专利名称：用于dna序型分析试验的物质和方法
技术领域：
本发明总体上涉及对基因组系统中遗传标记物的检测。在本发明的一个具体 实施方式中，本发明具体涉及用聚合酶链反应或其它扩增系统同时扩增多个不同的多态 性遗传基因座，优选在一个反应中测定这种多重系统中所含各个基因座的等位基因。因 此，本发明属于化学和生物学领域，较具体说是分子生物学，更具体说是人类遗传学， 最具体说是法医学以及亲子鉴定领域。
背景技术：
通常采用DNA分型来鉴定人类儿童的亲子关系和验证马、犬和其它动物以及农 作物的世系。也常用DNA分型来鉴定在犯罪现场发现的血液、唾液、精液和其它组织的 来源或其它需要鉴定的人类遗迹。临床上，例如某些白血病的治疗，也用DNA分型来确 定存在特定癌组织时骨髓移植是否成功。DNA分型包括分析基因组DNA中的具有感兴 趣特征通常称为“标记物”的等位基因。目前所用的大多数分型方法是专门设计用于检 测和分析在人群中至少以两种形式出现的已知DNA标记物的一个或多个区域的长度和/ 或序列的差异。这种长度和/或序列的差异称为“多态性”。出现这种差异的DNA区 域，g卩“基因座”称为“多态性基因座”。具体说，提到多态性DNA序列时，必须将所谓的重复多态性DNA序列与非重 复多态性元件区分开。在DNA序列研究中，人们能够区别两种主要类型的重复序列， 即串联重复和散布重复。串联重复包括卫星DNA。卫星DNA由高度重复的DNA构 成，如此称呼是因为短DNA序列的重复倾向于产生不同频率的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤 和胸腺嘧啶，因此与大DNA的密度不同，所以当通过密度梯度分离基因组DNA时它们 形成了第二条带或“卫星”条带。小卫星是由IO-IOObp的短碱基序列构成的DNA区 段。它们出现在人类基因组中的1000个以上位置。一些小卫星包含中心(或核心)序列
“GGGCAGGANG” (其中N可以是任何核苷酸)(N = A、C、G、T的UPAC编码)， 或更常见包含链偏好(strand bias)。已证明，这种序列本身能促进染色体交换DNA。在 另一种模型中，存在相邻的顺式作用有丝分裂(myotic)双链断裂热点是小卫星重复拷贝 数差异的主要原因。在所有真核基因组中均发现了散在的(indispersed)重复性DNA。这些序列通 过RNA介导的转座自我增殖，它们称为反转录子。这种反转录子显著大于上述重复性元 件。所谓的短散在核元件(short indispersed nuclear element，SINE)是另一类重复性 DNA元件。SINE的一种具体类型是所谓的ALU-序列。它们的长度约为300个碱基 对。因此，对简单直接的序型分析试验而言，这些元件也不特别有用。微卫星是存在于核DNA或细胞器中的简单序列重复(SSR)或短串联重复(STR) 或多态性基因座，它们由长度为1-6个碱基对的重复单位构成。它们用作分子标记物， 在遗传学，包括亲缘关系和人群研究领域有广泛应用。微卫星也可用于研究(寻找特定 遗传区域的重复或缺失)所需的基因剂量。微卫星的一个常见例子是(CA)n重复，其中η在各等位基因之间不同。这些标记物常常存在高水平的种间和种内多态性。特别是当 串联重复数为10或更高时。这些重复序列常常较简单，由两个、三个或四个核苷酸构成 (分别称为二 _、三_、四-核苷酸重复)，可以重复10-100次。在人类和其他基因组 中，CA核苷酸重复非常常见，每数千个碱基对出现一次。由于STR基因座常常存在极 多的等位基因，系谱内的基因型常常能提供丰富的信息并且常常能够鉴定到特定等位基 因的祖先。然而，在遗传学试验中利用这些所谓的STR有以下基本作用由于人群中的 差异大，在极大量的等位基因中发现所述等位基因时，例如，用电泳凝胶系统分析这些 基因时，所述等位基因的大小可能有显著差异。采用(例如)RFLP时，巧合匹配的理论风险为千亿(100,000,000,000)分之一.然
而，实验室的误差率几乎肯定高于此，实际的实验室操作常不能反映计算巧合概率的理 论。例如，根据两个样品中标记物产生的条带精确位于同一位置的概率计算这种巧合概 率时，实验室工作人员可能断定，由于琼脂糖凝胶存在某些不完美，相同的遗传样品可 能产生相似但不精确相同的条带图样。然而，在这种情况下，实验室工作人员通过扩大 宣称匹配的标准，可能导致提高巧合风险。STR具有同样的问题。这是由于每个基因座 都有许多等位基因，这种复杂性可导致产生模棱两可的随后被错误认定的扩增产物。含有多个基因座的系统称为多重系统，已经开发出含有多达11个以上不同STR 基因座的许多这类系统，它们可商品化购得。虽然可设计出STR基因座的扩增方案来产 生通常长度为60-500个碱基对(bp)的小产物，但每个基因座所含的等位基因常少于100 个碱基对范围。采用STR基因座的显著缺点是，由于人群中特定基因座存在高度差异， 某些等位基因可能有大量重复，导致产生大的扩增产物。这些系统的设计部分受限于一 次凝胶或毛细管电泳难以分离多个基因座。这是因为不同大小的片段，特别是较长片段 在本领域技术人员分离DNA片段常用方法的凝胶或毛细管电泳中受到空间压缩。虽然多 个等位基因短串联重复(STR)的分析仍然对法医遗传学和案例调查有着最大的影响，但 不得不说该系统由于检测DNA时质量低和数量少其应用受到限制。例如，对分析重要 的STR而言，降解的DNA样品是一种主要挑战，因为多重试验中扩增子的大小常常超过 200个碱基对。这种降解样品极难扩增。同时，研究关注点是所谓的单核苷酸多态性(SNP)，然而，难以分析这些 SNP,因为给定系统须要能够鉴定单核苷酸多态性的位置。本发明提供了超过现有技术的显著进步，提高了 DNA序型分析用于关联 (linkage)分析、刑事司法、亲子鉴定和其它法医学或医学应用以及遗传鉴定应用的分 辨、定位能力和处理总量。这具体是因为本发明采用了不同类型的多态性标记物的组 合，即所谓常见的双等位基因缺失-插入多态性(DIP)。
发明内容
本发明涉及一种DNA序型分析试验，包括以下步骤提供待分析样品，提供 用聚合酶链反应同时扩增至少20个基因座所必需的试剂、酶和引物-寡核苷酸，扩增这 些基因座，检测扩增产物；其中扩增产物和待扩增基因座的特征如下各待扩增基因座 的特征是已知人群中存在至少一个缺失-插入多态性，各基因座两个等位基因的大小差 异在1个核苷酸以上100个核苷酸以下，源自至少两个不同基因座的大小约为20个核苷
21酸至300个核苷酸的第一组的至少两种扩增产物携带第一标记，源自至少两个不同基因 座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的第二组的至少两种扩增产物携带第二标记， 源自至少两个不同基因座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的第三组的至少两种扩 增产物携带第三标记，标记一、标记二和标记三是各不相同的可区分荧光标记，可用与 DNA测序设备联用的多色检测器同时检测。本发明的一个目的是提供包含所述基因座(DIP)的多重扩增专用的方法、试剂 盒和引物。在本文中，相同性综合概率(CPI)表示，发现人群中某组基因座的基因型相同 的两个个体的概率(Kirst M，Cordeiro CM, Rezende GD, Grattapaglia D. “微卫星标记物 对巨桉繁殖种群指纹和亲子分析的效力，，(Power oftnicrosatellite markers for fingerprinting and parentage analysis in Eucalyptusgrandis breeding populations) .J Hered.2005 96 161—166. PMID 15601907)。在本文中，CPE/Trio(排除亲子关系的综合概率)表示人群中某组基因座父母 双方的基因型已知时，排除亲子关系的可能性。(Jamieson A，TaylorSCS (1997) “排 除亲子关系三禾中_既率方程的比较” (Comparisons of threeprobability formulae for parentage exclusion) .Animal Genetics，28, 397-400。 )在本文中，“等位基因梯”是采用与用于扩增未知DNA样品相同的PCR引物， 扩增至少一个基因座的等位基因产生的一组标准大小(已知)的标记物。每个DIP有两 个等位基因。在本文中，等位基因是DNA区段中的相关遗传变异，即占据同一基因座的DNA 序列的两种或多种交替形式之一种。在本文中，DNA多态性是同一种群间DNA序列中共存有两种或多种不同的核苷 酸序列的情况。在本文中，基因座或遗传基因座是染色体上的特定位置。在本文中，基因座的等位基因位于同源性染色体的同一位点，但它们的DNA序 列至少有一个位置的核苷酸不同。在本文中，基因座-特异性引物是在扩增方法所用条件下，能与所述基因座或 其互补链(至少是该基因座的一个等位基因)的一部分特异性杂交、且不与其它DNA序 列有效杂交的引物。通常，引物指长度为10至40个(15-35个；18-30个)核苷酸，与 互补DNA链杂交后能形成可用DNA聚合酶延长的底物复合物的单链DNA寡核苷酸。在本文中，序型分析试验适合于区分物种个体，特别是人类个体的扩增的多态 性DNA标记物模式。该方法也称为“分子遗传学鉴定模式”或“遗传学指纹”。发明详述本发明涉及一种DNA序型分析试验，包括以下步骤提供待分析样品，提供同 时进行聚合酶链反应扩增至少20个基因座所必需的试剂、酶和引物-寡核苷酸，扩增这 些基因座，检测扩增产物；其中扩增产物和待扩增基因座的特征如下各待扩增基因座 的特征是已知人群中存在至少一个缺失-插入多态性，其中各基因座的两个等位基因大 小差异在1个核苷酸以上100个核苷酸以下，源自至少两个不同基因座的大小约为20个 核苷酸至300个核苷酸的第一组的至少两种扩增产物携带第一标记，源自至少两个不同基因座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的第二组的至少两种扩增产物携带第二标 记，源自至少两个不同基因座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的第三组的至少两 种扩增产物携带第三标记，标记一、标记二和标记三是各不相同的可区分荧光标记，可 用DNA测序设备的多色检测器同时检测，给定基因座的两个等位基因的大小差异大于1 个核苷酸小于100个核苷酸。理想情况下所述大小差异大于2个小于80个、小于60个、 小于40个、小于30个或小于20个核苷酸。优选大于3个小于20个核苷酸。从所做的 实验可知，该大小范围具有出乎意料的优点，能够进行大量多重检测。本发明人发现，当所用样品含降解的DNA、部分降解的DNA、极少量DNA， 或者例如PCR抑制剂时，该试验的结果明显好得多。待分析样品可以是许多物质，例如分离的DNA、细胞、唾液、尿液或血液中的 一种。同样，也可包括其它组织。所述DNA可来自人、猫、犬或任何其它动物。“分离的DNA”是(1)所含序列与任何天然产生的序列不相同的DNA，或(2) 在具有天然产生序列的DNA(如cDNA或基因组DNA)中，不含在天然存在的含有感兴 趣DNA的基因的生物体基因组中侧接于含有感兴趣DNA基因的至少一个基因的DNA。 因此，该术语包括掺入载体、掺入自主复制质粒或病毒、或者掺入原核或真核细胞基因 组DNA中的重组DNA。该术语也包括单独分子，例如相应基因组DNA具有内含子因 而序列不同的cDNA ；缺少至少一个侧接基因的基因组片段；通过聚合酶链反应(PCR) 产生且缺少至少一个侧接基因的cDNA或基因组DNA的片段；缺少至少一个侧接基因的 限制性酶切片段；编码非天然产生的蛋白质，例如融合蛋白、突变蛋白或给定蛋白片段 的DNA;和cDNA或天然产生核酸的简并变体核酸。此外，包括作为杂合基因，即非 天然产生的融合蛋白编码基因的一部分的重组核苷酸序列。从以上描述可以明白，分离 的DNA不是指存在于(例如)限制性消化反应混合物或电泳凝胶薄片中的DNA，例如， 存在于cDNA或基因组DNA文库或基因组DNA限制性消化产物的几百至几百万个其他 DNA分子中的DNA。PCR反应可由10-45个变性和合成DNA分子的“循环”构成。这类方法包 括但不限于PCR(如美国专利号4,683,195和4,683,202所述，通过引用纳入本文)、 链置换扩增(“SDA”)(如美国专利号5,455,166所述，通过引用纳入本文)和核酸 序列扩增("NASBA “)(如美国专利号5,409,818所述，通过引用纳入本文)。例 如，可通过滚环复制系统进行扩增，其中甚至可采用解旋酶提高DNA解链效率并减 少加热(参见 Yuzhakou 等，Cell 86 877-886(1996)和 Mok 等，J.Biol.Chem.262 16558-16565(1987)，通过引用纳入本文)。在一个优选实施方式中，进行热循环扩增反应的变性温度约为90°C至95°C以 上，更优选92-94°C。优选的热循环扩增方法包括聚合酶链反应，包括约10至100个循 环，更优选约25至50个循环，峰值温度约为90°C至95°C以上，更优选92_94°C。在一个优选实施方式中，采用DNA聚合酶I进行PCR反应，相对于所涉及的反 应步骤数目，可产生以指数扩增的至少一种靶核酸序列，前提是(a)对靶序列二末端的了 解足够详细，以便合成与其杂交的寡核苷酸引物，和(b)得到少量靶序列以启动聚合酶 链反应。该聚合酶链反应的产物是不连续的核酸双链体，其末端对应于所用特异性引物的末端。可采用任何来源的纯化或非纯化形式的核酸作为原料核酸，如果其含有或被认 为含有所需的靶核酸序列。因此，该方法可采用(例如)单链或双链DNA。此外，可 利用DNA-RNA各含一条链的DNA-RNA杂合体。也可采用这些核酸的任何混合物，或 者用相同或不同引物进行前述扩增反应所产生的核酸。扩增的核酸优选DNA。待扩增 的靶核酸序列可以只是较大分子的一部分，或者最初可以是不连续的分子，然后与靶核 酸构成完整的核酸。待扩增的靶序列最初不一定以纯形式出现；可以是复杂混合物的微 小部分或某特定动物核酸序列的一部分，可能只构成特定生物样品的很小部分。原料核 酸可含有一种以上的所需靶核酸序列，这些序列可以相同或不同。因此，该方法不仅可 用于产生大量的一种靶核酸序列，而且可用于同时扩增位于相同或不同核酸分子上的多 个靶核酸序列。在动物DNA背景中扩增人类DNA时这特别有用。这种情况可能发生在 某些犯罪现场。所述核酸可获自任何来源，包括质粒和克隆的DNA，DNA的来源包括细菌、 酵母菌、病毒和高等生物如植物或动物。可用各种技术例如Sambrook J，Fritsche EF， Maniatis T.《分子克隆实验室手册》(Molecular cloningAlaboratory manual)第 2 版，冷 泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratoryPress) (1989)所述技术提取(例如)血液
或其他液体，或组织材料如绒毛膜绒毛或羊膜细胞的DNA。该试验采用基因座-特异性引物。这些引物位于DIP的上游和下游。将引物理想 地置于大约相等距离以减少错配，而获得理想的解链温度。引物长度优选约为15-100， 更优选约20-50，最优选约20-40个碱基。该方法的引物必须横跨包含DIP(缺失-插 入-多态性)的区域。具体地说，本发明人发现，对20个以上基因座进行高度多重PCR 时，引物的退火温度应为56-65°C，更优选57-63°C，最优选59-61°C。此外，一个基因 座特异性引物对的正向和反向引物，以及多重PCR混合物的所有引物之间的退火温度差 异应小于4°C。所有引物应是给定试验的特异性PCR引物，例如，在人类法医学或诊断 学多重应用中应是人类特异性引物。基因座特异性引物对以及多重反应混合物中的所有 引物在PCR或多重-PCR中应不会产生非特异性副产物。而且，非常重要的是应避免多 重反应混合物的所有引物之间发生DNA序列自身互补，以防止在PCR或多重PCR中形 成自身二聚体或异质二聚体。可用任何合适的方法，例如磷酸三酯和磷酸二酯法，或其自动化实施方式制备 寡核苷酸引物。在这类自动化的一种实施方式中，将二乙基亚磷酰胺用作原料，根据通 过引用纳入本文的 Beaucage 等，Tetrahedron Letters，22: 1859-1862 (1981)所述进行合 成。一种在修饰的固体支持物上合成寡核苷酸的方法参见美国专利号4,458,006，通过引 用纳入本文。也可采用分离自生物来源(例如限制性核酸内切酶消化物)的引物。用含有模板序列的核酸扩增靶核酸序列。如果这种核酸含有两条链，将其用 作模板之前需要分离核酸的二条链，可以单独步骤分离或与引物延伸产物的合成同时分 离。可用任何合适的变性方法，包括物理、化学或酶学方法实施这种链分离。分离 核酸链的一种物理方法包括加热核酸，直到其完全(> 99% )变性。热变性涉及的温 度范围通常为约80°C _105°C，优选约90°C-98°C，更优选93°C _95°C，时间范围为约 1-10分钟。也可用称为解旋酶的这类酶或RecA酶诱导链分离，RecA具有解旋酶活性且已知能变性DNA。适合用解旋酶分离核酸链的反应条件参见冷泉港定量生物学研讨 会(Cold Spring Harbor Symposia onQuantitative Biology)，第 XLIII 卷，“DNA 复制和 重组”(DNA: Replicationand Recombination)(纽约州(NewYork)冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)，1978)，采用 RecA 的技术参见 C.Radding，Ann.Rev.Genetics,
16: 405-37(1982)，通过引用纳入本文。可用任何合适方法进行合成。通常，在缓冲水溶液中进行合成。在一些优选 的实施方式中，所述缓冲液的pH约为7.5-9.2 (在室温下调节)。优选将摩尔过量(对克 隆的核酸而言，引物模板的比例通常为约1000 1，对基因组核酸而言，引物模板 的比例通常为约IO6: 1)的两种寡核苷酸引物加入到含有分离的模板链的缓冲液中。然 而应理解，如果将本文所述方法用于某些应用，互补链的量可能未知，因此不能明确确 定相对于互补链含量所需要的引物用量。然而，作为一个实际问题，当复杂的长链核酸 链的混合物中包含待扩增序列时，加入的引物摩尔量通常需超过互补链(模板)含量。 优选超过的摩尔量较大可提高该方法的效率。PCR的优选反应条件如下20mMTris/ HCl-缓冲液(室温调节至 pH 8.8)，200 μ M (40-500 μ Μ) dNTP, 1-10 (1-4) mM MgCl2, 50mM KCl,寡核苷酸引物各0.05-2 μ Μ, 0.05-0.5% (体积/体积)吐温20和1-2.5单 位Taq DNA聚合酶。在一些实施方式中(分析法医学残迹、单细胞或低拷贝数(LCN) DNA)，优选采用Taq DNA聚合酶和所谓“热启动技术”(美国专利号05587287 ；美国 专利号05677152;美国专利号06214557 ；美国专利号06183967)以避免非特异性扩增。 而且，缺乏5’ 一3’核酸外切酶活性的遗传工程改造的Taq DNA聚合酶(例如，欧洲专 利号0553264，欧洲专利号1507002，欧洲专利号0395736，欧洲专利号0983364)对某些 应用有利。可用Nonidet Ρ-40
或曲通Χ-100
代替去污剂吐温20，或者采用这些去污剂的混合物(例如，吐温20和Nonidet Ρ-40)。可用ΝΗ4+(终浓度l_20mM)代替单价阳离子K+，或采用这两种阳离子的混合 物。有时，优选除氯以外的阴离子，例如硫酸根或醋酸根离子。本领域技术人员知道还 有其他添加剂，例如DNA聚合酶的稳定剂和/或PCR增强剂。这些物质的例子是甜菜碱 (0.1-2.0M)、海藻糖(0.02-2.0M)、山梨糖醇(0.02-2.0M)、二甲基亚砜(高达5%体积/ 体积)或四甲基氯化铵(高达5%体积/体积)。此外，有时可加入200-2000mg/mL牛 血清白蛋白(BSA)或明胶以中和不纯DNA样品制剂中PCR抑制物的作用。也优选在合成混合物中加入足量的三磷酸核苷，优选dATP、dCTP、dGTP、 dTTP和/或dUTP。核苷酸的摩尔浓度优选为40-500 μ M，具体是100-250 μ Μ。虽然 这种dNTP浓度适合于本发明方法，但高于500 μ M的浓度可能有利于某些实施方式。优选本发明聚合酶选自以下菌属的细菌栖热菌属(Thermus)、产液 菌属(Aquifex)、栖热袍菌属(Thermotoga)、热发状菌属(Thermocridis)、氢杆 菌属(Hydrogenobacter)、嗜热蓝细菌属(Thermosynchecoccus)禾口热厌氧杆菌属 (Thermoanaerobacter)。优选本发明聚合酶选自以下生物体伊欧产液菌属(Aquifex aeolicus)、酿脓产 液菌属(Aquifex pyogenes)、B耆热栖热菌(Thermus thermophilus)、7_Κ生栖热菌(Thermus aquaticus)、那不勒其j 栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)、太平洋栖热菌(Thermus pacificus)禾口海栖热袍菌(Thermotoga maritima)。
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DNA聚合酶I是在原核细胞中介导DNA复制过程的酶。Pol I是首个发现的具 有聚合酶活性的酶，并且是对其特征最了解的酶。虽然此酶是发现的具有获得性聚合酶 活性的第一种酶，但它不是参与细菌DNA复制的原始酶。1956年Arthur Komberg发现 它是第一种已知的DNA聚合酶，最初是在大肠杆菌(E.coli)中得到特征鉴定，但它在原 核生物中广泛存在。常将它简称为Poll。在大肠杆菌和许多其他细菌中，编码Poll的 基因称为pol-A。在本发明中，优选的酶是pol-A型聚合酶。最优选的聚合酶是Taq DNA聚合酶。在一个实施方式中，在PCR反应中掺入尿嘧啶残基。尿嘧啶DNA糖基化酶(尿 嘧啶-N-糖基化酶)是大肠杆菌ung基因的产物，已克隆、测序和在大肠杆菌中表达。 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)能去除DNA (单链和双链)中的这些尿嘧啶残基，但不破 坏DNA糖-磷酸二酯键主链，从而防止其成为杂交靶点或DNA聚合酶的模板。在升高 的温度下，(酶解)产生的脱碱基位点易于被水解切割。因此，去除尿嘧啶碱基通常伴 随着DNA片段化。本领域技术人员知道如何使用尿嘧啶DNA糖基化酶来避免污染。同 样，此酶以及尿嘧啶核苷酸均可用于本发明试剂盒中。在一个优选实施方式中，至少同时扩增25个基因座。在另一实施方式中，可用等位基因特异性多重PCR扩增本发明的DIP基因座 (本文披露的SEQ ID)和基因分型(美国专利号5,595,890 ； Newton CR，Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, MarkhamAF. “DNA 中 的点突变分析扩增受阻突变系统(Analysis ofanypoint mutation in DNA.The amplification refractory mutation system (ARMS)) .Nucleic Acids Res 17 2503-2516，1989)。在这个例 子中，每个基因座用了三种引物，一种是基因座特异性引物，两种是等位基因特异性引 物。等位基因特异性引物的3’ -末端位于DIP序列内，这种方式可使DNA聚合酶合成 等位基因特异性延伸产物。因此，在杂合DNA的情况下，可在一次PCR中用基因座特 异性引物同时产生两种不同扩增子。如果这两种等位基因特异性扩增子可通过电泳区分 其大小，只需采用一种标记的引物(基因座特异性引物)。如果不能区分，可用人造加尾 序列延伸一个等位基因特异性引物的5’端(用核苷酸或迁移修饰剂在5’端加尾)，或 者用两种不同的荧光团标记两种等位基因特异性引物的5’端。在一个特别优选的实施方式中，至少同时扩增30个基因座。在另一优选的实施方式中，至少同时扩增40个基因座。在进一步优选的实施方式中，至少同时扩增50个基因座。在本发明序型分析试验的一个特别优选的实施方式中，所述三组扩增产物包括 至少六种扩增产物。本发明人第一次证明，一次反应产生30种扩增产物是可能的，反应 中至少用三种颜色标记PCR引物。本发明人已鉴定到这种理想的分布，能够在多个装置 上进行检测，同时能够提高相同性综合概率(CPI)。本发明人发现，这使得能够额外利用测序装置中通常存在的第四种颜色作为不 同类型的对照和/或梯。因此，采用至少三组扩增产物可能包含至少十种扩增产物这一令人惊讶的事 实，第一次使得能够采用数量足够高的DIP获得高的相同性综合概率(CPI)评分，同时允 许有一个额外的对照泳道/染料/标记。这导致不需要使用STR。
本发明人已用德国人群的样品测试过该系统。该系统的相同性综合概率(CPI) 为2,1X10_13。这是一个极佳值，优于采用8种STR的AmpFISTRMinifilier试剂盒(CPI为 8,21xlO-11)。另外，本发明人能够证明，本发明30种DIP的CPE/Trio(排除亲子关系的综合 概率)为 0,9979205。因此，在本发明序型分析试验的一个实施方式中，a)-c)三组扩增产物包括至 少十种扩增产物，它们显示的相同性综合概率(CPI)为2,1X10_13或更优，和/或它们的 CPE/Trio(排除亲子关系的综合概率)为0,9979205或更优。各基因座的两个等位基因的大小差异优选大于1个核苷酸小于40个核苷酸。源自至少两个不同基因座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的两种或多种 扩增产物优选携带第四标记。同样，在另一实施方式中，可采用5、6、7种或更多种标 记。由于DNA的核苷酸内含物优选4种标记，，因此用于扩增产物DNA测序的大多数 装置都能够检测4种标记。所述标记优选荧光染料。这类染料可选自荧光素异硫氰酸酯(FITC)、6-羧基 荧光素(6-FAM)、2，7-萤光素二醋酸酯(xanthen)、罗丹明、6-羧基-2，，4，，7，， 4，7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4，，5，-二氯_2，，7，-二甲氧基荧光素(JOE)、 N，N，N，，N，-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、 5_羧基罗丹明-6GCR6G5)、2，-氯_7，苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)、 2'-氯-5'-氟-7'，8'-苯并-1，4-二氯-6-羧基荧光素(NED)或PET(美国加 州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystems、Foster City、CA、USA)的专有产 品)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明110;香豆素、得克萨斯红、Cy3、Cy5、Cy7和 BODIPY 染料。用三种颜色标记PCR寡核苷酸内部长度标准品时，优选的组合是6-FAM(蓝 色)、VIC(绿色)、NED(黄色)，ROX(红色)。任选将6-FAM(蓝色)、VIC(绿 色)、NED (黄色)和PET (红色)用作PCR引物标记，联合用LIZ (橙色)标记内部长度 标准品。表1列出了与应用生物系统公司(美国加州福斯特城)自动化测序设备联用的 多重PCR所用的其他优选的标记染料组合。应提及，也有其他多色自动化测序设备，如 CEQ 8000系列遗传分析仪(美国加州富勒敦的贝克曼库尔特公司(Beckmarai Coulter, Fullerton, CA, USA))、MEGABace 系列基因分型系统(英国白金汉郡的GE健康护 理公司(GE Healthcare，Buckinghamshire, UK))或 LI-CORE 4300 DNA 分析系统(英国 剑桥的英国 LI-CORE 生物科学公司(LI-CORE Biosciences UK，Cambridge, UK))，或 可能出现其他光学系统、因而需要其他荧光染料和染料组合的自动化设备。因此，联用 其他荧光团用于其他自动化测序设备的本发明实施方式任何时候都有可能建立。美国专利6,734,296、美国专利5,624,800和WO 2006071568 (通过引用纳入本文) 公开了用所谓迁移修饰剂提高后续用毛细管凝胶电泳进行基因分型的多重检测的应用程 度。迁移修饰剂定义为引物5’端的共价非核苷酸修饰，这种修饰能降低DNA扩增产 物、引物延伸产物或寡核苷酸-连接酶产物的电泳迁移率。这种技术能够分离含有相同 数量核苷酸的多种扩增产物的DNA片段。在一个优选的实施方式中，通过标准的亚磷 酰胺化学法，在寡核苷酸5’端与多种引物亚组的荧光标记之间合成不同数量(n= 1、2、3、....)的六乙二醇部分(Grossman PD，BlochW，Brinson E, Chang CC, Eggerding FA, Fung S, Iovannisci, DM, Woo S, Winn-Deen ES. “核酸序列的高密度多重检 测寡核苷酸连接试验和序列编码的分离(High-densitymultiplex detection of nucleic acid sequences oligonucleotide ligation assayand sequence-coded separation), Nucleic Acids Res
22 4527-34， 1994)。表1:与应用生物系统公司测序设备相容的组合荧光染料。染料缩写名的解释 参见正文。
颜色数蓝色绿色黄色红色橙色46-FAMHEXNEDROX46-FAMVICNEDROX46-FAMTETHEXTAMRA46-FAMJOENEDROX56-FAMVICNEDPETLIZ56-FAMHEXNEDPETLIZ45/6-FAMJOETMRROX在一个实施方式中，用毛细管凝胶电泳装置进行检测步骤。也可以在凝胶装置 上进行检测步骤。为各个基因座构建等位基因梯后，在加入扩增样品的同时，混合和加入这些基 因梯进行凝胶电泳。各等位基因梯与样品中相应基因座的等位基因共同迁移。可利用泳 道内部标准品评价本发明多重反应的产物，泳道内部标准品是专门用于在聚丙烯酰胺凝 胶同一泳道或同一根毛细管中运行的大小标记物类型。泳道内部标准品优选由一系列已 知长度的片段组成。泳道内部标准品更优选用一种荧光染料标记，该染料可与扩增反应 中的其他染料相区别。本发明还涉及本文所述DIP在制备等位基因梯中的应用。构建泳道内部标准品后，也可将此种标准品与扩增的样品或等位基因梯混合加 入进行电泳，比较凝胶电泳不同泳道中或毛细管电泳不同毛细管中的迁移。泳道内部标 准品迁移的差异标示出分离介质行为的差异。定量测定此种差异并与等位基因梯相关联 后，能够校正对未知样品中等位基因大小的测定。在另一实施方式中，还扩增一个或多个短串联重复序列(STR)，和/或扩增 一个或多个数目不同的串联重复序列(VNTR)，和/或扩增一个或多个单核苷酸多态性 (SNP)。因此，按照这些实施方式，DIP可与其他多态性序列混合。优选STR序列。
28
至关重要的是经常需要能够测定个体的性别。因此，在前述权利要求任一项所 述的序型分析试验的一个实施方式中，还扩增一个或多个非重组无变异的X-和/或Y-染 色体DNA序列、性别特异性短串联重复序列(STR)，和/或一个或多个性别特异性数目 不同的串联重复序列(VNTR)和/或扩增一个或多个性别特异性单核苷酸多态性(SNP)。 优选的基因座是牙釉蛋白基因座，它有两个平行进化的同源拷贝AmelX和AmelY，位 于人性染色体的非重组区域内(AkaneA. “用PCR分析X_Y牙釉蛋白基因进行性别鉴 定” (Sexdetermination by PCR analysis of the X_Y amelogenin gene)，Methods MolBiol，第 98卷，第245-249页，1998)。牙釉蛋白基因的内含子1某些部分编码DIP，可通过聚 合酶链反应(PCR)利用该DIP测定未知来源样品的人性别。例如，DNASEQIDN0.61 和SEQ ID N0.62分别是AmelX和AmelY序列，其编码6bp DIP (-/AAAGTG)。可用弓| 物SEQ ID NO.185和SEQ IDN0.186扩增X-染色体的113bp片段和Y-染色体的119bp， 进行电泳分离。同样，DNA SEQ ID N0.63和SEQ ID N0.64分别是AmelX和AmelY序 列，其编码3bp DIP (-/GAT)。可用引物SEQ ID NO. 187和SEQ ID NO. 188扩增X-染色 体的83bp片段和Y-染色体的86bp，进行电泳分离。本发明方法所用的引物对必须满足某些标准。它们必须能与所需位置特异性杂 交。假退火对该反应非常不利。Ta优选50-68°C，更优选56-65°C或57-63°C，最优选 59-61°C。GC含量优选20-60% GC。长度优选18_30bp。在多重PCR中，优选引物最 大自身互补和所有引物之间的最大互补为3-7bp。而且，高度多重PCR合适引物的选择 总是需要根据经验使之优化以避免产生非特异性副产物。在本发明序型分析试验的一个非常优选的实施方式中，引物-寡核苷酸对选自 具有以下序列的核酸分子a) DIP NO. 1 SEQ ID NO.125 和 SEQ ID NO.126
或者 SEQ ID N0.267 和 SEQ ID N0.268b)DIPN0.2 SEQ ID NO. 127 和 SEQ ID NO. 128c)DIPN0.3 SEQ ID NO.129 和 SEQ ID NO.130d) DIP NO.4 SEQ ID NO. 131 和 SEQ ID NO. 132e)DIPN0.5 SEQ ID NO.133 和 SEQ ID NO.134f)DIP NO.6 SEQ ID N0.135 和 SEQ ID NO. 136g)DIPN0.7 SEQ ID NO. 137 和 SEQ ID NO. 138h) DIP NO.8 SEQ ID NO. 139 和 SEQ ID NO. 140或者SEQ ID N0.287 和 SEQ ID N0.288i) DIP NO.9 SEQ ID NO. 141 和 SEQ ID NO. 142j) DIP NO. 10 SEQ ID NO. 143 禾口 SEQ ID NO. 144k)DIP NO.ll SEQ ID NO. 145 和 SEQ ID NO. 1461) DIP NO. 12 SEQ ID NO. 147 和 SEQ ID NO. 148m) DIP NO. 13 SEQ ID NO. 149 和 SEQ ID N0.150n)DIP NO. 14 SEQ ID NO. 151 和 SEQ ID NO. 152o) DIP NO. 15 SEQ ID NO. 153 和 SEQ ID NO. 154或者SEQ ID N0.281 和 SEQ ID N0.282
p) DIP NO. 16 SEQIDN0.155 和 SEQIDN0.156q) DIP NO. 17 SEQ ID N0.157 和 SEQ ID N0.158或者SEQ ID N0.273 和 SEQ ID N0.274r)DIP NO. 18 SEQ ID NO. 159 和 SEQ ID NO. 160或者SEQ ID N0.277 和 SEQ ID N0.278s) DIP NO. 19 SEQ ID NO. 161 和 SEQ ID NO. 162或者SEQ ID N0.279 和 SEQ ID N0.280t) DIP N0.20 SEQ ID NO. 163 和 SEQ ID NO. 164或者SEQ ID N0.275 和 SEQ ID N0.276u)DIPN0.21 SEQ ID NO. 165 和 SEQ ID NO. 166v) DIP N0.22 SEQ ID NO. 167 和 SEQ ID NO. 168w)DIPN0.23 SEQ ID NO. 169 和 SEQ ID NO. 170x)DIP N0.24 SEQ ID NO. 171 和 SEQ ID NO. 172y)DIPN0.25 SEQ ID NO. 173 禾口 SEQ ID NO. 174z)DIPN0.26 SEQ ID NO.175 和 SEQ ID NO.176aa)DIPN0.27 SEQ ID NO. 177 和 SEQ ID NO. 178ab)DIPN0.28 SEQ ID NO.179 和 SEQ ID NO.180ac) DIP N0.29 SEQ ID NO. 181 和 SEQ ID NO. 182或者SEQ ID N0.271 与 SEQ ID N0.272ad)DIPN0.30 SEQ ID NO. 183 和 SEQ ID NO. 184或者SEQ ID N0.283 和 SEQ ID N0.284ae)DIPN0.31 SEQ ID NO. 185 和 SEQ ID NO. 186af) DIP N0.32 SEQ ID NO. 187 和 SEQ ID NO. 188或者SEQ ID N0.269 和 SEQ ID N0.270ag)DIPN0.33 SEQ ID NO. 189 和 SEQ ID NO. 190或者SEQ ID N0.285 和 SEQ ID N0.286ah) DIP N0.34 SEQ ID NO. 191 和 SEQ ID NO. 191ai)DIPN0.35 SEQ ID NO. 193 和 SEQ ID NO. 194aj)DIPN0.36 SEQ ID NO. 195 和 SEQ ID NO. 196ak)DIPN0.37 SEQ ID NO. 197 和 SEQ ID NO. 198al) DIP N0.38 SEQ ID NO. 199 和 SEQ ID N0.200am)DIPN0.39 SEQ ID N0.201 和 SEQ ID N0.202an) DIP N0.40 SEQ ID N0.203 和 SEQ ID N0.204
ao) DIP N0.41 SEQ ID N0.205 和 SEQ ID N0.206或者SEQ ID N0.251 与 SEQ ID N0.252ap) DIP N0.42 SEQ ID N0.207 和 SEQ ID N0.208或者SEQ ID N0.253 和 SEQ ID N0.254aq) DIP N0.43 SEQ ID N0.209 和 SEQ ID N0.210或者SEQ ID N0.255 与 SEQ ID N0.2560127]ar) DIP N0.44 SEQ ID N0.211 和 SEQ ID N0.2120128]或者 SEQ ID N0.257 和 SEQ ID N0.2580129]as) DIP N0.45 SEQ ID N0.213 和 SEQ ID N0.2140130]或者 SEQ ID N0.259 和 SEQ ID N0.2600131]at) DIP N0.46 SEQ ID N0.215 和 SEQ ID N0.2160132]或者 SEQ ID N0.261 和 SEQ ID N0.2620133]au) DIP N0.47SEQ ID N0.217 和 SEQ ID N0.2180134]或者 SEQ ID N0.263 和 SEQ ID N0.2640135]av) DIP N0.48 SEQ ID N0.219 和 SEQ ID N0.2200136]aw) DIP N0.49SEQIDN0.221 和 SEQIDN0.2220137]ax) DIP N0.50SEQ ID N0.223 和 SEQ ID N0.2240138]ay) DIP NO.51SEQ ID N0.225 和 SEQ ID N0.2260139]或者 SEQ ID N0.265 和 SEQ ID N0.2660140]az) DIP N0.52 SEQ ID N0.227 和 SEQ ID N0.2280141]ba) DIP N0.53SEQ ID N0.229 和 SEQ ID N0.2300142]bb) DIP N0.54SEQ ID N0.231 和 SEQ ID N0.2320143]be) DIP N0.55SEQ ID N0.233 和 SEQ ID N0.2340144]bd) DIP N0.56SEQ ID N0.235 和 SEQ ID N0.2360145]be) DIP N0.57SEQ ID N0.237 和 SEQ ID N0.2380146]bf) DIP N0.58 SEQ ID N0.239 和 SEQ ID N0.2400147]bg) DIP N0.59SEQ ID N0.241 和 SEQ ID N0.2420148]bh) DIP N0.60SEQ ID N0.243 和 SEQ ID N0.2440149]bi) DIP NO.61 SEQ ID N0.245 和 SEQ ID N0.2460150]bj) DIP N0.62 SEQ ID N0.247 与 SEQ ID N0.2480151]bk) DIP N0.63SEQ ID N0.249 和 SEQ ID N0.2500152]优选选择至少 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、9、20、21、22、23、24、25、26、27 对或 30 对以上。0153]本发明涉及一种用于DNA序型分析方法的试剂盒，其包括用于聚合酶链反应扩
增的至少 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30对或更多对引物，其中所述引物对由一个上游引 物和一个下游引物组成，能够结合选自以下序列中任何之一的特异性DIP序列，DIP NO. 1 -SEQ ID N0.1,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.2,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP N0.2 -SEQ ID N0.3,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间，-SEQ ID N0.4,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与255之间，DIP N0.3 -SEQ ID N0.5,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，0162]-SEQ ID N0.6,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，
0163]DIP N0.4
0164]-SEQIDNO
0165]-SEQIDNO
0166]DIP N0.5
0167]-SEQIDNO
0168]-SEQIDNO
0169]DIP N0.6
0170]-SEQ ID NO
0171]-SEQ ID NO
0172]DIP NO.7
0173]-SEQ ID NO
0174]-SEQ ID NO
0175]DIP NO.8
0176]-SEQ ID NO
0177]-SEQ ID NO
0178]DIP N0.9
0179]-SEQ ID NO
0180]-SEQ ID NO
0181]DIP NO. 10
0182]-SEQ ID NO
0183]-SEQ ID NO
0184]DIP NO. 11
0185]-SEQ ID NO
0186]-SEQ ID NO
0187]DIP NO. 12
0188]-SEQ ID NO
0189]-SEQ ID NO
0190]DIP NO. 13
0191]-SEQ ID NO
0192]-SEQ ID NO
0193]DIP NO. 14
0194]-SEQ ID NO
0195]-SEQ ID NO
0196]DIP NO. 15
0197]-SEQ ID NO
0198]-SEQ ID NO
0199]DIP NO. 16
0200]-SEQ ID N0.31，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，
,7，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， ,8，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与262之间，
,9，其中缺失_插入多态性位于核苷酸编251与252之间， ,10，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，
,11，其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,12，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，
,13，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,14，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，
,15，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,16，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，
,17,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,18，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间，
,19，其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与247之间， ,20，其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与252之间，
,21，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,22，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，
,23，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， ,24，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与260之间，
,25，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,26，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，
,27，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,28，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与260之间，
,29，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,30，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与263之间，
32-SEQ ID N0.32，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO 17 -SEQ ID N0.33, -SEQ ID N0.34, DIP NO. 18 -SEQ ID N0.35, -SEQ ID N0.36, DIP NO. 19 -SEQ ID N0.37, -SEQ ID N0.38, DIP N0.20 -SEQ ID N0.39, -SEQ ID N0.40, DIP N0.21 -SEQ ID N0.41, -SEQ ID N0.42, DIP N0.22 -SEQ ID N0.43, -SEQ ID N0.44, DIP N0.23 -SEQ ID N0.45, -SEQ ID N0.46, DIP N0.24 -SEQ ID N0.47, -SEQ ID N0.48, DIP N0.25 -SEQ ID N0.49, -SEQ ID N0.50, DIP N0.26 -SEQ ID N0.51, -SEQ ID N0.52, DIP NO 27 -SEQ ID N0.53, -SEQ ID N0.54, DIP N0.28 -SEQ ID N0.55, -SEQ ID N0.56, DIP N0.29
-SEQ ID N0.57,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与270之间，
其中插入_缺失多态性位于核苷酸251与252之间， 其中插入_缺失多态性位于核苷酸251与263之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与257之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与257之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与258之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与257之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与257之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与263之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与296之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与266之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与273之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与260之间，-SEQ ID N0.58，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与267之间， DIP N0.30 -SEQ ID N0.59, -SEQ ID N0.60, DIP N0.31 -SEQ ID N0.61, -SEQ ID N0.62, DIP N0.32 -SEQ ID N0.63, -SEQ ID N0.64, DIP N0.33 -SEQ ID N0.65, -SEQ ID N0.66, DIP N0.34 -SEQ ID N0.67, -SEQ ID N0.68, DIP N0.35 -SEQ ID N0.69, -SEQ ID N0.70, DIP N0.36 -SEQ ID N0.71, -SEQ ID N0.72, DIP N0.37 -SEQ ID N0.73, -SEQ ID N0.74, DIP N0.38 -SEQ ID N0.75, -SEQ ID N0.76, DIP N0.39 -SEQ ID N0.77, -SEQ ID N0.78, DIP N0.40 -SEQ ID N0.79, -SEQ ID N0.80, DIP N0.41 -SEQ ID N0.81, -SEQ ID N0.82, DIP N0.42
-SEQ ID N0.83，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与270之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸271与272之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸271与278之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸280与281之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸280与284之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与256之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与256之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与255之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与258之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与256之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸255与256之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸255与261之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与256之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与259之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与254之间，
-SEQ ID N0.84，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与254之间，DIP N0.43 -SEQ ID N0.85,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.86，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与255之间，DIP NO.44 -SEQ ID N0.87，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间，-SEQ ID N0.88，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间，DIP N0.45 -SEQ ID N0.89，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间，-SEQ ID N0.90,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间，DIP N0.46 -SEQ ID N0.91，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间，-SEQ ID N0.92,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间，DIP N0.47 -SEQ ID N0.93，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.94，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP N0.48 -SEQ ID N0.95，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.96，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP N0.49 -SEQ ID N0.97，其中缺失-插入多态性位于核苷酸247与248之间，-SEQ ID N0.98，其中缺失-插入多态性位于核苷酸247与252之间，DIP N0.50 -SEQ ID N0.99，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间，-SEQ ID NO. 100,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间，DIPN0.51 -SEQ ID NO. 101,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.102,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间，DIP N0.52 -SEQ ID N0.103,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间，-SEQ ID NO. 104,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间，DIP N0.53 -SEQ ID NO. 105,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间，-SEQ ID NO. 106,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间，DIP N0.54 -SEQ ID NO. 107,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID NO. 108,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与258之间，DIP N0.55 -SEQ ID NO. 109,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，
一SEQ ID NO．110，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与258之间，
DIP NO．56
一SEQ ID NO．11l，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与25l之间，
一SEQ ID NO．112，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与258之间，
DIP NO．57
一SEQ ID NO．113，其中缺失一插入多态性位于核苷酸246与247之间，
一SEQ ID NO．114，其中缺失一插入多态性位于核苷酸246与252之间，
DIP NO．58
一SEQ ID NO．115，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与25l之间，
一SEQ ID NO．116，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与263之间，
DIP NO．59
一SEQ ID NO．117，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与25l之间，
一SEQ ID NO．118，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与266之间，
DIP NO．60
一SEQ ID NO．119，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．120，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与268之间，
DIP NO．6l
一SEQ ID NO．12l，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与25l之间，
一SEQ ID NO．122，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与277之间，
DIP NO．62
一SEQ ID NO．123，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．124，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与260之间，
DIP NO．63
一SEQ ID NO．289，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与25l之间，
一SEQ ID NO．290，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与256之间，
其中所述引物对各为不同DIP序列的特异性引物对。
所述试剂盒优选包括至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2l、22、23、24、25、26、27或30个以上引物对。
所述试剂盒优选至少包括20、30或40个DIP的引物，所述试剂盒包括DIP编号3l的引物(SEQ ID NO．6l和62)和DIP编号32的引物(SEQ IDNO．63和64)。
这两种DIP分别是Y染色体和X染色体上的DIP。
所述试剂盒优选包括各自能够结合选自以上不同序列的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2l、22、23、24、25、26、27、28、29或30．／卜引物对。
优选试剂盒包括的引物对选自以下的引物对
a)DIP NO．1SEQ II)NO．125和SEQ II)NO．126
或者SEQ ID NO．267和SEQ ID NO．268
b)DIP NO．2SEQ II)NO．127和SEQ II)NO．128
C)DIP NO．3SEQ II)NO．129和SEQ II)NO．130d)DIP N0.4 SEQ ID NO. 131 禾口 SEQIDN0.132
e)DIP N0.5 SEQ ID NO.133 禾口 SEQ ID NO.134
f)DIPN0.6 SEQ ID N0.135 和 SEQ ID NO. 136
g)DIPN0.7 SEQ ID NO. 137 禾P SEQ ID NO. 138
h)DIP N0.8 SEQ ID NO. 139 禾P SEQ ID NO. 140 或者 SEQ ID N0.287 和 SEQ ID N0.288
i)DIP N0.9 SEQ ID NO. 141 和 SEQ ID NO. 142 j) DIP NO. 10 SEQ ID NO. 143 禾口 SEQ ID NO. 144 k)DIP NO.ll SEQ ID NO. 145 和 SEQ ID NO. 146 1) DIP NO. 12 SEQ ID NO. 147 和 SEQ ID NO. 148 m) DIP NO. 13 SEQ ID NO. 149 禾P SEQ ID N0.150 n) DIP NO. 14 SEQ ID NO. 151 和 SEQIDN0.152 o) DIP NO. 15 SEQ ID NO. 153 禾P SEQ ID NO. 154 或者 SEQ ID N0.281 和 SEQ ID N0.282
p) DIP NO. 16 SEQ ID NO. 155 和 SEQ ID NO. 156
q) DIP NO. 17 SEQ ID NO. 157 禾P SEQ ID NO. 158
或者 SEQ ID N0.273 和 SEQ ID N0.274
r)DIP N0.18 SEQ ID NO. 159 和 SEQ ID N0.160
或者 SEQ ID N0.277 和 SEQ ID N0.278
s) DIP NO. 19 SEQ ID NO. 161 和 SEQ ID NO. 162
或者 SEQ ID N0.279 和 SEQ ID N0.280
t) DIP N0.20 SEQ ID NO. 163 和 SEQ ID NO. 164
或者 SEQ ID N0.275 和 SEQ ID N0.276
u) DIP N0.21 SEQ ID NO. 165 和 SEQ ID NO. 166
v) DIP N0.22 SEQ ID NO. 167 和 SEQ ID NO. 168
w) DIP N0.23 SEQ ID NO. 169 禾P SEQ ID NO. 170
x) DIP N0.24 SEQ ID NO. 171 和 SEQIDN0.172
y) DIP N0.25 SEQ ID NO. 173 禾P SEQ ID NO. 174
z) DIP N0.26 SEQ ID NO.175 和 SEQ ID NO. 176
aa)DIP N0.27 SEQ ID NO. 177 和 SEQ ID NO. 178
ab)DIP N0.28 SEQ ID NO. 179 和 SEQ ID NO.180
ac)DIP N0.29 SEQ ID NO. 181 和 SEQ ID NO. 182 或者 SEQ ID N0.271 与 SEQ ID N0.272
ad)DIP N0.30 SEQ ID NO. 183 和 SEQ ID NO. 184 或者 SEQ ID N0.283 和 SEQ ID N0.284
ae)DIP N0.31 SEQ ID NO. 185 和 SEQ ID NO. 186
af)DIP N0.32 SEQ ID NO. 187 和 SEQ ID NO. 188 或者 SEQ ID N0.269 和 SEQ ID N0.270
ag)DIP N0.33 SEQ ID NO. 189 和 SEQ ID NO. 190
37或者 SEQ ID N0.285 和 SEQ ID N0.286
ah)DIP N0.34 SEQ ID NO. 191 和 SEQ ID NO. 191
ai)DIP N0.35 SEQ ID NO. 193 和 SEQ ID NO. 194 aj) DIP N0.36 SEQ ID NO. 195 和 SEQ ID NO. 196 ak) DIP N0.37 SEQ ID NO. 197 和 SEQ ID NO. 198 al) DIP N0.38 SEQ ID NO. 199 和 SEQ ID N0.200 am) DIP N0.39 SEQ ID N0.201 和 SEQ ID N0.202 an) DIP N0.40 SEQ ID N0.203 禾口 SEQ ID N0.204 ao) DIP N0.41 SEQ ID N0.205 和 SEQ ID N0.206 或者 SEQ ID N0.251 与 SEQ ID N0.252
ap) DIP N0.42 SEQ ID N0.207 禾口 SEQ ID N0.208
或者 SEQ ID N0.253 和 SEQ ID N0.254
aq) DIP N0.43 SEQ ID N0.209 和 SEQ ID N0.210
或者 SEQ ID N0.255 与 SEQ ID N0.256
ar) DIP N0.44 SEQ ID N0.211 和 SEQ ID N0.212
或者 SEQ ID N0.257 和 SEQ ID N0.258
as) DIP N0.45 SEQ ID N0.213 和 SEQ ID N0.214
或者 SEQ ID N0.259 和 SEQ ID N0.260
at) DIP N0.46 SEQ ID N0.215 禾P SEQIDN0.216
或者 SEQ ID N0.261 和 SEQ ID N0.262
au) DIP N0.47 SEQ ID N0.217 禾P SEQ ID N0.218
或者 SEQ ID N0.263 和 SEQ ID N0.264
av) DIP N0.48 SEQ ID N0.219 禾口 SEQ ID N0.220
aw) DIP N0.49 SEQ ID N0.221 和 SEQ ID N0.222
ax) DIP N0.50 SEQ ID N0.223 和 SEQ ID N0.224
ay) DIP N0.51 SEQ ID N0.225 和 SEQ ID N0.226
或者 SEQ ID N0.265 和 SEQ ID N0.266
az) DIP N0.52 SEQ ID N0.227 和 SEQ ID N0.228
ba)DIP N0.53 SEQ ID N0.229 禾口 SEQ ID N0.230
bb)DIP N0.54 SEQ ID N0.231 和 SEQ ID N0.232 be) DIP N0.55 SEQ ID N0.233 禾口 SEQ ID N0.234
bd)DIP N0.56 SEQ ID N0.235 和 SEQ ID N0.236
be)DIP N0.57 SEQ ID N0.237 禾口 SEQ ID N0.238
bf)DIP N0.58 SEQ ID N0.239 和 SEQ ID N0.240
bg)DIP N0.59 SEQ ID N0.241 和 SEQ ID N0.242
bh)DIP N0.60 SEQ ID N0.243 和 SEQ ID N0.244
bi)DIP N0.61 SEQ ID N0.245 和 SEQ ID N0.246 bj) DIP N0.62 SEQ ID N0.247 与 SEQ ID N0.248 bk) DIP N0.63 SEQ ID N0.249 禾P SEQ ID N0.250
在本发明的一个实施方式中，本发明涉及采用选自以下的至少2、3、4、5、6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、28、29、30个或更多个序列DIP NO. 1 -SEQ ID N0.1，其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.2，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP N0.2 -SEQ ID N0.3，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间，-SEQ ID N0.4，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与255之间，DIP N0.3 -SEQ ID N0.5，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.6，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP N0.4 -SEQ ID N0.7，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间，-SEQ ID N0.8，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与262之间，DIP N0.5 -SEQ ID N0.9，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID NO.IO,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP N0.6 _SEQIDNO.il，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.12，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP N0.7 -SEQ ID N0.13，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID NO. 14,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP N0.8 -SEQ ID N0.15，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.16，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP N0.9 -SEQ ID N0.17，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.18，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间，DIP NO. 10 -SEQ ID N0.19，其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与247之间，-SEQ ID N0.20,其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与252之间，DIP NO. 11 -SEQ ID NO.21，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.22，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP NO. 12 -SEQ ID N0.23，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间，-SEQ ID N0.24，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与260之间，
DIP N0．13
一SEQ ID NO．25，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．26，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与256之间，
DIP N0．14
一SEQ ID NO．27，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．28，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与260之间，
DIP N0．15
一SEQ ID NO．29，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．30，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与263之间，
DIP N0．16
一SEQ ID NO．3l，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．32，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与256之间，
DIP N017
一SEQ ID NO．33，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．34，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与270之间，
DIP N0．18
一SEQ ID NO．35，其中插入一缺失多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．36，其中插入一缺失多态性位于核苷酸25l与263之间，
DIP N0．19
一SEQ ID NO．37，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．38，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与257之间，
DIP N0．20
一SEQ ID NO．39，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．40，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与257之间，
DIP NO．2l
一SEQ ID NO．41，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．42，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与258之间，
DIP N0．22
一SEQ ID NO．43，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与25l之间，
一SEQ ID NO．44，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与257之间，
DIP N0．23
一SEQ ID NO．45，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．46，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与257之间，
DIP N0．24
一SEQ ID NO．47，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与252之间，
一SEQ ID NO．48，其中缺失一插入多态性位于核苷酸25l与263之间，
DIP N0．25
一SEQ ID NO．49，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与25l之间，
一SEQ ID NO．50，其中缺失一插入多态性位于核苷酸250与296之间，DIP N0.26 -SEQ ID N0.51, -SEQ ID N0.52, DIP NO 27 -SEQ ID N0.53, -SEQ ID N0.54, DIP N0.28 -SEQ ID N0.55, -SEQ ID N0.56, DIP N0.29 -SEQ ID N0.57, -SEQ ID N0.58, DIP N0.30 -SEQ ID N0.59, -SEQ ID N0.60, DIP N0.31 -SEQ ID N0.61, -SEQ ID N0.62, DIP N0.32 -SEQ ID N0.63, -SEQ ID N0.64, DIP N0.33 -SEQ ID N0.65, -SEQ ID N0.66, DIP N0.34 -SEQ ID N0.67, -SEQ ID N0.68, DIP N0.35 -SEQ ID N0.69, -SEQ ID N0.70, DIP N0.36 -SEQ ID N0.71, -SEQ ID N0.72, DIP N0.37 -SEQ ID N0.73, -SEQ ID N0.74, DIP N0.38 -SEQ ID N0.75, -SEQ ID N0.76,
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与266之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与273之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与260之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与267之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与270之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸271与272之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸271与278之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸280与281之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸280与284之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与256之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与256之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与255之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与258之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与256之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸255与256之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸255与261之间，DIP N0.39 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.40 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.41 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.42 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.43 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.44 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.45 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.46 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.47 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.48 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.49 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.50 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.51 -SEQ ID NO -SEQ ID NO
,77,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,78,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，
,79,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， ,80，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与259之间，
,81，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,82，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与254之间，
,83，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,84，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与254之间，
,85，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,86，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与255之间，
,87，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， ,88，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间，
,89，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， ,90，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间，
,91，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， ,92，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间，
,93，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,94，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，
,95，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,96，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，
,97，其中缺失-插入多态性位于核苷酸247与248之间， ,98，其中缺失-插入多态性位于核苷酸247与252之间，
,99，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， ,100，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间，
,101，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， ,102，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间，DIP N0.52 -SEQ ID NO. 103， -SEQ ID NO. 104， DIP N0.53 -SEQ ID NO. 105， -SEQ ID NO. 106， DIP N0.54 -SEQ ID NO. 107， -SEQ ID NO. 108， DIP N0.55 -SEQ ID NO. 109， -SEQ ID NO. 110， DIP N0.56 -SEQ ID NO.lll, -SEQ ID NO. 112， DIP N0.57 -SEQ ID NO. 113， -SEQ ID NO. 114， DIP N0.58 -SEQ ID NO. 115， -SEQ ID NO. 116， DIP N0.59 -SEQ ID NO. 117， -SEQ ID NO. 118， DIP N0.60 -SEQ ID NO. 119， -SEQ ID NO. 120， DIP N0.61 -SEQ ID NO. 121， -SEQ ID NO. 122， DIP N0.62 -SEQ ID NO. 123， -SEQ ID NO. 124， DIP N0.63 -SEQ ID N0.289, -SEQ ID N0.290,
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与256之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与256之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与258之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与258之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与258之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸246与247之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸246与252之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与263之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与266之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与268之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与277之间，
其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与252之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸251与260之间，和
其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与251之间， 其中缺失_插入多态性位于核苷酸250与256之间。
只可以部分使用这些序列。可采用90%、80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%或20%的序列，只要其包括使用DIP。这意味着，如果本文揭示含有100个核苷酸 的序列，其中DIP距离该序列5’端30个核苷酸，那么意味可采用50%，例如，扩增从
435’端开始的前50个核苷酸，当然也意味可扩增任何50个核苷酸，只要其包含该DIP多 态性。DIPN0.31和32是牙釉蛋白DIP。优选这些DIP是所选DIP的一部分。在一个实施方式中，所述试剂盒还可包括进行“实时PCR”应用所需的组分。 术语“实时PCR”指依据荧光信号进行检测和定量测定的系统。这种信号的增加与PCR 反应产物的含量成正比。通过记录每个循环的荧光发射量，就能监测指数期PCR反应， 其中最初显著增加的PCR产物量与目标模板的初始量相关。靶核酸的起始拷贝数越高， 观察到荧光显著增加越快。在3-15个循环期间检测到荧光显著增加超过基线值以上， 表明检测到累积的PCR产物。所述组分包括但不限于嵌入性染料、荧光标记的引物和探 针，及其衍生物。本发明试剂盒可包括使用信息小册子。本发明序型分析试验的应用，优选连接酶链反应试验、杂交试验、聚合酶链反 应试验、基于芯片的试验。也优选杂交试验、阵列化引物延伸(APEX，也称为基于芯片 的小测序反应或单个碱基延伸)、阵列化连接试验、等位基因特异性阵列化连接试验。最 优选聚合酶链反应试验。具有高度多重容量的其它基因分型技术是基于芯片的技术，单个碱基引物延伸 (SnaPShot)或基于OLA的(SNPlex)技术与毛细管电泳联用，和珠技术与可寻址序列联 用。这些方法和下述方法可与本文所述探针一起使用，它们都属于本发明范围。已知其它检测技术也能对多重DNA混合物的双等位基因多态性进行基因分型。 综述参见Syvanen (2001) ( Syvanen AC, 2001. “可及的遗传变异单核苷酸多态性的基 因分型” (Accessing genetic variation Genotypingsingle nucleotide polymorphisms), Nature Reviews Genetics 2 930-941)和 Kwock(2003) (Kwock PY, 2003.《单核苷酸多态性， 方法和方案》(SingleNucleotide Polymorphisms.Methods and Protocols).美国新泽西州托托 瓦的休曼娜出版社(Humana Press，Totowa, New Jersey, USA))。对本发明方法具有特 别价值的的技术是能够在一次反应中对多个DIP同时进行基因分型的技术。用于自动化
多色DNA测序和毛细管电泳联用的两种市售系统是^SWa/^Ac^ 多重系统(SNaPshot Multiplex System)禾P SNPlex 基因分型系统(SNPlex Genotyping System)(均购自美国 加州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystems，Foster City, CA，USA))。第 一个系统是基于引物延伸的方法，根据生产商说明，它能够检测10个以上的双等位基因 多态性；第二个系统联合了多重等位基因-特异性寡核苷酸连接试验(OLA)和PCR， 能够同时对多达48个双等位基因的多态性进行基因分型。另一种基于电泳的多重基因 分型方法称为多重连接依赖性探针扩增(MultiplexLigation-dependent Probe Amplification) (MLPA ； Schouten JP, McElgunn CJ，Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F 禾口 Pals G (2002)，“用多重连接依赖性探针扩增相对定量40种核酸序列”(Relative quantification of 40nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent prob amplification), Nucleic Acids Res30:e57)。而且，对本发明方法而言，基于DNA-芯片的技术特别有用。EU Patent No.820,524 and US Patent No.欧洲专利号820,524和美国专利号5,679,524 (通过引用纳入 本文)揭示了基于芯片的等位基因特异性杂交试验、阵列化引物延伸(APEX，也称为基 于芯片的小测序反应或芯片单碱基引物延伸)、阵列化连接反应和等位基因特异性阵列化 连接试验。欧洲专利号799,897(通过引用纳入本文)描述了通用标签-阵列的应用，欧洲专利号1,186,669 897(通过引用纳入本文)描述了嵌套可寻址等位基因的特异性芯片 (NOCTM)-PCR。最后，美国专利号6,287,778897 (通过引用纳入本文)描述了与珠联用 的通用标签-序列。本发明试剂盒可用于DNA序型分析，具体是法医学应用。该试剂盒还可包括等位基因梯。
图1:通过多重PCR扩增进行人DNA序型分析和性别测定，并对一个性染色 体和30个常染色体的DIP进行基因分型描绘的电泳图显示片段大小(碱基对，bp)上的 6-FAM、VIC、NED、PET和LIZ染料的相对荧光单位(RFU)。如实施例1所述，从 250pg男性基因组DNA开始进行多重PCR和基因分型。如正文所述，PCR后进行纯化 步骤再作电泳。利用LIZ-标记的大小内部标准品计算片段大小。每幅电泳图底部标出 了峰与等位基因之间的排布。图2 DIP标记物编号以及等位基因和PCR引物的SEQ ID编号。 实施例实施例1:通过多重PCR扩增对人DNA作序型分析和性别测定，并对一个性染 色体和30个常染色体的DIP进行基因分型 基本方法和DNA制备.所有试剂和其它消耗品均为PCR级，特别是不含DNA、 DNA-和RNA-依赖性核酸酶。基本的分子遗传学实验按照Sambrook等(1989) (Sambrook J, Fritsche EF, Maniatis T.《分子克隆实验室手册》(Molecular cloning.A laboratory manual).第 2 版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989)所述 进行。人类检测样品是全血或痰液，后者按照生产商说明书用无菌口颊拭子(德国文森 / 陆赫的 NP 公司(Nerbe Plus GmbH, Winsen/Luhe, Germany))收集。按照生产商说
明书用NucleoSpin 组织试剂盒(Macherey 和 Nagel，德国多让(Dueren，Germany))提 取DNA。用UV VIS分光计记录核苷酸碱基的260nm吸光度(Sambrook等，1989)，或 者用Quantifyler 人DNA定量试剂盒(美国加州福斯特城的应用生物系统公司)和ABI Prism 7000 SDS实时热循环仪(美国加州福斯特城的应用生物系统公司)进行定量实时 PCR(qPCR),测定 DNA 含量。 遗传标记物的选择和PCR引物设计。选择能够区分位于X-和Y-染色体非重 组区的人牙釉蛋白基因的两个平行进化同源DIP拷贝3bp DIP(Seq.ID N0.61和62)和 6bp DIP (Seq.ID N0.63和64)测定性别。在该实施例的多重PCR中，还采用了 DIP基因 座的Seq.ID N0.63/64序列。按照以下标准总共采用61个常染色体DIP基因座人基 因组内已确定和绘了图的单拷贝靶序列，DIP的核苷酸长度为2-30bp，用于多重PCR的 标记物位于不同染色体上或标记物的物理距离至少为10.000.000bp，小等位基因的等位基 因频率为0.3-0.5，至少一个人群研究报告的杂合性至少为40%。进一步采用这些基因 座的30个DIP (参见表2)进行本实施例的多重PCR。设计PCR引物。用Blastn软件 根据人基因组序列核查引物的特异性(“局部排列对比搜索工具的基本核苷酸”(Basic Local Alignment Search Tool nucleotides) ； Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW,Lipman DJ. “局部排列对比搜索基本工具”(Basic local alignment search tool) .J Mol Biol,
第215卷，第403-410页，1990)。用自身二聚体软件(Autodimer)控制多重PCR引物 对的相容性(VallonePM，Butler JM. “自身二聚体引物二聚体和发夹结构的筛选工 具” (AutoDimer a screening tool for primer-dimer and hairpinstructures) .Biotechniques,第 37卷，第226-231页，2004)。对于多重检测，还要根据扩增子大小和荧光染料标记仔细 选择寡核苷酸引物对，以保证毛细管凝胶电泳的最佳信号分离。在服务性实验室(比利 时瑟兰的友基公司(Eurogentec SA，Seraing, Belgium)；或美国加州福斯特城的应用生 物系统公司)，用标准的亚磷酰胺化学法合成寡核苷酸引物。用荧光染料6-羧基荧光素 (6-FAM)、2，-氯-7，苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)、2'-氯-5'-氟-7'， 8'-苯并-1，4-二氯-6-羧基荧光素(NED)或PET (美国加州福斯特城的应用生物系 统公司的专有产品)和标准化学法在5’ _端共价标记各引物对的一个引物。在服务性 实验室，通过离子对反相高效液相层析按照标准方法纯化所有引物后，溶于TE-缓冲液 (10mM Tris/HCl(室温调节至 pH 8.0)，ImM EDTA)至 100 y M 浓度，4°C避光保存。先在单一 PCR反应中加入不同浓度的人DNA(0.03_5.0ng)和非人DNA(最高 20ng)至200nM终浓度，检测引物的灵敏度和特异性是否合格(参见下一节)。而且， 逐渐升高温度(55-65°C )进行退火步骤。重复这些实验以建立多重PCR，进行多轮手工 引物重设计和优化引物浓度。最终的引物及其在多重PCR中的浓度见表2。聚合酶链反应(PCR).该酶反应的总体积为25 u L，其中含50mMTris/HCl (室 温调至 pH8.8)、20mMNH4S04、0.2mMdNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的等摩尔 混合物)、1.5mM MgCl2、1.5单位JumpStartTM TaqDNA聚合酶(德国陶克城的西格玛 奥德里奇化学品公司(Sigma-AldrichChemie GmbH、Taufkirchen、Germany))、200 u g/ mL牛血清白蛋白(德国曼海姆的罗氏诊断公司(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、 Germany))、0.01 %吐温20和0.1_1.0ng人基因组DNA。所用引物对及其在PCR中的 终浓度见表2，它们的核苷酸序列参见序列表(Seq.ID.125-184和187-188)。采用ABI 9600 (美国加州福斯特城的应用生物系统公司)热循环仪。循环条件如下初始95°C热 激活240秒；然后94°C变性30秒、60°C引物退火120秒、72°C引物延伸75秒共30轮。 所有温度变化的速度设定为1°C/秒。然后，进行68°C 3600秒的最后延伸步骤，通过 TaqDNA聚合酶的固有末端转移酶活性，而可不依赖模板地在3’ -端最大程度地加上一 个核苷酸(优选A)。表2 用于多重PCR的寡核苷酸引物。图1中采用DIP等位基因的标记物编码 (Dx确定DIP基因座，而x是连续的编号；附带的负号(_)指缺失，加号⑴指插入)来 注明各峰。列出了相应的SeqID编号。
权利要求
1.一种DNA序型分析试验，包括以下步骤(i)提供待分析的样品，(ii)提供用聚合酶链反应同时扩增至少20个基因座所必需的试剂、酶和引物-寡核 苷酸，(iii)扩增所述基因座，(iv)检测扩增产物，其中所述扩增产物和待扩增基因座的特征如下a)各待扩增基因座的特征是已知人群中存在至少一个缺失_插入多态性，其中各基 因座的两个等位基因的大小差异在1个核苷酸以上100个核苷酸以下，b)源自至少两个不同基因座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的第一组的至少 两种扩增产物携带第一标记，C)源自至少两个不同基因座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的第二组的至少 两种扩增产物携带第二标记，d)源自至少两个不同基因座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的第三组的至少 两种扩增产物携带第三标记，e)标记一、标记二和标记三是各不相同的荧光标记，f)对给定基因座而言，两个等位基因之间的大小差异大于1个核苷酸小于100个核苷酸。
2.如权利要求1所述的序型分析试验，其特征在于，同时扩增至少25个基因座。
3.如权利要求1所述的序型分析试验，其特征在于，同时扩增至少30个基因座。
4.如权利要求3所述的序型分析试验，其特征在于，b)至d)三组扩增产物各自包含 至少十种扩增产物。
5.如前述权利要求中任一项所述的序型分析试验，其特征在于，各基因座的两个等 位基因的大小差异大于1个核苷酸小于40个核苷酸。
6.如权利要求1-5中任一项所述的序型分析试验，其特征在于，源自至少两个不同基 因座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的两种或多种扩增产物携带第四标记。
7.如权利要求1-6中任一项所述的序型分析试验，其特征在于，用毛细管凝胶电泳装 置进行所述检测步骤。
8.如权利要求1-7中任一项所述的序型分析试验，其特征在于，所述待扩增基因座选 自以下序列DIP NO. 1 -SEQ ID N0.1,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.2,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.2 -SEQ ID N0.3，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.4,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与255之间， DIP N0.3 -SEQ ID N0.5,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.6,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.4 -SEQ ID N0.7，其中缺失 -插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.8,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与262之间， DIP N0.5 -SEQ ID N0.9,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 10,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.6 -SEQIDNO.il，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 12,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.7 -SEQ ID NO. 13,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.14,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.8 -SEQ ID NO. 15,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 16,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.9 -SEQ ID NO. 17,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 18,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP NO. 10 -SEQ ID NO.19，其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与247之间， -SEQ ID N0.20,其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与252之间， DIP NO. 11 -SEQ ID NO.21,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.22,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO. 12 -SEQ ID N0.23，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.24,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与260之间， DIP NO. 13 -SEQ ID N0.25,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.26,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO. 14 -SEQ ID N0.27,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.28,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与260之间， DIP NO. 15 -SEQ ID N0.29,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.30,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与263之间， DIP NO. 16 -SEQ ID NO.31,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.32,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO 17 -SEQ ID N0.33,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.34,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与270之间， DIP NO. 18 -SEQ ID N0.35,其中插入-缺失多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.36,其中插入-缺失多态性位于核苷酸251与263之间， DIP NO. 19 -SEQ ID N0.37,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0. 38,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.20 -SEQ ID N0.39,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.40,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.21 -SEQ ID N0.41,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.42,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与258之间， DIP N0.22 -SEQ ID N0.43，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.44,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与257之间， DIP N0.23 -SEQ ID N0.45,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.46,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.24 -SEQ ID N0.47,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.48,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与263之间， DIP N0.25 -SEQ ID N0.49，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.50,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与296之间， DIP N0.26 -SEQ ID N0.51,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.52,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与266之间， DIP NO 27 -SEQ ID N0.53，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.54，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与273之间， DIP N0.28 -SEQ ID N0.55,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.56,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与260之间， DIP N0.29 -SEQ ID N0.57,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.58,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与267之间， DIP N0.30 -SEQ ID N0.59,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.60,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与270之间， DIP N0.31 -SEQ ID N0.61,其中缺失-插入多态性位于核苷酸271与272之间， -SEQ ID N0.62,其中缺失-插入多态性位于核苷酸271与278之间， DIP N0.32 -SEQ ID N0.63，其中缺失-插入多态性位于核苷酸280与281之间， -SEQ ID N0.64，其中缺 失-插入多态性位于核苷酸280与284之间， DIP N0.33 -SEQ ID N0.65，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.66,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， DIP N0.34 -SEQ ID N0.67,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.68,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.35 -SEQ ID N0.69，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.70,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与255之间， DIP N0.36 -SEQ ID N0.71,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.72，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与258之间， DIP N0.37 -SEQ ID N0.73,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.74,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.38 -SEQ ID N0.75，其中缺失-插入多态性位于核苷酸255与256之间， -SEQ ID N0.76，其中缺失-插入多态性位于核苷酸255与261之间， DIP N0.39 -SEQ ID N0.77,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.78,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.40 -SEQ ID N0.79，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.80,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与259之间， DIP N0.41 -SEQ ID N0.81,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.82,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与254之间， DIP N0.42 -SEQ ID N0.83,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.84,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与254之间， DIP N0.43 -SEQ ID N0.85,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.86,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与255之间， DIP N0.44 -SEQ ID N0.87，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.88，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间， DIP N0.45 -SEQ ID N0.89，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.90,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间， DIP N0.46 -SEQ ID N0.91,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.92，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间， DIP N0.47 -SEQ ID N0.93,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.94,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.48 -SEQ ID N0.95,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.96,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.49 -SEQ ID N0.97,其中缺失-插入多态性位于核苷酸247与248之间， -SEQ ID N0.98,其中缺失-插入多态性位于核苷酸247与252之间， DIP N0.50 -SEQ ID N0.99，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.100,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， DIP N0.51 -SEQ ID NO. 101,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 102,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.52 -SEQ ID NO. 103,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.104,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， DIP N0.53 -SEQ ID NO. 105,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.106,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， DIP N0.54 -SEQ ID NO. 107,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 108,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与258之间， DIP N0.55 -SEQ ID NO. 109,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 110,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与258之间， DIP N0.56 -SEQ IDN0.111,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID NO. 112,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与258之间， DIP N0.57 -SEQ ID NO. 113,其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与247之间， -SEQ ID N0.114，其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与252之间， DIP N0.58 -SEQ ID NO. 115,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.116，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与263之间， DIP N0.59 -SEQ ID NO. 117,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.118，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与266之间， DIP N0.60 -SEQ ID NO. 119,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 120,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与268之间， DIP NO.61 -SEQ ID NO. 121,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.122，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与277之间， DIP N0.62 -SEQ ID N0.123,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 124,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与260之间， DIP N0.63 -SEQ ID N0.289，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.290,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， 其中所述引物对为不同DIP序列各自的特异性引物对。
9.如前述权利要求中任一项所述的序型分析试验，其特征在于，还扩增一个或多个 短串联重复序列(STR)，和/或扩增一个或多个数目不同的串联重复序列(VNTR)，和/ 或扩增一个或多个单核苷酸多态性(SNP)。
10.如前述权利要求中任一项所述的序型分析试验，其特征在于，还扩增一个或多个 性别特异性短串联重复序列(STR)，和/或扩增一个或多个性别特异性无变异DNA区 段，和/或扩增一个或多个性别特异性数目不同的串联重复序列(VNTR)，和/或扩增一 个或多个性别特异性单核苷酸多态性(SNP)。
11.如前述权利要求中任一项所述的序型分析试验，其特征在于，所述引物-寡核苷 酸对选自含有以下序列的核酸分子a)DIP NO.l SEQ ID NO. 125 和 SEQ ID NO. 126 或者 SEQ ID N0.267 和 SEQ ID N0.268b)DIP N0.2 SEQ ID NO. 127 和 SEQ ID NO. 128c)DIP N0.3 SEQ ID NO. 129 和 SEQ ID NO. 130d)DIP N0.4 SEQ ID NO. 131 和 SEQ ID NO. 132e)DIP N0.5 SEQ ID NO. 133 和 SEQ ID NO. 134f)DIP N0.6 SEQ ID NO. 135 和 SEQ ID NO. 136g)DIPNO.7 SEQ ID N0.137 和 SEQIDN0.138h)DIP NO.8 SEQ ID NO. 139 和 SEQIDN0.140 或者 SEQ ID N0.287 和 SEQ ID N0.288i)DIP NO.9 SEQ ID NO.141 和 SEQIDN0.142 j) DIP NO. 10 SEQ ID NO. 143 和 SEQ ID NO. 144 k) DIP NO. 11 SEQ ID NO. 145 和 SEQ ID NO. 146 1) DIP NO. 12 SEQ ID NO. 147 和 SEQIDN0.148 m) DIP NO. 13 SEQ ID NO. 149 和 SEQIDN0.150 η) DIP NO. 14 SEQ ID NO. 151 和 SEQ ID NO. 152 o) DIP NO. 15 SEQ ID NO. 153 和 SEQ ID NO. 154 或者 SEQ ID N0.281 和 SEQ ID N0.282p) DIP NO. 16 SEQ ID N0.155 和 SEQIDN0.156 q) DIP NO. 17 SEQ ID NO. 157 和 SEQ ID NO. 158或者 SEQ ID N0.273 和 SEQ ID N0.274r) DIP NO. 18 SEQ ID NO. 159 禾口 SEQ ID NO. 160或者 SEQ ID N0.277 和 SEQ ID N0.278s) DIP NO. 19 SEQ ID NO. 161 和 SEQ ID NO. 162或者 SEQ ID N0.279 和 SEQ ID N0.280t) DIP N0.20 SEQ ID NO. 163 和 SEQ ID NO. 164或者 SEQ ID N0.275 和 SEQ ID N0.276u) DIP NO.21 SEQ ID NO. 165 和 SEQ ID NO. 166v) DIP N0.22 SEQ ID NO. 167 和 SEQ ID NO. 168w) DIP N0.23 SEQIDN0.169 和 SEQIDN0.170χ) DIP N0.24 SEQ ID NO. 171 和 SEQ ID N0.172y) DIP N0.25 SEQ ID N0.173 和 SEQIDN0.174ζ) DIP N0.26 SEQ ID NO. 175 和 SEQ ID NO. 176aa)DIP N0.27 SEQ ID NO. 177 和 SEQ ID NO. 178ab)DIP N0.28 SEQ ID N0.179 和 SEQ ID N0.180ac)DIP N0.29 SEQ ID NO. 181 和 SEQ ID NO. 182 或者 SEQ ID N0.271 和 SEQ ID N0.272ad)DIP N0.30 SEQ ID NO. 183 和 SEQ ID NO. 184 或者 SEQ ID N0.283 和 SEQ ID N0.284ae)DIP NO.31 SEQ ID NO. 185 和 SEQ ID NO. 186af)DIPN0.32 SEQ ID NO. 187 和 SEQ ID NO. 188 或者 SEQ ID N0.269 和 SEQ ID N0.270ag)DIP N0.33 SEQ ID NO. 189 和 SEQ ID NO. 190 或者 SEQ ID N0.285 和 SEQ ID N0.286ah)DIP N0.34 SEQ ID NO. 191 和 SEQ ID NO. 191ai) DIP N0.35 SEQ ID NO. 193 和 SEQ ID NO. 194aj) DIP N0.36 SEQ ID NO. 195 和 SEQ ID NO. 196ak) DIP N0.37 SEQ ID NO. 197 和 SEQ ID NO. 198al) DIP N0.38 SEQ ID NO. 199 和 SEQ ID N0.200am) DIP N0.39 SEQ ID N0.201 和 SEQ ID N0.202an) DIP N0.40 SEQ ID N0.203 和 SEQ ID N0.204ao) DIP NO.41 SEQ ID N0.205 和 SEQ ID N0.206或者 SEQ ID N0.251 和 SEQ ID N0.252ap) DIP N0.42 SEQ ID N0.207 和 SEQ ID N0.208或者 SEQ ID N0.253 和 SEQ ID N0.254aq) DIP N0.43 SEQ ID N0.209 和 SEQ ID N0.210或者 SEQ ID N0.255 和 SEQ ID N0.256ar) DIP N0.44 SEQ ID NO.211 和 SEQIDN0.212或者 SEQ ID N0.257 和 SEQ ID N0.258as) DIP N0.45 SEQ ID N0.213 和 SEQIDN0.214或者 SEQ ID N0.259 和 SEQ ID N0.260at) DIP NO.46 SEQ ID N0.215 和 SEQ ID N0.216或者 SEQ ID N0.261 和 SEQ ID N0.262au) DIP N0.47 SEQ ID N0.217 和 SEQ ID N0.218或者 SEQ ID N0.263 和 SEQ ID N0.264av) DIP N0.48 SEQ ID N0.219 和 SEQ ID N0.220aw) DIP N0.49 SEQ ID N0.221 禾P SEQ ID N0.222ax) DIP N0.50 SEQ ID N0.223 和 SEQ ID N0.224ay) DIP NO.51 SEQ ID N0.225 和 SEQ ID N0.226或者 SEQ ID N0.265 和 SEQ ID N0.266az) DIP N0.52 SEQ ID N0.227 和 SEQ ID N0.228ba)DIP N0.53 SEQ ID N0.229 和 SEQ ID N0.230bb)DIP N0.54 SEQ ID N0.231 和 SEQ ID N0.232 be) DIP N0.55 SEQ ID N0.233 和 SEQ ID N0.234bd)DIP N0.56 SEQ ID N0.235 和 SEQ ID N0.236be)DIP N0.57 SEQ ID N0.237 和 SEQ ID N0.238bf)DIP N0.58 SEQ ID N0.239 和 SEQ ID N0.240bg)DIP N0.59 SEQ ID N0.241 和 SEQ ID N0.242bh)DIP N0.60 SEQ ID N0.243 和 SEQ ID N0.244bi)DIP N0.61 SEQ ID N0.245 和 SEQ ID N0.246 bj) DIP N0.62 SEQ ID N0.247 和 SEQ ID N0.248 bk) DIP N0.63 SEQ ID N0.249 和 SEQ ID N0.250
12. —种用于DNA扩增方法的试剂盒，其包括至少3个用于聚合酶链反应扩增的引物 对，其中所述引物对由一个上游引物和一个下游引物组成，能够结合选自以下序列中的任何一个序列， DIP NO. 1 -SEQ ID N0.1,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.2,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.2 -SEQ ID N0.3，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.4,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与255之间， DIP N0.3 -SEQ ID N0.5,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.6,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.4 -SEQ ID N0.7，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.8,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与262之间， DIP N0.5 -SEQ ID N0.9,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 10,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.6 -SEQIDNO.il，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 12,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.7 -SEQ ID NO. 13,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.14,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.8 -SEQ ID NO. 15,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 16,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO.9 -SEQ ID NO. 17,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 18,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP NO. 10 -SEQ ID NO.19，其中缺 失-插入多态性位于核苷酸246与247之间， -SEQ ID N0.20,其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与252之间， DIP NO. 11 -SEQ ID NO.21,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.22,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO. 12 -SEQ ID N0.23，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.24,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与260之间， DIP NO. 13 -SEQ ID N0.25,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.26,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO. 14 -SEQ ID N0.27,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.28,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与260之间， DIP NO. 15 -SEQ ID N0.29,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.30,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与263之间， DIP NO. 16 -SEQ ID N0.31,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.32,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO 17 -SEQ ID N0.33,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.34,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与270之间， DIP NO. 18 -SEQ ID N0.35,其中插入-缺失多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.36,其中插入-缺失多态性位于核苷酸251与263之间， DIP NO. 19-SEQ ID N0.37,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.38,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.20 -SEQ ID N0.39,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.40,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.21 -SEQ ID N0.41,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.42,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与258之间， DIP N0.22 -SEQ ID N0.43，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.44,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与257之间， DIP N0.23 -SEQ ID N0.45,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.46,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.24 -SEQ ID N0.47,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.48,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与263之间， DIP N0.25 -SEQ ID N0.49，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.50,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与296之间， DIP N0.26 -SEQ ID N0.51,其中缺失-插入多态性位于 核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.52,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与266之间， DIP NO 27 -SEQ ID N0.53，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.54，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与273之间， DIP N0.28 -SEQ ID N0.55,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.56,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与260之间， DIP N0.29 -SEQ ID N0.57,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.58,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与267之间， DIP N0.30 -SEQ ID N0.59,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.60,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与270之间， DIP N0.31 -SEQ ID N0.61,其中缺失-插入多态性位于核苷酸271与272之间， -SEQ ID N0.62,其中缺失-插入多态性位于核苷酸271与278之间， DIP N0.32 -SEQ ID N0.63，其中缺失-插入多态性位于核苷酸280与281之间， -SEQ ID N0.64，其中缺失-插入多态性位于核苷酸280与284之间， DIP N0.33 -SEQ ID N0.65，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.66,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， DIP N0.34 -SEQ ID N0.67,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.68,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.35 -SEQ ID N0.69，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.70,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与255之间， DIP N0.36 -SEQ ID N0.71,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.72，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与258之间， DIP N0.37 -SEQ ID N0.73,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.74,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.38 -SEQ ID N0.75，其中缺失-插入多态性 位于核苷酸255与256之间， -SEQ ID N0.76，其中缺失-插入多态性位于核苷酸255与261之间， DIP N0.39 -SEQ ID N0.77,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间，-SEQ ID N0.78,其 中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.40 -SEQ ID N0.79，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.80,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与259之间， DIP N0.41 -SEQ ID N0.81,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.82,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与254之间， DIP N0.42 -SEQ ID N0.83,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.84,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与254之间， DIP N0.43 -SEQ ID N0.85,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.86,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与255之间， DIP N0.44 -SEQ ID N0.87，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.88，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间， DIP N0.45 -SEQ ID N0.89，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.90,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间， DIP N0.46 -SEQ ID N0.91,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.92，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间， DIP N0.47 -SEQ ID N0.93,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.94,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.48 -SEQ ID N0.95,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.96,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.49 -SEQ ID N0.97,其中缺失-插入多态性位于核苷酸247与248之间， -SEQ ID N0.98,其中缺失-插入多态性位于核苷酸247与252之间， DIP N0.50 -SEQ ID N0.99，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.100,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， DIP N0.51 -SEQ ID NO. 101,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 102,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.52 -SEQ ID NO. 103,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间，-SEQ ID N0.104,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， DIP N0.53 -SEQ ID NO. 105,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.106,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， DIP N0.54 -SEQ ID NO. 107,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 108,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与258之间， DIP N0.55 -SEQ ID NO. 109,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 110,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与258之间， DIP N0.56 -SEQ IDN0.111,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID NO. 112,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与258之间， DIP N0.57 -SEQ ID NO. 113,其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与247之间， -SEQ ID N0.114，其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与252之间， DIP N0.58 -SEQ ID NO. 115,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.116，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与263之间， DIP N0.59 -SEQ ID NO. 117,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.118，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与266之间， DIP N0.60 -SEQ ID NO. 119,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 120,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与268之间， DIP NO.61 -SEQ ID NO. 121,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.122，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与277之间， DIP N0.62 -SEQ ID N0.123,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.64,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与260之间， DIP N0.63 -SEQ ID N0.289，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.290,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， 其中所述引物对为不同DIP序列各自的特异性引物对。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括各自能够结合选自 权利要求11所示不同序列的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 个引物对。
14.选自下组的至少2个DIP序列的组合在序型分析试验中的应用-SEQ ID NO.l,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.2,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.2 -SEQ ID N0.3，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.4,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与255之间， DIP N0.3 -SEQ ID N0.5,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.6,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.4 -SEQ ID N0.7，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.8,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与262之间， DIP N0.5 -SEQ ID N0.9,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 10,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.6 -SEQIDNO.il，其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 12,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.7 -SEQ ID NO. 13,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.14,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO.8 -SEQ ID NO. 15,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 16,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO.9 -SEQ ID NO. 17,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 18,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP NO. 10 -SEQ ID NO.19，其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与247之间， -SEQ ID N0.20,其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与252之间， DIP NO. 11 -SEQ ID NO.21,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.22,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO. 12 -SEQ ID N0.23，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.24,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与260之间， DIP NO. 13 -SEQ ID N0.25,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.26,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP NO. 14 -SEQ ID N0.27,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.28,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与260之间， DIP NO. 15 -SEQ ID N0.29,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.30,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与263之间， DIP NO. 16 -SEQ ID N0.31,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.32,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP NO 17 -SEQ ID N0.33,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.34,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与270之间， DIP NO. 18 -SEQ ID N0.35,其中插入-缺失多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.36,其中插入-缺失多态性位于核苷酸251与263之间， DIP NO. 19-SEQ ID N0.37,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.38,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.20 -SEQ ID N0.39,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.40,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.21 -SEQ ID N0.41,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.42,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与258之间， DIP N0.22 -SEQ ID N0.43，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.44,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与257之间， DIP N0.23 -SEQ ID N0.45,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.46,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.24 -SEQ ID N0.47,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.48,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与263之间， DIP N0.25 -SEQ ID N0.49，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.50,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与296之间，DIP N0.26 -SEQ ID N0.51,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.52,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与266之间，DIP NO 27 -SEQ ID N0.53，其中 缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.54，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与273之间， DIP N0.28 -SEQ ID N0.55,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.56,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与260之间， DIP N0.29 -SEQ ID N0.57,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.58,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与267之间， DIP N0.30 -SEQ ID N0.59,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.60,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与270之间， DIP N0.31 -SEQ ID N0.61,其中缺失-插入多态性位于核苷酸271与272之间， -SEQ ID N0.62,其中缺失-插入多态性位于核苷酸271与278之间， DIP N0.32 -SEQ ID N0.63，其中缺失-插入多态性位于核苷酸280与281之间， -SEQ ID N0.64，其中缺失-插入多态性位于核苷酸280与284之间， DIP N0.33 -SEQ ID N0.65，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.66,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， DIP N0.34 -SEQ ID N0.67,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.68,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.35 -SEQ ID N0.69，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.70,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与255之间， DIP N0.36 -SEQ ID N0.71,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.72，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与258之间， DIP N0.37 -SEQ ID N0.73,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.74,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.38 -SEQ ID N0.75，其中缺失-插入多态性位于核苷酸255与256之间， -SEQ ID N0.76，其中缺失-插入多态性位于核苷酸255与261之间， DIP N0.39 -SEQ ID N0.77,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.78,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间，DIP N0.40 -SEQ ID N0.79，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.80,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与259之间， DIP N0.41 -SEQ ID N0.81,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.82,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与254之间， DIP N0.42 -SEQ ID N0.83,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.84,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与254之间， DIP N0.43 -SEQ ID N0.85,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.86,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与255之间， DIP N0.44 -SEQ ID N0.87，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.88，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间， DIP N0.45 -SEQ ID N0.89，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.90,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间， DIP N0.46 -SEQ ID N0.91,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.92，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与254之间， DIP N0.47 -SEQ ID N0.93,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.94,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.48 -SEQ ID N0.95,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID N0.96,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与256之间， DIP N0.49 -SEQ ID N0.97,其中缺失-插入多态性位于核苷酸247与248之间， -SEQ ID N0.98,其中缺失-插入多态性位于核苷酸247与252之间， DIP N0.50 -SEQ ID N0.99，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.100,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， DIP N0.51 -SEQ ID NO. 101,其中缺失-插入多态性位于核 苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 102,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与257之间， DIP N0.52 -SEQ ID NO. 103,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.104,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间，DIP N0.53 -SEQ ID NO. 105,其中缺 失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.106,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间， DIP N0.54 -SEQ ID NO. 107,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 108,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与258之间， DIP N0.55 -SEQ ID NO. 109,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 110,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与258之间， DIP N0.56 -SEQ IDN0.111,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID NO. 112,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与258之间， DIP N0.57 -SEQ ID NO. 113,其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与252之间， -SEQ ID N0.114，其中缺失-插入多态性位于核苷酸246与247之间， DIP N0.58 -SEQ ID NO. 115,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.116，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与263之间， DIP N0.59 -SEQ ID NO. 117,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.118，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与266之间， DIP N0.60 -SEQ ID NO. 119,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 120,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与268之间， DIP NO.61 -SEQ ID NO. 121,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.122，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与277之间， DIP N0.62 -SEQ ID N0.123,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与252之间， -SEQ ID NO. 124,其中缺失-插入多态性位于核苷酸251与260之间， DIP N0.63 -SEQ ID N0.289，其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与251之间， -SEQ ID N0.290,其中缺失-插入多态性位于核苷酸250与256之间； 其中安排所述引物使之能够扩增缺失-插入多态性。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述扩增方法选自等位基因特异性多重 PCR、连接酶链反应试验、多重连接依赖性探针扩增试验、杂交试验、聚合酶链反应试 验、基于芯片的试验、杂交试验、单碱基引物延伸试验、阵列化引物延伸(APEX)、阵列 化连接试验、等位基因特异性阵列化连接试验和芯片PCR。
全文摘要
本发明涉及一种DNA序型分析试验，包括以下步骤提供待分析样品，提供同时进行聚合酶链反应扩增至少20个基因座所必需的试剂、酶和引物-寡核苷酸，扩增这些基因座，检测扩增产物，其中扩增产物和待扩增基因座的特征如下各待扩增基因座的特征是已知人群中存在至少一个缺失-插入多态性，其中各基因座两个等位基因的大小差异在2个核苷酸以上100个核苷酸以下，源自至少两个不同基因座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的第一组的至少两种扩增产物携带第一标记，源自至少两个不同基因座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的第二组的至少两种扩增产物携带第二标记，源自至少两个不同基因座的大小约为20个核苷酸至300个核苷酸的第三组的至少两种扩增产物携带第三标记，标记一、标记二和标记三是各不相同可区分的荧光标记，可用(例如)与DNA测序设备联用的多色检测器同时检测。
文档编号C12Q1/68GK102016074SQ200980115783
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月24日 优先权日2008年4月28日
发明者J·加贝特, M·伯默, W·布拉贝兹 申请人:生物物种有限公司