使用rna干扰控制线虫的组合物和方法

专利名称：：使用rna干扰控制线虫的组合物和方法使用RNA干扰控制线虫的组合物和方法本发明的领域是线虫控制，特别是大豆胞囊线虫的控制。本发明还涉及将遗传材料引入易感线虫的植物，从而增加对线虫的抗性。
背景技术：
：线虫是以超过2，000种行间作物、蔬菜、水果和观赏植物的根、叶及茎为食，造成世界范围估计一千亿美元作物损失的微小线虫。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根结线虫(RKN)、形成胞囊及形成损伤的线虫。以造成采食部位处根瘿形成为特征的根结线虫具有相对广泛的宿主范围并且因此对种类繁多的作物物种是致病性的。形成胞囊和形成损伤的线虫物种具有更有限的宿主范围，不过依旧在易感作物中造成巨大损失。致病性线虫存在于美国各地，在南部和西部的温暖湿润地区及在沙土中密度最大。大豆植物的最严重病虫-大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines)在1卯4年首次于美国的北卡莱罗纳州发现。某些地区严重遭受大豆胞囊线虫(SCN)侵染，以至于不采用控制措施，则大豆生产不再可能是经济的。尽管大豆是受SCN侵袭的主要经济作物，然而SCN寄生包括大田作物、蔬菜、观赏植物和杂草的总计约50种宿主。线虫损伤的迹象包括在炎热时期矮化与叶子发黄及植物萎蔫。然而，线虫侵染可以引起严重产量损失，而无任何明显的地上部分发病症状。产量减少的主要原因归咎于地下的根损伤。受SCN感染的根矮缩或矮化。线虫侵染也可以减少根上固氮结节的数目，并且可以使根更易受其他土源性植物病原体侵袭。线虫的生命周期具有三个主要阶段卵、幼体和成体。该生命周期在线虫物种之间不同。例如，SCN的生命周期在最适条件下通常可以于对-30日内完成，而其他物种可能经过长达一年或更长时间以完成生命周期。当温度和湿度水平在春季变得适宜时，蠕虫形状的幼体在土壤中从卵孵化出来。仅幼体发育阶段的线虫能够感染大豆根。SCN的生命周期已经成为众多研究的主题，并且因此是理解线虫生命周期的有用实例。在穿透大豆根后，SCN幼体通过根移动直至它们接触维管组织，此时SCN幼体停止迁移并开始采食。借助口针，线虫注射了调节某些根细胞并将它们转化成特化采食部位的分泌物。这些根细胞在形态学上转化成巨大的多核合胞体(或在RKN情况中为巨细胞)，这种合胞体被用作线虫的营养物来源。主动采食的线虫因此从植物窃取必要的营养物，导致产量损失。当雌性线虫采食时，它们膨胀并最终变得如此巨大，以至于它们的身体突破根组织并暴露在根的表面。在采食一段时间后，作为成体不膨胀的雄性SCN线虫从根迁移至土壤内并使膨大的雌性成体受精。雄性线虫随后死亡，而雌性线虫仍附着于根系统并继续采食。膨大雌性线虫中的卵开始发育，最初在身体外的团块或卵囊(amassoreggsac)中并随后在线虫体腔内发育。雌性成体的整个体腔最终充满卵，并且雌线虫死亡。正是充满卵的死亡雌线虫身体才称作胞囊。最后胞囊释放并游离存在于土壤中。胞囊的璧变得极坚韧，从而为胞囊内所含大约200-400粒卵提供良好的保护作用。SCN卵在胞囊内存活直至适宜的孵化条件出现。尽管众多的卵可以在第一年中孵化，然而很多卵也会在保护性胞囊内存活几年。线虫依赖其自身力量在土壤中每年只能穿行几英寸。然而，线虫侵染可以以多种方式传播相当远的距离。可以移动受侵染土壤的任何事物，包括农场机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人，都能够传播这种侵染。种子大小的土壤颗粒往往污染收获的种子。因此，当来自受侵染田地的污染种子在非侵染田地中播种时，可以传播线虫侵染。甚至还存在某些线虫种类可以通过鸟类传播的证据。仅可以预防这些起因中的某些起因。防治线虫侵染的常规方法包括在线虫侵染的土地中保持合理的土壤养分和土壤PH水平；控制其他的植物疾病以及昆虫与杂草病害；使用消毒措施，如仅在处理完线虫非侵染田地后才翻耕、播种和中耕线虫侵染的田地；在侵染的田地中工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用在侵染田地中生长的种子播种非侵染田地，除非这种种子已经得到正确地清洁；轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和播种抗性植物品种。已经提出方法用于遗传转化植物以便赋予植物对寄生线虫增加的抗性。美国专利号5，589，622和5，824，876涉及线虫附着后在采食植物的部位内或其附近特异性表达的植物基因的鉴定。这些植物靶基因的启动子然后能够用于指导有害蛋白质或酶的特异性表达，或指导对靶基因或对一般细胞基因反义的RNA的表达。这些植物启动子也可以用于通过用含有与其产物被摄取后诱导线虫致死的基因连接的植物靶基因的启动子的构建体转化植物来在采食部位特异性赋予线虫抗性。最近，已提出用RNA干扰(RNAi)(也称作基因沉默)作为控制线虫的方法。当与靶基因或mRNA的序列基本上相关的双链RNA(dsRNA)引入细胞中时，靶基因的表达会被抑制(参见例如美国专利号6，506，559)。美国专利号6，506，559证明了RNAi抗秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中已知基因的有效性，但没有披露RNAi用于控制植物寄生的线虫的用途。对于RNAi的作用已提出了许多的模型。在哺乳动物系统中，大于30个核苷酸的双链RNA以一种非序列特异性方式引发诱导合成干扰素以及蛋白质合成的总体停止。但是，美国专利号6，506，559揭示，在线虫中，对应于靶基因序列的双链RNA的长度可为至少25、50、100、200、300或400碱基，甚至更长的双链RNA也能有效诱导秀丽隐杆线虫中的RNAi。已知当用包含98邪4个核苷酸的双链区的发夹RNA构建体转化许多植物品种时，能有效沉默靶植物基因。一般认为在包括线虫和植物的许多有机体中，大片的双链RNA在细胞内被裂解19-个核苷酸的片段(siRNA)，这些siRNA是RNAi现象的实际介质。在植物中，通过名为“Dicer”的RNA酶III将长的dsRNA加工成21个核苷酸的siRNA双链体。植物中的21个核苷酸的siRNA双链体可以包括19个核苷酸的双链部分和位于每条RNA链的3’端的2个核苷酸的突出部分。已显示，2个核苷酸的突出部分不引起序列特异性的基因沉默，而19个核苷酸的双链部分实际上介导了序列特异性的基因沉默(Elbashir(2001)Nature411:494-498)。在例如PCT公开WO01/96584、WO01/17654、US2004/0098761、US2005/0091713、US2005/0188438、US2006/0037101、US2006/0080749、US2007/0199100和US2007/0250947中，已经提出使用RNAi靶向关键的线虫基因。虽然已经有多种使用RNAi控制植物寄生线虫的尝试，但是迄今为止，尚无任何国家解除对线虫-抗性转基因植物的管制。因此，导致需要鉴别安全且有效的组合物和方法，用于使用RNAi控制植物寄生线虫；以及用于生产具有对植物寄生线虫增加的抗性的植物。发明概述本发明提供了核酸、转基因植物和方法，来克服或减轻有价值的农业作物(例如，大豆)的线虫感染。本发明的核酸能够通过RNAi降低寄生线虫靶基因的表达。根据本发明，寄生线虫的靶基因选自寄生线虫的innexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(ροδS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫(C.elegans)tCp-l基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-1样基因、与秀丽隐杆线虫rpt-Ι基因同源的寄生线虫基因、编码^S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因。本发明的核酸编码这样的双链RNA，所述RNA包括(a)第一链，其具有与靶基因的19至约400或500个连续核苷酸基本相同的序列，所述靶基因具有选自SEQIDNO=USEQIDNO5,SEQIDNO11；SEQIDNO:19、SEQIDNO23、SEQIDN0:104、SEQIDNO:39和SEQIDN0:57的序列；和(b)第二链，其具有与第一链基本互补的序列。本发明还涉及双链RNA分子的库，所述库包括多数的短干扰RNA分子，每个RNA分子包括具有长度为19至M个核苷酸的双链区，其中所述RNA分子源自选自以下的多核苷酸(a)具有SEQIDNO1所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO5所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQIDNO=Il所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO19所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO39所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO57所述序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了抗寄生线虫感染的转基因植物，植物包括编码能够特异性降低寄生线虫靶基因的dsRNA或siRNA的核酸构建体，所述靶基因选自寄生线虫的irmexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(ροδS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-Ι样基因、与秀丽隐杆线虫rpt_l基因同源的寄生线虫基因、编码26S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因。在另一个实施方案中，本发明提供了能够表达dsRNA分子的库的转基因植物，其中每个dsRNA分子包括具有长度为19至M个核苷酸的双链区，其中RNA分子源自与寄生线虫靶基因的一部分基本相同的多核苷酸，所述靶基因选自寄生线虫的irmexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(polSS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-Ι样基因、与秀丽隐杆线虫rpt-Ι基因同源的寄生线虫基因、编码26S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因。本发明还涵盖了产生能够表达与寄生线虫的靶基因的一部分基本相同的dsRNA或siRNA的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤(a)从寄生线虫的irmexin-样基因、编码聚合酶S小亚基(polSS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-1样基因、与秀丽隐杆线虫rpt-1基因同源的寄生线虫基因、编码^S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因中选择靶基因；(b)制备核酸序列，所述核酸序列包括与选定的靶基因的一部分基本相同的区域，其中核酸一旦在植物中表达就能够形成双链转录物；(C)用所述核酸转化受体植物；(d)生产所述受体植物的一个或多个转基因后代；和(e)针对线虫抗性选择后代。本发明还提供了赋予植物线虫抗性的方法，所述方法包括以下步骤(a)从寄生线虫的irmexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(ροδS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-Ι样基因、与秀丽隐杆线虫rpt_l基因同源的寄生线虫基因、编码^S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因中选择靶基因；(b)制备核酸序列，所述核酸序列包括与选定的靶基因的一部分基本相同的区域，其中核酸一旦在植物中表达就能够形成双链RNA；(c)用所述核酸转化受体植物；(d)生产所述受体植物的一个或多个转基因后代；和(e)针对线虫抗性选择后代。本发明还提供了表达盒和表达载体，其包括与植物寄生线虫靶基因的一部分基本相同的序列，所述靶基因选自寄生线虫的innexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(ρ01δS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-1基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-Ι样基因、与秀丽隐杆线虫rpt_l基因同源的寄生线虫基因、编码26S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因。附图简介图Ia-Ic显示了分配与来自大豆胞囊线虫(H.glycines)和其它线虫物种相应的核苷酸和氨基酸序列的SEQIDNOs的表格。SEQIDNO:1、5、11、19、23、104、39和57对应以下基因的全长大豆胞囊线虫核苷酸序列inneXin-样(inx，SEQIDNO1),pas-1(SEQIDNO:5)、T-复合体蛋白l(tcp-l,SEQIDNO:11)、snurportinl(SEQIDNO:19)、聚合酶δ小亚基(PolδS,SEQIDNO:23)、蛋白酶体调节亚基4(prs_4，SEQIDNO:104)、ATP酶样蛋白酶体调节颗粒(rpt-1，SEQIDNO:39)和非ATP酶的蛋白酶体调节亚基5(rpn-5，SEQIDNO57)基因。用SEQIDNO:3(innexin-样)、SEQIDNO7(pas-1),SEQIDNO:13(tcp-l)、SEQIDNO:21(snurportinl)、SEQIDNO:25(PolδS)、SEQIDNO:29(蛋白酶体调节亚基4，prs-4)、SEQIDNO:41(rpt-1)和SEQIDNO59(rpn-5)表示如实施例2所述的合成到发夹表达构建体中的正义核苷酸片段。SEQIDNO:69(来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的TPP-样启动子)、SEQIDN0:70(来自大豆(Glycinemax)的MtN3_样启动子)和SEQID而71(来自拟南芥的基因座4丨5812170的启动子)给出了诱导合胞体的启动子序列。列举了pas-1(SEQIDNO72-78),rpn-5(SEQIDN079—85)、tcp_l(SEQIDNO86-91)、prs-4(SEQIDNO92、93、106、和107)和rpt_l(SEQIDNO94-103)的保守核苷酸基序。图2显示了pas-1样序列的氨基酸比对全长大豆胞囊线虫pas-1(SEQIDNO:6)；由二元载体RTP1095靶向的大豆胞囊线虫pas-1片段(SEQIDNO8)；和来自Genbank登录号BM355389的马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)部分长度的表达序列标签(EST)(SEQIDNO:10)，使用VectorNTI软件包vlO.3.0(空位开放罚分=10.，空位延伸罚分=0.05，空位分离罚分=8)。图3显示了以下的氨基酸比对来自秀丽隐杆线虫Genbank登录号AAA93233的tcp-Ι样序列(SEQIDNO18)；全长大豆胞囊线虫tcp_l(SEQIDNO:12)；由二元载体RSA131靶向的大豆胞囊线虫tcp-Ι片段(SEQIDNO14)；来自Genbank登录号CF100567的甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii)部分长度的表达序列标签(EST)(SEQIDNO:16)，使用VectorNTI软件包vlO.3.0(空位开放罚分=10.，空位延伸罚分=0.05，空位分离罚分=8)。图4显示了以下的氨基酸比对来自秀丽隐杆线虫Genbank登录号016368的prs-4样序列(SEQIDNO34)；C.briggsaeEMBL登录号CAE64528(SEQIDNO32)；通过5，RACEPCR产生的全长大豆胞囊线虫prs-4(SEQIDNO:105)；通过二元载体RTPl169靶向的合成大豆胞囊线虫prs-4片段(SEQIDNO30)；由北方根结线虫(Meloidogynehapla)EST聚集成的部分Contig526(SEQIDNO:36)；和由南方根结线虫(Meloidogyneincognita)EST聚集成的部分Contig2153(SEQIDNO:38)；使用VectorNTI软件包vlO.3.0(空位开放罚分=10.，空位延伸罚分=0.05，空位分离罚分=8)。图^1-显示了以下的氨基酸比对来自秀丽隐杆线虫EMBL登录号CAB01414的rpt-Ι样序列(SEQIDNO54)；C.briggsaeEMBL登录号CAE75362(SEQIDNO56)；全长大豆胞囊线虫rpt-l(SEQIDNO:40)；来自Genbank登录号CB376265的大豆胞囊线虫EST序列(SEQIDNO44)；通过二元载体RSA012靶向的大豆胞囊线虫rpt_l片段(SEQIDNO42)；来自Genbank登录号CD750393的甜菜胞囊线虫EST(SEQIDNO:46)；来自Genbank登录号EE269079的马铃薯金线虫EST(SEQIDNO:50)；来自Genbank登录号EE269080的马铃薯金线虫EST(SEQIDNO:48)；和来自北方根结线虫EST的部分Contigl170(SEQIDNO:52)，使用VectorNTI软件包vlO.3.0(空位开放罚分=10，空位延伸罚分=0.05，空位分离罚分=8)。图6a-m3显示了以下的氨基酸比对来自秀丽隐杆线虫Genbank登录号AAA81U6的rpn-5样蛋白质(SEQIDNO66)；C.briggsaeEMBL登录号CAE60648(SEQIDNO68)；全长大豆胞囊线虫rpn-5(SEQIDNO:58)；来自Genbank登录号CA940612的大豆胞囊线虫EST(SEQIDNO:62)；来自Genbank登录号CA940612的部分大豆胞囊线虫EST(SEQIDNO62)；通过二元载体RTP1269靶向的大豆胞囊线虫rpn-5片段(SEQIDNO60)；和来自Genbank登录号EE266903的马铃薯金线虫EST(SEQIDNO:64)；使用VectorNTI软件包vlO.3.0(空位开放罚分=10，空位延伸罚分=0.05，空位分离罚分=8)。图7a_7b显示了以下的核苷酸比对全长大豆胞囊线虫pas_l编码区(SEQIDNO5)；在二元载体RTP1095-1中使用的合成大豆胞囊线虫pas-Ι片段(SEQIDNO7)；和部分的马铃薯金线虫BM355389EST(SEQIDNO:9)。用粗体表示保守基序，并列举在图12中。比对使用VectorNTI软件包vlO.3.0(空位开放罚分=15，空位延伸罚分=6.66，空位分离罚分=8)。图8a-8c显示了以下的核苷酸比对全长大豆胞囊线虫tcp_l编码区(SEQIDNO11)；和部分的甜菜胞囊线虫CF100567EST(SEQIDNO:15)。用粗体表示保守基序，并列举在图12中。比对使用VectorNTI软件包vlO.3.0(空位开放罚分=15，空位延伸罚分=6.66，空位分离罚分=8)。图9a_9b显示了以下的核苷酸比对全长大豆胞囊线虫prs-4编码区(SEQIDNO104)；北方根结线虫Contig526的部分EST汇编(SEQIDNO35)；和南方根结线虫Contig2153的全长EST汇编(SEQIDNO:37)。用粗体表示保守基序，并列举在图12中。比对使用VectorNTI软件包vlO.3.0(空位开放罚分=15，空位延伸罚分=6.66，空位分离罚分=8)。图IOa-IOe显示了以下的核苷酸比对全长大豆胞囊线虫rpt_l编码区(SEQIDNO39)；部分大豆胞囊线虫CB376265EST(SEQIDNO43)；部分甜菜胞囊线虫CD750393EST(SEQIDNO:45)；部分马铃薯金线虫EE269079EST(SEQIDNO:49)；部分马铃薯金线虫EE^9080EST(SEQIDNO:47)；和北方根结线虫Contigll70的部分EST汇编(SEQIDNO51)。用粗体表示保守基序，并列举在图12中。比对使用VectorNTI软件包vlO.3.0(空位开放罚分=15，空位延伸罚分=6.66，空位分离罚分=8)。图Ila-Ilb显示了以下的核苷酸比对全长大豆胞囊线虫rpn-5编码区(SEQIDNO57)；部分马铃薯金线虫ESTEE266903(SEQIDNO:63)。用粗体表示保守基序，并列举在图12中。比对使用VectorNTI软件包vlO.3.0(空位开放罚分=15，空位延伸罚分=6.66，空位分离罚分=8)。图12显示了从pas-l、rpn-5、tcp-l、prs-4和rpt-Ι基因中鉴别的保守核苷酸基序的表格，如图7-11中描述的。图13a_13j显示了示例性的pas-Ι样序列(图13a，氨基酸；图13b，核苷酸)、tcp-Ι样序列(图13c，氨基酸；图13d，核苷酸)、prs-4样序列(图13e，氨基酸；图13f，核苷酸)、rpt-l样序列(图13g，氨基酸；图13h，核苷酸)和rpn-5样序列(图13i，氨基酸；图13j，核苷酸)的全局百分比同一性。使用VectorNTI软件包vlO.3.0根据多重比对计算百分比同一性。图14a-141通过核苷酸位置显示了在SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67或104中可能的多个21mer碱基。发明详述本发明可以通过参考以下详细描述的本发明优选实施方案及本文所包含实施例而更容易地理解。除非另外说明，本文中所用术语将根据相关领域普通技术人员的习惯用法加以理解。除了下文提供的术语定义外，分子生物学中常用术语的定义也可以在Rieger等，1991Glossaryofgenetics:classical禾口molecular，第五片反，BerlinSpringer-Verlagjf^CurrentprotocolsinMolecularBiology，F.Μ·Ausubel等编著，CurrentProtocols，GreenePublishingAssociates，Inc.与JohnWiley&Sons，Inc.的合资企业(1998增刊)中找到。应当理解如本说明书及在权利要求书中所用，“一种(a)”或“一个(an)”可以意指一个或多个，这取决于该冠词所用的上下文。因此，对“单数细胞”的称谓可以意指可以使用至少一个细胞。还应当理解本文中使用的术语仅仅旨在描述具体实施方案而并非意味对其限制性。在本申请通篇范围内，参考了多种出版物。全部这些出版物及这些出版物中引用的那些参考文献的公开内容完整地并入本申请作为参考，旨在更充分地描述本发明所涉及领域的现状。用于克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术、用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶促反应的标准技术，以及多种分离技术是本领域技术人员已知和通常使用的。一些标准技术描述在Sambrook等人，1989MolecularCloning，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,Plainview,N.Y.；Maniatis等人，1982MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory,Plainview,N.Y.；Wu(编著)1993Meth.Enzymo1.218，部分I;Wu(编著)1979MethEnzymo1.68;Wu等人，(编著)1983Meth.Enzymo1.100禾口101；Grossman禾口Moldave(编著)1980Meth.Enzymol.65；Miller(编著)1972ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.；Old禾口Primrose,1981PrinciplesofGeneManipulation,UniversityofCaliforniaPress,Berkeley；Schleif禾口Wensink,1982PracticalMethodsinMolecularBiology;Glover(编著)1985DNACloning卷I禾口II，IRLPress,Oxford,UK；Hames禾口Higgins(编著)1985NucleicAcidHybridization,IRLPress,Oxford,UK；以及Setlow禾口Hollaender1979GeneticEngineeringPrinciplesandMethods，卷1-4，PlenumPress,NewYork。当使用时，缩写和命名被认为是本领域中标准的并且在专业杂志例如本文中引用的那些专业杂志中经常使用的。此处使用的“RNAi”或“RNA干扰”指的是双链RNA(dsRNA)介导的线虫中序列特异性转录后基因沉默方法。此处使用的“dsRNA”指部分或完全双链的RNA。双链RNA还指短的干扰RNA(siRNA)、短干扰核酸(siNA)、微小-RNA(miRNA)等等。在RNAi方法中，将包含与靶基因的一部分基本上相同的第一链和与第一链互补的第二链的dsRNA引入线虫中，优选通过浸泡且更优选通过饲喂。在引入线虫以后，该靶基因特异性dsRNA被加工成较小的片段(siRNA)，接着能够从胃肠分布到线虫的其他部分，导致具有表型的失功能突变，这种表型在一代的时间内可能会与靶基因的部分或完全缺失产生的表型非常接近。或者，靶基因特异性dsRNA被含有RNAi加工结构的植物细胞加工为较小的片段，并且当植物加工的较小dsRNA被寄生线虫摄取时，得到失功能表型。如本文中所用，考虑到比较RNA和DNA序列时尿嘧啶替换胸腺嘧啶，用于dsRNA的术语“基本上相同”意指dsRNA的一条链的核苷酸序列与靶基因的19个或更多个连续核苷酸至少约80%-90%相同，更优选地、与靶基因的19个或更多个连续核苷酸至少约90-95%相同并且最优选与靶基因的19个或更多个连续核苷酸至少约95^^96^^97^^98%或99%相同或完全相同。术语“靶基因的19个或更多个连续核苷酸”对应于dsRNA的双链部分，其与靶基因互补，是靶基因的至少约19、20、21、22、23、24、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500个连续碱基或至多全长。如此处所用，“互补的”多核苷酸是那些能够根据标准沃森-克里克互补规则碱基配对的多核苷酸。具体而言，嘌呤会与嘧啶碱基配对形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)、对于DNA是腺嘌呤与胸腺嘧啶(A:T)、或对于RNA是腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。可以理解即使不完全互补两种多核苷酸也可以互相杂交，只要各自具有与对方基本上互补的至少一个区域。如此处所用，“基本上互补”指两个核酸序列的核苷酸至少超过80%互补。优选这两个核酸序列至少超过85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或全部核苷酸互补。或者，“基本上互补”指两个核酸序列能够在高度严格的条件下杂交。如此处所用，术语“基本上相同”或“对应于”指两个核酸序列具有至少80%的序列同一性。优选这两个核酸序列具有至少85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^；100%的序列同一性。如此处所用，术语“核酸”和“多核苷酸”指线性或分支的、单链或双链的RNA或DNA或其杂合体。该术语还包括RNA/DNA杂合体。当合成制备双链RNA时，不常见的碱基(例如肌酐、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤及其他)也可用于反义RNA、双链RNA和核酶配对。例如含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已表明能以高亲和力结合RNA并作为基因表达的有效的反义抑制剂。也可以进行其他修饰，例如对磷酸二酯骨架的修饰或对RNA的核糖糖基中的2’-羟基修饰。如此处所使用的，术语“接触”和“施用，，可互换使用，是指本发明的dsRNA被递送到寄生线虫细胞中的过程，这是为了抑制线虫中的关键靶基因的表达。dsRNA可以以多种方式被施用，包括但不限于，直接导入细胞(细胞内)；或细胞外导入腔中、胞间隙或导入线虫循环中；口服导入，dsRNA可以通过将线虫浸浴在包含dsRNA的溶液中来导入，或者dsRNA可以存在于食物源中。用于口服导入的方法包括直接将dsRNA与线虫食物混合，以及将用作食物的物种改造为表达dsRNA的改造方法，然后饲喂给待被感染的生物。例如，可以将dsRNA喷雾到植物中，或者可以将dsRNA应用到根附近的土壤中，通过植物和/或寄生线虫摄取所述dsRNA，或者植物可以被遗传改造成表达dsRNA，其量足以杀死或不利地影响一些或全部的植物所暴露的寄生线虫。如此处所用的术语“控制”当用于感染的上下文中时指感染的降低或预防。减低或预防线虫的感染会使植物具有对线虫增加的抗性；但是，这种增加的抗性并不意味着植物必须100%地抗线虫感染。在优选实施方案中，在抗性植物中对线虫感染的抗性比对线虫无抗性的野生型植物高10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。优选所述野生型植物是具有与线虫抗性增加的植物相似或更优选相同的基因型，但是不包含针对靶基因的双链RNA的植物。植物对线虫感染的抗性可以是由于当暴露于对关键基因特异性的dsRNA时，线虫的死亡、不育、停止发育或移动性受损造成的，所述双链RNA特异性针对对于功能性采食部位、合胞体或巨细胞的发育或维持必须的基因。此处使用的术语“对线虫感染的抗性”或“具有线虫抗性的植物”指与野生型植物相比，植物避免线虫感染、杀死线虫或阻止、减少或停止线虫的发育、生长或增殖的能力。这可以通过主动过程达到，例如通过产出对线虫有害的物质，或通过被动过程达到，例如含有降低的线虫所需的营养价值或不形成由线虫采食部位诱导的结构例如合胞体或巨细胞。植物的线虫抗性水平可以以多种方法检测，例如，计数能够在植物上建立寄生的线虫数量，或测量线虫发育时间、雌雄线虫的比例，或对于胞囊线虫计数在感染的植物的根部或植物分析系统中产生的胞囊数量或线虫卵的数量。若非上下文中另外说明，术语“植物”涵盖植物发育或成熟的任何阶段，以及取自任何这样的植物的任何组织或器官(植物部分)。植物部分包括，但不限于茎、根、花、胚珠、雄蕊、种子、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、微孢子、原生质体、毛根培养物等等。本发明还包括用本发明的植物制备的种子。在一个实施方案中，与植物种子的野生型变体相比，种子确实被育种为有提高的抗线虫感染的抗性。如此处所用，“植物细胞”包括但不限于，原生质体、生产配子的细胞和再生为完整植株的细胞。植物多种组织的组织培养物和从这些组织培养物的植物再生为本领域所公知且已经广泛公开。如此处使用的术语“转基因”指含有至少一个重组多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在许多情况下，重组多核苷酸的所有或部分被稳定整合入染色体中，或是稳定的染色体外元件，从而能够传递至下一代。出于本发明的目的，术语“重组多核苷酸”指的是已经由遗传工程改变、重排或修饰的多核苷酸。其实例包括连接到或加入到异源序列的任何克隆多核苷酸。术语“重组”并非指天然发生事件例如自发突变或通过选择性育种导致的非自发诱变所导致的多核苷酸的改变。如本文中使用的，术语“足以抑制表达的量”指足以降低从寄生线虫的靶基因产生的mRNA或蛋白质的水平或稳定性的dsRNA的浓度或量。如本文中使用的，“抑制表达”指靶基因的蛋白质和/mRNA产物的水平的缺失或可观察到的减少。抑制靶基因表达对寄生线虫可以是致死的，或者如果植物疾病与寄生线虫生活周期的特定阶段相关，则此类抑制可以推迟或阻止进入特定的发育步骤(例如，变态)。可以通过检验线虫的外在性质来验证抑制的结果(如下文实施例中所示)。根据本发明，将寄生线虫与dsRNA接触，所述dsRNA特异性的抑制对线虫的存活、变态或繁殖关键性的靶基因的表达。优选的，寄生线虫在进入表达dsRNA的植物后与dsRNA接触。在一个实施方案中，dsRNA由转化到受感染植物的祖先中的载体编码。优选的，表达所述dsRNA的核酸序列处于根特异性启动子、寄生线虫诱导的摄食细胞-特异性启动子或组成型启动子的转录控制下。在一个实施方案中，寄生线虫的靶基因是innexin-样基因。Innexin包括一大家族的基因，认为它们编码无脊椎动物的间隙连接通道-形成蛋白。这类通道形成蛋白允许在相邻细胞之间运输离子和其它小分子。在秀丽隐杆线虫中，靶向irmexin的RNAi导致秀丽隐杆线虫胚胎和幼虫致死。优选的，靶基因是秀丽隐杆线虫innexin基因家族的同源物，且源自植物寄生线虫。在本发明的该实施方案中，寄生线虫innexin-样靶基因包括选自以下的序列(a)SEQIDNO:1或3所述的序列，和(b)与SEQIDNO:1或3具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如实施例1所示，分离了全长的大豆胞囊线虫irmexin-样基因，并如SEQIDNO1所示。在另一个实施方案中，寄生线虫的靶基因是编码聚合酶δ小亚基(ροδS)的基因。聚合酶S涉及DNA复制、修复和重组。小亚基是非催化性的。小亚基是催化亚基与增殖细胞核抗原的功能性相互作用和进行的DNA合成所必需的。在秀丽隐杆线虫中，靶向聚合酶δ小亚基(F12F6.7)的RNAi导致胚胎致死。优选的，靶基因是秀丽隐杆线虫聚合酶δ小亚基基因的同源物，且源自植物寄生线虫。在本发明的该实施方案中，寄生线虫聚合酶δ小亚基靶基因包括选自以下的序列(a)SEQIDNO:23或25所述的序列，和(b)与SEQIDNO:23或25具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如实施例1所示，分离了全长的大豆胞囊线虫聚合酶S小亚基基因，并如SEQIDN0:23所示。在另一个实施方案中，寄生线虫的靶基因是秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因T21B10.7(Genbank登录号AAA9323!3)的同源物，其编码真核细胞胞质(“T复合体”)陪伴蛋白的假定的α亚基。该T复合体蛋白是前核-中心体旋转、有丝分裂纺锤体的定位、减数分裂和远顶细胞迁移所必需的；也是秀丽隐杆线虫的能育性和存活所必需的。优选的，靶基因是秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因的同源物，且源自植物寄生线虫。在本发明的该实施方案中，寄生线虫tcp-Ι靶基因包括选自以下的序列(a)SEQIDNO:11或13所述的序列，和(b)与SEQIDNO:11或13具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如实施例1所示，分离了全长的大豆胞囊线虫tcp-Ι样基因，并如SEQIDNO11所示。在另一个实施方案中，寄生线虫的靶基因是秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因T21B10.7(Genbank登录号AAA93233)的同源物或序列片段基序，源自使用与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的氨基酸序列对应的DNA序列。如实施例1中公开的，分离了全长的大豆胞囊线虫tcp-Ι样基因，并如SEQIDN0:11所示。SEQIDNO:11描述的序列含有具有如SEQIDNO:12所公开的氨基酸序列的可读框。如实施例4中公开的，使用SEQIDNO12描述的氨基酸序列鉴别同源基因的氨基酸序列。SEQIDNO:15描述了相应的同源DNA序列。图8a-c显示了鉴别的SEQIDNO15所述同源物与SEQIDNO11的DNA序列比对。在图8a-c中，覆盖21个或更多个核苷酸的高序列同源性区域标记为基序A至基序F。SEQIDNO:86-91描述了对应基序A至基序F的基序序列。在本发明的该实施方案中，寄生线虫tcp-Ι靶基因的同源序列或序列片段基序包括选自以下的序列(a)SEQIDNO:15所述的序列，(b)与SEQIDNO:15具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)SEQIDNO:86、87、88、89、90或91所述的序列。在另一个实施方案中，寄生线虫的靶基因是秀丽隐杆线虫pas-Ι基因的同源物，其编码蛋白酶体α亚基。蛋白酶体α亚基是26S蛋白酶体的20S蛋白酶核心颗粒的一部分。它们作用为门，通过所述门标记的蛋白质进入蛋白酶体进行降解。优选的，靶基因是秀丽隐杆线虫pas-Ι基因的同源物，且源自植物寄生线虫。在本发明的该实施方案中，寄生线虫pas-Ι靶基因包括选自以下的序列(a)SEQIDNO:5或7所述的序列，和(b)与SEQIDNO:5或7具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如实施例1所示，分离了全长的大豆胞囊线虫pas-Ι基因，并如SEQIDNO5所示。在另一个实施方案中，寄生线虫的靶基因是秀丽隐杆线虫pas-Ι基因的同源物或序列片段基序，源自使用与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的氨基酸序列对应的DNA序列。如实施例1中公开的，分离了全长的大豆胞囊线虫pas-Ι样基因转录物，并如SEQIDN0:5所示。SEQIDNO:5描述的序列含有具有如SEQIDNO:6所公开的氨基酸序列的可读框。如实施例4中公开的，使用SEQIDNO:6描述的氨基酸序列鉴别同源基因的氨基酸序列。SEQIDNO:9描述了相应的同源DNA序列。图7a_b显示了鉴别的SEQIDNO:9所述同源物与SEQIDNO5的DNA序列比对。在图7a_b中，覆盖21个或更多个核苷酸的高序列同源性区域标记为基序A至基序G。SEQIDNO:72-78描述了对应基序A至基序G的基序序列。在本发明的该实施方案中，寄生线虫pas-Ι靶基因的同源序列或序列片段基序包括选自以下的序列(a)SEQIDNO9所述的序列，(b)与SEQIDNO9具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)SEQIDNO72、73、74、75、76、77或78所述的序列。在另一个实施方案中，寄生线虫的靶是寄生线虫snurportin-Ι样基因。Snurportin是核输入受体，涉及将用于剪接的m3G_加帽的UsnRNP(小核核糖核蛋白)输入到细胞核中。在秀丽隐杆线虫中，靶向snurportin-1(F23F1.5)的RNAi导致胚胎致死。优选的，靶基因是秀丽隐杆线虫snurportin-Ι基因F23G1.5(Genbank登录号AAB70323)的同源物，且源自植物寄生线虫。在本发明的该实施方案中，寄生线虫snurportin-Ι靶基因包括选自以下的序列(a)SEQIDNO:19或21所述的序列，和(b)与SEQIDN0:19或21具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如实施例1所示，分离了全长的大豆胞囊线虫snurportin-Ι基因，并如SEQIDNO:19所示。在另一个实施方案中，寄生线虫的靶基因是秀丽隐杆线虫rpt-Ι基因的同源物，其编码蛋白酶体19S调控复合体的预测的ATP酶亚基，影响能育性和胚胎存活。优选的，靶基因是秀丽隐杆线虫rpt-Ι基因C52E4.4(EMBL登录号CAB01414)的同源物，且源自植物寄生线虫。在本发明的该实施方案中，寄生线虫rpt-Ι靶基因包括选自以下的序列(a)SEQIDNO:39,41或43所述的序列，和(b)与SEQIDNO:39、41或43具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如实施例1所示，分离了全长的大豆胞囊线虫rpt-Ι样基因，并如SEQIDNO39所示。在另一个实施方案中，寄生线虫的靶基因是秀丽隐杆线虫rpt-Ι基因C52E4.4(EMBL登录号CAB01414)的同源物或序列片段基序，源自使用与秀丽隐杆线虫rpt-Ι基因同源的氨基酸序列对应的DNA序列。如实施例1中公开的，分离了全长的大豆胞囊线虫rpt-Ι样基因转录物，并如SEQIDNO39所示。SEQIDNO39描述的序列含有具有如SEQIDNO40所公开的氨基酸序列的可读框。如实施例4中公开的，使用SEQIDNO40描述的氨基酸序列鉴别同源基因的氨基酸序列。SEQIDN0:45、47、49、51、53和55描述了相应的同源DNA序列。图lOa-e显示了SEQIDNO:45、47、49和51描述的已鉴别的植物寄生线虫同源物与SEQIDNO39的DNA序列比对。在图10a_e中，覆盖21个或更多个核苷酸的高序列同源性区域标记为基序A至基序J。SEQIDNO:94-103描述了对应基序A至基序J的基序序列。在本发明的该实施方案中，寄生线虫rpt-Ι靶基因的同源序列或序列片段基序包括选自以下的序列(a)SEQIDNO:45、47、49或51所述的序列，(b)与SEQIDNO:45、47、49或51具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)SEQIDNO:94、95、96、97、98、99、100、101、102或103所述的序列。在另一个实施方案中，靶是编码寄生线虫^S蛋白酶体调控亚基4(prs_4)的基因。亚基4蛋白是^S蛋白酶体的19S调控复合体的一部分，含有ATP酶结构域。用RNAi破坏寄生线虫中的该基因可以导致蛋白酶体的潜在缺陷和死亡。优选的，靶基因是秀丽隐杆线虫26S蛋白酶体调控亚基4基因——基因F29G9.5,Swiss-Prot登录号016368的同源物，且源自植物寄生线虫。在本发明的该实施方案中，寄生线虫26S蛋白酶体调控亚基4靶基因包括选自以下的序列(a)SEQIDNO:27、29或104所述的序列，(b)与SEQIDNO:27、29或104具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在严格条件下与SEQIDNO27,29或104所述的序列杂交的、来自寄生线虫的多核苷酸。如实施例1所示，分离了全长的大豆胞囊线虫26S蛋白酶体调控亚基4基因序列，并如SEQIDNO:104所示。在另一个实施方案中，寄生线虫的靶基因是寄生线虫^S蛋白酶体调控亚基4(prs-4)或序列片段基序，源自使用与寄生线虫26S蛋白酶体调控亚基4(prs-4)序列同源的氨基酸序列对应的DNA序列。如实施例1中公开的，分离了全长的大豆胞囊线虫^S蛋白酶体调控亚基4基因序列，并如SEQIDNO:104所示。SEQIDNO:104描述的序列含有具有如SEQIDNO105所公开的氨基酸序列的可读框。如实施例4中公开的，使用SEQIDNO:105描述的氨基酸序列鉴别同源基因的氨基酸序列。SEQIDN0:31、33、35和37描述了相应的同源DNA序列。图9a-b显示了SEQIDNO35和SEQIDNO37描述的已鉴别的同源物与SEQIDNO:104的DNA序列比对。在图9a_b中，覆盖21个或更多个核苷酸的高序列同源性区域标记为基序A至基序D。SEQIDNO:92、93、106和107描述了对应基序A至基序D的基序序列。在本发明的该实施方案中，寄生线虫prs-4靶基因的同源序列或序列片段基序包括选自以下的序列(a)SEQIDNO:35或37所述的序列，(b)与SEQIDNO35或37具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(C)SEQIDNO:92、93、106或107所述的序列。在另一个实施方案中，寄生线虫的靶基因是秀丽隐杆线虫rpn-5基因的同源物，其编码蛋白酶体调控颗粒。蛋白质是26S蛋白酶体调控复合体的一部分，含有非ATP酶结构域。在秀丽隐杆线虫采食测定中的RNAi研究已显示了胚胎致死表型。优选的，靶基因是秀丽隐杆线虫rpn-5基因F10G7.8(Genbank登录号AAA81126)的同源物，且源自植物寄生线虫。在本发明的该实施方案中，寄生线虫rpn-5基因包括选自以下的序列(a)SEQIDNO57、59或61所述的序列，(b)与SEQIDNO:57、59或61具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在严格条件下与SEQIDNO:57、59或61所述的序列杂交的、来自寄生线虫的多核苷酸。如实施例1所示，分离了全长的大豆胞囊线虫rpn-5基因，并如SEQIDNO57所示。在另一个实施方案中，寄生线虫的靶基因是寄生线虫rpn-5基因或序列片段基序，源自使用与寄生线虫rpn-5基因同源的氨基酸序列对应的DNA序列。如实施例1中公开的，分离了全长的大豆胞囊线虫rpn-5基因，并如SEQIDN0:57所示。SEQIDNO57描述的序列含有具有如SEQIDNO:58所公开的氨基酸序列的可读框。如实施例4中公开的，使用SEQIDNO:58描述的氨基酸序列鉴别同源基因的氨基酸序列。SEQIDNO:63描述了相应的同源DNA序列。图lla-b显示了SEQIDNO63描述的已鉴别的同源物与SEQIDNO57的DNA序列比对。在图1la-b中，覆盖21个或更多个核苷酸的高序列同源性区域标记为基序A至基序G。SEQIDNO:79-85描述了对应基序A至基序G的基序序列。在本发明的该实施方案中，寄生线虫rpn-5靶基因的同源序列或序列片段基序包括选自以下的序列(a)SEQIDNO:63所述的序列，(b)与SEQIDNO:63具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)SEQIDNO:79、80、81、82、83、84或85所述的序列。可以使用本文提供的信息和生物
技术领域：
的技术人员已知的技术，从大豆胞囊线虫以外的其它寄生线虫中分离与发明的寄生线虫靶基因对应的完整cDNA。例如，可以从寄生线虫cDNA文库中分离来自寄生线虫的核酸分子，所述核酸分子在严格条件下与SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61的核苷酸序列杂交。如本文中使用的，关于DNA与DNA印迹的杂交，术语“严格条件”指在IOXDenhart氏溶液，6XSSC,0.5%SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中，在60°C杂交过夜。然后，在62°C下，依次在3XSSC/0.1%SDSUXSSC/0.1%SDS和最后0.IXSSC/0.1%SDS中各洗涤印迹30分钟。亦如本文使用的，在优选的实施方案中，词组“严格条件”指在65°C下，在6XSSC杂交。在另一个实施方案中，“高严格条件”指在IOXDenhart氏溶液，6XSSC,0.5%SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中，在65°C杂交过夜。然后，在65°C下，依次在3XSSC/0.1%SDSUXSSC/0.1%SDS和最后0.1XSSC/0.1%SDS中各洗涤印迹30分钟。核酸杂交的方法描述在Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138:267-284中，是本领域普遍已知的。可选的，可以从寄生线虫细胞中分离mRNA，可以使用逆转录酶制备cDNA。可以基于SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61所示的核苷酸序列设计用于聚合酶链式反应扩增的合成寡核苷酸引物。可以使用cDNA或可选的基因组DNA作为模板，以及合适的寡核苷酸引物，根据标准的PCR扩增技术，扩增对应本发明的寄生线虫靶基因的核酸分子。可以将如此扩增的核酸分子克隆到合适的载体中，并通过DNA序列分析来表征。因此，在一个实施方案中，发明的dsRNA包括与植物寄生线虫基因组的irmexin-样靶基因的一部分基本相同的第一链，以及与第一链基本互补的第二链。在优选的实施方案中，靶基因选自(a)具有SEQIDNO:1或3所述的序列的多核苷酸，(b)与SEQIDNO:1或3具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在严格条件下与具有SEQIDNO:1或3所述的序列的多核苷酸杂交的、来自寄生线虫的多核苷酸。在另一个实施方案中，发明的dsRNA包括与植物寄生线虫基因组的pas-Ι靶基因的一部分基本相同的第一链，以及与第一链基本互补的第二链。在优选的实施方案中，靶基因选自:(a)具有SEQID而5、7、9、72、73、74、75、76、77或78所述的序列的多核苷酸，(13)与SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77或78具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在严格条件下与具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77或78所述的序列的多核苷酸杂交的、来自寄生线虫的多核苷酸。在另一个实施方案中，发明的dsRNA包括与植物寄生线虫基因组的tcp-Ι靶基因的一部分基本相同的第一链，以及与第一链基本互补的第二链。在优选的实施方案中，靶基因选自:(a)具有SEQIDNO:11、13、15、86、87、88、89、90或91所述的序列的多核苷酸，(b)与SEQIDNO:11、13、15、86、87、88、89、90或91具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在严格条件下与具有SEQIDNO:11、13、15、86、87、88、89、90或91所述的序列的多核苷酸杂交的、来自寄生线虫的多核苷酸。在另一个实施方案中，发明的dsRNA包括与植物寄生线虫基因组的snurportin-1靶基因的一部分基本相同的第一链，以及与第一链基本互补的第二链。在优选的实施方案中，靶基因选自(a)具有SEQIDNO:19或21所述的序列的多核苷酸，(b)与SEQIDNO19或21具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在严格条件下与具有SEQIDNO19或21所述的序列的多核苷酸杂交的、来自寄生线虫的多核苷酸。在另一个实施方案中，发明的dsRNA包括与植物寄生线虫基因组的聚合酶δ小亚基靶基因的一部分基本相同的第一链，以及与第一链基本互补的第二链。在优选的实施方案中，靶基因选自(a)具有SEQIDNO:23或25所述的序列的多核苷酸，(b)与SEQIDNO23或25具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在严格条件下与具有SEQIDNO23或25所述的序列的多核苷酸杂交的、来自寄生线虫的多核苷酸。在另一个实施方案中，发明的dsRNA包括与植物寄生线虫基因组的prs-4靶基因的一部分基本相同的第一链，以及与第一链基本互补的第二链。在优选的实施方案中，靶基因选自:(a)具有SEQID而27、104、四、92、93、106或107所述的序列的多核苷酸，(13)与SEQIDNO:27、104、四、92、93、106或107具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在严格条件下与具有SEQIDN0:27、104J9、92、93、106或107所述的序列的多核苷酸杂交的、来自寄生线虫的多核苷酸。在另一个实施方案中，发明的dsRNA包括与植物寄生线虫基因组的rpt-Ι靶基因的一部分基本相同的第一链，以及与第一链基本互补的第二链。在优选的实施方案中，靶基因选自(a)具有SEQIDN0:39、41、43、94、95、96、97、98、99、100、101、102或103所述的序列的多核苷酸，(b)与SEQIDNO:39、41、43、94、95、96、97、98、99、100、101、102或103具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在严格条件下与具有SEQIDN0:39、41、43、94、95、96、97、98、99、100、101、102或103所述的序列的多核苷酸杂交的、来自寄生线虫的多核苷酸。在另一个实施方案中，发明的dsRNA包括与植物寄生线虫基因组的rpn-5靶基因的一部分基本相同的第一链，以及与第一链基本互补的第二链。在优选的实施方案中，靶基因选自:(a)具有SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84或85所述的序列的多核苷酸，(b)与SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84或85具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在严格条件下与具有SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84或85所述的序列的多核苷酸杂交的、来自寄生线虫的多核苷酸。如上文讨论的，长度大于19-个核苷酸的dsRNA片段被线虫和植物在胞内切割成长度为19-个核苷酸的siRNA，这些siRNA是RNAi现象的实际介质。图Ha_141的表格提出了SCNinnexin-样基因，SEQIDNO:1;pas_l基因，SEQIDNO:5;tcp_l基因，SEQIDNO:11;snurportin-l样基因，SEQIDNO:19；polδS基因，SEQIDNO23；prs_4基因，SEQIDNO:104;rpt-l基因，SEQIDNO:39；和rpn_5基因，SEQIDNO:57；及其各自的片段和同源物(如表格所述的SEQIDNO所示)的示例性21-mer。该表格还可用于计算19、20、22,23或M-mer，通过从各21mer中添加或减去合适数量的核苷酸。因此，本发明的dsRNA的长度范围可以从19个核苷酸至约500个连续的核苷酸，或者直至靶基因的全长。发明的dsRNA可以作为miRNA实施，所述miRNA靶向寄生线虫靶基因中的单个位点。可选的，发明的dsRNA具有长度约19个核苷酸至约600个连续的核苷酸。在另一个实施方案中，发明的dsRNA具有长度约20个核苷酸至约400个连续的核苷酸，或约21个核苷酸至约300个连续的核苷酸。如本文讨论的，实践本发明不需要dsRNA和靶基因之间100%的序列同一性。优选的，发明的dsRNA包括19个核苷酸的部分，所述部分与靶基因的至少19个连续的核苷酸基本相同。而包含与发明的寄生线虫靶基因的一部分相同的核苷酸序列的dsRNA优选的用于抑制，发明可以耐受序列差异，所述差异可以预期是由于基因操作或合成、遗传突变、品系多态性或进化分歧造成的。因此，发明的dsRNA还可以涵盖这样的dsRNA，其包括与靶基因至少1、2或更多个核苷酸的错配。例如，只要获得的序列仍然干扰寄生线虫靶基因的功能，则本发明中可以认为图Ha-141例举的21merdsRNA序列可以含有1、2或更多个核苷酸的添加、缺失或取代。可以通过本领域已知的序列比较和比对算法(参见Gribskov和Devereux，SequenceAnalysisPrimer,StocktonPress，1991，和其中引用的参考文献)，以及通过例如使用默认参数的BESTFIT软件程序(例如，UniversityofWisconsinGeneticComputingGroup)执行Smith-Waterman算法来计算核苷酸序列之间的百分比差异，优化发明的dsRNA和寄生线虫靶基因之间的序列同一性。在抑制性RNA和靶基因的至少19个连续核苷酸之间大于80%序列同一性、90%序列同一性或甚至100%序列同一性是优选的。当发明的dsRNA具有大于约21个核苷酸的长度时，例如从约50个核苷酸至约1000个核苷酸，在植物或寄生线虫细胞中，可以被随机的切割成约21个核苷酸的dsRNA，即siRNA。切割发明的较长的dsRNA将产生源自较长的dsRNA的21merdsRNA的库。该21merdsRNA的库也涵盖在本发明的范围内，不论是在植物或线虫的胞内产生的，或者使用已知的寡核苷酸合成的方法合成产生的。发明的siRNA具有与寄生线虫靶基因完整序列中19-个连续核苷酸的片段相对应的序列。例如，源自大豆胞囊线虫靶基因(如SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61所述)的发明的siRNA库可以包括多个选自这样的寡核苷酸的RNA分子，所述寡核苷酸与图14a-141中发现的SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、104、29、39、41、43、57、59或61的21mer核苷酸基本相同。相似的，发明的siRNA库还可以实施为图14a-141的表中所述大豆胞囊线虫靶基因的片段和同源物的21mer库。本领域技术人员可以认识到siRNA可具有与靶基因至少1、2或更多个核苷酸的错配。此外，本发明意图将这类错配包括在内。例如，本发明认为，图14a-141例举的21merdsRNA序列可含有1、2或更多个核苷酸的添加、缺失或取代，且获得的序列仍然干扰线虫基因的功能。源自SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61的大豆胞囊线虫靶基因的发明的siRNA库还可以包括任何特定RNA分子的组合，所述RNA分子具有源自图14a-141中所述SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、104、29、39、41、43、57、59或61的任意21个连续核苷酸的序列。此外，由于植物中多个专门化的Dicer产生siRNA通常在大小范围在19nt至24nt(参见Henderson等人，2006.NatureGenetics38:721-725)，本发明的siRNA的范围可以在19个连续的核苷酸序列至约M个连续的核苷酸序列。相似的，发明的siRNA库可以包括多个RNA分子，所述RNA分子具有源自SEQIDN0:l、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61的任意19、20、21、22、23或24个连续核苷酸的序列。可选的，发明的siRNA库可以包括多个RNA分子，所述RNA分子具有源自SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61的任意19、20、21、22、23和/或M个连续核苷酸的序列的组合。本发明的dsRNA可任选地包括在一端或两端的单链突出端。优选的，单链突出端在dsRNA分子的每条链的3’端包含至少两个核苷酸。合成siRNA可以在二-核苷酸突出部分包含2’-脱氧胸苷(TT)或核糖尿苷(UU)。该双链结构可以通过单链自身互补RNA链形成(即形成发夹环)或两个互补的RNA链形成。RNA双链体的形成可以在细胞内或细胞外起始。当本发明的双链RNA形成发夹环时，可任选地包括内含子(如US2003/0180945A1中所述)或核苷酸间割区，该间割区是在互补的RNA链间的序列片段以稳定细胞中的发夹转基因。制备各种双链RNA分子的方法记载于例如WO99/53050和美国专利No.6，506，559中。RNA可以允许每个细胞输送至少一个拷贝的量引入。更高剂量的双链材料会产生更有效的抑制。在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组表达载体，其包含编码如上所述dsRNA的核酸，其中与宿主植物细胞的野生型品种相比，该载体在宿主植物细胞中的表达导致对寄生线虫的抗性增加。如此处所用的术语“载体”指能够转运其已经连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指环状双链DNA环，附加的DNA片段可以连接其中。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们导入的宿主植物细胞中自主复制。其他载体在导入宿主细胞时整合入宿主植物细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。这样的载体在此称为“表达载体”，用于重组DNA技术的表达载体一般是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，本发明意欲包括具有等同功能的表达载体的其他形式，例如病毒载体(例如马铃薯病毒X，烟草rattle病毒和双粒病毒组)。本发明的重组表达载体包括以适宜在宿主植物细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，意思是该重组表达载体包括一个或多个调节序列，例如启动子，该调节序列基于待用于表达的宿主植物细胞进行选择，被有效连接至待表达的核酸序列。至于重组表达载体，术语“有效连接”和“有效结合”可以互换，意为以允许核苷酸序列表达的方式(即，当载体被引入宿主植物细胞中时在宿主植物细胞中表达)将目的核酸序列连接到调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多聚腺苷酸信号)。例如这类调节序列记载于Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)已及GruberandCrosby的MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick禾口Thompson编著，第7章，89-108,CRCPress=BocaRaton，Florida中，包括其参考文献。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些和仅仅在某些宿主细胞中或在某些情况下指导核苷酸序列表达的那些。本领域技术人员了解表达载体的设计可取决于诸如要转化的宿主细胞、所需dsRNA的表达水平等因素。本发明的表达载体可引入植物宿主细胞中进而产生此处所述的核酸编码的本发明的dsRNA分子。根据本发明，重组表达载体包括有效连接到核苷酸序列的调节序列，该核苷酸序列是本发明dsRNA的一条或两条链的模板。在一个实施方案中，所述核酸分子进一步包括在所述核酸分子任何一端侧翼的启动子，其中该启动子驱动各个DNA链的表达，从而产生杂交形成dsRNA的两个互补的RNA。在另一个实施方案中，核酸分子包含在一个转录单元中转录成dsRNA的两个链的核苷酸序列，其中正义链从转录单元的5’端开始转录，反义链从3’端开始转录，其中这两个链被3到500个碱基对或更多碱基对隔开，转录后，该RNA转录产物自身折叠形成发夹。根据本发明，发夹转录物中的间隔区可以是任何DNA片段。根据本发明，所引入的多核苷酸如果合并入非染色体自主复制子中或整合入植物染色体中，会在植物细胞中稳定保持。或者，所引入的多核苷酸可以存在于染色体外非复制载体上，并瞬时表达或瞬时有活性。不管存在于染色体外非复制载体中还是整合入染色体的载体中，该多核苷酸优选位于植物表达盒中。植物表达盒优选含有能够驱动在植物细胞中基因表达的调节序列，该调节序列得到有效地连接，从而使得每个序列都能够发挥其功能，例如通过多聚腺苷酸信号终止转录。优选的多聚腺苷酸信号是那些来自于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)t-DNA的信号，例如已知为Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合成酶的基因3(Gielen等人，1984，EMBOJ.3835)或其功能等同物，还有植物中的所有其他有功能活性的终止子都适用。因为植物基因的表达通常不在转录水平限制，植物表达盒优选包含其他有效连接的序列，例如像翻译增强子的序列，例如来自烟草花叶病毒的含有5’-不翻译前导序列的增速驱动序列，可增加每个RNA产生的多肽比例(Gallie等人，1987，Nucl.AcidsResearch15:8693-8711)。植物表达载体的实例包括详细描述于下列文献中的载体Becker,D.等人，1992,Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder,PlantMol.Biol.20:1195-1197；Bevan,M.W.,1984,BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721；禾口TransgenicPlants第1卷，EngineeringandUtilization中的VectorsforGeneTransferinHigherPlants;Kung禾口R.Wu编著，AcademicPress,1993，S.15-38。植物基因的表达应该有效地连接至适当启动子，该启动子以时间优先、空间优先、细胞类型优先和/或组织优先方式使该基因表达。用于本发明表达盒的启动子包括能够起始存在于植物根部的植物细胞中转录的任何启动子。这类启动子包括但不限于，那些能够从植物、植物病毒和含有在植物中表达的基因的细菌(如农杆菌和根瘤菌)中得到的启动子。优选本发明的表达盒包括根特异性启动子、病原体可诱导的启动子或线虫可诱导的启动子。更优选该线虫可诱导的启动子是寄生线虫采食部位特异性启动子。寄生线虫采食部位特异性启动子可以对合胞体细胞或巨细胞具有特异性或对这两种细胞都具有特异性。如果一个启动子在其诱导状态下的活性(通过其控制下产生的RNA量来测定)比未诱导状态下的活性高至少30%、40%、50%，优选至少60%、70%、80%、90%，更优选至少100%、200%、300%，那么这个启动子是可诱导的启动子。如果一个启动子的活性(通过其控制下产生的RNA量来测定)在特定的细胞类型、组织或器官中比在同一个植物的其他细胞类型、组织中要高至少30%、40%、50%，优选至少60%、70%、80%、90%，更优选至少100%、200%、300%，那么这种启动子是细胞、组织或器官特异性启动子，优选所述其他的细胞类型或组织是相同植物器官(例如根)的细胞类型或组织。在器官特异性启动子的情况中，启动子活性应该与其他植物器官中的启动子活性比较，例如叶、茎、花或种子。启动子可以是组成型的、可诱导的、发育阶段优先的、细胞类型优先的、组织优先的或器官优先的。组成型启动子在大多数情况下都有活性。组成型启动子的非限制实例包括CaMV19S和35S启动子(Odell等人，1985，Nature313:810-812)、sXCaMV35S启动子(Kay等人，1987，kience236:1299-130工印1启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，PlantCell2:163-171)、拟南芥肌动蛋白启动子、泛素启动子(Christensen等人，1989，PlantMolec.Biol.18:675-689),pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81581-588)、玄参花斑病病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等人，1984，EMBOJ.32723-2730)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利5，683，439)、来自农杆菌属T-DNA的启动子，例如甘露碱合成酶、胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶、核酮糖磷酸氢盐羧化酶(ssuRUBISCO)启动子的小亚基等。优选在接触寄生线虫的细胞中表达双链RNA的启动子。或者，所述启动子可以驱动dsRNA在远离接触线虫的部位的植物组织中表达，然后该dsRNA可以由植物转运至下述细胞中，所述细胞在线虫采食部位的特定细胞中接触寄生线虫，或接近线虫采食部位，例如合胞体细胞或巨细胞。可诱导的启动子在特定环境条件下是有活性的，例如存在或缺乏营养素或代谢产物、热或冷、光照、病原体攻击、缺氧条件等。例如，已经表明启动子iTobRBTjtRPEjtPykKKGemini19和AtHMGl可以由线虫诱导(对于线虫可诱导的启动子的综述，请参见Arm.Rev.Phytopathol.(2002)40:191-219；还参见U.S.Pat.No.6，593，513)。优选的线虫可诱导的启动子公开在共同转让的共同未决申请PCT/EP2007/、PCT/EP2007/、PCT/EP2007/，和PCT/EP2008八最优选的，具有SEQIDNO:69、70和71的线虫可诱导的启动子在本发明的表达载体中使用。分离可以由线虫诱导的其他启动子的方法在美国专利5，589，622和5，824，876中列出。其他可以诱导的启动子包括芸苔属的hsp80启动子，其可由热休克诱导；PPDK启动子，其由光诱导；烟草、拟南芥和玉蜀黍的PR-I启动子，其可以由病原体感染诱导；和Adhl启动子，其由缺氧和冷胁迫诱导。植物基因表达也可由可诱导的启动子促进(关于综述参见Gatz，1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48:89-108)如果需要时间特异性基因表达，可化学诱导的启动子特别适用。这种启动子的非限制性实例是可水杨酸诱导的启动子(PCT申请No.WO95/19443)、可四环素诱导的启动子(feitz等人，1992，PlantJ.2:397-404)和可乙醇诱导的启动子(PCT申请No.WO93/21334)。发育阶段优先的启动子在发育的特定阶段优先表达。组织和器官优先的启动子包括那些在特定组织或器官优先表达的启动子，例如叶、根、种子或木质部。组织优先和器官优先启动子的实例包括但不限于果实优先、胚珠优先、雄性组织优先、种子优先、珠被优先、块茎优先、柄优先、果皮优先和叶子优先、柱头优先、花粉优先、花药优先、花瓣优先、萼片优先、花梗优先、长角果优先、根优先、茎优先等等。种子优先的启动子在种子发育和/或萌发时优先表达。例如，种子优先启动子可以是胚优先、胚乳优先和种皮优先的。见Thompson等人，1989，BioEssays10:108。种子优先的启动子包括但不限于纤维素合酶(eelA)、Ciml、Y-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉蜀黍19kD玉米醇溶蛋白(CZ19B1)等。其他适宜的组织优先或器官优先启动子包括但不限于油菜籽napin-基因启动子(美国专利号5，608，152)、蚕豆(Viciafaba)USP-启动子(Baeumlein等人，1991，MolGenGenet.225(3):459-67)、拟南芥油质蛋白启动子(PCT申请No.WO98/45461)、菜豆(Phaseolusvulgaris)菜豆素启动子(美国专利号5，504，200)、芸苔属Bce4-启动子(PCT申请No.WO91/13980)、或豆球蛋白B4启动子(LeB4;Baeumlein等人，1992，PlantJournal,2(2):233-9)，以及在像玉蜀黍、大麦、小麦、黑麦、稻等单子叶植物中赋子种子特异性表达的启动子。要关注的适宜启动子是大麦的lpt2或Iptl-基因启动子(PCT申请No.WO95/15389和PCT申请No.WO95/23230)，或在PCT申请No.WO99/16890中描述的那些启动子(大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的醇溶谷蛋白基因、小麦的麦胶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因和黑麦的黑麦碱基因)。用于本发明的表达盒的其他启动子包括但不限于，主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-conglycin启动子、油菜籽蛋白启动子、大豆凝集素启动子、玉蜀黍15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、蜡质基因(waxy)启动子、超甜基因(Shrunken)I启动子、超甜基因2启动子和bronze基因启动子、Zml3启动子、(美国专利号5，086，169)、玉蜀黍多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5，412，085和5，545,546)和SGB6启动子(美国专利号5，470，359)，以及合成的或其他天然启动子。根据本发明，所述表达盒包括与核苷酸序列有效连接的表达控制序列，该核苷酸序列是所述dsRNA的一条或两条链的模板。该dsRNA模板包括(a)第一链，具有与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、104、29、35、37、39、41、43、45、47、49、51、57、59、61、63、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、106或107的19至大约400-500个或至多全长的连续核苷酸基本上相同的序列；和(b)第二链，具有与第一链基本上互补的序列。在进一步的实施方案中，启动子位于所述模板核苷酸序列任一端的侧翼，其中所述启动子驱动各个单独的DNA链的表达，进而产生两条互补的RNA，这两条互补的RNA能够杂交并形成所述dsRNA。在备选的实施方案中，核苷酸序列在一个转录单元上被转录成dsRNA的两条链，其中，正义链从转录单元的5’端转录，而反义链从3’端转录，其中这两条链隔开大约3大约500个碱基对，并且转录之后，该RNA转录物自身折叠形成发夹结构。在另一个实施方案中，所述载体含有双向启动子，驱动两个核酸分子的表达，由此一个核酸分子编码与寄生线虫innexin-样、pas_l、tcp_l、snurportin-1样、polδS、prs-4、rtp-1或rpn_5靶基因的一部分基本上相同的序列，而另一个核酸分子编码与第一链基本上互补的第二序列，并且当两个序列都转录时能够形成dsRNA。双向启动子是能够在两个方向介导表达的启动子。在另一个实施方案中，所述载体含有两种启动子，一个介导与寄生线虫innexin-样、pas_l、tcp-Ksnurportin-1样、polδS、prs-4Λrtp-1或rpn-5革巴基因的一部分基本上相同的序列的转录，另一个启动子介导与第一链基本上互补的第二序列的转录，并且当两个序列都转录时能够形成dsRNA。第二启动子可以是不同的启动子。不同启动子指就细胞或组织特异性来说具有不同活性，或对诸如病原体、非生物胁迫或化学品等不同的诱导物呈现表达的启动子。例如，一个启动子可以是组成型的或组织特异性的，而另一个则可能是组织特异性或可被病原体诱导的。在一个实施方案中，一个启动子介导与过表达innexin-样、pas_l、tcp_l、snurportin-1样、polδS、prs-4>rtp-1或rpn-5基因相适应的核酸的转录，而另一个启动子介导互补核酸的组织或细胞特异性转录或病原体诱导的表达。本发明还涉及能表达本发明的dsRNA、进而抑制寄生线虫中innexin-样、pas-1、tcp-1、snurportin-1样、polδS、prs_4、rtp-1或rpn_5基因的转基因植物。所述植物或转基因植物可以是诸如但不限于树、切花(cutflowers)、观赏植物、蔬菜或农作物植物的任何植物。上述植物可来自选自由苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属(Cucumis)、^n属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、黑小麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属G^seudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属、百脉根属(Lotus)、苜蓿属、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、萝卜属(fciphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属、萱草属(Heterocallis)、水仙属(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、蓝英花属(Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)禾口葱属(Allium)组成的组中的属。所述植物可以来自选自下列属的属拟南芥属、苜蓿属、番茄属、芸苔属、香瓜属、茄属、核桃属、棉属、苹果属、葡萄属、金鱼草属、Brachipodium、杨属、草莓属、拟南芥属、云杉属、辣椒属、藜属、菊属、牵牛属、松属、豌豆属、稻属、玉蜀黍属、小麦属、黑小麦属、黑麦属、黑麦草属、大麦属、大豆属、黄杉属、伽蓝菜属、甜菜属、向日葵属、烟草属、南瓜属、蔷薇属、草莓属、百脉根属、苜蓿属、驴食草属、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、橘属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、萝卜属、白芥属、颠茄属、曼陀罗属、天仙子属、烟草属、碧冬茄属、毛地黄属、墨角纶属、菊苣属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、萱草属、水仙属、天竺葵属、黍属、狼尾草属、毛莨属、千里光属、喇叭舌属、蓝英花属、菜豆属、燕麦属和葱属组成的组中的属。在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是农作物植物。农作物植物是用于农业的所有植物。根据一个实施方案，所述植物是单子叶植物，优选禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae)植物，优选是禾本科植物。因此，在又一个实施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍属、小麦属、稻属、大麦属、黑麦属、燕麦属、甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)、狼尾草属、狗尾草属(Setaria)、黍属、糝属(Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodium)、羊茅属(Festuca)或黑麦草属植物。当植物是玉蜀黍属时，优选物种是玉米(Zeamays)。当该植物是小麦属时，优选物种是普通小麦(Triticumaestivum)、斯佩尔特小麦(Triticumspeltae)或圆柱小麦(Triticumdurum)。当所述植物是稻属时，优选物种是稻(0.sativa)0当所述植物是大麦属植物时，优选物种是大麦(Hordeumvulgare)。当所述植物是黑麦属植物时，优选物种是黑麦(kcalecereale)。当所述植物是燕麦属植物时，优选物种是燕麦(Avenasativa)。当所述植物是甘蔗属植物时，优选物种是甘蔗(Saccharumofficinarum)。当所述植物是高粱属植物时，优选物种是高粱(Sorghumvulgare)、高粱(Sorghumbicolor)或苏丹草(Sorghumsudanense)。当所述植物是狼尾草属植物时，优选物种是御谷(Permisetumglaucum)。当所述植物是狗尾草属植物时，优选物种是粱(Setariaitalica)。当所述植物是黍属植物时，优选物种是野生稷(Panieummiliaceum)或柳枝稷(Panieumvirgatum)。当所述植物是糝属(Eleusine)植物时，优选物种是糝子(Eleusinecoracana)。当所述植物是芒属植物时，优选物种是芒(Miscanthussinensis).当所述植物是羊茅属O^estuca)植物时，优选物禾中是Festucaarundinaria、紫羊茅(Festucarubra)或草甸草(Festucapratensis)。当所述植物是黑麦草属植物时，优选物种是黑麦草(Loliumperenne)或多花黑麦草(Loliummultiflorum)。或者，所述植物是黑小麦(Triticosecale)。作为备选方案，在一个实施方案中，植物为双子叶植物，优选豆科(Fabaceae)、^jp禾斗(Solanaceae)、十字花禾斗(Brassicaceae)、薬禾斗(Chenopodiaceae)、菊禾斗(Asteraceae)、锦葵禾斗(Malvaceae)、亚麻禾斗(Linacea)、大卓戈禾斗(Euphorbiaceae)、方宠花禾斗(Convolvulaceae)、蔷蔽禾斗(Rosaceae)、葫声禾斗(Cucurbitaceae)、山茶禾斗(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科(Merculiaceae)或柑桔科(Citrus)植物。在一个实施方案中，所述植物是豆科、茄科或十字花科植物。所以，在一个实施方案中，所述植物是豆科植物，优选的属是大豆属、豌豆属、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、蚕豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜猜属(Medicago)或兵豆属(Lens)。豆科的优选物种是蒺藜苜蓿(M.trimcatula)、紫花苜蓿(M.sativa)、大豆、豌豆、落花生(A.hypogaea)、鹰嘴豆(C.arietinum)、蚕豆(V.faba)、菜豆(P.vulgaris)、白羽扇豆(Lupinusalbus)、黄习习扇豆(Lupinusluteus)、|夹卩十习习扇豆(Lupinusangustifolius)>苜蓿(Msativa)或兵豆(Lensculinaris)0更优选是大豆、落花生和紫花苜蓿。最24优选的物种是大豆。当所述植物是茄科时，优选的属是茄属、番茄属、烟草属或辣椒属。茄科的优选物种是马铃薯(S.tuberosum)、番茄(L.esculentum)(也已知为Solanumlycopersicon)、烟草(N.tabaccum)或黄灯笼辣椒(C.chinense)。更优选的是马铃薯。因此，在一个实施方案中，所述植物是十字花科，优选属是芸苔属或萝卜属。十字花科的优选物种是欧洲油菜(B.napus)、甘蓝(B.oleracea)、芥(B.juncea)或芜青(B.rapa)。更优选的物种是欧洲油菜。当所述植物是藜科植物时，优选属是甜菜属植物。且优选物种是甜菜(B.vulgaris)。当所述植物是菊科植物时，优选属是向日葵属，优选物种是向日葵(H.armUUS)。当所述植物是锦葵科植物时，优选属是棉属或秋葵属。当所述属是棉属时，优选物种是陆地棉(G.hirsutum)或海岛棉⑷.bartadense)。最优选的是陆地棉。秋葵属的优选物种是咖啡黄葵(A.esculentus)。当所述植物是亚麻科时，优选属是亚麻属，优选物种是亚麻(Lusitatissimum)。当所述植物是大戟科植物时，优选的属木薯属、麻风树属(Jatropa)、或蓖麻属(Iihizinus)植物。优选物种是木薯(M.esculenta)、麻风树(J.curcas)或蓖麻(R.commimis)。当所述植物是旋花科植物时，优选属是番薯属，优选物种是甘薯(L.batatas)。当所述植物是蔷薇科时，优选属是蔷薇属、苹果属、梨属、李属、悬钩子属(Rubus)、茶薦子属(Ribes)、越橘属(Vaccinium)或草莓属植物。优选物种是杂交草莓(FragariaXananassa)。当所述植物是葫芦科植物时，优选是香瓜属、西瓜属(Citrullus)或南瓜属(Cucurbita)植物。优选物种是黄瓜(Cucumissativus)、西瓜(Citrulluslanatus)或西葫芦(Cucurbitaρ印ο)。当所述植物是山茶科时，优选属是山茶属，优选物种是山茶(C.sinensis)。当所述植物是茜草科植物时，优选属是咖啡属，优选物种是小果咖啡(C.arabica)或中果咖啡(C.canephora)。当所述植物是梧桐科时，优选属是可可属(Theobroma)，优选物种是可可树(T.cacao)。当所述植物是柑桔属时，优选物种是甜橙(C.sinensis)、柠檬(C.limon)、桔(C.reticulata)、柚(C.maxima)，和柑桔属物种的杂交品种，等等。在本发明的优选实施方案中，所述植物是大豆、马铃薯或玉米植物。转化或转染包括植物细胞的宿主细胞的适当方法在植物生物生物
技术领域：
内已知。任何方法都可以用于将重组表达载体转化入植物细胞中以获得本发明的转基因植物。转化双子叶植物的一般方法公开于例如美国专利号4，940，838和5，464，763等中。转化具体双子叶植物(例如棉花)的方法在美国专利号5，004，863,5,159，135和5，846，797中列出。大豆转化方法于美国专利号4，992，375,5,416，011,5,569，834,5,824，877和6，384，301中列出，也可以使用EP0301749B1中的方法。转化方法可包括直接和间接转化法。适当的直接法包括聚乙二醇诱导的DNA摄取、脂质体介导的转化(US4，536，475)、用基因枪的生物发射技术(FrommME等人，Bio/technology.8(9):833-9,1990；Gordon-Kamm等人PlantCell2:603，1990)、电穿孔、在含DNA的溶液中孵育干胚的方法和微注入法。在直接转化法的情况下，所用质粒不需要满足任何特殊要求。可以使用简单的质粒，例如PUC系列的质粒、pBR322、M13mp系列和pACYC184等等。如果要从转化的细胞再生完整的植物，优选在质粒中有一个附加的选择性标记基因。直接转化技术对双子叶和单子叶植物都同等适用。还可以通过利用农杆菌(例如EP0116718)的细菌感染、利用病毒载体(EP0067553,US4,407,956,WO95/34668,WO93/03161)的病毒感染来进行转化或借助花粉转化(EP0270356；WO85/01856；US4，684，611)。农杆菌类转化技术(尤其是对于双子叶植物)为本领域公知的技术。农杆菌菌株(例如根癌农杆菌或发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes))包括质粒(Ti或Ri质粒)和用农杆菌感染之后转移入植物的T-DNA元件。该T-DNA(转移DNA)被整合到植物细胞的基因组中。T-DNA可定位在Ri-或Ti-质粒上，或者分开包括在所谓的双元载体中。农杆菌介导的转化方法记载于例如HorschRB等人(1985)Science225:12中。农杆菌介导的转化最适用于双子叶植物，也已经适用于单子叶植物。用农杆菌的转化记载于下列文献中，例如WhiteFF,VectorsforGeneTransferinHigherPlants,TransgenicPlants,第1卷，EngineeringandUtilization,S.D.Kung禾口R.Wu编著，AcademicPress，1993，第15—38页、JenesB等人TechniquesforGeneTransfer,TransgenicPlants,第1卷，EngineeringandUtilization,S.D.Kung禾口R.Wu编著，AcademicPress，1993，第128—143页禾口Potrykus(1991)AnnuRevPlantPhysiolPlantMolecBiol42:205-225中。转化可能会导致瞬时或稳定的转化和表达。虽然本发明的核苷酸序列可以插入到属于这些广泛类别的任何植物和植物细胞中，但是它特别适用于农作物植物细胞。利用植物育种中的已知方法，本发明的转基因植物可以与相似的转基因植物杂交，或与缺少本发明核酸的转基因植物杂交，或与非转基因植物杂交，来产生种子。此外，本发明的转基因植物可包括、和/或与另一种含有一种或多种核酸的转基因植物杂交，从而在该植物和/或其后代中形成转基因的“垛叠”。然后种植种子来得到杂交的能育的含有本发明核酸的转基因植物。该杂交能育的转基因植物可以具有特定的通过母本或通过父本遗传的表达盒。第二代植物可以是近交植物。杂交的能育转基因植物可以是杂交种。本发明还包括任何这些杂交能育转基因植物的种子。本发明种子可从能育转基因植物收获，并用于生长包括含有所述DNA构建体的杂交植物系的本发明转化植物的后代。“基因垛叠”也可以用植物转化通过将两个或多个基因转移入细胞核中来实现。在转化过程中多个基因可以引入细胞核中，无论是依次引入还是一次引入。利用针对多个连锁的部分目的序列的单次转基因，可以通过基因沉默机制特别是RNAi下调植物中或目的病原体物种中的多个基因。在单独启动子控制下的垛叠的多个基因也可以过表达，来得到所需的单个或多个表型。含有既包括过表达基因又包括沉默靶基因的基因垛叠的构建体也可以引入植物中，获得单个或多个农艺学重要表型。在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与任何目的多核苷酸序列的组合垛叠，以形成所需的表型。这些组合可以产生具有多种性状组合的植物，这些性状包括但不限于，疾病抗性、除草剂耐受、产量升高、耐冷和抗旱。这些垛叠组合可以通过包括但不限于常规方法或遗传转化方法杂交育种植物的任何方法形成。如果通过遗传转化法垛叠所述性状，目的多核苷酸可以以任何顺序依次组合或同时组合。例如，如果要引入两个基因，这两个序列可以包含在分别的转化盒中，或在同一个转化盒中。这些序列的表达可以被同一个启动子或不同启动子驱动。根据本实施方案，本发明的转基因植物用包括如下步骤的方法生产提供寄生线虫innexin-样、pas_l、tcp-Ksnurportin-1样、polδS、prs_4、rtp-1或rpn-5革巴基因；制备具有与选择的innexin-样、pas_l、tcp_l、snurportin-1样、polδS、prs_4、rtp-1或rpn-5基因的一部分基本上相同的第一区和与第一区互补的第二区的表达盒；将该表达盒转化入植物中；选择表达本发明dsRNA构建体的经转化植物的子代。对线虫感染的增加的抗性是希望能够遗传至广泛的植物中的一般性状。本发明可用于减少任何植物寄生线虫造成的农作物破坏。优选所述寄生线虫属于诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫科。诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫发现于长针线虫科(Longidoridae)、毛刺线虫科CTrichodoridae)、异皮线虫科(Heteroderidae)、根结线虫科(Meloidogynidae)、短体线虫科(Pratylenchidae)或小垫刃科(Tylenchulidae)中。特别地，发现于异皮线虫科或根结线虫科中。所以，本发明所针对的寄生线虫属于选自下列的一个或多个属NaCCObUS、棘皮线虫属(Cactodera)、长形胞囊线虫属(Dolichodera)、球胞囊线虫属(Globodera)、胞囊线虫属(Heterodera)、斑皮线虫属(Punctodera)、长针线虫属(Longidorus)或根结线虫属(Meloidogyne)。在优选的实施方案中，寄生线虫属于选自下组的一个或多个属NaCCObus、棘皮线虫属、长形胞囊线虫属、球胞囊线虫属、胞囊线虫属、斑皮线虫属或根结线虫属。在更加优选的实施方案中，寄生线虫属于选自下组中的一个或多个属球胞囊线虫属、胞囊线虫属或根结线虫属。在进一步更优选的实施方案中，寄生线虫属于选自球胞囊线虫属或胞囊线虫属中的一个或两个属。在另一个实施方案中，寄生线虫属于根结线虫属。当寄生线虫属于球胞囊线虫属时，其物种优选选自蓍草球胞囊线虫(G.achilleae)、蒿球胞囊线虫(G.artemisiae)、枸杞球胞囊线虫(G.hypolysi)、G.mexicana、欧蓍草球胞囊线虫(G.millefolii)、乔巴特棘皮线虫(G.mali)、马铃薯白线虫(G.pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、烟草球胞囊线虫(G.tabacum)和弗吉亚球胞囊线虫(Globoderavirginiae)0在另一个优选的实施方案中，寄生的球胞囊线虫属线虫包括物种马铃薯白线虫、烟草球胞囊线虫或马铃薯金线虫中的至少一个。当所述寄生线虫属于胞囊线虫属时，所述物种优选选自燕麦胞囊线虫(H.avenae)、胡萝卜胞囊线虫(H.carotae)、鹰嘴豆胞囊线虫(H.ciceri)、十字花科胞囊线虫(H.cruciferae)、龙爪稷胞囊线虫(H.delvii)、褐藻胞囊线虫(H.elachista)、菲氏胞囊线虫(H.filipjevi)、冈比亚胞囊线虫(H.gambiensis)、大豆胞囊线虫(H.Glycines)、豌豆胞囊线虫(H.goettingiana)、荞麦胞囊线虫(H.graduni)、啤酒花胞囊(H.humuli)、大麦胞囊线虫OLhordecalis)、麦类胞囊线虫(H.Iatipons)、燕麦胞囊线虫(H.major)、苜蓿胞囊线虫OLmedicaginis)、水稻同居胞囊线虫(H.oryzicola)、巴基斯坦胞囊线虫(H.pakistanensis)、玫瑰胞囊线虫(H.rosii)、甘蔗胞囊线虫(H.sacchari)、甜菜胞囊线虫(H.schachtii)、蜀黍胞囊线虫(H.sorghi)、三叶草胞囊线虫(H.trifolii)、荨麻胞囊线虫OLurticae)、木豆胞囊线虫(H.vigni)和玉米胞囊线虫(H.zeae)。在另一个实施方案中，寄生胞囊线虫属线虫包括物种大豆胞囊线虫、燕麦胞囊线虫、木豆胞囊线虫(H.cajani)、豌豆胞囊线虫、三叶草胞囊线虫、玉米胞囊线虫或甜菜胞囊线虫中的至少一个。在更优选的实施方案中，寄生线虫包括大豆胞囊线虫或甜菜胞囊线虫的至少一个物种。在最优选的实施方案中，所述寄生线虫是大豆胞囊线虫。当所述寄生线虫是根结线虫属线虫时，所述寄生线虫可选自高粱根结线虫(Macronea)、小果咖啡线虫(Earabica)、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、短尾根结线虫(M.brevicauda)、山茶根结线虫(M.camelIiae)、奇氏根结线虫(M.chitwoodi)、咖啡根结线虫(M.cofeicola)、短小根结线虫(M.esigua)、禾草根结线虫(M.graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫(M.incognita)、印度根结线虫(M.indica)、海滨根结线虫(M.inornata)、爪哇根结线虫(M.javanica)、林氏根结线虫(M.Iini)、苹果根结线虫(M.mali)、小头根结线虫(M.microc印hala)、小突根结线虫(M.microtyla)、纳西根结线虫(M.haasi)、萨拉斯根结线虫(Msalasi)和花生根结线虫(M.thamesi)。在优选的实施方案中，所述寄生线虫包括以下物种至少之一爪哇根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或奇氏根结线虫。下列实施例并不意味着限制本发明要求保护的范围，而意在作为某些实施方案的示例性描述。本领域技术人员所想到的对这些示例性方法的任何改变都应落入本发明的范围内。实施例1鉴别和分离大豆胞囊线虫RNAi靶基因利用分离自SCNJ2阶段的总RNA，使用RT-PCR分离长度约400_500bp的cDNA片段，用于构建实施例2中讨论的二元载体。将PCR产物克隆到TOPOpCR2.1载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并通过测序验证插入物。使用该方法分离所有八个靶基因的基因片段。为了获得大豆胞囊线虫靶基因的全长cDNA，使用基于存在于多种线虫物种中的高保守剪接前导序列(SLl)的RT-PCR方法。使用Superscript—步试剂盒(Invitrogen，Carlsbad,Calif.，货号10928-034)和引物组进行反应。正向引物由22-merSLl序列组成，反向引物是基因特异性的，位于之前克隆的cDNA区域中。将PCR产物克隆到pCR4-T0P0载体(Invitrogen,Carlsbad,Calif)中，并测序。使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，货号L1500-01)扩增3，cDNA末端。使用全RNA和GeneRacerOligodT引物，通过逆转录产生第一链cDNA。用GeneRacer3’引物和基因特异性正向引物实施3’RACEPCR0然后使用GeneRacer3’嵌套式引物和基因特异性正向引物进行嵌套PCR。将PCR产物克隆到pCR4-T0P0anvitrogen，Carlsl3ad，CA)中，并测序。将八种SCN靶基因各自的全长序列组装成各自八种基因靶对应的cDNA，命名为SEQIDN0:1、SEQIDN0:5、SEQIDNO:11、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23,SEQIDNO:39,SEQIDNO57和SEQIDNO:104。为了评估SCN靶在体内是否有效，使用用于八种SCN靶基因的cDNA片段制造二元载体。载体由靶(例如，大豆胞囊线虫tcp-Ι)的反义片段、间隔区片段、靶(例如，大豆胞囊线虫tcp-Ι)的正义片段和载体骨架组成。在该载体中，靶基因的dsRNA在组成型Super启动子(参见US5955，646，通过引用整合到本文中)下表达。用于转化的选择标记是来自拟南芥的突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因，产生对除草剂ARSENAL(Imazapyr，BASFCorporation,FlorhamPark,NJ)的抗性。通过泛素启动子驱动突变AHAS的表达。使用对应SEQIDNO3的基因片段构建二元载体RTP1030。使用对应SEQIDNO7的基因片段构建二元载体RTP1095。使用对应SEQIDNO13的基因片段构建二元载体RSA131。使用对应SEQIDNO:21的基因片段构建二元载体RSA123。使用对应SEQIDN0:25的基因片段构建二元载体RCB987。使用对应SEQIDNO:29的基因片段构建二元载体RTPl169。使用对应SEQIDNO:41的基因片段构建二元载体RSA012。使用对应SEQIDN0:59的基因片段构建二元载体RTPU69。实施例3靶向大豆胞囊线虫靶基因的dsRNA生物测定使用生根的外植体测定证实dsRNA表达和获得的线虫抗性。该测定的细节可见于共同未决申请USSN12/001，234，其内容通过引用整合到本文中。将实施例2中描述的二元载体RTP1030、RCB987、RSA131、RTP1095、RSA123、RSAO12,RTPl169、RTP1269转染到卸甲(disarmed)的毛根农杆菌菌株K599中，使用含有连接幼苗处的近端的大豆子叶作为转化的外植体。根据USSN12/001，234的方法接种和根诱导两至三周后，在外植体的切断端形成了转化的根。从生根的外植体上切出大豆根，传代培养，在传代培养1-5天后，在多孔板中用表面灭菌的SCNJ2幼体(juvenile)接种根，用于目标基因构建体测定。作为对照，使用大豆栽培种Williams82对照载体和Jack对照载体根。在接种线虫4周后，计算各个孔中的孢囊。构建体RTP1030、RCB987、RSA131、RTP1095、RSA123、RSA012、RTP1169和RTP1269的生物测定结果导致在多个品系中具有降低的孢囊计数，显示在所测试的多个品系中孢囊计数降低的普遍趋势。实施例4同源物和DNA序列基序的描述如实施例3公开的，当与组成型启动子有效连接并在大豆根中表达时，构建体RTP1095导致靶向SEQIDNO5的双链RNA分子的表达，并导致降低的孢囊计数。如实施例1中公开，SEQIDNO5描述的假定的全长基因转录序列，含有具有SEQIDNO6公开的氨基酸序列的可读框。使用SEQIDNO:6描述的氨基酸序列鉴别同源基因。鉴别和通过SEQIDNO9和SEQIDNO10描述具有分别与SEQIDNO5和SEQIDNO6同源的DNA和氨基酸序列的样品基因。图2显示了已鉴别的同源物与SEQIDNO:6的氨基酸比对。图13a显示的矩阵表格显示了已鉴别的同源物和SEQIDNO:6相互的氨基酸百分比同一性。图7a-b显示已鉴别的同源物SEQIDNO:9与SEQIDNO:5的DNA序列比对。在图7a_b中，覆盖21个或更多个核苷酸的高同源性比对区域被标记为基序A至基序G。SEQIDNO:72-78描述了对应基序A至基序G的基序序列。图1显示的矩阵表格显示了SEQIDNO:5和已鉴别的同源物SEQIDNO9相互的DNA序列百分比同一性。如实施例3公开的，当与组成型启动子有效连接并在大豆根中表达时，构建体RSA131导致靶向SEQIDNO:11的双链RNA分子的表达，并导致降低的孢囊计数。如实施例1中公开，SEQIDNO:11描述的假定的全长基因转录序列，含有具有SEQIDN0:12公开的氨基酸序列的可读框。使用SEQIDNO:12描述的氨基酸序列鉴别同源基因。鉴别和通过SEQIDNO15-18描述具有分别与SEQIDNO:11和SEQIDNO12同源的DNA和氨基酸序列的植物寄生线虫基因。图3显示了已鉴别的同源物与SEQIDNO:12的氨基酸比对。图13c显示的矩阵表格显示了已鉴别的同源物和SEQIDNO:6相互的氨基酸百分比同一性。图8a-c显示了由SEQIDNO15描述的已鉴别的同源物与SEQIDNO:11的DNA序列比对。在图8a-c中，覆盖21个或更多个核苷酸的高同源性比对区域标记为基序A至基序G。SEQIDNO86-91描述了对应基序A至基序F的基序序列。图13d显示的矩阵表格显示了SEQIDNO11和已鉴别的同源物相互的DNA序列百分比同一性。如实施例3公开的，当与组成型启动子有效连接并在大豆根中表达时，构建体RTPl169导致靶向SEQIDNO27和SEQIDNO:104的双链RNA分子的表达，并导致降低的孢囊计数。SEQIDNO:27描述的序列是部分的DNA序列，不代表相关基因的全长编码序列。该部分的DNA序列的氨基酸序列是由SEQIDNOJ8表示的。由SEQIDN0:27描述的相关基因的假定的全长序列源自使用5，和3，RACE，并由SEQIDNO:104描述。假定的全长序29列的氨基酸序列由SEQIDNO:105描述。由SEQIDNO105描述的氨基酸序列用于鉴别同源基因。鉴别和通过SEQIDNO:31-38描述具有分别与SEQIDNO:104和SEQIDNO:105同源的DNA和氨基酸序列的植物寄生线虫基因。图4显示了已鉴别的SEQIDNO:105同源物的氨基酸比对。图1显示的矩阵表格显示了已鉴别的同源物和SEQIDNO:105相互的氨基酸百分比同一性。图9a-b显示了由已鉴别的同源物与SEQIDNO:104的DNA序列比对。在图9a-b中，覆盖21个或更多个核苷酸的高同源性比对区域标记为基序A至基序D。SEQIDNO:92、93、106和107描述了对应基序A和基序B的基序序列。图13f显示的矩阵表格显示了SEQIDNO:104和已鉴别的同源物相互的DNA序列百分比同一性。如实施例3公开的，当与组成型启动子有效连接并在大豆根中表达时，构建体RSA012导致靶向SEQIDNO:39的双链RNA分子的表达，并导致降低的孢囊计数。如实施例1中公开，SEQIDNO:39描述的假定的全长基因转录序列，含有具有SEQIDNO:40公开的氨基酸序列的可读框。使用SEQIDNO:40描述的氨基酸序列鉴别同源基因。鉴别和通过SEQIDNO43-56描述具有分别与SEQIDNO39和SEQIDNO40同源的DNA和氨基酸序列的植物寄生线虫基因。图如-b显示了已鉴别的同源物与SEQIDNO:40的氨基酸比对。图13g显示的矩阵表格显示了已鉴别的同源物和SEQIDNO:40相互的氨基酸百分比同一性。图lOa-e显示了已鉴别的同源物与SEQIDNO39的DNA序列比对。在图10a_e中，覆盖21个或更多个核苷酸的高同源性比对区域标记为基序A至基序J。SEQIDNO:94-103描述了对应基序A至基序J的基序序列。图1显示的矩阵表格显示了SEQIDNO39和已鉴别的同源物相互的DNA序列百分比同一性。如实施例3公开的，当与组成型启动子有效连接并在大豆根中表达时，构建体RTP1269导致靶向SEQIDNO:57的双链RNA分子的表达，并导致降低的孢囊计数。如实施例1中公开，SEQIDNO:57描述的假定的全长基因转录序列，含有具有SEQIDNO:58公开的氨基酸序列的可读框。使用SEQIDNO:58描述的氨基酸序列鉴别同源基因。鉴别和通过SEQIDNO61-68描述具有分别与SEQIDNO57和SEQIDNO58同源的DNA和氨基酸序列的植物寄生线虫基因。图6a-b显示了已鉴别的同源物与SEQIDNO:58的氨基酸比对。图13i显示的矩阵表格显示了已鉴别的同源物和SEQIDNO:58相互的氨基酸百分比同一性。图lla-b显示了已鉴别的的同源物与SEQIDNO57的DNA序列比对。在图lla_b中，覆盖21个或更多个核苷酸的高同源性比对区域标记为基序A至基序G。SEQIDNO:79-85描述了对应基序A至基序G的基序序列。图13j显示的矩阵表格显示了SEQIDNO57和已鉴别的同源物相互的DNA序列百分比同一性。权利要求1.双链RNA分子，其包括(a)第一链，具有与植物寄生线虫靶基因的19至约400或500个连续核苷酸基本相同的序列，所述靶基因选自寄生线虫的innexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(polSS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫(C.elegans)tCp-l基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫snurportin-1样基因、与秀丽隐杆线虫rpt-Ι基因同源的寄生线虫基因、编码26S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因。2.权利要求1的双链RNA，其中第一链具有与靶基因的19至约400或500个连续核苷酸基本相同的序列，所述靶基因具有选自NO:1、3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、104、29、35、37、39、41、43、45、47、49、51、57、59、61、63、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、106或107的序列，和(b)第二链，具有与第一链基本互补的序列。3.双链RNA分子的库，其包括多种短干扰RNA分子，各包括具有长度为19至M个核苷酸的双链区，其中所述RNA分子源自选自以下的多核苷酸寄生线虫的irmexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(polSS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-1样基因、与秀丽隐杆线虫rpt-Ι基因同源的寄生线虫基因、编码26S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因。4.权利要求3的双链RNA分子的库，其中RNA分子源自选自以下的多核苷酸(a)具有SEQIDNO:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQID而11、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、四、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。5.抗寄生线虫感染的转基因植物，所述植物包括编码dsRNA的核酸构建体，所述dsRNA能够特异性的降低下述基因的表达寄生线虫的innexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(ροδS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-1样基因、与秀丽隐杆线虫rpt-Ι基因同源的寄生线虫基因、编码^S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，或与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因。6.权利要求5的转基因植物，其中dsRNA靶向选自以下的多核苷酸(a)具有SEQIDNO:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQIDNO:11、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO:19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、29、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。7.能够表达dsRNA分子的库的转基因植物，其中各dsRNA分子包括具有长度为19-个核苷酸的双链区，且其中RNA分子源自与选自以下基因的寄生线虫靶基因的一部分基本相同的多核苷酸寄生线虫的innexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(ροδS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-1样基因、与秀丽隐杆线虫rpt_l基因同源的寄生线虫基因、编码^S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因。8.权利要求7的转基因植物，其中dsRNA的库靶向选自以下的多核苷酸(a)具有SEQIDNO:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQID而11、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；⑷具有SEQIDNO19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、四、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。9.产生能够表达与寄生线虫中的靶基因基本相同的dsRNA的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤(a)从寄生线虫的irmexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(ρ01δS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-1样基因、与秀丽隐杆线虫rpt_l基因同源的寄生线虫基因、编码26S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因中选择靶基因；(b)制备核酸序列，所述核酸序列包括与选定的靶基因的一部分基本相同的区域，其中核酸一旦在植物中表达就能够形成双链转录物；(c)用所述核酸转化受体植物；(d)生产所述受体植物的一个或多个转基因后代；和(e)针对线虫抗性选择后代。10.权利要求9的方法，其中dsRNA靶向这样的多核苷酸，所述多核苷酸选自(a)具有SEQIDNO:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQIDNO:11、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、四、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。11.赋予植物线虫抗性的方法，所述方法包括以下步骤(a)从寄生线虫的innexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(polSS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-Ι样基因、与秀丽隐杆线虫rpt-Ι基因同源的寄生线虫基因、编码沈5蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn-5基因同源的寄生线虫基因中选择靶基因；(b)制备核酸序列，所述核酸序列包括与选定的靶基因的一部分基本相同的区域，其中核酸一旦在植物中表达就能够形成双链转录物；(c)用所述核酸转化受体植物；(d)生产所述受体植物的一个或多个转基因后代；和(e)针对线虫抗性选择后代。12.权利要求11的方法，其中靶基因是选自以下的多核苷酸(a)具有SEQIDN0:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDN0:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQIDN0:ll、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、四、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸;(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。13.表达盒，其包括与植物寄生线虫靶基因的一部分基本相同的序列，所述靶基因选自寄生线虫的innexin-样基因、编码聚合酶δ小亚基(ροδS)的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫tcp-Ι基因同源的寄生线虫基因、与秀丽隐杆线虫pas-Ι基因同源的寄生线虫基因、寄生线虫的snurportin-1样基因、与秀丽隐杆线虫rpt_l基因同源的寄生线虫基因、编码26S蛋白酶体调节亚基4(prs-4)的寄生线虫基因，以及与秀丽隐杆线虫rpn_5基因同源的寄生线虫基因。14.权利要求13的表达盒，其中靶基因是这样的多核苷酸，所述多核苷酸选自(a)具有SEQIDNO:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQID而11、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、四、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。全文摘要本发明提供了能够抑制寄生线虫中的关键基因表达的双链RNA组合物和转基因植物，以及与其相关的方法。特别地，发明涉及RNA干扰在抑制靶向关键的线虫基因表达中的用途，所述基因是线虫innexin-样、pas-1、tcp-1、snurportin-1样、polδS、prs-4、rtp-1或rpn-5基因，以及涉及产生具有增加的对寄生线虫抗性的植物。文档编号C12N15/113GK102203260SQ200980115495公开日2011年9月28日申请日期2009年4月29日优先权日2008年4月30日发明者R·佩锋,S·莫蒂卡,T·劳文斯温菲尔德,J·麦克米兰,B·麦克凯格申请人:巴斯夫植物科学有限公司