加入35 μ 1线粒体乳液(含有 0. 5mg蛋白)、920mM DMP0、0. 1 %十二烷基麦芽糖苷、IOmM L-谷氨酸钾、IOmML(-)-苹果酸 钠、200!111琥珀酸二钠和1()(^11 NADH制备测试溶液。然后，为了进行ESR测定，将所得溶液在37°C温育5分钟。用0. 03M三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7. 4，含有0. 25M蔗糖和0. IM氯化钾) 悬浮各组中的线粒体部分，然后立即保藏在-80°C，直至进行ESR分析。将实施例1的组合物加入到ESR测定样品溶液中，用于ESR谱分析。对实施例1中 的组合物进行试验，从而根据捕获活性氧和游离自由基的DMPO自旋加合物的ESR谱强度对 该组合物在降低由于线粒体功能失调产生的活性氧和游离自由基(ROS)方面的功效进行 评价(参见Takayama F. et al Japanese Journal of Pharmacology, 85, 227-233 (2001))。 具体而言，通过观察DMPO与羟基自由基之间的加合物(DMPO-OH)的具有典型g_值和精细 结构参数的ESR谱强度的变化来确认线粒体产生的活性氧和游离自由基(ROS)的存在。向 含有NASH病理线粒体的测试溶液中加入干燥螺旋藻制品。根据DMPO-OH/Mn的ESR谱相对 强度的变化，利用ESR谱分析检测所获得的溶液，评价所述组合物在降低由于NASH病理学 模型的能量代谢而产生的活性氧和游离自由基方面的功效进行评价。根据IC5tl值(μ g/ml) 评价所述功效，所述IC5tl值表示引起相对ESR信号强度降低50%的实施例1的该组合物的 浓度。通过与上述“本发明的口服组合物针对NASH的功效”中相同的方式，操作ESR装置 进行ESR测定。

获得关于由肝脏线粒体产生的ROS的存在而产生的ESR谱的相对信号强度的以下 结果。经测定所述相对信号强度为第1组(CDHF+0S) 1. 0士0. 1，第2组(CDHF+0S+2g/Kg实 施例1)0. 8 士 0. 1和第3组(⑶HF+0S+6g/Kg实施例1)0. 6 士 0. 1，从实施氧化应激之前获得 的相对信号强度0. 5士0. 1升高。该结果表明，通过施用实施例1的组合物降低了由肝脏线 粒体产生的随NASH的发展而提高的ROS的量，这与所述组合物的浓度有关。上述结果证明，本发明的口服组合物能够抑制并调节由NASH病理学动物模型的 肝脏线粒体的能量代谢引起的自由基的产生。因此，证明了本发明的口服组合物在口服施 予患者时有效预防、减轻和治疗NASH。
权利要求
1.用于预防或治疗肝炎的口服组合物，其包含作为活性成分的螺旋藻。
2.如权利要求1所述的口服组合物，其中所述肝炎为非酒精性脂肪性肝炎。
3.如权利要求1或2所述的口服组合物，其包含0.1重量％或更多的干燥螺旋藻。
4.如权利要求1-3中任一项所述的口服组合物，其具有通过电子自旋共振谱一自旋捕 获法测定的IC5tl值为3000 μ g/ml-100 μ g/ml的羟基自由基清除活性。
全文摘要
本发明涉及用于预防和治疗诸如NASH的肝炎的口服组合物。具体地，本发明涉及用于预防或治疗肝炎的口服组合物，所述口服组合物包含作为活性成分的螺旋藻。所述组合物可以经口服摄入，表现出对NASH等的预防、改善或治疗作用，这主要依赖于所述组合物中所含有的螺旋藻粉的自由基清除活性。
文档编号A23L1/30GK102006877SQ20098011316
公开日2011年4月6日 申请日期2009年1月6日 优先权日2008年4月15日
发明者西垣广志, 黄堂泰昌 申请人:株式会社螺旋藻研究所