专利名称：在甜菜和甘蔗的农业生产中增加蔗糖产量的方法
在甜菜和甘蔗的农业生产中增加蔗糖产量的方法本发明涉及能够降低植物细胞中转化酶酶活性的核酸的用途，以及增加甜菜和甘蔗的农业栽培中蔗糖产量的方法。甜菜是两年生植物。营养生长(vegetative growth)发生在发育的第一年，其中植物发育出莲座叶，并形成初生根、甜菜体(beet body)。在第二年，生殖生长期(generative phase)，形成花序和种子。甜菜生产的特殊生理特征是蔗糖的积聚和储存主要发生在第一个生长年(vegetation year) 0因此为了生产蔗糖，在发育的营养生长阶段收获甜菜。就甜菜体的生长以及蔗糖产量而言，数十年来在甜菜培育方面的努力已取得令人瞩目的成功。尽管如此，这些改善仍未令人满意，尽管如今甜菜体的蔗糖浓度已达到甜菜鲜重的 15-20% ο从EP 0956357B1已知用于产生转基因植物(具有降低了的储存相关蔗糖损失) 的核酸的用途，所述核酸编码能够降低转化酶酶活性的多肽。这篇文献没有提供如下的提示，即借助转化酶抑制剂以增加植物的蔗糖储存器官中蔗糖浓度的可能性。此外，EP 13460MB1公开了植物液泡转化酶的抑制。这篇文献也仅仅描述了改善了的植物储存稳定性而没有蔗糖浓度的增加。因此本发明的目的是进一步增加植物的蔗糖储存器官中的蔗糖浓度。本发明的目的特别是提供用于甜菜和甘蔗的农业栽培的方法，利用该方法可以增加蔗糖产量。根据本发明，对该问题的解决在于使用能够降低植物细胞中转化酶酶活性的核酸以形成植物的蔗糖储存器官，其中与类似发育阶段中相同基因型的未改变的对照蔗糖储存器官的蔗糖浓度相比，蔗糖浓度增加。然而到目前为止，蔗糖浓度和甜菜体产量还是负相关的，S卩，具有较高蔗糖浓度的品种所提供的甜菜体产量比具有较低蔗糖浓度的品种低。其原因在于，具有高蔗糖浓度的甜菜形成更小的甜菜体。Milford在1973年已经尝试解释甜菜中蔗糖浓度与甜菜体产量的负相关。之后建立了甜菜重量与薄壁组织储存细胞的大小之间的联系。大的薄壁组织细胞相应地显示出比小的薄壁组织细胞更低的蔗糖浓度。在新品种中蔗糖浓度与甜菜体产量仍然是负相关的，尽管不像之前描述的那样紧密相关(Campbell and Kern 1983，Hoffmann and Marlander 2002) 因此栽培法的进展还只是导致蔗糖浓度和甜菜产量之间负相关性的改化，而并没有导致这种关系的根本性改变(
图1)。上述甜菜中蔗糖浓度和蔗糖储存器官产量之间的负相关对于甘蔗而言原则上也是适用的。出人意料地，现在发现通过根据本发明的核酸(其可用于在植物细胞中降低转化酶的酶活性)的使用，也可以导致降低或消除蔗糖浓度与蔗糖储存器官产量(甜菜体产量或甘蔗秆产量)之间的负相关。具体来说，本发明核酸的使用可通过蔗糖浓度X个百分点的提高而导致蔗糖储存器官产量的降低，其中蔗糖储存器官产量的降低总计最高达5X%。
根据本发明的一个具体实施方案，通过对可用于在植物细胞中降低转化酶酶活性的核酸的使用，从而使蔗糖储存器官产量不改变变或增加。因此，蔗糖浓度的增加例如2个百分点，就蔗糖储存器官产量的降低来说，导致最高10%的降低。然而，通常蔗糖浓度的增加也还导致蔗糖储存器官产量的增加，这样蔗糖储存器官的蔗糖浓度与蔗糖储存器官产量就不是负相关的。就甜菜而言，蔗糖浓度表示甜菜鲜重中蔗糖的量，即百分比。对于“甜菜体产量”应理解为无土的(erdfrei)、最好是经去头的(gekSpft)甜菜的鲜重。以甜菜体产量乘以蔗糖浓度，即得到蔗糖产量。同样对于甜菜的例子，基于下文给出的实例计算来说明本发明的优点。特别适宜用作降低转化酶的酶活性的核酸是编码转化酶抑制剂的核酸。转化酶抑制剂最早描述是在马铃薯中Gchwimmer et al. 1961)。已知其来自甜菜、番茄和烟草 (Pressey 1968，Pressey 1994，Weil et al. 1994，Rausch and Greiner 2004)。但是，尽管转化酶抑制剂是本领域已知的，迄今为止没有预料到通过此多肽可以增加甜菜体的蔗糖浓度。特别是，仍不知道通过其还可以使蔗糖浓度和蔗糖储存器官产量之间的负相关产生变化。另一方面，各种转化酶抑制剂的可用性也为这种新用途提供了良好基础。因此，可以容易地鉴定出或者获得编码能够降低转化酶酶活性的多肽的核酸并用于甜菜和甘蔗，亦即通过育种的方式以及遗传工程的方法。另一种降低转化酶的酶活性的可能性也通过以下方式实现，即不是通过抑制性多肽来降低转化酶酶活性，而是例如借助反义RNA或RNA干扰。这两种方法现在都是公知的标准技术。就反义RNA来说，使用与转化酶的mRNA互补的单链RNA。随后通过互补RNAs的配对而达到对mRNA翻译的抑制，从而阻止细胞中转化酶的基因表达。对于RNA干扰，相反使用的是cDNA片段的反向重复，其在转录后形成双链RNA分子，该分子被植物自身的酶切割成长度为约21到23个核苷酸的片段，其导致转化酶mRNA翻译的阻断。来自甜菜的转化酶也是已知的(Rosenkranz et al,2001,Gonzales et al，2005)， 或者可以基于已知的转化酶(Sturm and Chrispeels, 1990 ；Sturm, 1999)而毫无困难的从甜菜和甘蔗中分离，从而可以容易地产生相应的反义RNA或RNA干扰构建体。使用公知的植物转化方法，可以容易地将这类构建体转移到植物中并在该处表达。根据本发明另一个优选的实施方案，其中所使用的核酸是源自烟草(Mcotiana tabacum)的异源核酸。术语“异源”表示所述核酸对于宿主细胞而言具有另外的来源或者至少处于非天然状态。如果用源自外源生物体的核酸转化宿主细胞，则所述核酸序列对携带该携带核酸序列的宿主细胞及宿主细胞的后代而言是异源的。出人意料的，通过转基因的途径，也只有在从种子长出的原代转化体的转基因后代的甜菜体中才检测到增加的蔗糖浓度。与非转基因对照相比，甜菜重量没有改变，从而也引起了蔗糖产量的增加。在不定根(即，从原代转化体直接形成的甜菜体样结构)中，没有测出蔗糖浓度的变化。根据本发明另一个优选的实施方案，异源核酸是SEQ ID NO :1的序列，或者是能够与SEQ ID NO 1的序列或其部分的互补的序列杂交的核酸序列。
如本文使用的术语“杂交”是指在通常条件下杂交，如Sambrook et al. (1989) 所述的，优选在严格条件下进行。严格杂交条件例如是在65°C 4XSSC中杂交，然后在 650C 0. IXSSC中重复洗涤总共约1小时。低严格杂交条件例如是在37°C 4X SSC中杂交， 然后在室温下IXSSC中重复洗涤。“严格杂交条件”还可以表示在68°C于0. 25M磷酸钠， pH 7. 2,7% SDS, ImM EDTA 禾口 1% BSA 中杂交 16 小时，然后用 2X SSC 禾口 0. 1% SDS 在 68°C 洗涤两次。核酸编码的多肽(转化酶抑制剂)在转化至甜菜或甘蔗细胞完成后，优选位于液泡中，胞浆中或细胞壁中。在本发明另一个实施方案中，核酸是同源核酸。本文中术语“同源”表示核酸来源于和宿主细胞相同的天然来源。术语“同源”还表示被导入其所源自的相同的天然原始细胞类型的核酸序列，但是，受到例如非天然存在于该细胞类型中或该组合中的另一调控元件的控制。其中，调控元件序列是涉及到支持核苷酸序列的表达。它们包括例如启动子和终止子序列。因此，可以例如用来自相同类型生物体的核酸转化宿主细胞，以实现例如这些核酸的过表达。另一方面，可以通过已知的育种措施来增加核酸在细胞中的表达，或者确保其所编码多肽的活性在细胞中被增强。例如，可以分析来自甜菜和甘蔗的转化酶抑制剂的基因位点的等位基因变异，然后在育种中采用最佳等位基因来继续运作。其可以基于，就甜菜来说，根据SEQ ID N0:2的转化酶抑制剂BvC/VIFl(i3-果糖苷酶的甜菜(Beta vulgaris)细胞壁或液泡抑制剂)的序列，以及可以与SEQ ID NO :2所示序列或其部分的互补序列杂交的核酸序列。等位基因变异的分析以下述方式进行首先，通过比较测序(comparative sequencing)，鉴定存在于现有等位基因群中转化酶抑制剂的基因位点。然后通过总是具有相同遗传背景的重复的回交(back-crossing)保存不同的等位基因。针对转化酶抑制剂的表达对获得的近等基因系进行分析。通过Northern Blot技术或RT-PCR进行分析。还可以通过测量转化酶的酶活性间接比较转化酶抑制剂不同等位基因的有效性。在田间试验中培养近等基因甜菜系。收获后，测定甜菜产量和蔗糖浓度。这允许比较等位基因与目标特征-蔗糖产量的关系。就蔗糖产量来说具有最佳效果的等位基因被杂交入现有的育种材料，用于品种开发。本发明还涉及一种在甜菜和甘蔗的农业栽培中增加蔗糖产量的方法。本文中，所使用的甜菜或甘蔗植物的遗传组成用于降低转化酶的酶活性。甜菜或甘蔗植物的遗传组成可以通过遗传工程的方法或常规植物育种方法实现。 在这方面，可以参照上述核酸新用途的可能性。本发明方法的优选实施方案提供了遗传改造使得蔗糖储存器官可以形成，且其中蔗糖浓度不是与蔗糖储存器官产量负相关的。下列计算说明，以甜菜为例，新方法如何对蔗糖总产量起作用。标准甜菜类型的蔗糖产量是，就60t/ha的甜菜产量和17%的甜菜蔗糖浓度来说， 总共10. 2t/ha。但是利用本发明的方法可以实现18%或更高的蔗糖浓度。对于相同的甜菜产量，浓度增加就是600kg蔗糖每公顷的蔗糖产量增加。因为此前蔗糖浓度与甜菜产量的负相关，到目前为止蔗糖浓度的增加，例如从17%到18%，导致甜菜产量超比例的降低，这样的话蔗糖浓度的增加只有非常有限的应用。下面通过附图和优选的实施方案进一步说明本发明。图1显示根据Hoffmann 2006，甜菜品种的甜菜产量和蔗糖浓度的育种进展。根据图示，只在相对较低的甜菜体产量下实现高蔗糖浓度。高的甜菜体产量伴随相对较低的蔗糖浓度。通过育种进展，回归线的倾斜实际上进一步减少，但甜菜体产量与蔗糖浓度的关系在新品种中仍然是负的。图2显示载体，其中来自烟草的转化酶(SEQ ID NO 1)被掺入(pBINAR-NtVIF)。图3显示与非转基因对照C(n = 40)相比，转基因系T(n = 25)的相对蔗糖含量。 所有植物在温室的试管内培育，并在种子栽培204天后收获。转基因系(蔗糖含量高
与非转基因对照有显著差别。图4显示图3的甜菜植株体的相对重量。在这种情况下转基因系甜菜体的重量与对照甜菜的重量没有不同。因此，与非转基因对照相比，转基因系具有更高的蔗糖含量，并且在甜菜重量方面没有显著变化。在这种情况下蔗糖含量与根产量的负相关被打破。使用异源核酸的实施例在限制性酶切位点BamHI (1194)和)(baI (2031)处，将挑选的编码烟草转化酶抑制剂的长度为81 Ibp的cDNA (SEQ ID NO 1)整合入载体pBINAR以获得质粒pBINAR-NtVIF。根据Lindsey等(1991)实现甜菜的转化。通过PCR确认植物的转基因。再生后， 转化体在温室培养和受精以产生种子。通过所选转基因系和非转基因对照的自体受精获得的种子在3月上旬播种或栽种，在3月中旬分离新芽。在温室试管内(19\100側)，约161的温度、61(1皿光强和18小时的光照期下进行培养。试管包含FE 340型盆栽土(Fruhsdorfer)，种子堆肥LAT Terra P8和5g Triabon。每周用Kamaso 1 3_4%。给植物受精，并进行抗霉菌和蚜虫处理。培养204 天后，收获甜菜，修剪，清洗，称重并用单个甜菜研磨机进行加工。浆液在-20°C直接冷冻。蔗糖测定在室温下搅拌5分钟，用177ml提取液(3g硫酸铝溶于IOOOml超纯水)提取26g 甜菜浆液。将混合物通过MOmm圆形滤纸进行过滤，然后用超纯水进行1 10稀释。将约1. 5ml稀释滤液转移到玻璃小瓶中用于HPLC分析。在Merck Lichrocart 250-3柱 (Lichrospher 100 NH2 (5 微米)Cat. No. 1. 50834)上，按照 70% 乙腈(ν/ν 乙腈 70，水 30) 的流动相和0. 8ml/min的流速，在装备RI检测器的Agilent Technologies的P1100 HPLC 系统中分析10 μ 1稀释滤液。HPLC测定值给出单位为μ g/ml的蔗糖，再考虑稀释系数转变为相对于甜菜鲜重的％蔗糖。为了外部校准，使用IOOmg蔗糖/ml水，500mg蔗糖/ml水和 5000mg蔗糖/水的标准溶液。参考文献Campbell, L. G. , and Core, J. J. (1983).Relationship among components of yield and quality of sugarbeets. J. Am. Soc. Sugar Beet Technol. 22,135-145.Gonzales, M. -C. , Roitsch,Τ. , Cejudo, F. (2005). Circadian and developmental regulation of vacuolar invertase expression in petioles of sugar beet plants. Planta 222(2)386-395Hoffmann,C. ,(2006). Sugar beet as raw material—the technical quality asa prerequisite for efficient processing. ISBN 978-3-93033-87-5.Hoffmann，C.，and Maerlaender, B.，(2002). Genetic progress in yield and quality of sugar beet. Zuck Erind. 127,425-429.Lindsey, K.，Gallois，P.，Eady, C.，(1991). Regeneration and transformation of sugar beet by Agrobacterium tumefaciens. Plant Tissue Culture Manual B7 :1-13, Kluwer Academic Publisher.Milford, G. F. J. , (1973). The growth and development of the storage root of sugar beet. Ann. Appl. Biol 75，427-438.Pressey，R.，(1968). Invertase inhibitor from red beet，sugar beet and sweet potato roots.Plant Physiol· ，43，1430—1434·Pressey，R.，(1994). Invertase inhibitor in tomato fruit. Phytochemistry, 36,543-546.Rausch T.，Greiner, S.，(2004). Plant protein inhibitors of invertases. Biochimica et Biophysica Acta，1696，253—261.Rosenkranz, H.，Vogel, Μ.，Greiner, S.，Rausch，Τ.，(2001). In wounded sugar beet(Beta vulgaris L.)tap-root, hexose accumulation correlates with the induction of a vacuolar invertase isoform. J Exp Bot，52 (365)，2381-· 2385thSambrook, J. , Fritsch, E. F.，and Maniatis, T.，(1989). In Molecular Cloning， A Laboratrory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).Schwimmer, S.，Makower, R. U.，Rorem，Ε. S.，(1961). Invertase and invertase inhibitor in potato. Plant Physiol.，36，313-316.Sturm，A.，(1999). Invertase. Primary structures，functions，and roles in plant development and sucrose partitioning. Plant Physiology 121,1-7.Sturm，A.，Chrispeels，M. J.，(1990). cDNA cloning of carrot extracellular beta-fructosidase and expression is in response to wounding and bacterial infection. Plant Cell 2，1107_1119thWei 1,M.，Kraus Grill，S. ,SchusteriA. ,RauschiT.，(1994). A 17-kDa Nicotiana tabacum cell-wall peptide acts as in—vitro inhibitor of the cell-wall isoform of acid Invertase. Planta,193,438-445.
权利要求
1.在植物细胞中适于降低转化酶酶活性的核酸在用于形成植物的蔗糖储存器官中的用途，其中蔗糖浓度与处于类似发育阶段相同基因型的未改变对照蔗糖储存器官的蔗糖浓度相比是增加的。
2.权利要求1的用途，其中蔗糖浓度增加X个百分点导致降低的蔗糖储存器官产量，且蔗糖储存器官产量的降低总计最高达5X%。
3.权利要求1的用途，其中所述蔗糖储存器官产量是未变的或增加的。
4.权利要求1的用途，特征在于其中所述蔗糖储存器官的蔗糖浓度不是与蔗糖储存器官产量负相关的。
5.权利要求1的用途，特征在于其中所述核酸是同源或异源核酸。
6.权利要求5的用途，特征在于其中所述异源核酸是编码能够降低转化酶酶活性的多肽的核酸，且其优选来自于烟草(Nicotiana tabacum)。
7.权利要求5或6的用途，特征在于其中所述核酸序列是SEQID N0:1的序列，或者是能够与SEQ ID NO 1的序列或其部分的互补序列杂交的核酸序列。
8.权利要求1-7之一的用途，特征在于其中所述蔗糖储存器官是甜菜体或甘蔗秆。
9.权利要求6的用途，特征在于其中所述多肽位于甜菜或甘蔗细胞的液泡中、胞浆中或细胞壁中。
10.甜菜和甘蔗的农业栽培方法，其中使用了甜菜或甘蔗植物，所述甜菜或甘蔗植物的遗传组成用于降低转化酶的酶活性。
11.权利要求10的方法，特征在于其中所述遗传组成使得蔗糖储存器官能够形成，其中蔗糖浓度与处于类似发育阶段相同基因型的未改变的对照蔗糖储存器官的蔗糖浓度相比是增加的。
12.权利要求11的方法，其中蔗糖浓度增加X个百分点导致降低的蔗糖储存器官产量， 且蔗糖储存器官产量的降低总计最高达5X%。
13.权利要求11的方法，其中所述蔗糖储存器官产量是未变的或增加的。
14.权利要求10-12之一的方法，特征在于其中所述遗传组成使得蔗糖储存器官能够形成，其中蔗糖浓度不是与蔗糖储存器官产量负相关的。
15.权利要求10-14之一的方法，特征在于其中转化酶酶活性的降低是通过同源或异源核酸实现。
16.权利要求15的方法，特征在于其中所述异源核酸是编码能够降低转化酶酶活性的多肽的核酸，且其优选来自于烟草。
17.权利要求15或16的方法，特征在于其中所述核酸是SEQID NO :1的序列，或是能够与SEQ ID NO 1的序列或其部分的互补序列杂交的核酸序列。
18.权利要求15的方法，特征在于其中所述核酸是SEQID NO :2的序列，或着是能够与SEQ ID NO :2的序列或其部分的互补序列杂交的核酸序列。
全文摘要
适于降低转化酶的酶活性的核酸用于形成植物的蔗糖储存器官的用途，其中蔗糖浓度相对于处于类似发育阶段的相同基因型的未改变对照蔗糖储存器官的蔗糖浓度是增加的。蔗糖浓度增加X个百分点从而产生改变或未变的蔗糖储存器官产量，其中，就蔗糖储存器官产量的降低来说，降低总计最高达5X％。本发明进一步涉及在甜菜或甘蔗植物的农业生产中增加蔗糖产量的方法，其中所使用的甜菜或甘蔗植物的遗传组成用于降低转化酶的酶活性。
文档编号C12N15/82GK102232112SQ200980147981
公开日2011年11月2日 申请日期2009年12月18日 优先权日2008年12月22日
发明者B·舒尔茨, K·哈姆斯 申请人:Kws种子股份有限公司