专利名称：间充质干细胞用于治疗遗传疾病和病症的用途的制作方法
间充质干细胞用于治疗遗传疾病和病症的用途对相关申请的交叉引用本申请要求2008年3月5日提交的美国非临时申请流水号12/042,487的优先权 (通过提及而完整收录其内容)。本申请还涉及2007年1月10日提交的美国专利申请流 水号11/651,878和2006年1月12日提交的美国临时申请流水号60/758,387，通过提及而 完整收录每篇的内容。
背景技术：
间充质干细胞(MSC)是能容易地分化成谱系(包括成骨细胞、肌细胞、软骨 细胞和脂肪细胞)的多能干细胞(Pittenger等，Science,第284卷，第143页(1999)； Haynesworth 等，Bone,第 13 卷，第 69 页(1992) ； Prockop, Science,第 276 卷，第 71 页(1997))。体外研究已经证明了 MSC分化成肌肉(Wakitani等，Muscle Nerve,第18 卷，第 1417 页(1995))、神经元样前体(Woodbury 等，J.Neurosci.Res.,第 69 卷，第 908 页(2002) ； Sanchez-Ramos 等，Exp.Neurol.,第 171 卷，第 109 页(2001))、心肌细胞 (Toma 等，Circulation，第 105 卷，第 93 页(2002) ； Fakuda，Artif.Organs,第 25 卷， 第187页(2001))和可能的其它细胞类型的能力。另外，已经显示了 MSC为造血干细胞 的扩充提供了有效的饲养层(Eaves等，Ann.N.Y.Acad.Sci.,第938卷，第63页(2001)； Wagers 等，GeneTherapv,第 9 卷，第 606 页(2002))。近来用多种动物模型进行的研究已经显示了可用于修复或再生受损伤的骨、软 骨、半月板或心肌组织的MSC (Dekok等，Clin.Oral Implants Res.,第14卷，第481页 (2003)) ； Wu 等，Transplantation,第 75 卷，第 679 页(2003) ； Noel 等，Curr.Opin. Investig.Drugs,第 3 卷，第 1000 页(2002) ； Ballas 等，J.Cell.Biochem.Surpl.,第 38 卷， 第 20 页(2002) ； Mackenzie 等，Blood Cells Mel.Dis.,第 27 卷(2002))。数位研究员 已经将MSC在动物疾病模型中用于移植，获得令人鼓舞的结果，所述动物疾病模型包括 成骨不全(osteogenesis imperfecta) (Pereira 等，Proc.Nat.Acad.Sci.，第 95 卷，第 1142 页 (1998))、帕金森综合征(parkinsonism) (Schwartz 等，Hum.Gene Ther.，第 10 卷，第 2539 页(1999))、脊髓损伤(spinal cord injury) (Chopp 等，Neuroreport,第 11 卷，第 3001 页 (2000) ； Wu 等，Neurosci.Res.,第 72 卷，第 393 页(2003))和心脏病症(Tomita 等， Circulation,第 100 卷，第 247 页(1999) ； Shake 等，Ann.Thorac.Surg.，第 73 卷，第 1919 页(2002))。还已经在成骨不全(Horwitz等，Blood,第 97 卷，第 1227 页(2001) ； Horowitz 等Proc.Nat.Acad.Sci.,第99卷，第8932页(2002))和异源骨髓移植物的增强型移入 (Frassoni 等，Int.Society for Cell Therapy, SA006 (摘要)(2002) ； Koc 等，J.Clm.Oncol.,
第18卷，第307页(2000))的临 床试验中报告了有希望的结果。发明概述本技术一般涉及间充质干细胞。更具体而言，目前所描述的技术涉及间充质干 细胞用于治疗遗传疾病和病症的用途。还要更具体地，本技术涉及间充质干细胞用于治 疗遗传疾病或病症的用途，所述遗传疾病或病症以至少一种组织和/或至少一种器官的炎症表征。在至少 一个方面，本技术提供了 MSC用于用MSC再生(repopulate)宿主组织的
用途。本技术的又一方面提供了 MSC用于改善功能障碍组织功能的用途。还要更具体 地，在本技术的又一方面，提供了间充质干细胞用于改善功能障碍组织功能的用途，所 述功能障碍组织以遗传缺陷和/或炎症或炎性介导物表征。附图简述以下是附图简述，所述附图为了例示本技术而并非为了限制本技术而呈现。
图1-6是全身照射和下列一项后源自大鼠骨髓的间充质干细胞的集落的一系 列显微照片的图示对照处理、外源骨髓细胞和间充质干细胞的骨内投递(intraosseous delivery)、或外源骨髓细胞和间充质干细胞的静脉内投递。图1-3显示了用伊文思蓝染色的细胞的图示。水平线表示扩散紫色染色(diffuse purple staining)，而垂直线表示浓缩的深紫色染色。图4-6显示了经人胎盘碱性磷酸酶(hPAP)染色的细胞的图示。右倾斜对角线表 示扩散亮粉红色染色，而左倾斜对角线表示浓缩的暗粉红色染色。发明详述令人惊讶地，已经发现了在系统施用，诸如通过静脉内或骨内施用时，间充质 干细胞朝向炎性组织迁移并移入炎性组织内。如此，根据本技术的至少一个方面，提供 了一种或多种在动物中治疗遗传疾病或病症的方法，更具体而言，一种治疗以动物的至 少一种炎性组织或器官表征的遗传疾病或病症的方法。在至少一些实施方案中，方法包 括如下步骤，即以在动物中有效治疗所述遗传疾病或病症的量对所述动物(包括人)施用 间充质干细胞。虽然本发明的范围不限于任何理论推理，输注的间充质干细胞(MSC)归巢 至，即移向炎性组织，并移入炎性组织内。已经对数种遗传疾病(包括但不限于例如 多囊性肾病、囊性纤维化病、威尔逊氏病(Wilson，s Disease)、高歇氏病(Gaucher，s Disease)、和亨延顿氏病(Huntington，s Disease))描述了炎性受累。受这些和其它遗传 病症影响的组织或器官内的炎症的存在能促进MSC归巢到炎性组织和/或器官，而且促 进MSC的移入。再次，不想要受限于任何特定的理论，认为MSC的施用可以改正由遗传缺陷引 起的组织和/或器官功能障碍，因为MSC携带野生型拷贝的基因，该基因在所治疗的动 物中是缺陷的。对患者(动物，包括人)施用MSC导致携带野生型基因的细胞移入受疾 病影响的组织和/或器官。移入的MSC能根据局部环境进行分化。分化后，MSC能表 达野生型型式的蛋白质，该蛋白质是缺陷的或者不在周围组织。供体MSC在缺陷组织和 /或器官内的移入和分化可以改正组织和/或器官功能。如本领域技术人员会领会的是，MSC可以进行遗传修饰以含有在所治疗的动物 中有缺陷的基因的野生型拷贝。或者，如果例如供体MSC具有在所治疗的动物中有缺陷 的基因的内源野生型型式，那么可以不需要供体MSC的遗传转导。如此，认为组织和/ 或器官功能的改正源自此类野生型基因的存在。此外，MSC作为野生型基因投递的媒介物的用途可以提供所有基因的正常拷 贝，所述所有基因在突变时导致要治疗的遗传疾病的形成。这被认为是实现的，(1)是否已经鉴定基因缺陷，(2)突变形式的基因促成疾病形成是否已知，或者(3)疾病是否源 自单一遗传突变或遗传突变的组合。正常形式的蛋白质的表达可以改善或改正受到疾病 损害的组织的功能，所述蛋白质在非功能性时促成疾病的形成。一般而 言，要通过本技术的方法治疗的遗传疾病或病症是以至少一种炎性组织 或器官表征的遗传疾病或病症，虽然也可以治疗其它遗传疾病和病症。可以根据目前 所描述的技术治疗的遗传疾病或病症包括但不限于囊性纤维化病、多囊性肾病、威尔逊 氏病、肌萎缩侧索硬化(或ALS或Lou Gehrig氏病)、迪谢内肌营养不良(Ducheraie muscular dystrophy)、贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy)、高歇氏病、中白金 森氏病、阿耳茨海默氏病、亨延顿氏病、夏-马_图三氏综合征(Charcot-Marie-Tooth syndrome)、泽韦格综合征(Zellweger syndrome)、自身免疫性多内分泌腺综合征 (autoimmune polyglandular syndrome) > 马方氏综合征(Marfan，s syndrome)、沃纳综合征 (Werner syndrome)、肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)(或ALD)、门克斯综 合征(Menkes syndrome)、恶性婴儿骨硬化症(malignant infantile osteopetrosis) > 脊髓小脑 性共济失调(spinocerebellar ataxia)、脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)(或 SMA)、 或葡萄糖半乳糖吸收不良。例如，囊性纤维化病(CF)是一种以肺、胰腺和其它器官中分泌细胞的受损功能 性表征的遗传病症。这些细胞的分泌缺陷是囊性纤维化病跨膜传导调节物(CFTR)基因 的功能性拷贝的缺乏引起的。CFTR基因的突变导致肺中出现异常厚的、粘的粘膜，其阻 塞气道，而且导致威胁生命的感染。还有，胰腺中厚的分泌物阻止消化酶达到肠，导致 较差的重量增加等并发症。在一些实施方案中，可以采用根据本文中所描述的本技术的MSC施用来治疗 CF症状，其通过向受疾病影响的组织提供野生型(正常的)CFTR基因来实现。认为系 统投递的MSC向肺的定位是通过循环流的路径和MSC对炎性组织的迁移响应两者实现 的。CF患者通常遭受频繁的肺部铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeraginosa)感染。连续多 轮假单胞菌感染和消退伴有炎症和瘢痕形成(scarring)。CF患者的肺中的炎性标志物包 括TNF-α和MCP-1，即已知促进MSC募集的趋化因子。如此，进一步认为在受累组织内的整合后，MSC根据局部环境进行分化(成 熟)，并开始生成功能上正常的CFTR蛋白。含有活性形式的蛋白质的细胞的存在可以改 善或改正CF组织中观察到的分泌损伤。MSC投递还可以限制CF患者(即动物，包括 人)肺中的纤维化行进和瘢痕扩大。威尔逊氏病是一种铜转运的遗传病症，导致肝、脑、眼和其它位置中的铜积累 和毒性。患有威尔逊氏病的人的肝没有将铜正确地释放入胆汁中。ΑΤΡ7Β基因的缺陷负 责威尔逊氏病的症状。肝中的铜积累导致以炎症和纤维化表征的组织损伤。威尔逊氏病的炎性响应牵 涉TNF-α，即一种已知促进MSC募集到受损伤的组织的趋化因子。因此，认为系统投 递的MSC迁移到威尔逊氏病患者中的炎性肝区域。移入后，MSC分化以形成肝细胞， 并且启动ATP7B基因的正常拷贝的表达和功能性ATP7B蛋白的生成。因此，源自外源 投递的MSC的肝细胞因此可以进行正常的铜转运，由此降低或改善肝中过量的铜积累。 MSC的位置特定成熟也可以降低脑和眼中的铜累积。这些组织中铜积累的降低能减轻通过MSC疗法治疗的患者中威尔逊氏病的症状。肌萎缩侧索硬化(ALS或Lou Gehrig氏病)是一种以脊髓和脑中运动神经元细胞 的进行性变性(其最终导致瘫痪和死亡)表征的神经病学病症，。SODl基因(或ALSl 基因)与家族性ALS的许多病例有关(参见例如Nature，第362卷59-62)。再次不想 要受限于任何具体的理论，认为由SODl编码的酶除去超氧自由基，这通过将它们转化 成无害的物质来实现。SODl作用的缺陷由于过量水平的超氧自由基而导致细胞死亡。 如此，此酶中数个不同突变均导致ALS，使该疾病的准确分子原因难以确定。其它在突 变时促成 ALS 发作的已知基因包括 ALS2 (Nature Genetics, 29 (2) 166-73.)、ALS3 (Am J Hum Genet, 2002 年 1 月；70(1) 251—6.)禾口 ALS4 (Am J Hum Genet.June ； 74(6).)。怀疑有数种目前未鉴定的基因，其促成对ALS的易感性。在非家族性ALS患 者(例如人患者)中特别是这种情况。如此，根据本技术的使用和方法，认为MSC治疗 能向ALS患者提供正常拷贝的这些基因，因为供体MSC可以从健康供体获得，而且导致 ALS形成的突变是罕见的。因此，根据本技术，进一步认为MSC作为野生型基因投递媒介物的用途可以提 供在突变时导致ALS形成的所有基因的正常拷贝。这是正确的，(1)是否已经鉴定出基 因缺陷，(2)突变形式的基因促成ALS形成是否是已知的，和(3)疾病是否源自单一遗传 突变或遗传突变的组合。在非功能性时促成ALS形成的蛋白质的正常形式的表达可以恢 复ALS患者中的肌肉功能。肌肉营养不良(muscular dystrophy)是牵涉随意肌的逐渐损耗，最终影响控制肺 功能的肌肉的疾病。杜兴(Duchenne)和贝克(Becker)肌肉营养不良均由编码蛋白质抗 肌萎缩蛋白的基因中的突变引起。在杜兴氏肌肉营养不良(即更严重的疾病)中，正常 的抗肌萎缩蛋白是缺乏的。在较轻微的贝克氏肌营养不良中，生成一些正常的抗肌萎缩 蛋白，但是以不足的量生成。抗肌萎缩蛋白通过连接内部细胞骨架与质膜来将结构完整性赋予肌肉细胞。缺 乏或具有不足量的抗肌萎缩蛋白的肌细胞也是相对可透过的。细胞外成分可以进入这些 更可透过的细胞，这提高肉压力，直至肌肉细胞破裂并死亡。随后的炎性响应可以添加 损伤。肌肉营养不良中的炎性介导物包括TNF- α (Acta Neuropathol LBerl).，2005年2 月；109(2) 217-25.Epub 2004年11月16日)，即一种已知促成MSC迁移至受损伤的 组织的趋化因子。
如此，认为根据本技术的含有正常的抗肌萎缩蛋白基因的MSC的投递以如下 方式治疗杜兴氏和贝克氏肌肉营养不良的症状。MSC迁移至变性肌肉(degenerative muscle)可以导致根据局部环境的MSC分化，在此情况中以形成肌细胞。认为进行分 化以形成肌肉的MSC会表达正常的抗肌萎缩蛋白，因为这些细胞携带正常的抗肌萎缩蛋 白基因。MSC衍生的肌细胞能与内源肌细胞融合，向多核细胞提供正常的抗肌萎缩蛋 白。表达抗肌萎缩蛋白的MSC与分化中的人成肌细胞的成功融合已经在题目为“Human mesenchymal stem cells ectopically expressing full-length dystrophin can complement Duchenne muscular dystrophy myotubes by cell fusion.，，的文章中报告(Goncalves 等，于 2005 年 12 月1日在Human Molecular Genetics中在线预先发表)。变性肌肉内MSC移入的程度越 大，肌肉组织可以在结构和功能上越类似正常的肌肉。
高歇氏病源自不能生成酶葡糖脑苷脂酶，即一种通常分解称作葡糖脑苷脂的特 定种类的脂肪的蛋白质。在高歇氏病中，葡糖脑苷脂在肝、脾、和骨髓中积累。可以通过投递含有正常拷贝的编码葡糖脑苷脂酶的基因的MSC(例如根据本技 术的方法)来治疗高歇氏病。由葡糖脑苷脂积累引起的组织损伤产生炎性响应，其引起 MSC迁移到受损伤的区域。高歇氏病中的炎性响应牵涉TNF-α，即一种已知将MSC 募集到组织损伤区域的细胞因子(Eur Cytokine Netw., 1999年6月；10(2) 205-10)。 一旦移入受损伤的组织内，MSC便能根据局部环境信号(cue)分化以替换缺乏的细胞类 型。MSC衍生的细胞可以具有在正常情况下分解葡糖脑苷脂的能力，这是由于此类细胞 表达活性葡糖脑苷脂酶的能力。如此，静脉内投递的葡糖脑苷脂酶在减缓高歇氏病行进 或者甚至反转高歇氏病的症状中是有效的(Biochem Biophys Res Commun.，2004年5月28 日；318(2) 381-90.)。不知道野生型MSC是否会生成葡糖脑苷脂酶，其对于生成该酶 的MSC衍生的细胞会是外部可获得的。倘若如此，通过外源衍生的MSC进行的葡糖脑 苷脂酶表达会降低周围组织中的葡糖脑苷脂水平。然而，认为以此方式进行的高歇氏病 的MSC疗法的益处不仅会在于贡献具有分解葡糖脑苷脂能力的细胞，而且还在于如下实 情，即这些细胞也可以向邻近细胞提供葡糖脑苷脂酶，导致降低天然组织中的葡糖脑苷 脂。帕金森氏病(PD)是一种运动系统病症，其源自丧失生成多巴胺的脑细胞。PD 的主要症状是震颤、肢和躯干的僵硬、运动徐缓、和受损的平衡和协调。疾病的典型病 理学特征是许多脑区中包含体(称作Lewy小体)的存在。
一般认为有针对PD的遗传成分，而且多种独特的突变可以导致疾病发作。认 为牵涉帕金森氏病的至少一些病例的一种基因是ASYN，其编码蛋白质α-突触核蛋白。 Lewy小体斑中α -突触核蛋白的积累是帕金森氏病和阿耳茨海默氏病两者的特征。然而，还不清楚α-突触核蛋白积累是帕金森氏病中神经损伤的根本原因还是 神经细胞死亡的结果。如果α-突触核蛋白累积是神经变性的主要原因，那么一种可能 性是负责调节α-突触核蛋白损伤的表达或积累的一种或多种别的蛋白质已经随年龄降 低。因此，认为MSC疗法可以治疗PD的一种机制提供了一种或多种此类调节性蛋白质 的更新来源。不管疾病的遗传基础，认为向PD患者投递根据本技术的MSC可以导致替换生 成多巴胺的细胞。源自神经元细胞死亡的炎症应当引起MSC直接迁移到受影响的脑区。阿耳茨海默氏病导致记忆实情和事件，并且最终导致认识朋友和家人的能力逐 渐丧失。阿耳茨海默氏病患者的脑中的病理学的特征在于形成由淀粉样家族蛋白围绕的 碎裂的脑细胞构成的损伤。认为投递含有早老蛋白-1 (PSI)、早老蛋白_2(PS2)和可能其它(如尚未鉴定 的)基因的正常拷贝的MSC(如依照本技术的)治疗阿耳茨海默氏病的并发症。源自该 疾病特征性的脑细胞片段化的炎症吸引MSC迁移到所述区域中。然后，MSC在位于受 损伤的神经组织内时能分化成神经细胞类型。此外，由MSC表达和分泌的金属蛋白酶降 低阿耳茨海默氏病患者脑中找到的特征性损伤，其通过降解这些斑内的淀粉样蛋白质和 其它蛋白质类型来实现。淀粉样斑的消退可以为MSC和内源干细胞的分化提供机会以形 成神经元。
亨延顿氏病(HD)是一种遗传性、变性神经病学疾病，其导致移动控制降低、智 力才能丧失和情绪紊乱(emotional disturbance)。HD基因(即编码亨廷顿蛋白的基因)的 突变最终导致脑的基底神经节和大脑皮层中的神经变性。HD基因突变如何导致亨延顿氏病目前还不清楚。然而，与神经变性有关的炎症 提供了有助于MSC募集的环境。MSC向这些区域的移入可以导致根据局部环境进行分 化，包括MSC成熟以形成携带正常形式的HD基因的神经元。因此，MSC疗法的一个效果可以是替换对于神经变性丧失的神经元。认为根据本技术的实践的投递方法实现此 类结果和/或后果。促成亨延顿氏病发作和/或行进的因素可以包括控制亨延顿蛋白生成水平的调 节性蛋白质的年龄相关降低。如此，还认为MSC的施用恢复此类调节性成分的可用性。夏-马_图三氏综合征(CMT)的特征在于足、小腿、手、和前臂中肌肉的缓慢 进行性变性和肢、指、和足趾中感觉的轻微丧失。在突变时产生CMT的基因在神经膜细胞和神经元中进行表达。数种不同且独特 的突变或突变组合可以产生CMT的症状。CMT突变的不同遗传样式也是已知的。最常 见的CMT形式之一是IA型。认为IA型CMT中突变的基因编码蛋白质PMP22，其牵 涉用髓磷脂(即一种在神经电导中重要的脂肪鞘)包被外周神经。其它类型的CMT包括 IB型、常染色体隐性、和X连锁的。根据本技术的MSC(例如表达IA型CMT基因、IB型CMT基因和/或其它基 因的正常拷贝)的投递可以恢复外周神经的髓磷脂涂层。变性区域中炎性响应的成分牵 涉生成和分泌MCP-I (单核细胞化学引诱蛋白-1 ； J.NeurosciRes., 2005年9月15日； 81(6) 857-64),即一种已知支持MSC归巢到受损伤的组织的细胞因子。恢复变性组织 的结构和功能性的机制会取决于牵涉促进该疾病的特定突变。在I型糖尿病中，免疫系统攻击β-细胞，即胰腺中生成胰岛素的细胞。某些 基因、基因变体、和等位基因的存在可以提高对该疾病的易感性。例如，在携带人白细 胞抗原(HLA)DQBl和DRBl的某些等位基因的患者中提高对该疾病的易感性。再次认 为投递来自具有I型糖尿病易感性基因的正常拷贝的供体的根据本技术的MSC可以恢复 身体制备和使用胰岛素的能力。不管疾病的遗传基础，向I型糖尿病投递MSC可以导 致替换功能障碍的生成胰岛素的细胞。I型糖尿病患者的胰腺中存在的炎性标志物包括 TNF-α ,即一种已知吸引MSC的趋化因子。因此，通过本技术系统施用的MSC可以归 巢到I型糖尿病中的炎性胰腺组织区域。移入后，MSC能分化成生成胰岛素的细胞。另 夕卜，MSC移入可以保护生成胰岛素的β-细胞不受免疫系统的检测和破坏。β-细胞数 目的恢复可以减轻或降低I型糖尿病的严重性。可以通过施用根据本技术的实践的MSC治疗的其它遗传疾病在下文列出。多囊件肾病ιΗ常形式的PKDl基因的投递可以抑制囊肿形成。泽韦格综合征通过MSC投递正常拷贝的PXRI基因可以改正过氧化物酶体功 能，赋予正常的细胞脂质代谢和代谢氧化。自身免疫性多内分泌腺综合征可以通过投递表达IH常拷贝的ARE(自身免疫 性调节物)基因的MSC和/或再生疾病行进过程中破坏的腺组织来治疗疾病。马方氏综合征投递表达IH常形式的FBNl基因的MSC可以导致微纤维蛋白的生成。微纤维蛋白的存在可以将正常的结构完整性赋予结缔组织。沃纳综 合征投递表汰IH常形式的WRN基因的MSC可以为组织周转提供不过 早变老的细胞来源。肾上腺脑白质营养不良(ALD)=投递表汰ιΗ常形式的ALD基因的MSC可以导 致脑中正确的神经元髓鞘生成和/或可以导致肾上腺的受损伤区域的再生。门克斯综合征投递表汰X染色体上尚未鉴定的基因的正常拷贝的MSC可以减 轻疾病症状，所述MSC具有吸收铜的能力。恶件婴儿骨硬化症.例如，MSC可以携带在突变时促成恶性婴儿骨硬化症发作 的基因的正常拷贝。这些基因包括氯化物通道7基因(CLCN7)、骨硬化症相关跨膜蛋白 (OSTMl)基因、和T细胞免疫调节物(TCIRGl)基因。MSC投递可以通过提供MSC来 改正成骨细胞/破骨细胞比率，所述MSC可以充当成骨细胞前体和/或控制破骨细胞分 化的其它细胞类型的前体。脊髓小脑件共济失调投递表汰ιΗ常形式的SCAl基因的MSC提供能进行分化 以形成新神经元的细胞，所述新神经元以合适的水平生成共济失调蛋白-1蛋白(SCA1基 因的产物)以替换神经变性损失的宿主神经元。也有可能的是，MSC移入可以提供调节 共济失调蛋白-1蛋白表达的蛋白质。脊髓件肌萎缩投递表汰ιΗ常拷贝的SMA基因的MSC可以提供如下的细胞, 其能进行分化以形成新的运动神经元来替换在疾病行进过程中已经死亡的神经元。葡萄糖半乳糖吸收不良投递表达ιΗ常拷贝的SGLTl基因的MSC可以改正穿过 肠膜的葡萄糖和半乳糖转运。本领域技术人员会领会的是，MSC可以进行遗传修饰以含有野生型拷贝的基 因。例如，MSC可以进行遗传修饰以含有基因或其部分、其组合、衍生物、或备选，诸 如例如CFTR基因、ATP7B基因、SODl基因、编码蛋白质抗肌萎缩蛋白的基因、编码蛋 白质葡糖脑苷脂酶的基因、ASYN基因、HD基因、编码蛋白质PMP22的基因、PKDl基 因、PXRI基因、ARE基因、FBNl基因、WRN基因、ALD基因、CLCN7基因、OSTMl 基因、TCIRGl基因、SCAl基因、SMA基因、或SGLTl基因。如本领域技术人员会进 一步领会的是，MSC可以进行遗传修饰以含有一种或多种外源基因。可以通过本领域中 公知的方法和技术(包括转染和转化)来实现此类遗传修饰。然而，要理解的是，本文中所描述和要求保护的本技术的范围不限于任何特定 遗传疾病或病症的治疗。相反，本领域技术和熟练人员应当领会，可以在MSC的投递中 以多种不同方式利用本技术。如此，根据本技术的至少一个方面，提供了一种或多种用间充质干细胞再生宿 主组织(人的或动物的)的方法。该方法包括下列步骤，即降低宿主中的内源间充质干 细胞群体，并以用间充质干细胞有效再生宿主组织的量对宿主施用分离的外源间充质干 细胞。如此，再生的组织可以包含外源MSC和内源MSC的混合物。或者，再生的组织 可以基本上没有内源MSC。根据目前描述的技术的另一个方面，提供了一种或多种用于改善动物(例如人) 中的功能障碍组织的功能的方法。该方法包括下列步骤，即以有效改善功能障碍组织的 功能的量对动物施用间充质干细胞。可以系统地诸如通过静脉内或骨内投递或者直接向功能障碍组织施用间充质干细胞。功能障碍组织可以以遗传缺陷和/或炎症和炎性介导 物(包括那些促进MSC迁移到受损伤的组织的)表征。根据本技术的进一步的方面，提供了用于在动物(例如人)中改善功能障碍组织 的功能的药物组合物。药物组合物包含有效改善功能障碍组织的功能的量的间充质干细 胞。功能障碍组织可以以遗传缺陷和/或炎症和炎性介导物(包括那些促进MSC迁移到 受损伤的组织的)表征。在关于此方面的至少一个实施方案中，对其施用间充质干细胞的动物是哺乳动 物。哺乳动物可以是灵长类，包括人和非人灵长类。此外，本技术的间充质干细胞(MSC)疗法、方法、组合物一般基于例如下列顺 序在进行或不进行生化操作的情况中收获含有MSC的组织、分离并扩充MSC、并对动 物施用MSC。 根据本技术的实践施用的间充质干细胞可以是同质的组合物或者可以是MSC中 富集的混合细胞群体。可以通过培养粘附的髓细胞或骨膜细胞来获得同质的间充质干细 胞组合物，并可以通过用独特的单克隆抗体鉴定的特定的细胞表面标志物来鉴定间充质 干细胞。一种用于获得间充质干细胞中富集的细胞群体的方法记载于例如美国专利号 5,486,359。备选的间充质干细胞来源包括但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、 骨、软骨膜、肝、肾、肺和胎盘。可以通过多种方法来施用本技术的实施中利用的间充质干细胞。例如，可以系 统地诸如通过静脉内、动脉内、腹膜内、或骨内施用来施用间充质干细胞。也可以通过 向受疾病影响的组织和器官直接注射来投递MSC。在一个实施方案中，静脉内施用间充 质干细胞。如此，本领域技术和熟练人员会领会，可以以适合于MSC投递和与基于MSC 的疗法一起使用的多种方式施用目前描述的技术。另外，本领域技术和熟练人员还会领 会，本技术可以在治疗形态、系统、或方案中利用，其中MSC是期望的形态、系统、或 方案的成分或方面或部分。另外，间充质干细胞可以来自一系列来源，包括异基因的、自体的、和异种 的。例如，在本技术的一个实施方案中，在施用供体间充质干细胞前，降低宿主间 充质干细胞群体，这提高供体MSC持续性。可以通过本领域技术人员已知的多种手段 (包括但不限于部分或完全身体照射和/或化学消融或非消融方法)之任一种来降低宿主 间充质干细胞群体。先前已经显示了此方法提高MSC迁移到骨髓。不希望受限于任何 特定的理论，认为此方法为根据本技术实践的供体MSC移入(组织整合)提供了开放的 适当位置(niche)。在另一个非限制性实施方案中，通过本领域技术人员已知的多种手段(包括但 不限于那些在上文所引用的手段)之任一种来降低宿主间充质干细胞群体。然后可以通 过施用供体MSC来再生宿主组织。施用供体MSC后，宿主组织MSC群体可以包含大 于50%的供体或外源衍生的细胞。或者，宿主组织MSC群体可以包含大于80%的供体 或外源衍生的细胞。或者，基本上所有的再生宿主组织MSC可以是供体起源的或者外源 衍生的。施用根据本技术的异基因供体MSC后，宿主组织MSC群体可以是宿主衍生的MSC和供体衍生的MSC的混合物。或者，宿主组织MSC群体可以基本上没有宿主衍生 的或内源的MSC。在一个非限制性实施方案中，对宿主进行部分或完全身体照射，之后施用供体 MSC0可以以单剂或者以多剂施用照射。例如在一些实施方案中，以总量为约8戈瑞 (Gy)至约12戈瑞(Gy)施用照射。在备选的实施方案中，以总量为约IOGy至约12Gy 施用照射。要施用的照射量和所施用的剂量数目取决于多种因素，包括施用时患者的年 龄、重量、和性别、和患者的一般健康。在其它非限制性实施方案中，在通过部分或完全身体照射和/或化学消融 (chemoablative)或非消融方法来降低宿主MSC群体时，与MSC—起施用造血干细胞以重 建宿主的造血系统。造血干细胞可以源自多种来源，包括但不限于骨髓、脐带血、或外 周血。要施用的造血干细胞量取决于多种因素，包括患者的年龄、重量、和性别、给予 患者的照射和/或化学消融或非消融处理、患者的一般健康、和造血干细胞的来源。在更进一步的实施方案中，供体MSC对于宿主而言可以是异基因的。供体MSC 与宿主可以是人白细胞抗原(HLA)匹配的或不匹配的(mismatched)。供体MSC与宿主 可以是部分HLA不匹配的。例如，供体和宿主可以是非相同的同胞。不希望受限于任何 特定的理论，认为异基因供体MSC (包括与宿主部分HLA不匹配的供体MSC)在某些情 况下可以提高供体MSC的移入率和持续性，其中对患者共施用供体造血干细胞和MSC。 造血干细胞的共施用对于用于降低患者的内源MSC群体的方法后重建血液和免疫系统可 以是必要的，如上文所描述的。对在捐赠的MSC和捐赠的造血干细胞上具有基本上相异 的表型的患者施用彼此具有相同或基本上相似的免疫表型的MSC和造血干细胞可以促进 供体MSC的移入和持续性。例如，供体MSC和供体造血干细胞两者均可以获自接收者的HLA匹配同胞。或 者，供体MSC和供体造血干细胞获自两个捐赠个体，他们彼此具有基本上相似的免疫表 型，但是相对于患者具有基本上相异的免疫表型。在任一种情况中，自捐赠的造血干细 胞衍生的重建的免疫系统不应与捐赠的MSC起反应(降低捐赠的MSC的数量)，或者对 降低捐赠的MSC的数量应当具有有限的影响。在这些条件下，捐赠的MSC可以比宿主 MSC具有存活优势，由此在所治疗的患者中提高供体衍生的MSC比宿主MSC的比率。在本技术的至少一个实施方案中，骨髓细胞(包括造血干细胞)是患者自体的。 在别的实施方案中，以每kg体重IxlO7个细胞至约IxlO8个细胞的量施用自体骨髓细胞
在其它实施方案中，骨髓细胞(包括造血干细胞)对于患者而言是异基因的。供 体骨髓细胞与宿主可以是HLA匹配的或HLA不匹配的。供体骨髓细胞与宿主可以是部 分HLA不匹配的。例如，供体和宿主可以是非相同的同胞。在一个别的实施方案中， 以每kg体重约IxlO8个细胞至约3xl08个细胞的量施用异基因的骨髓细胞。另外，以在动物(例如人)中有效治疗遗传疾病或病症的量施用根据本技术利用 的间充质干细胞。在至少一个实施方案中，以每千克(kg)体重约0.5xl06个MSC至每 kg体重约IOxlO6个MSC的量施用间充质干细胞。在又一些实施方案中，以每kg体重约 SxlO6个MSC的量施用间充质干细胞。在进一步的实施方案中，以每kg体重约IxlO6个 MSC至每kg体重约5xl06个MSC的量施用间充质干细胞。在更进一步的实施方案中， 以每kg体重约&106个MSC的量施用间充质干细胞。或者，也可以对重约35kg或更多的个体以每次输注200xl06个MSC的平坦剂量施用间充质干细胞，对重小于约35kg但重 约IOkg或更多的个体50xl06个，和对小于约IOkg但重约3kg或更多的个体20xl06个。此外，可以施用间充质干细胞一次，或者可以以约3天至约7天的定期时间间隔 施用间充质干细胞两次或更多次，或者可以长期地，即动物(例如人)的整个一生期间以 约1个月至约12个月的定期时间间隔施用间充质干细胞。要施用的间充质干细胞量和施 用频率取决于许多因素，包括患者(动物，包括人)的年龄、重量、和性别、要治疗的遗 传疾病或病症、和其程度和严重性。根据本技术的另一方面，提供了用于在动物(例如人)中治疗遗传疾病或病症的药物组合物。药物组合物包含在动物中有效治疗遗传疾病或病症的量的间充质干细胞。 遗传疾病或病症可以以动物的至少一个炎性组织或器官表征。关于本技术的此方面，可以与可接受药物载体联合施用间充质干细胞。例如， 间充质干细胞可以以供注射用的药学可接受液体介质中的细胞悬浮液施用。在至少一个 实施方案中，药学可接受液体介质是盐水溶液。盐水溶液可以含有别的材料诸如二甲基 亚砜(DMSO)和人血清清蛋白。目前所描述的技术及其优点现在通过参阅下列实施例会更好地理解。提供这些 实施例来描述本技术的具体实施方案。通过提供这些具体的实施例，申请人并不以任何 方式意图限制本技术的范围和精神。本领域技术人员会理解和领会，目前所描述的技 术的全部范围包括由本说明书所附权利要求书所限定的主题、及那些权利要求的任何改 变、修饰或等同方案。
实施例实施例1 :用于治疗囊性纤维化病的间充质干细胞向患者进行供体MSC投递前，可以通过使用全身照射和/或化学消融或非消融 方法来降低宿主MSC群体，从而实现升高的供体MSC持续性。此方法为供体MSC移 入(组织整合)提供了开放的适当位置，而且先前已经显示了提高MSC迁移到骨髓。在 MSC输注外，还会需要骨髓细胞或造血干细胞的投递来重建患者的造血系统，其可以通 过用于降低患者骨髓中宿主MSC数目的方法来破坏。可以通过静脉内输注或直接注射到骨髓腔中(骨内注射)来投递MSC。虽然静 脉内MSC投递对于接收者骨髓内的成功MSC整合可以为足够的，但是骨内注射可以增强 MSC移入持续性。再次不想要受限于任何具体的理论，认为快速的供体MSC移入应当 增加如下的可能性，即外源衍生的群体会在宿主MSC降低方法后保留的任何天然的MSC 扩充前良好地建立。使用照射后骨髓移植的大鼠模型来测试如下假设，即与骨髓移植同时发生的静 脉内(IV)或骨内(IO)MSC投递会导致消融方法后的移入。还设计方案来获得两种MSC 投递方法的相对成功的初步比较测量。在第O天，用2个5.0戈瑞(Gy)部分照射12只雄性Lewis大鼠。将照射部分 以4小时分开。在第二天，从另外的8-10只雄性Fisher大鼠制备骨髓细胞(BMC)。对 于注射，使用总体积150ul中总共30xl06个BMC和IxlO6个MSC。方法中使用的MSC 携带供以后检测用的遗传标志物人胎盘碱性磷酸酶ChPAP)。下文表1中显示了此研究的实验设计。表1.研究设计。通过实验组的分配。
权利要求
1.一种用外源间充质干细胞再生宿主组织的方法，包括下列步骤降低宿主组织的内源间充质干细胞群体；并以用间充质干细胞有效再生所述宿主组 织的量施用分离的外源间充质干细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述宿主组织是骨髓。
3.权利要求2的方法，其中所述内源间充质干细胞群体是骨髓间充质干细胞群体。
4.权利要求1的方法，进一步包括对所述宿主施用外源骨髓细胞的步骤。
5.权利要求4的方法，其中所述骨髓细胞是异基因的(allogeneic)。
6.权利要求5的方法，其中所述骨髓细胞是HLA匹配的。
7.权利要求5的方法，其中所述骨髓细胞是部分HLA不匹配的。
8.权利要求4的方法，其中所述骨髓细胞是自体的。
9.权利要求1的方法，其中所述再生的组织包含外源间充质干细胞和内源间充质干细胞。
10.权利要求1的方法，其中所述再生的宿主组织基本上没有内源间充质干细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述外源间充质干细胞是异基因的。
12.权利要求11的方法，其中所述外源间充质干细胞是HLA匹配的或部分HLA不匹 配的。
13.权利要求1的方法，其中所述外源间充质干细胞是自体的。
14.权利要求1的方法，其中所述外源间充质干细胞已经进行过遗传修饰。
15.权利要求14的方法，其中所述外源间充质干细胞已经进行过遗传修饰以含有选自 下组的基因CFTR基因、ATP7B基因、SODl基因、编码蛋白质抗肌萎缩蛋白的基因、 编码蛋白质葡糖脑苷脂酶的基因、ASYN基因、HD基因、编码蛋白质PMP22的基因、 PKDl基因、PXRI基因、ARE基因、FBNl基因、WRN基因、ALD基因、CLCN7基 因、OSTMl基因、TCIRGl基因、SCAl基因、SMA基因、禾Π SGLTl基因。
16.一种改善功能障碍组织的功能的方法，包括以有效改善所述功能障碍组织的功能 的量施用分离的异基因间充质干细胞的步骤。
17.权利要求16的方法，其中所述功能障碍组织以遗传缺陷表征。
18.权利要求16的方法，其中所述功能障碍组织以炎症表征。
19.权利要求16的方法，其中通过静脉内施用来施用所述异基因间充质干细胞。
20.权利要求16的方法，其中通过骨内施用来施用所述异基因间充质干细胞。
21.权利要求16的方法，其中以每千克体重约0.5χ106个细胞至每千克体重约IOxlO6 个细胞的量施用所述异基因间充质干细胞。
22.权利要求16的方法，其中以每千克体重约IxlO6个细胞至每千克体重约5χ106个 细胞的量施用所述异基因间充质干细胞。
23.权利要求16的方法，其中以每千克体重约2χ106个细胞的量施用所述异基因间充 质干细胞。
24.一种用于在动物中治疗一种或多种遗传疾病或病症的药物组合物，其包含在所述 动物中有效治疗所述一种或多种遗传疾病或病症的量的间充质干细胞。
25.权利要求24的药物组合物，其中所述遗传疾病或病症以所述动物的至少一种炎性 组织或器官表征。
26.权利要求24的药物组合物，其中所述间充质干细胞是异基因的。
27.权利要求26的药物组合物，其中所述间充质干细胞是HLA匹配的或部分HLA不 匹配的。
28.权利要求24的药物组合物，其中所述间充质干细胞是自体的。
29.权利要求24的药物组合物，其中所述间充质干细胞已经进行过遗传修饰。
30.权利要求29的方法，其中所述外源间充质干细胞已经进行过遗传修饰以含有选自 下组的基因CFTR基因、ATP7B基因、SODl基因、编码蛋白质抗肌萎缩蛋白的基因、 编码蛋白质葡糖脑苷脂酶的基因、ASYN基因、HD基因、编码蛋白质PMP22的基因、 PKDl基因、PXRI基因、ARE基因、FBNl基因、WRN基因、ALD基因、CLCN7基 因、OSTMl基因、TCIRGl基因、SCAl基因、SMA基因、禾Π SGLTl基因。
31.权利要求24的药物组合物，其进一步包含骨髓细胞。
32.一种用于改善功能障碍组织的功能的药物组合物，其包含有效改善所述功能障碍 组织的功能的量的分离的异基因间充质干细胞。
33.权利要求32的药物组合物，其中所述功能障碍组织以遗传缺陷表征。
34.权利要求33的药物组合物，其中所述功能障碍组织以炎性介导物的表达或生成表征。
35.权利要求34的药物组合物，其中所述间充质干细胞是异基因的。
36.权利要求35的方法，其中所述异源间充质干细胞是HLA匹配的或部分HLA不匹 配的。
37.权利要求34的药物组合物，其中所述间充质干细胞是自体的。
38.权利要求34的药物组合物，其中所述间充质干细胞已经进行过遗传修饰。
39.权利要求38的方法，其中所述外源间充质干细胞已经进行过遗传修饰以含有选自 下组的基因CFTR基因、ΑΤΡ7Β基因、SODl基因、编码蛋白质抗肌萎缩蛋白的基因、 编码蛋白质葡糖脑苷脂酶的基因、ASYN基因、HD基因、编码蛋白质ΡΜΡ22的基因、 PKDl基因、PXRI基因、ARE基因、FBNl基因、WRN基因、ALD基因、CLCN7基 因、OSTMl基因、TCIRGl基因、SCAl基因、SMA基因、禾Π SGLTl基因。
40.权利要求34的药物组合物，其进一步包含骨髓细胞。
全文摘要
一种在动物中治疗遗传疾病或病症(诸如例如囊性纤维化病、威尔逊氏病、肌萎缩侧索硬化、或多囊性肾病)的方法，包括以在动物中有效治疗所述遗传疾病或病症的量对所述动物施用间充质干细胞。
文档编号C12N5/0775GK102014936SQ200980115533
公开日2011年4月13日 申请日期2009年3月4日 优先权日2008年3月5日
发明者查尔斯·R·米尔斯, 蒂莫西·R·瓦尼, 阿拉·丹尼尔科维奇 申请人:奥西里斯治疗公司