专利名称：纯化的免疫球蛋白融合蛋白及其纯化方法
纯化的免疫球蛋白融合蛋白及其纯化方法
背景技术：
鉴于日益接受生物制品(biologies)作为批准的疗法，这些种类的药物的详细表征是重要的。不可预见的产物分解或杂质的存在可危害治疗效果及患者安全。生物制品生产过程中发现的杂质的实例可包括产物的聚集体。在药物组合物中，聚集体是不期望的，因为它们可为免疫原性的并给体内使用带来安全顾虑。由于中和在患者产生的抗体，聚集体还可降低产物在体内的稳定性。此外，还可能在生产过程中制造失活蛋白。失活蛋白可能是在生产过程中不正确折叠引起的。例如，美国专利申请2002/0039580 (Browning等人)描述了当在哺乳动物细胞中表达时淋巴毒素β受体免疫球蛋白(LTiiR-Ig)融合蛋白的两种形式，活性和失活形式。美国专利申请2002/0039580还教导了在Ig融合蛋白生产过程中通过降低细胞培养温度，可以降低制品中失活分子的百分比。此公布描述了 LTiiR-Ig的仅一种失活形式，其没有结合配体的能力。在生物制品生产中，这些产物相关杂质可带来纯化的挑战。这些杂质往往难以鉴定，因为它们往往具有与感兴趣的治疗蛋白的活性形式相当的特征，并因此可能很难检测。 此外，即使当鉴定了这些杂质时，从药物产品中分离杂质可能是很困难的。因此，不仅对鉴定可能会出现在生物制品生产和纯化过程中的产物相关杂质，而且对鉴定杂质后去除杂质的方法仍然存在需要。发明概述本发明解决了从在哺乳动物细胞如CHO细胞培养中表达生物制品的过程产生的杂质中纯化基于抗体的生物制品例如LT-β -R-Ig融合蛋白的问题，使得由此产生的组合物无论是在蛋白质大量生产还是纯度方面都适合于药物用途。如本文描述，LT-β-R-Ig融合蛋白在哺乳动物细胞中表达产生LT-β-R-Ig的两种失活形式和LT-β -R-Ig聚集体。这些杂质必须从生物活性、单体形式的LT-β -R-Ig中分离以提供足够的纯度供患者使用。LT-i3-R-Ig的失活形式对纯化方法提出了独特的挑战。例如，本文描述的LT-β-R-Ig的两种失活形式与融合蛋白的活性、单体形式十分相似， 例如，在大小和电荷方面。此外，当扩大规模生产LT-β-R-Ig以增加产量时(如生产治疗剂所需的)，将产生高水平的聚集的LT-β -R-Ig。因此，为了以足够的浓度和为临床用途所需的纯度生产活性、单体LT-β-R-Ig融合蛋白，需要最大限度地减少聚集、最大限度地减少蛋白质失活形式的存在和最大限度地降低LT-β-R-Ig融合蛋白损失的方法。本发明提供了这一复杂问题的解决方法。更具体地，本发明提供了在基于抗体的生物制品即免疫球蛋白(Ig)融合蛋白的纯化过程能去除多种产物相关杂质的高分辨率疏水作用色谱(HIC)方法。本发明提供了从 Ig融合蛋白的失活形式中纯化Ig融合蛋白如淋巴毒素β受体免疫球蛋白(LTiiR-Ig)的活性形式的方法。本发明另外的方面包括纯化的Ig融合蛋白组合物(例如，具有其他蛋白、 折叠不当的不具有完全生物活性的变体和蛋白质聚集体的最小污染量，其往往由蛋白质在哺乳动物细胞中表达引起)。本发明还提供了纯化蛋白质混合物的方法，所述蛋白质混合物例如，来自哺乳动物细胞培养的起始原料(例如，来自生物反应器培养的大量原料)，其具有多于30%的杂质，如失活形式的蛋白和/或蛋白质聚集体。在一个实施方案中，本发明提供了纯化具有多于50%杂质例如约35%聚集蛋白和约19%失活蛋白的起始蛋白混合物的方法。本发明包括分离生物活性淋巴毒素-β受体免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白与生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，包括将包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和生物失活LT-β-R-Ig融合蛋白的混合物荷载到丁基疏水作用色谱(HIC)树脂上，并将所述树脂与包含盐梯度例如1. 6Μ至0. OM NaCl的溶液接触以获得包含生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液和包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液。在一个实施方案中，包含生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的第二洗脱液是通过用1.5Μ NaCl洗液冲洗HIC 树脂获得的。在一个实施方案中，盐浓度是不连续梯度或连续梯度。在一个实施方案中，盐梯度包含0. 6Μ至0. OM Na2S04。在一个实施方案中，盐梯度是从0. 4至0. 5Na2S04的反向梯度，接着是不连续梯度和柱反萃(column strip)。在一个实施方案中，序贯Na2SO4不连续梯度首先用于去除失活-1 (冲洗组分中)，其次是活性单体LT-β -R-Ig (洗脱组分)，其次是失活-2(反萃组分)。在一个实施方案中，丁基HIC树脂具有600至750A的孔径。在一个实施方案中，HIC树脂具有约8g蛋白质/L树脂的荷载量。在一个实施方案中，在Na2SO4 存在时HIC树脂具有约20g蛋白质/L树脂的荷载量。在一个实施方案中，包含生物活性 LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液包含少于2%的生物失活LT- β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液包含少于的生物失活 LT-β-R-Ig融合蛋白。本发明提供了分离非聚集、生物活性淋巴毒素-β受体免疫球蛋白(LT-β-R-Ig) 融合蛋白与聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，包括将包含非聚集、生物活性LT-β -R-Ig 融合蛋白和聚集的LT-i3-R-Ig融合蛋白的混合物荷载到苯基疏水作用色谱(HIC)树脂上， 其中树脂具有介于约10_20g蛋白质/L树脂之间的荷载量和约四至31cm的床高，并将树脂与溶液以约50至150cm/hr (厘米/小时)的流速接触以获得包含生物非聚集、生物活性 LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液和包含聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液。在一个实施方案中，将树脂与溶液以约lOOcm/hr的流速接触。在一个实施方案中，包含非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的第一洗脱液包含少于2 %的聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，包含非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液包含少于的聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白。本发明还提供了分离生物活性淋巴毒素-β受体免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白与生物失活LT-β-R-Ig融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤在允许生物活性LT-i3-R-Ig融合蛋白结合丁基疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下将包含生物活性 LT-β -R-Ig融合蛋白和生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物荷载到所述丁基树脂上； 将丁基HIC树脂与包含盐梯度例如连续盐梯度或不连续盐梯度的溶液接触，以获得富集存在生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液；在允许生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白结合第二 HIC树脂的条件下将步骤ii)的第一洗脱液荷载到第二 HIC树脂上；并将第二 HIC 树脂与溶液接触以获得进一步富集存在生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液，从而分离生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白与生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，丁基HIC树脂包含羟基化的甲基丙烯酸酯聚合物化学骨架。在一个实施方案中，丁基HIC树脂具有600至750A的孔径。在一个实施方案中，第一洗脱液包含少于2%的失活LT-β-R-Ig融合蛋白的第一形式(失活-1)。在一个实施方案中，第一洗脱液包含少于1 %的失活LT- β -R-Ig融合蛋白的第一形式(失活-1)。在一个实施方案中，第二洗脱液包含少于2%的失活LT- β -R-Ig融合蛋白的第二形式(失活-2)。 在一个实施方案中，第二洗脱液包含少于1 %的失活LT- β -R-Ig融合蛋白的第二形式(失活-2)。本发明提供了用混合模式树脂分离生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白与生物失活 LT- β -R-Ig融合蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括在允许生物活性LT- β -R-Ig 融合蛋白结合混合模式树脂的条件下将包含生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白和生物失活 LT- β -R-Ig融合蛋白的混合物荷载到混合模式树脂上。该方法还包括用溶液从混合模式树脂上洗脱生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以获得富集存在生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液，然后在允许生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白结合疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下将第一洗脱液荷载到HIC树脂上；最后用溶液洗脱生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以获得进一步富集存在生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液。在一个实施方案中，将混合模式树脂与用于清除LT-β -R-Ig的失活-1形式和部分清除LT-β -R-Ig的聚集形式的洗脱前冲洗步骤接触。此方法分离生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白与生物失活LT-β -R-Ig 融合蛋白。在一个实施方案中，本发明还提供使用混合模式树脂分离非聚集、生物活性 LT- β -R-Ig融合蛋白与聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤在允许生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白结合混合模式树脂的条件下将包含非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物荷载到混合模式树脂上，其中混合物中多于约30%或约30%的LT-β-R-Ig融合蛋白是聚集的；用溶液从步骤i)的混合模式树脂上洗脱生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以获得富集存在生物活性 LT-β-R-Ig融合蛋白的第一洗脱液；在允许生物活性Ig融合蛋白结合疏水作用色谱(HIC) 树脂的条件下将步骤ii)的第一洗脱液荷载到HIC树脂上；并用溶液洗脱步骤iii)的生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以获得进一步富集存在生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液。在一个实施方案中，将混合模式树脂与用于清除LT-β -R-Ig的失活-1形式和部分清除LT-β -R-Ig的聚集形式的洗脱前冲洗步骤接触。使用此方法，可分离非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白与聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，混合模式树脂的特征是具有离子相互作用能力和疏水相互作用能力二者。在另一实施方案中，将混合物在约5.0的ρΗ荷载到混合模式树脂上。在又另一实施方案中，在步骤(i)之前(第一洗脱步骤之前)，用具有约7.0至7. 2的ρΗ的缓冲液例如Bis Tris或柠檬酸钠冲洗已荷载的混合模式树脂。在一个实施方案中，HIC树脂是苯基树脂，如，但不限于，苯基琼脂糖。在一个实施方案中，用硫酸铵从苯基树脂上洗脱生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中， 硫酸铵的浓度在 0. 3 至 0. 5Μ 范围内，包括 0. 31,0. 32,0. 33,0. 34,0. 35,0. 36,0. 37,0. 38、 0. 39,0. 4,0. 41,0. 42,0. 43,0. 44,0. 45,0. 46,0. 47,0. 48 和 0. 49Μ。在一个实施方案中，流速是50至150cm/hr。在一个实施方案中，流速是lOOcm/hr。在另一个实施方案中，流速是130 至 170cm/hr。本发明包括从包含非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和聚集的LT-β -R-Ig 融合蛋白的混合物中去除存在的至少97%的聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤在允许非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白结合混合模式树脂的条件下将混合物荷载到混合模式树脂上；用溶液从步骤i)的混合模式树脂上洗脱非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以获得富集存在非聚集、生物活性 LT- β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液；在允许非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白结合疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下将步骤ii)的第一洗脱液荷载到HIC树脂上；并用溶液洗脱非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以获得进一步富集存在非聚集、生物活性 LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液。此方法可用于从包含非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白和聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白的混合物中去除至少97%的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，第一洗脱液包含少于25%的聚集的LT-i3-R-Ig融合蛋白。在另一个实施方案中，第一洗脱液包含少于20 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在又另一实施方案中，第一洗脱液包含少于15 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在又另一实施方案中， 第一洗脱液包含约10 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，第二洗脱液包含少于2 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在另一实施方案中，第二洗脱液包含少于1 % 的聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。本文描述的纯化方法可用于组合物，其产生方式以最大限度地减少LT-β-R-Ig 的不需要的形式或由基于细胞的生产所产生的其他杂质的存在，或用于包括促进纯化的试剂的组合物。例如，在本发明的一个实施方案中，该方法包括首先将混合物与重组蛋白 A(rProtein Α)接触。在一个实施方案中，与重组蛋白A接触的混合物是哺乳动物细胞培养上清液。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养上清液是从在培养的哺乳动物细胞获得的。在一个实施方案中，细胞培养上清液包含非离子表面活性剂，如，但不限于，Triton X-100。在本发明的一个实施方案中，该方法包括在将混合物荷载到混合模式树脂之前将混合物与阴离子交换膜吸附器(adsorber)接触。在一个实施方案中，在病毒灭活步骤(例如低PH病毒灭活)之后将混合物与阴离子交换膜吸附器接触。在一个实施方案中，在将混合物与重组蛋白A(I^roteinA)接触之后将混合物与阴离子交换膜吸附器接触。本发明还提供了制备大致上富集生物活性、单体形式LT-β -R-Ig融合蛋白的纯化的组合物的方法。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于50%的聚集体。在一个实施方案中，纯化的组合物包含减少量的LT-β-R-Ig聚集体。在另一实施方案中，纯化的组合物包含少于40%的聚集体。在另一实施方案中，纯化的组合物包含少于30%的聚集体。 在另一实施方案中，纯化的组合物包含少于20%的聚集体。在另一实施方案中，纯化的组合物包含少于10%的聚集体。在另一实施方案中，纯化的组合物包含少于7. 5%的聚集体。 在另一实施方案中，纯化的组合物包含少于5%的聚集体。在另一实施方案中，纯化的组合物包含少于3%的聚集体。在另一实施方案中，纯化的组合物包含少于2%的聚集体。在另一实施方案中，纯化的组合物包含少于的聚集体。在另一实施方案中，纯化的组合物包含不可检测的量的聚集体。在另一实施方案中，纯化的组合物包含减少量的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于20%的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2 形式。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于10%的LT-β-R-Ig融合蛋白的失活-2 形式。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于7. 5%的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-2 形式。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于5%的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于4%的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于3%的LT-β-R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于2%的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式。在另一实施方案中，纯化的组合物包含不可检测的量的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-2 形式。在又另一实施方案中，纯化的组合物包含少于6%的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活 1形式。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于5%的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活1形式。在另一实施方案中，纯化的组合物包含少于4%的LT-β-R-Ig融合蛋白的失活1形式。 在另一实施方案中，纯化的组合物包含少于3%的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-1形式。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于2%的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-1形式。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的失活-1形式。在另一实施方案中，纯化的组合物包含不可检测的量的LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-1形式。在另一实施方案中，本发明的纯化的组合物包含比存在于起始组合物中的水平减少的一种或多种聚集体形式、失活-1、和/或失活_2。例如，在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于7. 5%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于7. 5%的 LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于7. 5%的聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。例如，在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于5 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于5%的LT-β-R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活_2)、和少于5 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。例如，在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于 3%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于3%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于3%的聚集的LT-i3-R-Ig融合蛋白。例如，在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于2%的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于2%的LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于2%的聚集的LT- β -R-Ig 融合蛋白。例如，在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于的LT-β-R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于1 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。本领域的技术人员应该理解，这些产物的污染水平可能不相等和以上所列的例子仅是说明性的。例如，在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于5%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于10 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于20%的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于2%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于5%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于5%的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于2%的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于 5%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于10%的聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于2%的LT-β-R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于5%的LT-β-R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活_2)、和少于 10%的聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，纯化的组合物包含少于5%的 LT-β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于5%的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于1 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤从包含用编码LT-β -R-Ig-融合蛋白的DNA转化的哺乳动物宿主细胞的哺乳动物细胞培养系统获得细胞培养上清液；将细胞培养上清液与重组蛋白A(rfr0tein Α)接触以获得LT-β -R-Ig融合蛋白混合物；在约5. 0 的ΡΗ，使得LT-β -R-Ig融合蛋白结合混合模式树脂的条件下将ii)的LT-β -R-Ig融合蛋白混合物荷载到混合模式树脂上；用具有约7. 0至7. 2的ρΗ的缓冲液冲洗混合模式树脂；将混合模式树脂与溶液接触以获得富集存在生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液；在允许LT-β-R-Ig融合蛋白结合疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下将第一洗脱液荷载到HIC树脂上；并将步骤vi)的HIC树脂与溶液接触以获得进一步富集存在生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液。在一个实施方案中，此方法产生一种组合物，其中第二洗脱液包含少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于1 %的 LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于1 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，混合物中LT-β -R-Ig融合蛋白的浓度是至少300mg/L。在一个实施方案中，混合物中LT-β -R-Ig融合蛋白的浓度是至少800mg/L。在一个实施方案中， 混合物中LT-β -R-Ig融合蛋白的浓度是至少1350mg/L。在一个实施方案中，混合物的体积是至少5000L。在一个实施方案中，混合物的体积是至少10000L。在一个实施方案中，混合物的体积是至少15000L。本发明包括包含生物活性淋巴毒素-β -受体免疫球蛋白(LT-β -R-Ig)融合蛋白的组合物，其大致上无聚集体。在一个实施方案中，少于6 %的LT- β -R-Ig融合蛋白是生物失活的，和少于2%的LT-β -R-Ig融合蛋白是聚集的。例如，在一个实施方案中，少于5% 的LT-β -R-Ig融合蛋白是生物失活的。在一个实施方案中，少于3%的LT-β -R-Ig融合蛋白是生物失活的。在一个实施方案中，少于的LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的。在一个实施方案中，少于0.5%的LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的。在一个实施方案中，本发明涉及包含少于2%的聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白的组合物。在一个实施方案中，少于 1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白是聚集的。在一个实施方案中，少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白是生物失活的，和少于的LT-β-R-Ig融合蛋白是聚集的。在一个实施方案中，LT-β-R-Ig融合蛋白包含IgGl同种型的Ig恒定区。在一个实施方案中，LT-β-R-Ig融合蛋白包含SEQ ID NO :1中所列的LT-β-R的胞外域。在一个实施方案中，本发明的生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白是单体。本发明的生物活性LT- β -R-Ig 融合蛋白能结合到LTi3和能阻断细胞中由LT β R结合到LT β所诱导的生物活性。在一个实施方案中，这可通过在标准体外IL-8抑制测定中LT- β -R-Ig抑制IL-8的产生和/或阻断IL-8的释放的能力来测量。例如，在一个实施方案中，将表达LT β R的细胞与LTa 1 β 2 和LT- β -R-Ig接触，并测量LT- β -R-Ig抑制细胞释放IL-8的能力(与适当的对照，例如， 结合分子不存在时相比)。
本发明还包括包含本发明的组合物和药学上可接受的运载体(carrier)的药物组合物。本发明还包括包含至少97%的生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的组合物(即，缺乏失活-1、失活_2，或两者)。本发明进一步包括包含单体LT-β -R-Ig融合蛋白的组合物 (即，大致上(substantially)缺乏聚集体)。用本文描述的本发明方法可获得此组合物。本发明还提供了治疗自身免疫性疾病例如类风湿关节炎、克罗恩氏病或多发性硬化症的方法，包括给需要其的受试者施用药物组合物。附图简述
图1提供了循环-1-1方法的概述。图2显示了循环-1-1的HIC-I 丁基树脂步骤的结果，包括LT β R-Ig融合蛋白的失活形式1和2的洗脱条件。图3描述了使用HPLC的方法中间体(process intermediates)的概述。图4图解描述了丁基-650M LTi3 R-Ig纯化(循环1_1)的洗脱组分中活性和失活-2的百分比。以1.65M NaCl的荷载和冲洗浓度纯化LT β R-Ig。柱被荷载一式两份的 8mg/mL树脂。用0. 7M NaCl实施洗脱，依次收集洗脱组分(条形图显示了来自每一组分的数据，非累加)和测量LT β R-Ig的形式。图5提供了循环-1-2方法的概述。图6描述了循环1-2的不连续冲洗和梯度冲洗策略。图7提供总结了循环-1的三种分离方法即蛋白A、HIC_1 (丁基)和HIC-2 (苯基) 后杂质分辨率提高的表格。图8描述了通过HIC_2(苯基)步骤清除聚集体，包括荷载、床高和流速的影响。图 8A描述了苯基步骤后荷载对聚集体和活性LTiiR-Ig融合蛋白百分比的影响。图8B描述了在循环-2HIC(苯基)步骤的开发中，床高和速度对活性LTiiR-Ig(活性单体)产率百分比的影响。图9提供了循环-2方法的概述。图10提供了 LT β R-Ig融合蛋白的图解。图IlA和图IlB描述了混合模式柱的操作条件。图12图解描述了循环-2的第3柱的色谱条件。图13提供描述在15000生产中修改的下游方法的主要性能特征的表格。发明详述为了可充分理解本文描述的本发明，下面阐述详细描述。I.定义可在本文互换使用的术语“活性”或“生物活性”是指能够结合到其同源结合伴侣物(例如，对于受体，结合到配体)和阻断细胞相关LTiiR与LT的结合的生物效应的蛋白质形式。生物活性的定义不包括对蛋白质的生物反应或免疫反应。生物活性可根据被表征蛋白质的类型来确定。例如，为受体(或其可溶性形式)的蛋白质，如果其可结合到其各自的配体则可显示为生物活性的。可选择地，蛋白质可被蛋白质的活性形式特异性的抗体结合。在另一实施方案中，蛋白质的生物效应可以使用基于细胞的测定来测量。这种测定是本领域所熟知的(例如，LT β R活性可以使用标准IL-8抑制测定来确定)。
术语“失活”或“生物失活”是指不能结合到其同源结合伴侣物上，因此，不能改变系统中的生物反应或其结合亲和力不足以导致生物反应的蛋白质。例如，在一个实施方案中，就受体或其可溶形式来说，受体的失活形式不能结合到配体，从而不能介导活性形式的生物活性。在另一实施方案中，受体的失活形式可结合到配体，例如，以降低的亲和力，但是不导致适当的生物反应，或(当是可溶形式时)不充分阻断通过受体的基于细胞的形式和其配体结合而转导的生物信号。如本文使用的短语“活性单体”是指非聚集的和包含通过二硫键连接的 LT-β-R-Ig的两条链的生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白。在图11中提供了活性单体的一个实例。因此，单体是非聚集的双链Fc融合蛋白。术语“聚集体”是指错误折叠、刚性蛋白质群组或高分子量物质(包括蛋白质的多聚体)。在一个实施方案中，聚集体是指LT- β -R-Ig单体的多聚体形式，其包含多于两条链的Fc融合蛋白，例如，二聚体或更高阶的多聚体形式(四聚体、八聚体)。聚集体可以是生物活性的或失活的。术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换使用，是指各种长度的氨基酸序列，以其中性(不带电)形式或作为盐，及未修饰或由糖基化修饰、侧链氧化修饰或磷酸化修饰。在某些实施方案中，氨基酸序列是全长天然蛋白质。在其他实施方案中，氨基酸序列是全长蛋白的较小的片段。在其他实施方案中，氨基酸序列编码嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含免疫球蛋白分子的至少一部分和第二、非-免疫球蛋白分子的至少第二一部分。在一个实施方案中， 非免疫球蛋白分子包含分子的生物活性部分，例如配体的受体结合部分或受体的配体结合部分，例如TNF受体或其片段。术语“融合蛋白，，是指包含通过其各自肽主链由共价键连接的两种或多种蛋白质或其片段的分子，更优选地通过编码这些蛋白质的多核苷酸分子的遗传表达来产生。在优选实施方案中，融合蛋白包括免疫球蛋白结构域。术语“淋巴毒素-β-受体”或“LTi3R”是指结合到由淋巴毒素α和β链的三聚复合体组成的表面淋巴毒素(LT) (Crowe等人，1994)及配体LIGHT(与淋巴毒素同源，显示诱导型表达，及与单纯疱疹病毒糖蛋白D竞争T淋巴细胞表达的受体HVEM)的受体TNF家族的成员。LT-β-R牵涉在外周免疫系统的发育和成熟免疫系统中淋巴结和脾中事件的调节中(Ware 等人，1995 ；Mackay 等人，1997 ；Rennert 等人，1996 ；Rennert 等人，1997 ；Chaplin 和 Fu，1998)。在一个实施方案中，LT β R-免疫球蛋白(LTiiR-Ig)融合蛋白包含LT β R的胞外域的配体-结合部分和IgG恒定区，例如，Ig的Fc部分。LT β R-Ig融合蛋白可阻断表面LT 配体和LT β R之间的信号，并影响滤泡树突状细胞的功能状态(Mackay和Browning 1998)。 此阻断可进而导致啮齿动物模型中自身免疫性疾病减少(Mackay等人，1998，于1995年7 月21日提交的美国专利申请序列号08/505，606和1996年10月沈日提交的美国专利申请序列号60/029, 060)。LT β R的序列在SEQ ID NO 1中提供人类LT β R 序列(PUBMED ΑΑΗ26262 和 P36Ml)1 MLLPffATSAP GLAffGPLVLG LFGLLAASQP QAVPPYASEN QTCRDQEKEY YEPQHRICCS61 RCPPGTYVSA KCSRIRDTVC ATCAENSYNE HWNYLTICQL CRPCDPVMGL EEIAPCTSKR121 KTQCRCQPGM FCAAffALECT HCELLSDCPP GTEAELKDEV GKGNNHCVPC KAGHFQNTSS
181 PSARCQPHTR CENQGLVEAA PGTAQSDTTC KNPLEPLPPE MSGTMLMLAV LLPLAFFLLL241 ATVFSCIffKS HPSLCRKLGS LLKRRPQGEG PNPVAGSffEP PKAHPYFPDL VQPLLPISGD301 VSPVSTGLPA APVLEAGVPQ QQSPLDLTRE PQLEPGEQSQ VAHGTNGIHV TGGSMTITGN361 IYIYNGPVLG GPPGP⑶LPA TPEPPYPIPE E⑶PGPPGLS TPHQEDGKAff HLAETEHCGA421 TPSNRGPRNQ FITHD(SEQID NO 1)在一个实施方案中，LT-β-R-Ig融合蛋白可包括人类LT-β-R-Ig胞外域的全部或片段(例如，其可包括人类LT- β -R的残基40-200,35-200,40-210 ；35-220,32-225或 28-225) 0在一些实施方案中，LT-β-R融合蛋白包括LT-β-R分子的胞外域如SEQ ID NO: 1的残基32-225所示。可包括在本发明的方法和组合物中的LTiiR-Ig融合蛋白的实例如下面(SEQ ID NO 2)所列MLLPWATSAPGLAWGPLVLGLFGLLAA AVPPYASENQTCRDQEKEYYEPQHRICCSRCPPGTYVSAK CSRIRDTVCATCAENSYNEHWNYLTICQLCRPCDPVMGLEEIAPCTSKRKTQCRCQPGMFCAAffALECTHCELLSDC PPGTEAELKDEVGKGNNHCVPCKAGHFQNTSSPSARCQPHTRCENQGLVEAAPGTAQSDTTCKNPLEPLPPEMSGTM V DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN
WYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(斜体的氨基酸表示信号序列；带下划线的氨基酸表示来源于LT-β-R的胞外域的序列；黑体的氨基酸表示IgG Fc序列。连接LT-β-R序列和IgG-Fc序列的缬氨酸是人工的，及非来源于LT- β -R或IgG-Fc序列。带下划线的序列是LT- β -R胞外域的实质部分， 并相应于SEQ ID NO :1的氨基酸32至225)。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物中所使用的LT-β-R融合蛋白包括SEQ ID NO :2所列的氨基酸序列而无信号序列。“表面LT配体”是指可特异性地结合到LT β R的表面LT复合物或其衍生物。如本文使用的术语“配体结合结构域”或“配体结合部分”是指天然受体(例如， 细胞表面受体)或其保留至少定性配体结合能力的区域或衍生物，优选地保留相应天然受体的生物活性。术语“免疫球蛋白融合蛋白”是指多肽的功能部分(通常包含细胞表面蛋白质的胞外域)与免疫球蛋白恒定区的一个或多个部分例如CHI、CH2或CH3域或其组合的融合体。在一个实施方案中，多肽是受体TNF家族的成员。Ig分子的部分可来源于各种免疫球蛋白同种型的任一种，包括，例如，IgGU IgG2、IgM、IgA等。在优选实施方案中，本发明的方法和组合物中使用的蛋白质是免疫球蛋白融合蛋白。例如，融合蛋白可包含受体或其配体结合部分，和二聚化结构域，例如Fc结构域。通用术语“免疫球蛋白”包含5个不同类的可生化区分的抗体。明显地抗体的所有5类都在本发明的范围内，下面的讨论将一般地针对免疫球蛋白分子的IgG类。短语“受体TNF家族”是指无论是天然细胞膜结合还是分泌(如就骨保护素而言) 的受体，其具有典型的TNF家族半胱氨酸桥接模式，或结合到配体TNF家族的确定成员的任何受体(例如，Banner等人1993)。在其他实施方案中，本发明涉及由本文讨论的方法获得的TNF家族受体-Ig融合体、及包含它们的药物制剂。如本文使用的术语“大约”和“约”是关于通常包括落入该数字的任一方向10%范围内的数字(多于或少于该数字)，除非另外指明或上下文中另有证明(除了此数字超过可能值100% )。II.分离不同形式的失活和/或聚集的^融合蛋白本发明涉及通过分离蛋白质的活性形式与失活形式和/或分离蛋白质的活性形式与聚集体，产生纯化的活性形式的免疫球蛋白(Ig)融合蛋白包括LTiiR-Ig融合蛋白的能力。尽管已知Ig融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达可产生多种形式的失活Ig融合蛋白，污染程度和充分纯化融合蛋白的方法是未知的。更具体地，本领域教导了 LTiiR-Ig 融合蛋白以两种形式在猴cos细胞或中国仓鼠卵巢细胞中表达。教导了一种形式以高亲和力与配体结合，“活性”形式，而教导了另一种“失活”形式不结合配体(美国专利申请 20020039580)。然而认识到，以前未知实际上LT β R-Ig融合蛋白有两种不同的失活形式 (失活-ι和失活- ，因此，以前没有开发最大限度地减少制品中这些失活形式的两者(失活-1和失活-2)存在的方法。例如，如下面实施例所描述，哺乳动物表达LT β R-Ig融合蛋白产生活性LT β R-Ig融合蛋白混合物，该混合物包含LT β R-Ig融合蛋白的第一失活形式 (本文称为“失活-1”，其可被看作图3荷载HIC-I的HIC-HPLC图中主峰之前的第一个肩)， 和LT β R-Ig融合蛋白的第二失活形式(本文称为“失活_2”，其可被看作图3荷载HIC-I 的HIC-HPLC图中主峰之后的肩)，以及LT β R-Ig的聚集形式。本发明涉及从失活的多种形式和/或Ig融合蛋白及蛋白质聚集体中分离所需的 LT^R-Ig的活性、单体形式。本发明的方法依赖于不同类型的色谱的组合，例如，疏水作用色谱(HIC)，以有效减少混合物中失活形式(包括两种形式)和/或聚集Ig融合蛋白百分比。本发明提供了分离含有生物活性免疫球蛋白(Ig)融合蛋白、失活Ig融合蛋白和聚集体的混合物的方法。在一个方面，通过包含混合模式树脂的第一步骤，接着通过苯基 HIC步骤实现分离。本发明方法中第一步骤包括在允许生物活性Ig融合蛋白结合混合模式树脂的条件下将混合物与混合模式树脂接触。应该注意的是，有利于混合模式树脂结合活性Ig融合蛋白的条件可能也有利于杂质结合。因此，冲洗条件和洗脱条件可用于分离杂质与生物活性Ig融合蛋白。例如，为了纯化活性LT-i3-R-Ig，将蛋白质混合物荷载到混合模式树脂后，某些洗脱前冲洗条件和洗脱条件可用于分离活性LT-β -R-Ig与失活1。在下面实施例中提供了此冲洗/洗脱条件的实例。然后从第一混合模式树脂步骤洗脱生物活性 Ig融合蛋白，从而获得洗脱液。纯化方法的第二步骤包括在允许生物活性Ig融合蛋白结合HIC树脂的条件下将第一步骤的洗脱液与疏水作用色谱(HIC)树脂接触。然后洗脱活性Ig融合蛋白。由此产生的溶液包括已从Ig融合蛋白的两种失活形式和蛋白质聚集体中分离的生物活性Ig融合蛋白。在优选实施方案中，HIC树脂是苯基树脂，例如苯基琼脂糖。关于用苯基步骤纯化LT- β -R-Ig融合蛋白，如在下面实施例中更详细地描述，产物(活性LT- β -R-Ig融合蛋白)、聚集体、失活-2都在荷载后结合到苯基柱，但使用适当的冲洗/洗脱条件则分离。洗脱条件可导致聚集体和失活-2优先地保留在柱上，而LT- β -R-Ig产物洗脱成纯化形式。
分离活性Ig融合蛋白与失活形式和/或聚集体的一种方法包括在允许生物活性 Ig融合蛋白结合丁基树脂的条件下将包含生物活性Ig融合蛋白和生物失活Ig融合蛋白的混合物与丁基疏水作用色谱(HIC)树脂接触。应该注意的是，有利于丁基树脂结合活性 Ig融合蛋白的条件可能也有利于杂质结合。因此，冲洗条件和洗脱条件可用于分离杂质与生物活性Ig融合蛋白。例如，为了纯化活性LT-i3-R-Ig，将蛋白质混合物荷载到丁基树脂后，某些洗脱前冲洗条件和洗脱条件可用于分离活性LT-β -R-Ig与失活形式。失活-1可通过降低NaCl浓度冲洗掉。活性LT- β -R-Ig和聚集体可通过进一步降低NaCl浓度洗脱， 而失活-2仍结合在柱上直到用水(无NaCl)才脱落。在下面实施例中提供了此冲洗/洗脱条件的实例。洗脱生物活性Ig融合蛋白后，随后将洗脱液与第二 HIC树脂接触，使得生物活性 Ig融合蛋白结合第二 HIC树脂。洗脱生物活性Ig融合蛋白后，由此产生的溶液包括从失活形式和/或聚集体中分离的生物活性Ig融合蛋白。在一个实施方案中，丁基HIC树脂包含羟基化的甲基丙烯酸酯骨架。可选择地，使用苯基HIC步骤的组合可实现本发明的纯化方法。关于LT-β -R-Ig 融合蛋白，生物活性LT-β-R-Ig、失活形式(例如失活-1和失活-2)和聚集体各自结合到苯基树脂。因此，使用合适的冲洗和洗脱缓冲液的组合可纯化活性LT- β -R-Ig。本发明的一个重要方面是从蛋白质的两种失活形式及蛋白质聚集体中纯化生物活性LTi3 R-Ig融合蛋白。这些杂质从LT-β -R-Ig融合蛋白生产中产生，特别是在哺乳动物细胞培养中产生，但可根据本文描述的纯化步骤减少。本发明提供了分离包含生物活性LTi3 R-Ig融合蛋白、失活LTi3 R-Ig融合蛋白和聚集体的混合物的方法。在一个方面，通过包含混合模式树脂的第一步骤，接着苯基HIC步骤实现分离。方法中的第一步骤包括在允许生物活性LTi3 R-Ig融合蛋白结合混合模式树脂的条件下将混合物与混合模式树脂接触。应该注意的是，有利于混合模式树脂结合活性 Ig融合蛋白的条件可能也有利于杂质结合。因此，冲洗条件和洗脱条件可用于分离杂质与生物活性Ig融合蛋白。然后从第一混合模式树脂步骤洗脱生物活性LT β R-Ig融合蛋白，从而获得洗脱液。在一个实施方案中，来自混合模式树脂的洗脱液具有显著减少的量的 LT β R-Ig融合蛋白的失活-1形式，即第一洗脱液包含少于2%、少于或少于0.5%的 LT β R-Ig融合蛋白的失活1形式。此外，取决于色谱条件，聚集体可能从荷载中的观％减少到洗脱液中的8%。纯化方法的第二步骤包括在允许生物活性LTiiR-Ig融合蛋白(其可能还包括杂质)结合疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下，将第一步骤的洗脱液与HIC树脂接触。然后洗脱活性LT β R-Ig融合蛋白，使得LT β R-Ig融合蛋白的失活-2形式和蛋白质聚集体都显著减少。在一个实施方案中，来自HIC树脂的洗脱液具有显著减少的量的 LTi3 R-Ig融合蛋白的失活-2形式，即第一洗脱液包含少于2%、少于或少于0. 5%的 LT β R-Ig融合蛋白的失活2形式。由此产生的溶液包含已从LT β R-Ig融合蛋白的两种失活形式和蛋白质聚集体中分离的生物活性LTiiR-Ig融合蛋白。在优选实施方案中，HIC树脂是苯基树脂，例如苯基琼脂糖。分离活性Ig融合蛋白与失活形式和/或聚集体的另一方法包括在允许生物活性 Ig融合蛋白结合丁基疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下将包含生物活性Ig融合蛋白和生物失活Ig融合蛋白的混合物与丁基树脂接触。然后洗脱生物活性Ig融合蛋白并收集第一洗脱液。随后将洗脱液与第二HIC树脂接触，使得生物活性Ig融合蛋白结合第二 HIC树脂。 洗脱生物活性Ig融合蛋白后，由此产生的溶液包含从失活形式和/或聚集体中分离的生物活性Ig融合蛋白。在一个实施方案中，丁基HIC树脂包含羟基化的甲基丙烯酸酯骨架。还具有特征是从包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和蛋白质聚集体的混合物中去除至少97%的蛋白质聚集体的方法。该方法基于上面色谱步骤的组合，例如，HIC苯基或混合模式/HIC苯基。在一个实施方案中，该方法包括在允许生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白结合苯基HIC或混合模式树脂的条件下将混合物与苯基HIC树脂或混合模式树脂接触， 随后从苯基HIC或混合模式树脂中洗脱生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白以获得第一洗脱液。 第一洗脱液具有减少量的蛋白质聚集体，包括少于25%的蛋白质聚集体、少于20%的蛋白质聚集体、少于15%的蛋白质聚集体或约10%的蛋白质聚集体。在一个实施方案中，第一 HIC步骤后，在允许生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白结合HIC树脂的条件下可将洗脱液与第二树脂例如苯基HIC接触。洗脱生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以获得包括少于2%的蛋白质聚集体或少于的蛋白质聚集体的第二洗脱液。该方法导致至少97%的蛋白质聚集体从包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和蛋白聚集体的初始混合物中去除。本文描述的方法的特别优势是当50%的起始原料包含不需要的失活和聚集物质时，各种方法可用于纯化产物，例如LT- β -R-Ig融合蛋白。在一个实施方案中，混合模式树脂(例如Capto MMC)步骤能够将聚集体从减少至8%，循环-2苯基柱能够将聚集体从24%减少至< 1.0%。本发明的另一方面是制备包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的组合物的方法。 如本文以上阐述，在一个说明性实施方案中，组合物包含少于的LT-β-R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1蛋白)、少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2蛋白)、和少于的蛋白质聚集体。该方法基于提供失活Ig融合蛋白和蛋白质聚集体的去除的色谱步骤的某些组合。该方法包括从包含用编码LT-β -R-Ig-融合蛋白的DNA 转化的哺乳动物宿主细胞的哺乳动物细胞培养系统获得细胞培养上清液。表达后，将细胞培养上清液与重组蛋白A(rfr0tein Α)接触以获得LT-i3-R_Ig融合蛋白混合物。在允许活性LT-β -R-Ig融合蛋白结合树脂的条件下将LT-β -R-Ig融合蛋白混合物与疏水作用色谱 (HIC)树脂接触。洗脱活性LT-i3-R-Ig融合蛋白后，在允许活性LT-i3-R-Ig融合蛋白结合疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下将洗脱液与第二 HIC树脂接触。在一个实施方案中，洗脱活性LT- β -R-Ig融合蛋白后，洗脱液含有少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1蛋白)、少于的LT-β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2蛋白)、和少于的蛋白质聚集体。在一个实施方案中，该发明涉及包含少于的LT-β-R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1蛋白)、少于1 %的LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式 (失活-2蛋白)、和少于的蛋白质聚集体的组合物。在一个实施方案中，细胞培养中表达的LT-β-R-Ig融合蛋白的基于苯基的纯化包括不连续洗脱，从而柱上荷载IM硫酸铵并以0. 44Μ洗脱。LTBR-Ig的聚集体和失活_2形式比产物洗脱得“晚”些。在一个实施方案中，细胞培养中表达的LT-β-R-Ig融合蛋白的基于丁基的纯化包括，通过不连续降低NaCl浓度，在荷载柱后冲洗失活-ILT-β -R-Ig融合蛋白。然后，为了丁基洗脱，NaCl浓度进一步不连续降低，导致产物(和聚集体)洗脱而失活-2不被洗脱。最终通过降低NaCl盐浓度至0将失活-2从丁基柱上剥离。LT-β -R-Ig融合蛋白的活性和失活形式可根据本领域已知的大量参数的任一种确定，包括结合到LT配体。在一个实施方案中，可测量结合相互作用的亲和力。在另一实施方案中，在本领域已知的测量LT- β -R分子引起生物反应的能力的体外测定诸如IL-8抑制测定可用于从生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白中区分生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白。例如，在一个实施方案中，IL-8释放测定基于IL-8分泌，在可溶性重组人类淋巴毒素α 1 β 2结合到Α375细胞(人类黑素瘤细胞系)上的细胞表面淋巴毒素β受体后可观察到IL-8分泌。IL-8释放测定测量结合分子(例如LT-β -R-Ig)通过结合到可溶淋巴毒素α 1β 2，阻止其结合到淋巴毒素β受体而阻断此IL-8分泌的能力。然后用ELISA测定测量分泌到培养基上清液的IL-8。稀释结合分子至适当的浓度并与可溶性重组人类淋巴毒素α 1 β 2 (170ng/ml)在室温在96-孔微孔板上孵育1小时。通过确定IL-8释放的最大量的滴定实验优化淋巴毒素α1β2的浓度。然后向每孔加入2万Α375细胞，将微孔板在 37°C、5%C02条件下孵育17小时。在孵育期结束时，将微孔板离心和收集上清液。用标准夹心ELISA测定检测上清液的IL-8浓度。将IL-8浓度对抗体浓度绘图，从数据的4-参数曲线拟合确定IC50。通常，如果抑制百分比在对照参考的75% -135%之间，则认为LT-β-R-Ig融合蛋白在IL-8抑制测定中是活性的。可选择地，可使用对活性形式或失活形式特异的抗体来确定LT-β -R-Ig融合蛋白的活性和失活形式。对LT-β -R-Ig融合蛋白的活性或功能形式特异的抗体(不能结合失活形式的抗体)的实例包括AGHl (由杂交瘤AG. Hl. 5.1产生；ATCC登录号HB11796)和BDA8(产生小鼠抗-人类LT-^-R mAb BDA8的杂交瘤细胞系(BD.A8.AB9)，根据布达佩斯条约的规定在1995年1月12日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC) (Rockville, Md.)，指定ATCC登录号是HB11798)，其每一个在美国专利申请 20020197254、美国专利申请20020039580和美国专利第7，001, 598号中描述，其每一个在此通过引用并入。此外，可根据本文描述的色谱步骤通过它们的洗脱性质表征活性和失活蛋白。例如，使用丁基HIC柱，在1.55M NaCl的第一冲洗中将LT-β-R-Ig融合蛋白的失活-1形式洗脱。用0. 7Μ NaCl作为洗脱缓冲液将LT-β -R-Ig融合蛋白和蛋白质聚集体从柱上洗脱，用纯水的反萃冲洗将LT-β -R-Ig融合蛋白的失活-2形式洗脱。如下述的实施例更详细描述，用硫酸钠代替氯化钠的不连续梯度可实现类似的纯化。应该注意的是，使用大规模生产过程可实施上述的方法。例如，本文描述的方法可用于从具有至少5000L、至少10000L、至少15000L、15000L或大于15000L的体积的混合物中有效分离杂质。此外，可调整某些柱参数以最大限度地回收蛋白。在一个实施方案中，方法的第二 HIC步骤包括具有25-35厘米之间、四至30cm、或约30厘米的柱高的柱。应该理解的是，使用本文描述的方法获得的组合物也涵盖于本发明中。例如，在一个实施方案中，本发明提供了包含生物活性Ig融合蛋白例如LT-β-R-Ig融合蛋白的组合物，其中少于10%的Ig融合蛋白是生物失活的。在另一实施方案中，少于5%的Ig融合蛋白是生物失活的；少于的Ig融合蛋白是生物失活的；或少于0.5%的Ig融合蛋白是生物失活的。还描述了包含聚集体水平减少的组合物，包括包含生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白和少于2%的蛋白聚集体的组合物。
HL饩谱技术本发明的分离方法可对多肽未纯化群体(例如，培养上清液或从原核包涵体中分离的Ig融合蛋白的制品)实施。获得此培养上清液的方法在下面IV部分更详细地描述。 可选择地，本分离方法可用于一种或多种初始选择或纯化步骤后获得的多肽混合物，例如， 从亲和基质例如蛋白A洗脱包含失活和活性形式的制品后。在优选实施方案中，本文描述的色谱步骤可应用于已通过其他蛋白质纯化方案部分纯化的混合物。如本文使用的术语“部分纯化”包括一种蛋白制品，其中按重量计感兴趣的Ig融合蛋白以至少5%的浓度存在、按重量计更优选地至少10%和最优选地至少 45%。初始或后续纯化的步骤可用于去除，例如，免疫球蛋白聚集体、错误折叠物质、宿主细胞蛋白、来自前面的色谱步骤的残留物质(如蛋白A，当使用时)。因此，本文描述的具体色谱步骤的应用还可在整体纯化方案的上下文中理解。可用于纯化之前或之后的典型的纯化步骤包括亲和色谱(例如，由蛋白A共价结合到受控孔玻璃组成的PROSEP- A (BioProcessing Ltd.，U. K)、或蛋白 A SEPHAROSE FastFlow(Pharmacia)或 T0Y0PEARL 650M蛋白A(TosoHaas))。蛋白A优选用于人类γ1、γ2或Y 4重链，蛋白G优选用于小鼠同种型。Bakerbond ABXtm树脂可用于如果分子包含CH3结构域的情况。可用于本发明的方法中的色谱的一个实例是混合模式色谱。优选的混合模式树脂是具有在30mS/cm多于45mg BSA/ml介质的动态结合能力和为多模式弱阳离子交换剂的一种混合模式树脂。可以使用的混合模式树脂的实例是Capto MMC (GE Healthcare)。可以使用的色谱的实例是疏水作用色谱或HIC。如本文使用的术语“HIC”是指使用柱和Ig融合蛋白之间的疏水相互作用以分离蛋白质的失活形式和其他污染物如聚集体与再折叠产物即生物活性Ig融合蛋白的疏水作用色谱。疏水作用色谱最早是在观察到蛋白质可保留在包含碳氢化合物间隔臂但缺乏亲和配体的亲和凝胶上之后发展起来的。从HIC支持物上洗脱可通过改变溶剂、pH、离子强度，或通过添加离液剂或有机改性剂如乙二醇或丙二醇来实现。可在例如美国专利第 3，917，527号和美国专利第4，000, 098号中找到疏水作用色谱的一般原则的描述。在高效液相色谱(HPLC)范围内的HIC已经用于在单步骤方案中，从完整的抗体分子分离缺乏重链部分的抗体片段(例如 F(ab' )2) (Morimoto, K.等人，L Biochem. Biophys. Meth. 24 107(1992))。离子交换色谱也可以用于本发明的方法中。在这方面，各种阴离子或阳离子取代基可连接到基质以形成色谱的阴离子或阳离子支持物。阴离子交换取代基包括二乙基氨基乙基(DEAE)、季氨基乙基(QAE)和季胺(Q)基团。阳离子交换取代基包括羧甲基(CM)、 磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸基(P)和磺酸基(S)。纤维素离子交换树脂如DE23、DE32、 DE52、CM-23、CM-32 和 CM-52 可从 U. K, Kent, Maidstone 的 Whatman Ltd.得到。还已知基于SEPHADEX 和低交联的离子交换物。例如DEAE-、QAE-、CM-、和SP-SEPHADEX 和 DEAE-、Q-、CM-和 S- SEPHAROSE 禾口SEPHAROSE Fast Flow 都可从 Pharmacia AB得到。此外，DEAE和CM衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物如T0Y0PEARL DEAE-650S 或 M 禾口 T0Y0PEARLCM-650S 或 M 可从 Toso Haas Co.，Philadelphia, Pa 得到。疏水相互作用在高离子强度时最强，因此，盐沉淀或离子交换方案后方便地实施此种形式的分离。高盐浓度对蛋白质吸附到HIC柱有利，但是取决于蛋白质和所选特定HIC配体的性质，实际浓度可在很宽的范围内变化。各种离子可划分到所谓的soluphobic系列，取决于它们是否增强疏水相互作用(盐析效应)或破坏水的结构(离液效应)和导致疏水相互作用弱化。阳离子按盐析效应增加排列为Ba++ < Ca++ < Mg++ < Li+ < Cs+ < Na+ < K+ < Rb+ < NH4+,而阴离子可按离液效应增加排列为PO一 < SO4- < CH3COOO- < CF < Br— < NO3-< ClO4-< I-< SCN—。HIC色谱可用于结合和洗脱模式。可选择地，HIC可用于流通模式。通常，Na、K或NH4的硫酸盐有效增强HIC中配体-蛋白质相互作用。盐可根据如下列给出的影响相互作用强度的关系来配制(NH4)2SO4 > Na2SO4 > NaCl > NH4Cl > NaBr > NaSCN。通常，约0. 75和约2M之间的硫酸铵或约1和4M之间的NaCl的盐浓度是有用的。在一个实施方案中，0.3至0.6M Na2SO4用于结合LT β R-Ig融合蛋白到HIC。从HIC的 N. B洗脱还可在低于本文所述的盐浓度例如少于0. 3Na2S04实现。在一个实施方案中，0. 0 至0. 5M硫酸铵用于洗脱蛋白质产物，包括但不限于0. 3至0. 5M硫酸铵。可加入的另外的纯化方案包括但不必限于进一步离子交换色谱、尺寸排阻色谱、 病毒灭活、浓缩和冷冻干燥、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、肝素SEQHAR0SE 色谱、色谱聚焦、PEG沉淀或硫酸铵沉淀。见于本发明的实施方案中的另外的纯化步骤包括阳离子交换膜过滤(例如，用Q 膜吸附器纯化蛋白质制品)。在一些实施方案中，用Q膜吸附器纯化蛋白质在PH 6.2以上和高电导率的溶液中实施。如本文使用的“高电导率”是指约50mS/cm或更高的电导率。若干色谱支持物可在柱制备中使用，最广泛使用的是琼脂糖、二氧化硅和有机聚合物或共聚树脂。疏水作用材料是疏水性配体(例如，烷基或芳基)偶合的基础基质(例如，亲水性碳水化合物(如交联琼脂糖)或合成的共聚物材料)。在一个实施方案中，HIC材料包含苯基取代的琼脂糖树脂。典型的HIC材料包括具有低或高取代的苯基SEPHAR0SE ， FAST FLOW(GE Healthcare ；Pharmacia LKB Biotechnology, AB，瑞典)；苯基 SEPHAR0SE 高性能柱；苯基或丁基-SEPHAROSE CL-4B，丁基-SEPHAROSE FF，辛基 SEPHAROSE FF 和苯基-SEPHAROSE FF (Pharmacia LKBBiotechnology ABJi^ 典)；FractogelTM EMD 丙基或 FRACT0GEL EMC 苯基柱(E.Merck，德国)；MACR0PREP 甲基或 MACR0-PREP 叔丁基支持物(Bio-Rad，加利福尼亚)；WP HI-丙基(C3) 柱(J.T.Baker， 新泽西)。典型的HIC材料还可从以下获得日本东京的Tosoh公司，产品名称T0Y0PEARL 醚 650、苯基 650、丁基 650 (EMD Merck)、丁基 600 (EMDMerck)、醚-5PW-HR 或苯基-5PW-HR ； 以色列雷霍沃特的Miles-Yeda，产品名烷基-琼脂糖，其中烷基包括从2_10个碳原子；和新泽西菲利普斯堡的J.T.Baker，商品名Bakerbond WP-HI-丙基。用传统化学反应制备所需的HIC柱也是可能的(参见例如，Er-el.Z.等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 49 383(1972)或 Ulbrich，V.等人 Coll. Czech. Chem. Commum. 9 1466 (1964))。特定凝胶的选择可由本领域技术人员决定。通常蛋白质和配体的相互作用力随着烷基配体的链长的增加而增加，但具有约4至约8碳原子的配体适合于大多数分离。苯基与戊基具有大约相同的疏水性，虽然由于Pi-Pi轨道与蛋白质上的芳香基相互作用的可能性而选择性不同。选择性还可受支撑树脂的化学性质影响。配体密度是一个重要的参数，因为其不仅影响相互作用的强度和特异性还影响柱容量。市场上可得到的苯基或辛基苯基凝胶的配体密度是大约40皮摩尔/ml凝胶床的级别。凝胶容量是所考虑的特定蛋白以及PH、温度和盐的类型和浓度的函数，但通常可预计落入3-20mg/ml凝胶的范围。通常，温度降低使得与色谱材料的相互作用降低。然而，由提高温度产生的任何益处也必须与这种增加对蛋白质稳定性可能具有的不良反应相权衡。在一个实施方案中，Ig融合蛋白可同步洗脱。在同步洗脱中，开始时，所有的化合物开始在柱中迁移。然而，每种迁移的速率不同，导致较快或较慢的洗脱率。在另一实施方案中，本发明的蛋白质可结合到柱上并洗脱，例如，使用分阶洗脱或梯度洗脱。无论是分阶洗脱还是梯度形式的洗脱可以各种方式完成(a)通过改变盐浓度， (b)通过改变溶剂的极性或(c)加入洗涤剂。通过降低盐的浓度，吸附的蛋白质按照疏水性增加的顺序洗脱。极性的变化可受添加溶剂如乙二醇或丙二醇或(异)丙醇的影响，从而降低了疏水作用的强度。洗涤剂可起蛋白质的置换剂的作用，可主要用在膜蛋白质纯化方面。在进行分离时，多肽混合物可与色谱材料接触例如，使用分批纯化技术或使用柱。 纯化之前可能期望去除任何离液剂或非常疏水的物质，例如将混合物通过预层析柱。例如，对于分批纯化，将色谱材料在所需的起始缓冲液中制备或平衡。获得材料的浆液。将多肽溶液与浆液接触以吸附至少一种要分离的多肽到色谱材料。将包含不结合到色谱材料的多肽的溶液从浆液中分离，例如，通过允许浆液沉淀和去除上清。浆液可经受一个或多个冲洗步骤。如果需要的话，浆液可与较低导电率的溶液接触以解吸附已结合到HIC 材料的多肽。为了洗脱结合的多肽，盐浓度可降低。在一个实施方案中，色谱材料可装在柱中。包含要分离的多肽的混合物可施加到柱，允许至少一种要分离的多肽吸附到柱上。不吸附到柱上的多肽穿过柱并可被收集。为了洗脱结合的多肽，盐浓度可降低，例如以逐步方式或使用包括连续或不连续盐梯度的盐梯度通过差别解吸附实现结合物质的分离。本文进一步描述已被鉴定为有效分离Ig融合蛋白的失活形式和/或蛋白质聚集体的特定色谱组合。IV. Ig融合蛋白的表达本发明的方法用于纯化首先使用本领域已知的技术例如细胞培养技术制备的Ig 融合蛋白的混合物。简单地说，通常将编码Ig融合蛋白的核酸插入表达载体以引入可用于生产所需量多肽的宿主细胞，转而根据本文描述的方法为纯化提供Ig融合蛋白。本说明书和权利要求书使用的术语“载体”或“表达载体”是指根据本发明用作在细胞中引入和表达所需基因的媒介的载体。本领域的技术人员已知，这些载体可很容易地从由质粒、噬菌体、病毒和反转录病毒组成的组中选择。通常，与本发明兼容的载体包含筛选标记、方便所需基因克隆的适当的限制性位点和在真核细胞或原核细胞中进入和/或复制的能力。对于此发明，可使用许多表达载体系统。例如，一类载体使用来自动物病毒如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或M0MLV)或 SV40病毒的DNA元件。其他载体涉及使用多顺反子系统，带有内部核糖体结合位点。此外， 已整合DNA到其染色体的细胞可通过导入一种或多种允许筛选转染宿主细胞的标记进行筛选。标记可以为营养缺陷型宿主提供原营养、抗杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属如铜的抗性。选择标记基因可直接连接到要表达的DNA序列，或通过共转化导入同一细胞。mRNA的优化合成还可需要另外的元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号、及转录启动子、增强子和终止信号。在特别优选的实施方案中，克隆的可变区基因与如上面讨论合成的重链和轻链恒定区基因(优选地人类)一起插入到表达载体。优选地，这使用IDEC有限公司的称为NE0SPLA的专有表达载体来实现(美国专利第6，159，730号)。这种载体包含巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素多聚腺苷酸序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。在美国专利号第5，736，137和5，658，570号中还教导了载体系统，其每一个在此通过引用以其整体并入。这种系统提供了高表达水平，例如>30pg/细胞/天。其他典型的载体系统还在例如美国专利第6，413，777号中公开。在其他优选实施方案中，Ig融合蛋白可使用多顺反子构建体表达，如于2001年11 月16日提交的共同待决的美国临时申请号60/331，481中所公开的，在此以其整体并入。在这些新的表达系统中，感兴趣的多种基因产品如抗体的重链和轻链可从单个多顺反子构建体产生。这些系统有利地使用内核糖体进入位点(IREQ以在真核宿主细胞中提供相对高水平的本发明的多肽。也并入在此的美国专利第6，193，980号中公开了兼容的IRES序列。 本领域的技术人员应理解，这种表达系统可用于有效地产生本申请中公开的全部范围的多肽。更通常地，制备了编码Ig融合蛋白的载体或DNA序列后，表达载体可以导入适当的宿主细胞。也就是说，宿主细胞可以被转化。质粒导入宿主细胞可通过本领域技术人员熟知的各种技术实现。这些技术包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、用包膜DNA进行细胞融合、显微注射和用完整病毒感染。参见Ridgway， A. A. G"Mammalian Expression Vectors (哺乳动物表达载体)”第 24. 2 章，第 470-472 页， Vectors (载体),Rodriguez 禾口 Denhardt 编著(Butterworths, Boston, Mass. 1988)。最优选地，通过电穿孔将质粒导入宿主。转化的细胞在适合于轻链和重链产生的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白合成。典型的测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、或荧光激活细胞分选分析(FACS)、免疫组织化学及类似测定。如本文使用的术语“转化”应是广义上的使用，是指将DNA导入受者宿主细胞，改变基因型并因而导致受者细胞中发生变化。本着同样的精神，“宿主细胞”是指已使用重组DNA技术构建的编码至少一个外源基因的载体转化的细胞。为了描述从重组宿主中分离抗体的方法，除非另有明确说明，否则可互换地使用术语“细胞”和“细胞培养”以表示抗体来源。换言之，从“细胞”中回收多肽可意味着从沉降的完整细胞或从包括培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收。用于蛋白质表达的宿主细胞系最优选地是哺乳动物来源；认为本领域的技术人员具有优先地确定最适合所需基因产物在其中表达的特定宿主细胞系的能力。典型的宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB 11(中国仓鼠卵巢系，DHFR缺陷)、HELA (人类宫颈癌)、CVI (猴肾脏系)、C0S(以SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3 (小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾脏系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、 P3. times. 63-Ag3. 653(小鼠骨髓瘤)、BFA-lclBPT (牛内皮细胞)、RAJI (人类淋巴细胞)和四3(人类肾脏)。特别优选的是CHO细胞。宿主细胞系通常可从商业服务、美国组织培养物保藏中心或从出版的文献得到。体外生产允许扩大规模以生产大量所需的多肽。在组织培养条件下哺乳动物细胞培养技术为本领域已知的，包括均质悬浮培养，例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中， 或固定或截留的细胞培养，例如在空心纤维、微囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷管壳上。编码本发明多肽的基因还可由非-哺乳动物细胞如细菌或酵母或植物细胞表达。 在这方面要认识到，各种单细胞非-哺乳动物微生物如细菌也可以被转化，即能够在培养或发酵中生长的那些细菌。容易转化的细菌包括肠杆菌科的成员如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)菌株；芽胞杆菌科(Bacillaceae)的成员如枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)；月市炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)禾口、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) 0还应进一步理解，当在细菌中表达时多肽通常成为包涵体的一部分。多肽必须被分离、纯化和然后组装成功能分子。除了原核生物，还可使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通的面包酵母(baker' s yeast)是真核微生物中最常用的，虽然许多其他菌株通常可得到。对于在酵母中表达，常用例如质粒YRp7 (Minchcomb等人，Nature, 282 =39(1979)； Kingsman 等人，Gene, 7 :141(1979) ；Tschemper 等人，Gene, 10 :157(1980))。这种质粒中已包含为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株提供筛选标记的TRPl基因，例如 ATCCNo. 44076 或 PEP4-1 (Jones, Genetics, 85 :12(1977))。作为酵母宿主细胞基因组的特征的trpl损伤的存在从而为通过在缺乏色氨酸的情况下生长而检测转化提供了有效的环
^Mi ο在一个实施方案中，利用在低培养温度即低于常规的37°C或在和32°C之间培养哺乳动物细胞使本发明的Ig融合蛋白表达。Ig融合蛋白特别是TNF受体-Ig融合蛋白的低温培养降低失活融合蛋白的整体百分比。美国专利申请20020039580 (Browning等人)描述了在低温培养Ig融合蛋白的方法，在此通过引用以其整体并入。在一个实施方案中，本发明的方法使用的纯化用的起始材料是表达重组Ig融合蛋白的CHO细胞的上清液。在一个实施方案中，CHO细胞在约至32°C的温度培养。在一个实施方案中，纯化的起始材料包含大约20-40%的聚集材料。在一个实施方案中，纯化的起始材料包含大约30%的聚集材料。在一个可选择的实施方案中，起始材料包含大约50% 或多于50%的聚集材料。使用本发明方法纯化之前，包含待分离的多肽混合物的组合物优选放置在酸性或大约中性PH的缓冲液中。这可以例如，通过添加浓缩缓冲液，再悬浮缓冲液中样品，交换缓冲液(例如，使用透析或超滤)来进行。可选择地，样品缓冲液的PH可简单地调节到所需的范围内。V.免疫球蛋白融合蛋白本文描述的方法可用于Ig融合蛋白，其可能更容易具有例如由于多个二硫键的不适当的折叠。这种蛋白质可能会更容易具有不完整或异常折叠，产生不同形式的失活蛋白，其在大小和特征上与活性蛋白十分相似，但尽管如此，其是失活的和治疗用途所不需要的。
在一个方面，本发明的方法可用于纯化具有复杂折叠的融合蛋白，如具有高数目的形成二硫键的半胱氨酸残基的蛋白质。在一个实施方案中，Ig融合蛋白组合了配体或受体的结合结构域(例如受体的胞外域(EOT))与至少一条重链结构域和连接肽。在一个实施方案中，当制备本发明的融合蛋白时，编码配体的结合结构域或受体结构域的核酸C-末端融合到编码免疫球蛋白恒定区序列的N-末端的核酸。N-末端融合也是可能的。在一个实施方案中，融合蛋白包括CH2和 CH3结构域。融合还可对恒定结构域的Fc部分的C-末端，或紧接重链的CHl或轻链相应区的N-末端进行。在一个实施方案中，将配体或受体结合结构域的序列融合到免疫球蛋白分子的Fc 结构域的N-末端。还可能将整条重链恒定区融合到配体或受体结合结构域序列。在一个实施方案中，在融合中使用起始于铰链区、木瓜蛋白酶裂解位点正上游的序列，其化学上定义IgG Fc(即，残基216，把重链恒定区的第一个残基看作114)，或其他免疫球蛋白的类似位点。进行融合的确切位点不是关键；已熟知特定的位点，并可以选择以优化分子的生物活性、分泌或结合特征。本领域已知制备融合蛋白的方法。在一个实施方案中，包含结合结构域的蛋白与Fc结构域通过氨基酸连接子连接，所述连接子例如长度是1至5个氨基酸。在一个实施方案中，TNF受体和Fc结构域通过单个氨基酸连接。在优选实施方案中，本文描述的纯化方法可用于分离TNF受体Ig融合蛋白。在其他实施方案中，本发明涉及通过本文讨论的方法获得的TNF家族受体-Ig融合体，及包含它们的药物制剂。TNF受体的实例是LT β R0其他实例包括HVEM。在一个方面，本发明的方法实现了纯化的LTiiR-Ig融合蛋白组合物。在一个实施方案中，LT β R-Ig融合蛋白包含人类LT β R的胞外结构域(无跨膜结构域的形式)和免疫球蛋白Fc区(IgGlFc结构域)。SEQ ID NO 1描述了人类LT β R的全长序列，包括胞外结构域。图10中提供了 LT-β-R-Ig融合的示意图。其他融合蛋白也包括在本发明中。文献中报道的典型的融合蛋白包括与以下的融合体Τ 细胞受体(Gascoigne 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :2936-2940 (1987))； CD4 (Capon 等人，Nature 337 :525-531 (1989) ；Traunecker 等人，Nature 339 68-70(1989) ；Zettmeissl 等人，DNA Cell Biol. USA 9:347-353(1990)；和 Byrn 等人.， Nature 344:667-670(1990)) ；L-选择素(归巢受体)(Watson 等人，J. Cell. Biol. 110 2221-2229(1990)；和 Watson 等人，Nature 349 :164-167(1991)) ；CD44 (Aruffo 等人， Cell 61 :1303-1313(1990)) ；CD^ 和 B7 (Linsley 等人，J. Exp. Med. 173 :721-730 (1991))； CTLA-4(Lisley 等 A, J. Exp. Med. 174 :561-569 (1991)) ；CD22 (Stamenkovic 等人， Cell66 :1133-1144(1991)) ;TNF 受体(Ashkenazi 等 A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 10535-10539 (1991) ；Lesslauer 等人，Eur. J. Immunol. 27 :2883-2886 (1991)；和 Peppel 等人，J. Exp. Med. 174 1483-1489 (1991))；和 IgE 受体 a (Ridgway 和 Gorman，J. Cell. Biol. 第 115 卷，摘要号 1448(1991))。另外的典型的可包括在本融合蛋白中的配体和它们的受体包括以下细胞因子和细胞因子受体细胞因子对淋巴细胞的增殖、分化和功能活化具有多效作用。各种细胞因子或其受体结合部分可用于本发明的融合蛋白中。典型的细胞因子包括白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13 和 IL-18)、集落刺激因子(CSF)(例如粒细胞CSF(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和单核细胞巨噬细胞CSF(M-CSF))、肿瘤坏死因子(TNF) α和β、和干扰素如干扰素-α、β或γ (美国专利第4，925，793和4，929，554号)。细胞因子受体通常由配体-特异α链和共同的β链组成。典型的细胞因子受体包括以下物质的受体GM-CSF、IL-3 (美国专利第5，639，605号)、 IL_4(美国专利第 5，599，905 号)、IL_5(美国专利第 5，453，491 号)、IFNy (EP0240975) 和受体 TNF 家族(例如，TNF α (例如 TNFR-I (EP 417，563)、TNFR_2 (EP 417，014)、淋巴毒素 β受体)。粘附蛋白粘附分子是允许细胞彼此相互作用的膜结合蛋白。各种粘附蛋白，包括白细胞归巢受体和细胞粘附分子、其受体结合部分，可被并入本发明的融合蛋白。白细胞归巢受体在炎症期间在白细胞表面表达，包括整联蛋白(例如VLA-1、2、3、4、5和6)，其介导对胞外基质成分的结合，和β 2整联蛋白(例如LFA-I、LPAM-I、CR3和CR4)，其结合到血管内皮细胞上的细胞粘附分子(CAM)。典型的CAM包括ICAM-I、ICAM-2、VCAM-I和MAdCAM-I。其他CAM包括选择蛋白家族的CAM，包括E-选择蛋白、L-选择蛋白和P-选择蛋白。趋化因子刺激白细胞向感染部位迁移的趋化因子、趋化蛋白可以也并入本发明的融合蛋白中。典型的趋化因子包括巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α和MIP-1-β)、中性粒细胞趋化因子和RANTES(调节活化正常T细胞表达和分泌的因子)。生长因子和互长因子受体生长因子或其受体(或其受体结合或配体结合部分)可并入本发明的融合蛋白中。典型的生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)和其亚型(美国专利第5，194，596号)； 成纤维细胞生长因子(FGF)，包括aFGF和bFGF ；心房钠利尿因子(ANF)；肝生长因子(HGF ； 美国专利第5，227，158和6，099，841号)；神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5或神经营养蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或 NT-6)；或神经生长因子如NGF-β，血小板-源生长因子(PDGF)(美国专利第4，889，919、 4，845，075、5，910，574 和 5，877，016 号)；转化生长因子(TGF)如 TGF-α 和 TGF-β (W0 90/14359)；骨诱导因子包括骨形态发生蛋白(BMP)；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-IKIGF-I和IGF-II ；美国专利第6，403，764和6，506，874号)；红细胞生成素(EPO)； 干细胞因子(SCF)；血小板生成素(c-Mpl配体)，Wnt多肽(美国专利第6，159，462号)。可用作本发明的靶向受体结构域的典型的生长因子受体包括EGF受体；VEGF受体(例如Fltl 或 Flkl/KDR)，PDGF 受体(W0 90/14425) ；HGF 受体(美国专利第 5，648，273 和 5，686，292 号)，和神经营养受体包括低亲和力受体(LNGFR)，也称为ρ75·或ρ75，其结合NGF、BDNF 和ΝΤ-3，和为受体酪氨酸激酶的trk家族的成员的高亲和力受体(例如trkA、trkB(EP 455，460)、trkC(EP522, 530))。激素本发明的融合蛋白中使用的典型的生长激素包括肾素、人类生长激素(HGH ；美国专利第5，834，598号)、N-甲硫氨酰人类生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子； 甲状旁腺激素(PTH)；促甲状腺激素(TSH)；甲状腺素；胰岛素原和胰岛素(美国专利第5，157，021和6，576，608号)；卵泡刺激素(FSH)、降钙素、促黄体生成素(LH)、瘦素、胰高血糖素；铃蟾肽；生长激素；苗勒氏管抑制物；松弛素和松弛素原(prorelaxin)；促性腺激素相关肽；催乳素；胎盘催乳素；OB蛋白或苗勒氏管抑制物。凝血因子本发明的融合蛋白中使用的典型的凝血因子包括凝血因子(例如因子V、VII、 VIII、X、IX、XI、XII和XIII、血管性血友病因子)；组织因子(美国专利第5，346，991、 5，349，991,5, 726，147和6，596，84号)；凝血酶和凝血酶原；纤维蛋白和纤维蛋白原；纤溶酶和纤溶酶原；纤溶酶原激活物、如尿激酶或人类尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)。其他典型的融合蛋白教导于，例如，W00069913A1和W00040615A2。可包括于本发明融合蛋白中的另一典型的分子是IGSF9。融合蛋白可用本领域熟知的方法制备(参见例如美国专利第5，116，964和 5，225，538号)。通常，配体或配体结合伴侣物C-末端地融合到重链(或重链部分)的恒定区的N-末端，并代替可变区。融合之前优选失活或缺失配体结合受体的任何跨膜区或脂质或磷脂锚识别序列。编码配体或配体结合伴侣物的DNA通过限制性内切酶在编码所需的 ORF片段的DNA的5，和3，末端处或附近裂解。随后所得的DNA片段容易插入编码重链恒定区的DNA。进行融合的确切位点可凭经验选择以优化可溶性融合蛋白的分泌或结合特征。 然后将编码融合蛋白的DNA转染宿主细胞以表达。VI.药物组合物本发明的方法和组合物特别适合于用于药物配制的Ig融合蛋白的纯化，因为如果给治疗中的受试者施用失活和/或蛋白质聚集体可具有毒性效应。例如，融合蛋白的失活形式和蛋白质聚集体可能导致Ig融合蛋白的效力损失或增加免疫原性。因此，本发明提供了适合于治疗用途的纯化的生物蛋白的组合物。制备和给受试者施用使用本发明的方法获得的蛋白质的方法是本领域的技术人员熟知的或容易确定的。在一个实施方案中，本发明涉及包含纯化的LT-β -R-Ig融合蛋白的药物组合物。 可溶性LT-β-R-Ig可配制成药物组合物，例如，用于给受试者施用以治疗自身免疫性疾病，例如脱髓鞘疾病，如多发性硬化症。通常，药物组合物包括药学上可接受的运载体。如本文使用，“药学上可接受的运载体”包括溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂、及生理相容的类似物。该组合物可包括药学上可接受的盐，如酸加成盐或碱加成盐(参见例如 Berge 等人，J. Pharm. Sci. 66 :1_19，1977)。可溶性LT-β-R-Ig可根据标准方法配制。药物配制是完善建立的技术，进一步描述在，例如，Gennaro (编著)，Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿药学理论与实践)，第 20 版，Lippincott, Williams & amp ；Wilkins (2000) (ISBN :0683306472) ；Ansel 等人’ Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(药物剂型与药物递送系统)，第 7 版，Lippincott Williams & amp ；Wilkins 出版社(1999) (ISBN :0683305727)；和 Kibbe (编著)，Handbook of Pharmaceutical Excipients (药用辅料手册)American Pharmaceutical Association (美国制药协会)，第 3 版，(2000) (ISBN :091733096X)中。在一个实施方案中，可溶性LT-β-R-Ig可用辅料材料配制，如氯化钠、磷酸氢二钠七水合物、磷酸二氢钠和稳定剂。其可以例如合适浓度的缓冲溶液提供，并可在2-8°C贮藏。药物组合物可能是各种形式。这些包括，例如，液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如注射液和可输注溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉末剂、脂质体和栓剂。优选形式可取决于预期施用模式和治疗应用。通常情况下，本文描述的制剂的组合物为注射液或可输注溶液形式。此组合物可通过肠胃外模式施用(例如静脉、皮下、腹腔内或肌肉注射)。本文使用的短语“肠胃外施用”和“施用肠胃外”表示肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，包括但不限于静脉、肌肉、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、脑硬膜夕卜、脑内、颅内、颈动脉内和胸骨内注射和输液。该组合物可配制成溶液、微乳剂、分散剂、脂质体或适合于在高浓度稳定储存的其他有序结构。无菌注射液可通过将所需量的本文描述的药剂与根据需要的上述列举的成分的一种或组合一起加入到合适的溶剂中而制备，接着是过滤灭菌。通常，分散剂是通过将本文所述的药剂加入到包括基本分散介质和所需的上述列举的其他成分的无菌赋形剂中而制备。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况，优选地制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生本文描述的药剂加上来自其之前无菌-过滤的溶液的任何另外所需的成分的粉末。可维持溶液的适当流动性，例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过维持分散剂情况所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂。注射组合物的延长吸收可由包括在组合物中的延迟吸收的试剂所导致，例如单硬脂酸盐和明胶。在某些实施方案中，可溶性LT-β-R-Ig可与防止化合物快速释放的运载体一起制备，如包括植入体和微囊递送系统的控释制剂。可使用生物可降解、生物相容的聚合物， 如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这类制剂的许多制备方法是特许的或普遍所知。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (缓释和控释药物递送系统)，J. R. Robinson 编著，Marcel Dekker, Inc.，New York, 1978。可溶性LT-β -R-Ig可被修饰，例如用基团提高其稳定性和/或在循环例如血液、 血清或其他组织中的滞留时间，例如提高至少1.5、2、5、10或50倍。可评价修饰的药剂以评估其是否可达到炎症位点(例如损伤或硬化症)如可发生在脱髓鞘疾病，如多发性硬化症(例如，通过使用标记形式的药剂)。例如，LT-β -R-Ig可与聚合物缔合，例如，大致上非抗原性聚合物，如聚氧化烯烃或聚氧化乙烯。合适的聚合物的重量实质地不同。可使用具有数均分子量从约200至约 35，000道尔顿(或约1，000至约15，000，和2，000至约12，500)的聚合物。例如，可溶性LT-β -R-Ig可共轭到水溶性聚合物，例如亲水性聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。这类聚合物的非限制性列表包括聚氧化烯烃均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，前提是保持嵌段共聚物的水溶性。其他有用的聚合物包括聚氧化烯烃如聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物(Pluronics)、聚甲基丙烯酸酯、卡波姆、和分支或不分枝的多糖。当可溶性LT-β -R-Ig与第二种药剂联合使用时，两种药剂可分别配制或一起配制。例如各自的药物组合物可在例如施用之前混合并一起施用，或可分别施用，例如在相同的时间或不同的时间。可溶性LT-β -R-Ig可通过各种方法给受试者例如人类受试者施用。对于许多应用，施用的途径是以下之一静脉注射或输液(IV)、皮下注射(Sc)、腹腔内(IP)或肌内注射。在一些情况下，施用可直接进入CNS，例如鞘内、脑室内(ICV)、脑内或颅内。该药剂可以固定剂量施用或以mg/kg剂量施用。也可以选择剂量以减少或避免产生针对药剂的抗体。可溶性LT- β -R-Ig的施用路径和/或施用模式还可针对个别情况定制，例如通过确定受试者中硬化症的位置、数量或大小，例如使用磁共振成像(MRI)扫描、正电子发射成像(PET)扫描、弥散加权成像(DW-I或DW-MRI)、扩散张量成像、脊髓造影、磁化传递。脱髓鞘疾病的严重性或程度的还可由腰椎穿刺(例如，检查脑脊液中白细胞的升高)、用作神经功能量度的诱发电位测试，和/或与脱髓鞘疾病(例如多发性硬化症)相关的任何其他标准参数确定，例如，本文描述的任何评估标准。调整剂量方案以提供所需的反应，例如，治疗反应或联合疗效。剂量方案将例如导致髓鞘再生增加。一般来说，可溶性LT-β-R-Ig的剂量任选地分别配制，或与合适剂量的第二治疗剂一起配制，用于向受试者提供可溶性LT-β -R-Ig。合适的剂量和/或可溶性LT-β -R-Ig的剂量范围包括足以导致受试者中髓鞘再生增加的量。合适的剂量可以是本文描述的任何剂量，并包括，例如，至少0. OOlmg的可溶性LT- β -R-Ig每kg受试者(例如人类患者)体重。所需的增加髓鞘再生的可溶性LT-β -R-Ig的剂量可取决于许多因素，包括，例如年龄、性别和待治疗的受试者的体重。影响给受试者施用的剂量的其他因素包括，例如，脱髓鞘疾病的类型或严重程度。例如，与较轻形式的多发性硬化症相比，急性爆发型多发性硬化症的患者可能需要施用不同剂量的可溶性LT-i3-R_Ig。其他因素可包括，例如，同时或之前影响患者的其他疾病、患者的总体健康、患者的遗传倾向、饮食、施用时间、排泄率、联合用药和向该患者施用的任何其它另外的疗法。还应理解，对任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于治疗医师的判断。活性成分的量还取决于特别描述的化合物和组合物中另外的抗病毒剂的存在或不存在和性质。本文使用的剂量单位形式或“固定剂量”是指适合作为单一剂量用于要被治疗的受试者的物理离散单位；每一个单位包括与所需的药物运载体联合和任选地与其他药剂联合的计算为产生所需治疗效果(例如，受试者中髓鞘再生增加)的预定量的活性化合物。药物组合物可包括本文描述的治疗有效量的可溶性LT-i3-R_Ig。这种有效量的确定可基于施用的药剂的效果，或如果使用多于一种药剂则基于药剂与第二药剂的联合效应。药剂的治疗有效量也可变化，根据以下因素如病状、年龄、性别和个体体重、和化合物在个体中引起所需反应的能力，例如至少一种疾病参数的改善，例如自身免疫性疾病例如脱髓鞘疾病例如多发性硬化症的至少一种症状的改善。例如，治疗有效量的可溶性 LT-β-R-Ig将增加髓鞘再生，还可减慢和/或改善脱髓鞘。治疗有效量也是在其中治疗有益作用超过组合物的任何有毒或有害作用的剂量。装置和药盒。包括可溶性LT-β-R-Ig的药物组合物可用医疗装置施用。装置可设计成具有如便携性、室温贮藏和易用性特征以便其可在远离医疗设施和其他医疗设备的紧急情况下使用，例如由未经训练的受试者或由在现场的急救人员使用。该装置可包括，例如，一个或多个储存包括可溶性LT-β-R-Ig的药物制剂的外壳，并可以配置为递送药剂的一个或多个单位剂量。例如，药物组合物的施用可用经皮递送装置，如注射器，包括皮下注射器或多腔注射器。其他合适的递送装置包括支架、导管、经皮贴片、显微操作针和可植入控释装置。装置(例如，注射器)可包括足够引起髓鞘再生的剂量的干燥或液体形式的可溶性 LT-i3-R_Ig。装置还可以是双腔装置，其中一个腔含有足够导致增加受试者中髓鞘再生的单位剂量的冷冻干燥的可溶性LT-β -R-Ig，第二个腔含有用于重构冷冻干燥单位剂量的可溶性LT- β -R-Ig的液体(例如，缓冲液)。在其他实例中，药物组合物可以用无针皮下注射装置施用，如美国专利第 5，399，163,5, 383，851,5, 312，335,5, 064，413,4, 941，880,4, 790，824 或 4，596，556 号中所描述的装置。众所周知的植入体和模块在例如美国专利第4，487，603号中描述，其公开用于以控制的速率分配药物的可植入式微型输液泵；美国专利第4，486，194号，其公开了通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利第4，447，233号，其公开了以精确的输注率递送药物的药物输液泵；美国专利第4，447，224号，其公开了用于连续递送药物的变流速可植入式输液器；美国专利第4，439，196号，其公开了具有多腔室的渗透药物递送系统；和美国专利第4，475，196号，其公开了渗透药物递送系统。还已知许多其他装置、植入体、递送系统和模块。可溶性LT-β-R-Ig可在药盒中提供。在一个实施方案中，药盒包括(a)含有包括一个或多个单位剂量可溶性LT-β-R-Ig的组合物的容器，和任选地(b)信息材料。可溶性LT-β-R-Ig的单位剂量足以在受试者中导致所需的结果，例如，受试者中疾病进展放缓或改善。信息材料可以是描述性的、指导性的、营销性的或与本文描述的方法和/或用于治疗益处的药剂的用途有关的其他材料。药盒还可包括对髓鞘再生检测(测定)有用的试剂和说明。对髓鞘再生测定的这种方法包括但不限于本文描述的任何检测方法。在一个实施方案中，药盒包括一种或多种另外的用于治疗脱髓鞘疾病的药剂，如一种或多种治疗多发性硬化症的药剂。例如，药盒包括第一容器，其含有包括可溶性LT-β -R-Ig 的组合物，和第二容器，其包括一种或多种另外的药剂。药盒的信息材料不限于其形式。在一个实施方案中，信息材料可包括关于化合物生产、化合物的分子量、浓度、失效日期、批次或生产场地的信息等。在一个实施方案中，信息材料涉及可溶性LT-β -R-Ig的施用方法，例如以合适的剂量、剂型或施用模式(例如本文描述的剂量、剂型或施用模式)向患有脱髓鞘疾病或有发展成脱髓鞘疾病的危险或正在经历与脱髓鞘疾病相关的发作的受试者施用。信息可以以各种格式提供，包括印刷文件、计算机可读材料、显像记录、或录音、或提供了实质性材料的链接或地址的信息。除了药剂之外，药盒中的组合物还可包括其他成分，如溶剂或缓冲液、稳定剂或防腐剂。该药剂可以以任何形式提供，例如液体、干燥或冷冻干燥形式，优选地基本纯净和/ 或无菌。当药剂以液体溶液提供时，液体溶液优选地是水溶液。当药剂以干燥形式提供时， 通常通过加入合适的溶剂重构。溶剂，例如无菌水或缓冲液，可任选地在药盒中提供。药盒可包括用于组合物或含有药剂的组合物的一个或多个容器。在一些实施方案中，药盒包含用于组合物和信息材料的单独的容器、分隔器或腔室。例如，组合物可容纳于瓶、管形瓶或注射器中，信息材料可容纳于塑料套或小包中。在其他实施方案中，药盒的单独成分可容纳于单个的、未分隔的容器内。例如，该组合物容纳于具有贴着标签形式的信息材料的瓶、管形瓶或注射器中。在一些实施方案中，药盒包括多个(例如一包)单独的容器， 每个包括药剂的一个或多个单位剂量形式(例如，本文描述的剂量形式)。容器可包括联合单位剂量，例如，包括可溶性LT- β -R-Ig和第二药剂的单位，例如，以所需的比例。例如， 药盒包括多个注射器、安瓿、铝箔包、泡罩包装或医疗装置，例如，每个包括单个组合单位剂量。药盒的容器可以是密闭、防水(例如，湿气或蒸汽的变化不能渗透)和/或不透光的。药盒任选地包括适合于施用该组合物的装置，例如，注射器或其他适合的给药装置。提供的装置可以预装一种或两种药剂或可以是空的，但适合于装载。VIII.治疗方法使用根据本文描述的方法纯化的活性LT-β-R-Ig融合蛋白制造的制剂，可用于治疗用LT-β-R阻断剂能治疗的许多疾病。此类疾病的实例包括自身免疫性疾病，如类风湿关节炎、肠道疾病，如克罗恩氏病，和神经疾病，如多发性硬化症。美国专利申请 20020197254和美国专利第7，255，854号描述了可用本文描述的组合物治疗的疾病的其他实例，每个在此整体并入。在一个实施方案中，包含本发明纯化的LT-β-R-Ig融合蛋白的药物组合物用于治疗脱髓鞘疾病。如本文使用的“脱髓鞘疾病”是与髓鞘(包围和隔绝神经纤维的脂肪鞘) 被破坏或从神经去除相关的任何疾病。脱髓鞘疾病包括，例如，多发性硬化症(例如，复发/ 缓解型多发性硬化症、继发进展型多发性硬化症、进展复发型多发性硬化症、原发进展型多发性硬化症和急性爆发型多发性硬化症)、脑桥中央髓鞘溶解症、急性播散性脑脊髓炎、进行性多灶性白质脑病、亚急性硬化全脑炎、感染后脑脊髓炎、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、 格林巴利综合征、进行性多灶性白质脑病、德维克病、巴洛同心性硬化症和脑白质营养不良 (例如，异染性脑白质营养不良、克拉伯病、脑白质肾上腺萎缩症、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、卡纳万病、L童共济失调伴中枢髓鞘化不良、亚历山大病或雷夫叙姆病)。患有脱髓鞘疾病的人类患者可具有脱髓鞘疾病的一种或多种症状，如，但不限于，视力损伤、麻木、四肢无力、震颤或痉挛、热耐受不良、言语障碍、失禁、眩晕或本体感觉障碍(例如平衡、协调、肢体位置感)。对于本方法，具有脱髓鞘疾病的家族史(例如，对脱髓鞘疾病有遗传倾向性)的人 (例如，人类患者)，或显示上面所述的轻度或偶发症状的脱髓鞘疾病的人可视为有发展脱髓鞘疾病(例如，多发性硬化症)的危险，可用如本文描述的药物组合物治疗。在一些实施方案中，可溶性LT-β -R-Ig可以足够改善受试者病症的量、频率和/ 或时间给受试者施用。在一个实施方案中，本发明的组合物可用于在受试者中诱导或促进髓鞘再生。在一个实施方案中，给受试者施用可溶性LT-β -R-Ig —次。在其他实施方案中， 给受试者施用可溶性LT-β-R-Ig多于一次，例如每3-10天一次；至少两次和不多于每 5-20天一次；至少两次和不多于每观-31天一次；每周；每两周；每月；至少4周的整个疗程中每周一次；至少6周的整个疗程中每两周一次；至少3个月的整个疗程中每月一次；或至少6个月的整个疗程中每月一次。在一些实施方案中，剂量确定的试验中可溶性LT-β -R-Ig的合适的起始剂量(例如，足以诱导受试者中髓鞘再生的量)是0. OOlmg可溶性LT-β-R-Ig受试者每kg体重。在一些实施方案中，合适的剂量或起始剂量是取决于许多主观的、患者-特定因素，如，但不限于性别、年龄、体重、身体健康程度，或本文所述的任何其他因素。在一些实施方案中，可溶性LT- β -R-Ig给受试者静脉或肠胃外(例如，鞘内、皮下、肌内、鼻内或口服)施用。在一些实施方案中，可溶性LT-β-R-Ig可给受试者作为单一疗法施用。在一些实施方案中，可溶性LT- β -R-Ig可与其他疗法作为联合治疗施用，例如，用于自身免疫性疾病，例如，脱髓鞘性疾病(例如本文所述的任何脱髓鞘疾病(例如，多发性硬化症))的其他疗法。例如，联合疗法可包括向受试者(例如，人类患者)施用一种或多种对患有自身免疫性疾病例如脱髓鞘疾病或有发展危险的受试者提供治疗益处的另外药剂。在一些实施方案中，同时施用可溶性LT-β -R-Ig和一种或多种另外药剂。在其他实施方案中，第一时间施用可溶性LT-β-R-Ig，第二时间施用一种或多种另外药剂。在一些实施方案中，第一时间施用一种或多种另外药剂，第二时间施用可溶性LT-β-R-Ig。可溶性 LT-i3-R-Ig可取代或增强先前或目前施用的治疗。例如，用LT-β-R-Ig治疗后，一种或多种另外药剂的施用可停止或减少，例如，以低水平施用。在其他实施方案中，维持先前治疗的施用。在一些实施方案中，维持先前治疗直至LT- β -R-Ig水平达到足以提供治疗益处的水平。两种治疗可联合施用。在一个实施方案中，可监测正在用本文描述的药物组合物治疗脱髓鞘疾病的受试者的髓鞘再生。如本文定义的监测受试者(例如，人类患者)髓鞘再生是指评价受试者的改变，例如，指示髓鞘再生的一个或多个参数的改善，例如，可监测脱髓鞘疾病的一种或多种症状的改善。此种症状包括本文描述的脱髓鞘疾病的任何症状。髓鞘再生还可由包括直接确定受试者中髓鞘状态的方法监测，例如，可使用磁共振成像(MRI)测量白质质量或用磁共振波谱(MRQ脑部扫描测量髓鞘纤维的厚度。在一些实施方案中，评估在施用，优选地首次施用可溶性LT- β -R-Ig后至少1小时，例如，至少2、4、6、8、12、24或48小时，或至少 1天、2天、4天、10天、13天、20天或更久，或至少1周、2周、4周、10周、13周、20周或更久后进行。受试者可在一个或多个下列周期中评估开始治疗之前、治疗期间、或经过施用疗法的一种或多种组成部分后。评价可包括对进一步治疗的需要的评估，例如，评价剂量、施用频率或疗程是否应改变。其还可包括评估添加或删除选定的治疗方案的需要，例如添加或删除本文描述的脱髓鞘疾病的任何疗法。例如，如有需要时，持续施用可溶性LT-β-R-Ig 可与一种或多种另外的治疗药剂一起进行。在优选实施方案中，如果获得预选的评价结果， 则采取另外的步骤，如，向受试者施用另一疗法，或进行另一评价或试验。例如，可对患者进行腰椎穿刺(例如，腰椎抽液)以获得脑脊液样本。然后测试脑脊液中以下的存在，例如，⑴异常蛋白如髓鞘质的微小片段，( )淋巴细胞的浓度升高或特定类型，和/或(iii)免疫球蛋白(IgG)分子水平异常。对脱髓鞘疾病的定量试验的另一实例是诱发电位测试，其测量神经活性为神经冲动从眼睛、耳朵或皮肤到达大脑需要的时间的函数。脱髓鞘疾病的评估还可通过评价出现在中枢神经系统的炎症性病变(例如，硬化症)的大小和/或数量，用几种成像方法的任何一种，所述成像方法包括但不限于，磁共振成像(MRI)扫描、正电子发射成像(PET)扫描、弥散加权成像(DW-I或DW-MRI)、扩散张量成像、脊髓造影、磁化传递。还可使用多种半定量或定性评估患者的神经心理(例如，各种能力如记忆、算术、注意力、判断和推理的情况)或患者呈现的症状(临床参数)来诊断患者，所述症状包括，例如，本文描述的多发性硬化症的任何症状。此外，脱髓鞘疾病的程度或进展的检测可通过测试患者尿液的髓鞘碱性蛋白类物质(MBPLM)的升高水平，该物质当疾病进展过程中发生轴索损伤时升高(参见，例如，Whitaker等人(1995) Arm. Neural. 38(4) 635-632)。对于色盲的某些测试也可有助于追踪脱髓鞘疾病对眼睛的影响。上述的这些诊断方法也可用于评估受试者(如患者)用可溶性LT-β -R-Ig治疗后增加的髓鞘再生。例如，髓鞘再生可与患者中存在的硬化症的大小或数量的减少一致，通过本文描述的任何成像方法确定。此外，受试者中髓鞘再生可测量为信号从耳朵、眼睛或皮肤到大脑的传输速度的增加，通过诱发电位测试确定。在一些情况下，髓鞘再生可评价为白质体积(例如，脊柱或大脑的神经质量)的增加。在一些情况下，受试者中髓鞘再生的程度或发生可通过直接测量受试者中髓鞘的厚度来评估，通过使用例如磁共振光谱扫描。本发明还包括本文描述的方法和组合物与可引起脱髓鞘病症的疗法或药物联合使用。例如，治疗类风湿关节炎的抗-TNF治疗的副作用可导致一种类型的脱髓鞘病症。因此，可溶性LT-β -R-Ig可与抗TNF疗法联合施用以阻止、改善或逆转脱髓鞘的副作用和促进髓鞘再生。抗-TNF疗法包括但不限于阿达木单抗(Humira)、依那西普(Enbrel)或英利昔单抗(Remicade)。在一些情况下，可溶性LT-β -R(例如，LT-β -R-Fc)用作二线治疗。例如，对脱髓鞘疾病(例如，多发性硬化症)的一种或多种治疗确定无反应的患者将停止接受该一种或多种治疗，并将开始用可溶性LT- β -R-Ig治疗。上述公开教导了本领域的技术人员本发明的各方面，包括怎样制备和使用本发明。下面的实施例是为了提供本发明的进一步的说明，而不是为了限制本发明。
实施例下面的实施例描述了从产物相关杂质中纯化基于抗体的生物制品即LT-β -R-Ig 的方法。当在CHO细胞中表达时三种产物相关杂质与LT-i3-R-Ig共同表达。这些产物相关杂质对纯化方法提出了挑战。杂质包括两种单体但结构不同的失活形式的LT-β-R-Ig(称为“失活-1”和“失活-2”)和包括二聚体和较高分子量物质的聚集体。Fc融合蛋白在CHO 细胞中表达后，杂质对蛋白质产物的百分比的实例是约46%产物(活性、单体蛋白质)、约 35%聚集体、约13%失活-2和约6%失活-1。实施例1 能够在基于抗体的生物制品纯化过程中去除多种产物相关杂质的高分辨率疏水作用色谱方法的开发(循环1)为了第一阶段临床生产，开发能够从基于抗体的产物中去除两种单体的但失活的产物-相关杂质的HIC方法步骤。在随后的开发过程中，设法改善容量和稳健性同时维持色谱的分辨率。将描述开发研究，其中探讨了可选择的HIC树脂和结合盐，并通过实验设计方法鉴定了对分离效率关键的参数。在同一方法的下游使用了具有不同分辨力的第二 HIC 步骤用于去除第三种产物-相关杂质。将讨论在建立适合于生产-规模临床制备的稳健方法时所面临的问题和挑战。下面的实施例描述了能够从基于抗体的产物中去除产物相关杂质例如蛋白质的两种失活形式的疏水作用色谱(HIC)方法，其被开发用于临床生产。下面的实施例描述了HIC 丁基和苯基树脂、结合盐和鉴定为对分离效力重要的参数。总之，下面的方法(称为“循环1-1”和“循环1-2”)使用第一 HIC 丁基柱，例如丁基-650M树脂(Tosoh Biosciences)，其次是第二 HIC苯基柱。HIC方法的联合导致失活和聚集的分子减少。丁基-650M树脂被确定在分离活性LT- β -R-Ig与其他形式即失活-1、失活-2和聚集形式中有效。循环1-1用于LT-β -R-Ig的2000L生产，而优化循环1_2是为更高滴度的起始原料(例如800mg/mL)。循环1_1和循环1_2都包括第一丁基HIC分离和第二丁基HIC分离。材料与方法在此实施例中使用的树脂包括iToyopearl 丁基-650M(Tosoh Bioscience)和苯基琼脂糖6Fast Flow(Pharmacia)。丁基-650M色谱方法包括用包含20mM磷酸钠、pH 7.5、 1. 65M NaCl的溶液的平衡步骤和冲洗步骤，和用包含20mM磷酸钠、pH 7. 5,0. 7M NaCl的溶液的洗脱步骤。使用Pharmacia UV-I检测器在^Onm吸光度(Aaxi)监测柱流出物。Pharmacia生产的AKTA FPLC和Unicorn软件3. 2. 6版本用于各种实验。除特别注明外，进行色谱的温度范围是1848°C。在特定情况下使用Torrey Pines Scientific HPLC柱制冷/制热型号C030调节柱温度。在一些实验中使用Neslab水浴器型号RTE-211控制纯化溶液的温度。使用JMP 软件(SAS Institute)版本3. 2. 6进行统计分析，其用于实验设计和结果分析。在本报告中LT-β -R-Ig蛋白浓度是基于1. 25的消光系数。1. 1 循环 1-1开发循环1-1以从哺乳动物细胞培养物中表达的LT-β -R-Ig中去除杂质。需要去除的杂质包括LT- β -R-Ig蛋白的两种不同的失活形式，即失活-1和失活-2形式及聚集体。图1描述了循环1-1的方法的概述。首先使用分批补料方法在重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达LTBR-Ig。在循环 1-1中，滴度是 300mg/L，聚集体以 12%，失活-1以 5%和失活-2以 9%。表达后， 收获细胞培养物并离心。澄清的条件培养基用蛋白-A捕获柱处理。由此产生的LT-β -R-Ig 混合物用丁基树脂HIC柱(称为HIC-1) ( 丁基-650Μ ；Tosoh Bioscience)处理，其中树脂具有8g/L的容量。HIC-I步骤清除LT- β -R-Ig的失活形式1和失活形式2的混合物，并优化了蛋白质容量。较其他测试的树脂由于若干原因选择丁基-650Μ树脂，包括下面的优选特征1) 刚性甲基丙烯酸酯骨架；2) 40-90 μ m的孔径；3)80-300cm/hr的运行速度；和4)可能的严格清洗条件，例如IN Na0H、50%甲醇。丁基树脂能够去除多于99%的LT-β-R-Ig失活形式。筛选大量的盐以确定哪一种对从失活和聚集形式中分辨LT-β -R-Ig蛋白质产物最有效。NaCl和Na2SO4两者都被鉴定为可从LTBR-Ig产物中分辨杂质。LTBR-Ig的失活-1 和失活-2形式分别从丁基树脂中洗脱到洗液和反萃NaCl溶液中。丁基HIC-I步骤将洗脱组分中的失活-1和失活-2减少到< 1. 0%。图3描述了对HIC-I后方法中间体的HPLC分析，包括从活性LT- β -R-Ig和聚集体中分辨LT- β -R-Ig的失活形式的HIC-HLPC，和从活性、单体LT- β -R-Ig融合蛋白中分辨聚集体的尺寸排阻HPLC (SE-HPLC)。图2提供了 HIC-I 丁基步骤后结果的概述，其中LT-β -R-Ig的两种失活形式与活性LT-β -R-Ig分离。如图2中描述，用0. 7Μ NaCl从HIC-1 丁基树脂中洗脱LT-β -R-Ig 产物。对HIC-I的终循环-1-1条件是在1.65Μ NaCl (所有都结合)结合，然后以1. 55Μ NaCl冲洗(失活-1从柱上冲洗掉)，然后以0. 7Μ NaCl洗脱(洗脱产物和聚集体)，然后以 OM NaCl反萃(失活-2从柱上显现)(也参见图2)。然后用低ρΗ方法对来自HIC-I步骤的洗脱液灭活病毒，接着用苯基琼脂糖(苯基琼脂糖6高流速高分辨率)用第二 HIC色谱柱处理。第二 HIC步骤(苯基)导致蛋白质聚集体的清除和洗脱液的优化分辨。图8Α描述了显示由HIC-2(苯基)步骤清除聚集体的结果，包括荷载的影响。第二 HIC(HICj)步骤后，通过病毒清除过滤器(VF)和超滤/渗滤(UF/DF)进一步处理洗脱液。1. 2 循环 1-2循环1-2是上述的循环1-1的修改版本，其中循环1-2具有增加容量的改进能力 (起始原料中的蛋白质滴度增加)。图5提供了循环1-2的概述。如下所述，循环1-2中硫酸钠(代替氯化钠)用于增加丁基柱的容量从8至20g/L树脂。为了提高容量特征和分辨LT-β-R-Ig的活性对失活(失活1和失活幻的能力而筛选不同的易溶盐。滴度增加后进行筛选以确定有效去除LT-β -R-Ig的失活和聚集形式的盐和树脂。表1描述了易溶盐的筛选结果。表1 易溶盐的筛选
权利要求
1.一种包含生物活性淋巴毒素-β-受体免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白的组合物，其中少于6%的所述LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的，且少于2%的所述LT-β-R-Ig 融合蛋白是聚集的。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中少于5%的所述LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中少于的所述LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中少于0.5%的所述LT-β-R-Ig融合蛋白是生物失活的。
5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，所述组合物包含少于2%的聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
6.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，所述组合物包含少于的聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
7.根据权利要求1-6任一项所述的组合物，其中所述LT-i3-R-Ig融合蛋白包含IgGl 同种型的Ig恒定区。
8.根据权利要求1-7任一项所述的组合物，其中所述LT-i3-R-Ig融合蛋白包含SEQID NO: 2所列的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8任一项所述的组合物，其中所述生物活性的LT-β-R-Ig融合蛋白在标准体外IL-8抑制测定中可抑制IL-8释放。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-9任一项所述的组合物和药学上可接受的运载体。
11.一种治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用权利要求 10所述的药物组合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是多发性硬化症。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是继发、进展型多发性硬化症或复发、缓解型多发性硬化症。
14.一种分离生物活性淋巴毒素-β-受体免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白与生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，所述方法包括将包含所述生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白和所述生物失活LT- β -R-Ig融合蛋白的混合物荷载到丁基疏水作用色谱(HIC)树脂上，并将所述树脂与包含盐梯度的溶液接触以获得包含所述生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液和包含所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述盐梯度是不连续梯度或连续梯度。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述盐梯度包含1.6Μ至0. OMNaCl。
17.根据权利要求14所述的方法，其中包含所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的所述第二洗脱液通过用1. 5Μ NaCl洗液冲洗所述HIC树脂获得。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述盐梯度包含0.6Μ至0. OMNa2SCV
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述不连续梯度包含从0.6Μ至0. OM范围的增量的 Nei2SO4O
20.根据权利要求14-19任一项所述的方法，其中所述丁基HIC树脂具有600至750A 的孔径。
21.根据权利要求14-19任一项所述的方法，其中所述丁基HIC树脂具有约8mg至约 20mg蛋白质/L树脂的荷载量。
22.根据权利要求14-19任一项所述的方法，其中包含所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的所述第二洗脱液包含少于2%的生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白。
23.根据权利要求14-19任一项所述的方法，其中包含所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的所述第二洗脱液包含少于1 %的生物失活LT- β -R-Ig融合蛋白。
24.一种分离非聚集、生物活性淋巴毒素-β-受体免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白与聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，所述方法包括将包含所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和所述聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物荷载到苯基疏水作用色谱(HIC)树脂上，其中所述树脂具有介于约10-20g蛋白质/L树脂之间的荷载量和约30至31cm的床高，并将所述树脂与溶液以流速约50至150cm/hr接触以获得包含所述生物学非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液和包含所述聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液。
25.根据权利要求M所述的方法，其中包含所述非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的所述第一洗脱液包含少于2%的聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。
26.根据权利要求M所述的方法，其中包含所述非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的所述第一洗脱液包含少于1 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。
27.一种分离生物活性淋巴毒素-β-受体免疫球蛋白(LT-β-R-Ig)融合蛋白与生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤i)在允许所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白结合丁基疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下将包含所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和所述生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物荷载到所述丁基树脂上； )将所述丁基HIC树脂与包含盐梯度的溶液接触以获得富集有所述生物活性 LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液；iii)在允许所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白结合第二HIC树脂的条件下将步骤 )的所述第一洗脱液荷载到所述第二 HIC树脂上；并iv)将所述第二HIC树脂与溶液接触以获得进一步富集有所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白的第二洗脱液，从而分离所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白与所述生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白。
28.根据权利要求27所述的方法，其中(ii)的所述盐梯度是不连续梯度或连续梯度。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述丁基HIC树脂包含羟基化甲基丙烯酸酯骨架。
30.根据权利要求27- 任一项所述的方法，其中所述丁基HIC树脂具有600至750A 的孔径。
31.根据权利要求27- 任一项所述的方法，其中所述第一洗脱液包含少于2%的失活 LT-β-R-Ig融合蛋白的第一形式(失活-1)。
32.根据权利要求27- 任一项所述的方法，其中所述第一洗脱液包含少于的失活 LT-β-R-Ig融合蛋白的第一形式(失活-1)。
33.根据权利要求27- 任一项所述的方法，其中所述第二洗脱液包含少于2%的失活 LT-β -R-Ig融合蛋白的第二形式(失活-2)。
34.根据权利要求27- 任一项所述的方法，其中所述第二洗脱液包含少于的失活 LT-β -R-Ig融合蛋白的第二形式(失活-2)。
35.根据权利要求14-34任一项所述的方法，其中所述混合物中LT-β-R-Ig融合蛋白的浓度是至少300mg/L。
36.根据权利要求14-34任一项所述的方法，其中所述混合物中LT-β-R-Ig融合蛋白的浓度是至少800mg/L。
37.根据权利要求14-34任一项所述的方法，其中所述混合物中LT-β-R-Ig融合蛋白的浓度是至少1350mg/L。
38.根据权利要求14-37任一项所述的方法，其中所述混合物的体积是至少5000L。
39.根据权利要求14-37任一项所述的方法，其中所述混合物的体积是至少10000L。
40.根据权利要求14-37任一项所述的方法，其中所述混合物的体积是至少15000L。
41.一种分离生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白与生物失活LT-β-R-Ig融合蛋白的方法， 该方法包括以下步骤i)在允许所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白结合混合模式树脂的条件下将包含所述生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白和所述生物失活LT- β -R-Ig融合蛋白的混合物荷载到所述混合模式树脂上； )用溶液将所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白从步骤i)的所述混合模式树脂中洗脱以获得富集有所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液；iii)在允许所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白结合疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下将步骤ii)的所述第一洗脱液荷载到所述HIC树脂上；并iv)用溶液洗脱步骤iii)的所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以获得进一步富集有所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液，从而分离所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白与所述生物失活LT-β -R-Ig融合蛋白。
42.一种分离非聚集、生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白与聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤i)在允许所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白结合混合模式树脂的条件下将包含所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和所述聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物荷载到所述混合模式树脂上，其中所述混合物中多于约30%或约30%的LT-β -R-Ig融合蛋白是聚集的； )用溶液从步骤i)的所述混合模式树脂上洗脱所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以获得富集有所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液；iii)在允许所述生物活性Ig融合蛋白结合疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下将步骤 )的所述第一洗脱液荷载到所述HIC树脂上；并iv)用溶液洗脱步骤iii)的所述生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以获得进一步富集有所述生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液，从而分离所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白与所述聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述混合模式树脂的特征为具有离子相互作用能力和疏水相互作用能力。
44.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述混合物在约5.0的ρΗ荷载到所述混合模式树脂上。
45.根据权利要求44所述的方法，其中在步骤(ii)之前，用具有约7.0至7.2的ρΗ的缓冲液冲洗已荷载的混合模式树脂。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述缓冲液是BisTris0
47.根据权利要求41-46任一项所述的方法，其中所述HIC树脂是苯基树脂。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述苯基树脂是苯基kpharose。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述生物活性LT-β-R-Ig是用硫酸铵从所述苯基树脂上洗脱。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述生物活性LT-β -R-Ig是用0. 3至0. 5Μ的硫酸铵从所述苯基树脂上洗脱。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述苯基树脂的流速是50至150cm/hr。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述流速是约lOOcm/hr。
53.一种从包含非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白和聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白的混合物中去除至少97%的所述聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤i)在允许所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白结合混合模式树脂的条件下将所述混合物荷载到所述混合模式树脂上； )用溶液从步骤i)的所述混合模式树脂上洗脱所述非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以获得富集有所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液；iii)在允许所述非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白结合疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下将步骤ii)的所述第一洗脱液荷载到所述HIC树脂上；并iv)用溶液洗脱步骤iii)的所述非聚集、生物活性LT-β-R-Ig融合蛋白以获得进一步富集有所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液，从而从包含所述非聚集、生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白和所述聚集的LT-β -R-Ig融合蛋白的混合物中去除至少97%的所述聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述第一洗脱液包含少于25%的所述聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述第一洗脱液包含少于20%的所述聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述第一洗脱液包含少于15%的所述聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述第一洗脱液包含约10%的所述聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
58.根据权利要求53所述的方法，其中所述第二洗脱液包含少于2%的所述聚集的LT-β-R-Ig融合蛋白。
59.根据权利要求53所述的方法，其中所述第二洗脱液包含少于的所述聚集的 LT-β-R-Ig融合蛋白。
60.根据权利要求53-59任一项所述的方法，还包括在步骤(i)之前，将所述混合物与重组蛋白A(rfr0tein Α)接触。
61.根据权利要求60所述的方法，其中与所述重组蛋白A接触的所述混合物是哺乳动物细胞培养上清液。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养上清液是从在培养的哺乳动物细胞获得。
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述细胞培养上清液包含非离子型表面活性剂。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂是TritonX-100。
65.一种制备包含生物活性LT-β -R-Ig融合蛋白的组合物的方法，其中所述组合物包含少于的LT-β-R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于的LT-β-R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于1 %的聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白，该方法包括以下步骤i)从包含用编码所述LT-β -R-Ig-融合蛋白的DNA转化的哺乳动物宿主细胞的哺乳动物细胞培养系统获得细胞培养上清液； )将所述细胞培养上清液与重组蛋白A(rfrotein Α)接触以获得LT-β-R-Ig融合蛋白混合物；iii)在PH约5.0，在使得所述LT-β -R-Ig融合蛋白结合混合模式树脂的条件下将步骤ii)的所述LT-β -R-Ig融合蛋白混合物荷载到所述混合模式树脂上；iv)用具有约7.0至7. 2的pH的缓冲液冲洗所述混合模式树脂；ν)将步骤iii)的所述混合模式树脂与溶液接触以获得富集有所述生物活性 LT-β -R-Ig融合蛋白的第一洗脱液；vi)在允许所述LT-β-R-Ig融合蛋白结合疏水作用色谱(HIC)树脂的条件下将步骤 iv)的所述第一洗脱液荷载到所述HIC树脂上；并vii)将步骤vi)的所述HIC树脂与溶液接触以获得进一步富集有所述生物活性 LT- β -R-Ig融合蛋白的第二洗脱液，其中所述第二洗脱液包含少于1 %的所述LT- β -R-Ig融合蛋白的第一失活形式(失活-1)、少于1 %的所述LT- β -R-Ig融合蛋白的第二失活形式(失活-2)、和少于1 %的所述聚集的LT- β -R-Ig融合蛋白。
66.一种组合物，所述组合物包含至少97%的由权利要求14-65所述的任一方法制备的生物活性LT- β -R-Ig融合蛋白。
67.一种治疗受试者中自身免疫性疾病的方法，所述方法包括给受试者施用权利要求 67所述的组合物。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是多发性硬化症。
69.根据权利要求53-65所述的方法，还包括在步骤(i)之前将所述混合物与阴离子交换膜吸附器接触。
全文摘要
本发明提供了用于在免疫球蛋白(Ig)融合蛋白的生产过程中分离杂质的方法和组合物。根据本发明的方法可去除的杂质的实例包括Ig融合蛋白的失活形式和/或聚集体。
文档编号C12N15/62GK102239177SQ200980115497
公开日2011年11月9日 申请日期2009年2月27日 优先权日2008年2月29日
发明者乔纳森·罗梅罗, 戴维·埃文斯, 斯蒂芬·诺塔尼科拉, 沃纳·梅尔, 理查德·麦克尼文, 贾斯廷·麦丘 申请人:比奥根艾迪克Ma公司