流感疫苗的生产的制作方法

专利名称：流感疫苗的生产的制作方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及用于生产对抗流感病毒的改进疫苗的材料和方法。本发明提供了表达来自于单一病毒株例如甲型流感病毒H5m毒株的血凝素和神经氨酸酶、并且还具有来自于流感病毒株的所有内部基因的重排病毒(reassortant virus)。设想了对血凝素基因进行突变，使其与野生型毒株中的血凝素基因相比表现出降低的致病力。
背景技术：
高效的疫苗生产需要从宿主系统以高产量产生大量病毒的生长。不同类型的病毒需要不同生长条件以获得可接受的产量。因此，在其中生长病毒的宿主是极为重要的。取决于病毒类型，病毒可以生长在原代组织培养细胞、已建立的细胞系或含胚卵例如来自鸡的含胚卵中。某些用作病毒宿主系统的哺乳动物细胞系以高产量生产病毒，但是这些细胞的致瘤性质引起法规上限制它们用于疫苗生产。事实上，世界卫生组织(WHO)的适用准则表明， 只有几种细胞系被允许用于病毒疫苗生产。存在三种一般类型的流感病毒——甲型、乙型和丙型，由它们的内部蛋白之间缺乏血清学交叉反应性所定义。甲型流感病毒根据其糖蛋白——血凝素(HA)和神经氨酸酶 (NA)蛋白的抗原性差异进一步分成亚型。人类对每种甲型、乙型和丙型流感病毒的感染所引起的疾病易感。当前，人类中流感感染的最重要病因可归因于乙型流感以及甲型流感的Hmi和 H3N2亚型。因此，乙型流感以及甲型流感的Hmi和H3N2亚型的抗原通常被掺入到目前的季节性流感疫苗中。当前可用的疫苗具有75-90%的保护率。然而，可能引起大流行的感染的流感毒株是例如H5W亚型的毒株，其不受典型流感疫苗的防范。H2、H7和H9亚型也具有大流行的潜力。参见例如 Koopmans 等，Lancet 363 :587-93,2004 ;Jos印h 等，Md Med. 6 30-2，2005 ;Cameron 等，virology 278 :36-41，2000 ；以及 Huber 等，Pediatri Infect Dis 27(10Suppl) :S113-17，2008。最近，活的减毒流感病毒疫苗已在美国批准使用。许多当前的疫苗用于季节性流感感染，并含有甲型流感的两种组分Hmi和H3N2以及乙型流感的组分。在过去几年中，由于流感蛋白的抗原性漂移和突变，至少一种组分每年发生变化。从受感染的患者获取人类流感病毒的临床分离株，并使用实验室改造的高生长供体病毒主毒株A/ PuertoRico/8/34(HlNl)流感毒株在鸡胚卵中进行重排(美国专利7，037，707)。重排的目的是通过将来自原代临床分离株的至少HA或NA基因与主毒株供体病毒的6个内部基因进行重组，来实现候选疫苗毒株产量的增加。这种策略提供了具有与临床分离株类似的抗原决定簇的高生长重排体(Wood，J. Μ.和Williams，Μ. S.，《流感教科书》(Textbook of Influenza), Blackwell Science Ltd,Oxford,1998；Robertson 等，Biologicals,20 :213,1992)。通过将这种重排的病毒株在含胚卵中生长，然后通过化学手段将纯化的病毒失活， 来制备疫苗。高致病性禽流感病毒能够在鸟类中引起严重呼吸系统疾病和死亡。该特点已知只属于H5和H7亚型的HA。因为某些禽类病毒传播给人类的能力，它们也变成了人类健康隐患。禽流感病毒的致病性具有多基因性质，但是已经显示HA蛋白在感染中发挥主要作用。 病毒感染性的先决条件是将HA蛋白前体(HAO)切割成HAl和HA2亚基。这种切割释放出负责病毒与内体膜的融合的肽。低致病性病毒表达的表面HA分子只被呼吸或胃肠道细胞分泌的胰蛋白酶样蛋白酶所活化(Perdue等，Virus Res 49 :173_86，1997)。高致病性病毒的切割位点发生改变的方式是使其能够被不同细胞的蛋白酶切开，特别是被绝大多数细胞中存在的遍在性弗林蛋白酶切开(Steinhauer D.，Virology 258 :1-20,1999 ；Swayne D.， Vet Pathol 34,557-67,1997).所有高致病性毒株总是在切割位点处含有多个碱性残基 (例如R和K) (Perdue等，同上)。因此，病毒能够在几乎任何器官中快速扩散和复制，并引起全身性感染。已经通过反向遗传学生产了减毒的H5m重排病毒(RG，I^alese等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93 11354-58，1996)，其中使用了来自H5m毒株的HA和NA基因，并将这些基因插入到包含来自于致病性较低的病毒的其余内部流感病毒基因的“骨架”病毒中。常用的骨架源自于Hmi亚型的原型毒株A/Puerto Rico/8/34 (A/PR/8/34)，其高度适应于在卵中生长，并且只有两种表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)源自于H5W病毒。这些重排病毒被设计用于在卵中生产疫苗，但是本技术领域中已知的现有反向遗传学重排体在卵中和细胞培养物中生长不良。例如，Suguitan等(PLoS Medicine 3 1541-54，2006) 描述了使用冷适应Ann ArboHca AA)骨架产生了具有来自H5m毒株A/Hong Kong/^213和 A/Vietnam/1203/2004的HA和NA基因的病毒。这些病毒被证实在体内减毒，即在鸡中不致死，并且在用野生型H5W病毒重新激惹的小鼠中还表现出一定的保护效应。Shengqiang 等(J Infectious Dis 179 :1132-8,1999)也使用大流行的香港(Hong Kong)毒株的 HA 禾口 NA基因和Arm Arbor毒株的内部基因产生了重组病毒。然而，这些病毒在卵中的生长未达到最好。同样，Ming 等，Chin. J.Biotech. (2006)22 :720-7 特别描述了包含来自 H9N2 病毒株的内部基因以及来自H5m毒株的修饰的HA基因和来自H2N3的NA基因的重排病毒。 Shi等，Vaccine (2007) 25 :7379-7384特别描述了具有来自于H9N2毒株的内部基因和来自于H5m毒株的修饰的HA和野生型NA基因的重排病毒。Hickman等(J. Gen. Virol. 89 2682-2690, 2008)特别描述了包含用来自于HlNl、H5N1和H7N2毒株的HA和/或NA基因援救的来自于H9N2毒株的骨架基因的疫苗。最近的研究尝试了产生在哺乳动物细胞培养物中生长的疫苗，以避免在卵中生长病毒时所通常观察到的问题，例如保持和维护卵设施的成本、从卵蛋白纯化病毒以及对残留卵蛋白的过敏。其中美国专利6，146，873和7，132，271讨论了能够生产疫苗级病毒的培养细胞系的开发。也参见Kistner等(Vaccine 16 =960-8,1998)，其公开了适合于提高病毒生长的VERO细胞并描述了疫苗生产，以及Ehrlich等(New Eng J Med 35 =2573-84,2008), 其特别描述了用甲醛溶液失活的在Vero细胞中生长的H5W完整病毒疫苗。因此，在本技术领域中仍需要生产与现有疫苗相比抗原性增加的大流行或季节性流感疫苗，其能够在宿主中引发良好的免疫应答，不引起感染，并在哺乳动物细胞培养物中表现出强健的生长。发明概述本发明提供了针对流感病毒的改进疫苗的生产，其中疫苗包含重排病毒，所述重排病毒具有来自于相同的病毒性甲型流感亚型或乙型流感毒株的血凝素基因和神经氨酸酶基因以及来自于不同甲型流感亚型或乙型流感毒株的内部基因。在一种情况下，HA和NA 基因以及内部基因源自于甲型流感的高致病性H5W毒株。一方面，本发明提供了重排流感病毒，其包含来自于第一种甲型流感病毒亚型的内部基因区段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及来自于内部基因所来源的流感病毒亚型的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，内部基因源自于甲型流感亚型的第一种毒株，HA和NA 基因源自于甲型流感亚型的第二种毒株。此外，设想了 NS基因包含NS1、NS2、或NSl和NS2 基因。在一个实施方案中，本发明设想了纯化的重排流感病毒，其包含甲型流感H5m毒株的内部基因区段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及来自于甲型流感病毒H5W的血凝素(HA) 和神经氨酸酶(NA)基因，HA和NA基因源自于相同病毒株。在相关实施方案中，HA和NA基因来自于第一个H5W进化枝(clade)，内部基因来自于第二个H5W进化枝。在另一个实施方案中，HA和NA基因以及内部基因源于同一个进化枝。此外还设想了 NS基因包含NS1、 NS2、或NSl禾口 NS2基因。在另一个实施方案中，本发明设想了重排流感病毒，其包含来自于第一种乙型流感病毒株的内部基因区段PB1、PB2、PA、M、NP和NS以及来自于第二种乙型流感毒株的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，其中病毒的特征为在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。在又一个实施方案中，重排病毒的HA基因被修饰以产生减毒病毒。在一个实施方案中，HA基因在多碱性氨基酸切割位点(polybasic cleavage site)处被修饰。在另一个实施方案中，HA基因中多碱性氨基酸切割位点处的修饰是RERRRKKR(SEQ ID NO 13) — TETR(SEQ ID NO :14)的突变。在另一个实施方案中，病毒的特征是在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。在又一个实施方案中，哺乳动物细胞选自MRC-5、MRC-9、Lederle 130、张氏(Chang)肝细胞和 WI-38 ;U937、Vero、CV-l、IMR-90 和 IMR-91、MDCK、MDBK、HEK、H9、CEM 禾口 CD4 表达型 HUT78、 PerC6、BHK-21细胞、BSC和LLC-MK2。在相关实施方案中，哺乳动物细胞培养物是Vero细胞培养物。在某些实施方案中，甲型流感亚型包含Hl至H16与附至N9的任何组合，包括 HlNl、H2N1、H3N1、H4N1、H5N1、H6N1、H7N1、H8N1、H9N1、HlONl、HlINl、H12N1、H13N1、H14N1、 Hl 5N1、H16N1 ;H1N2、H2N2、H3N2、H4N2、H5N2、H6N2、H7N2、H8N2、H9N2、H10N2、Hl 1N2、Hl 2N2、 Hl3N2、H14N2、Hl5N2、H16N2 ;H1N3、H2N3、H3N3、H4N3、H5N3、H6N3、H7N3、H8N3、H9N3、H10N3、 H11N3、H12N3、H13N3、H14N3、H15N3、H16N3 ;H1N4、H2N4、H3N4、H4N4、H5N4、H6N4、H7N4、H8N4、 H9N4、H10N4、H11N4、H12N4、H13N4、H14N4、H15N4、H16N4 ；H1N5、H2N5、H3N5、H4N5、H5N5、H6N5、 H7N5、H8N5、H9N5、H10N5、H11N5、H12N5、H13N5、H14N5、H15N5、H16N5 ；H1N6、H2N6、H3N6、 H4N6、H5N6、H6N6、H7N6、H8N6、H9N6、H10N6、H11N6、H12N6、H13N6、H14N6、H15N6、H16N6 ； H1N7、H2N7、H3N7、H4N7、H5N7、H6N7、H7N7、H8N7、H9N7、H10N7、Hl 1N7、Hl 2N7、Hl 3N7、H14N7、Hl5N7、H16N7 ;H1N8、H2N8、H3N8、H4N8、H5N8、H6N8、H7N8、H8N8、H9N8、H10N8、Hl 1N8、Hl2N8、 Hl3N8、H14N8、Hl5N8、H16N8 ;H1N9、H2N9、H3N9、H4N9、H5N9、H6N9、H7N9、H8N9、H9N9、H10N9、 H11N9、H12N9、H13N9、H14N9、H15N9和H16N9。在某些实施方案中，甲型流感亚型是H5m。在一个实施方案中，重排病毒的内部基因源自于本技术领域已知并在下面的详细说明书中进一步详细描述的H5m病毒。在相关实施方案中，所述内部基因源自于选自下列的 H5m 毒株A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05 和 A/Cambodia/R0405050/2007、 A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-样、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004, A/duck/Singapore/3/97, A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。在具体实施方案中，内部基因来自于A/Vietnam/1203/2004。在另一个实施方案中，重排病毒的HA和NA基因源自于本技术领域已知并在下面进一步详细描述的H5m病毒。在又一个实施方案中，所述HA和NA基因源自于选自下列的 H5m 毒株A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05 和 A/Cambodia/R0405050/2007、 A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-样、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004,A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。在某些实施方案中，内部基因与HA和NA基因源自于相同病毒株。在其他实施方案中，内部基因与HA和NA基因源自于不同病毒株。在实施方案中，HA和NA基因来自于H5m毒株A/Vietnam/1203/2004。在另一个实施方案中，HA和NA基因来自于H5m毒株A/Indonesia/5/05o另一方面，本发明提供了抗原性重排流感病毒组合物，其包含来自于第一种甲型流感病毒亚型的内部基因区段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及来自于内部基因所来源的流感病毒亚型的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，内部基因源自于甲型流感亚型的第一种毒株，HA和NA基因源自于甲型流感亚型的第二种毒株。还设想了 NS基因包含NS1、NS2、 或NSl禾口 NS2基因。在一个实施方案中，抗原性重排甲型流感病毒组合物包含源自于甲型流感H5W 毒株的内部基因区段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及源自于甲型流感病毒H5W的血凝素 (HA)和神经氨酸酶(NA)基因，HA和NA基因源自于相同病毒株。还设想了 NS基因包含NS1、 NS2、或NSl禾口 NS2基因。在又一个实施方案中，本发明提供了抗原性重排流感病毒组合物，其包含来自于第一种乙型流感病毒株的内部基因区段PB1、PB2、PA、NP、M和NS以及来自于第二种乙型流感毒株的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，其中病毒的特征是在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。在一个实施方案中，组合物的HA基因被修饰以产生减毒的病毒。在相关实施方案中，HA基因在多碱性氨基酸切割位点处被修饰。在又一个实施方案中，流感病毒的特征是在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。在一个实施方案中，抗原性组合物的内部基因源自于本技术领域已知并在下面进一步详细描述的H5m病毒。在相关实施方案中，所述内部基因源自于选自下列的 H5N1 毒株A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/ chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96 样、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004, A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。在具体实施方案中，内部基因来自于A/Vietnam/1203/2004。在另一个实施方案中，抗原性组合物的HA和NA基因源自于本技术领域已知并在下面进一步详细描述的H5m病毒。在又一个实施方案中，所述HA和NA基因源自于选自下列的 H5m 毒株A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05 和 A/Cambodia/R0405050/2007、 A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96 样、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004,A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。在某些实施方案中，抗原性组合物的内部基因与HA和NA基因源自于相同病毒株。 在其他实施方案中，内部基因与HA和NA基因源自于不同病毒株。在实施方案中，抗原性组合物的HA和NA基因来自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。在另一个实施方案中，HA和NA基因来自于H5m毒株A/ Indonesia/5/05。在又一个实施方案中，HA基因中多碱性氨基酸切割位点处的修饰是RERRRKKR (SEQ ID NO 13) — TETR(SEQ ID NO 14)的突变。在另一个实施方案中，抗原性组合物还包含可药用载体。—方面，本发明设想了包含重排流感病毒的疫苗，所述病毒包含i)编码表面蛋白HA的多核苷酸和编码表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每个都源自于甲型流感病毒亚型的第一种毒株；编码PBl的多核苷酸，编码PA的多核苷酸，编码PB2的多核苷酸，编码M 的多核苷酸，编码NS (NSl和/或NS2)的多核苷酸，编码NP的多核苷酸，PB1、PB2、PA、NP、 M和NS的多核苷酸源自于甲型流感病毒亚型的第二种毒株，其中所述多核苷酸可操作地连接，以允许重排的多核苷酸包装在病毒粒子中。
在相关实施方案中，本发明提供了包含重排甲型流感病毒的疫苗，所述病毒包含 编码表面蛋白HA的多核苷酸和编码表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每个都源自于流感病毒H5W ；编码PBl的多核苷酸，编码PA的多核苷酸，编码PB2的多核苷酸，编码M的多核苷酸，编码NSl (NSl和/或NS2)的多核苷酸，编码NP的多核苷酸，PB1、PA、PB2、M、NP和NS 的多核苷酸源自于流感病毒H5W，多核苷酸可操作地连接，以允许重排的多核苷酸包装在病毒粒子中。在相关实施方案中，本发明设想了包含重排流感病毒的疫苗，所述病毒包含编码表面蛋白HA的多核苷酸和编码表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每个都源自于乙型流感病毒的第一种毒株；编码PBl的多核苷酸，编码PA的多核苷酸，编码PB2的多核苷酸，编码 M的多核苷酸，编码NP的多核苷酸，编码NS的多核苷酸，PB1、PA、PB2、M、NP和NS的多核苷酸源自于乙型流感病毒的第二种毒株，其中多核苷酸可操作地连接，以允许重排的多核苷酸包装在病毒粒子中，并且其中病毒的特征是在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。在一个实施方案中，组合物的HA基因被修饰以产生减毒病毒。在相关实施方案中，HA基因在多碱性氨基酸切割位点处被修饰。在一个实施方案中，疫苗中的内部基因源自于本技术领域中已知并在下面进一步详细描述的H5m病毒。在相关实施方案中，所述内部基因源自于H5m毒株A/ Vietnam/1203/2004。在另一个实施方案中，疫苗中的HA和NA基因源自于本技术领域中已知并在下面进一步详细描述的H5m病毒。在又一个实施方案中，所述HA和NA基因源自于选自下列的 H5m 毒株A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05 和 A/Cambodia/R0405050/2007、 A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96 样、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004, A/duck/Singapore/3/97, A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。在某些实施方案中，疫苗中的内部基因与HA和NA基因源自于相同病毒株。在其他实施方案中，内部基因与HA和NA基因源自于不同病毒株。在一个实施方案中，疫苗中的HA和NA基因来自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。在另一个实施方案中，HA和NA基因来自于H5m毒株A/ Indonesia/5/05。在又一个实施方案中，HA基因中多碱性氨基酸切割位点处的修饰是RERRRKKR (SEQ ID NO 13) — TETR(SEQ ID NO 14)的突变。在另一个实施方案中，疫苗还包含佐剂。示例性佐剂包括但不限于皂角苷、非离子型去污剂、植物油、无机凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢诺尼克 (Pluronic)多元醇、聚阴离子、肽类、油或烃类乳液、匙孔血蓝蛋白以及潜在有用的人类佐剂例如N-乙酰-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N_乙酰-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1' -2' -二棕榈酰基-s-n-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺、BCG(卡介苗)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、ISC0M、纳米珠、鲨烯和嵌段共聚物，它们被设想单独或组合使用。在又一个实施方案中，疫苗是失活的疫苗。设想了使用本技术领域已知的方法和试剂进行灭活，包括但不限于甲醛、UV辐射、戊二醛、二元乙烯亚胺(BEI)和β-丙内酯。还设想了疫苗作为活的减毒病毒疫苗给药。在一个实施方案中，疫苗包含的HA含量为Iyg至75 μ g HA。在另一个实施方案中，疫苗包含的HA含量为每份疫苗1 μ g至30 μ g。在相关实施方案中，给药的疫苗剂量为 1μ g、3y g、5y g、7. 5μ g、10y g、12. 5μ g、15y g、20y g、25y g、30y g HA，或者根据需要是直至100 μ g HA的任何量。因此，单次疫苗剂量包括具有约1 μ g、约2 μ g、约3 μ g、约 4μ g、@ 5μ g、@ 6μ g、@ 7 μ g> ^ 8 μ g> ^ 9 μ g> ^ 10μ g、@ 11 μ g、@ 12μ g、@ 13μ g、 约 14μ g、约 15μ g、约 16μ g、约 17μ g、约 18μ g、约 19μ g、约 20μ g、约 21μ g、约 22 μ g、 约 23μ g、约 Μμ g、约 25μ g、约 30μ g、约!35μ g、约 40μ g、约 45μ g、约 50μ g、约 55μ g、约 60μ g、约 65μ g、约 70μ g、约 75μ g、约 80μ g、约 85μ g、约 90μ g、约 95μ g、约 100 μ g 和超过100μ g血凝素的剂量，其以相同或不同的血凝素量在单剂或多剂中提供。另一方面，本发明提供了用于在对象中引发针对至少一种大流行的流感病毒株的免疫应答的方法，所述方法包含给药本文中所述的病毒、抗原性组合物或疫苗，其量能够有效保护对象抵抗至少一种H5m流感病毒株的感染。在相关方面，本发明设想了用于在对象中引发针对至少一种季节性流感病毒株的免疫应答的方法，所述方法包含给药本文中所述的病毒、抗原性组合物或疫苗，其量能够有效保护对象抵抗至少一种甲型流感病毒和/或乙型流感病毒株的感染。另一方面，本发明设想了防止对象被H5m流感病毒感染的方法，所述方法包含向对象给药有效量的本文中所述的病毒、抗原性组合物或疫苗。另一方面，本发明设想了用于防止对象被甲型流感病毒或乙型流感病毒感染的方法，所述方法包含向对象给药有效量的本文中所述的病毒、抗原性组合物或疫苗。在一个实施方案中，可用于本发明的方法的疫苗包含的HA含量为Iyg至75 μ g HA。在另一个实施方案中，疫苗包含的HA含量为每剂疫苗Iyg至30yg。在相关实施方案中，给药的疫苗剂量为 1 μ g>3 μ g,5 μ g,7. 5 μ gUO μ gU2. 5 μ g,15 μ g,20 μ g,25 μ g, 30 μ g ΗΑ，或者根据需要是直至IOOyg HA的任何量。因此，单次疫苗剂量包括具有约1 μ g、 ^ 2μ 3μ g、@ 4μ g、@ 5μ g、@ 6μ g、@ 7 μ g> ^ 8 μ g> ^ 9 μ g> ^ 10μ g、@ 11 μ g、 约 12μ g、约 13μ g、约 14μ g、约 15μ g、约 16μ g、约 17μ g、约 18μ g、约 19μ g、约 20 μ g、 约 21μ g、约 22μ g、约 23μ g、约 24μ g、约 25μ g、约 30μ g、约 35μ g、约 40μ g、约 45 μ g、 约 50 μ g、约 55 μ g、约 60 μ g、约 65 μ g、约 70 μ g、约 75 μ g、约 80 μ g、约 85 μ g、约 90 μ g、约 95 μ g、约100 μ g和超过100 μ g血凝素的剂量，其提供在单剂或相同或不同血凝素量的多剂中。另一方面，本发明提供了制造包含重排流感病毒的疫苗的方法，所述重排流感病毒包含甲型流感H5m毒株的内部基因区段(PB1、PB2、PA、M、NP和NS)以及来自于甲型流感病毒H5W的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，HA和NA基因源自于同一病毒株并且 HA基因在多碱性氨基酸切割位点处被修饰以产生减毒的HA基因，所述方法包含将病毒在适合于重排病毒生长的条件下转染到哺乳动物细胞中。在相关实施方案中，本文描述的制造疫苗的方法可用于制造包含甲型或乙型流感的季节性流感毒株的疫苗。在一个实施方案中，哺乳动物细胞选自MRC-5、MRC_9、Lederle 130、张氏肝细胞和 WI-38 ;U937、Vero、CV-l、IMR-90 和 IMR-91、MDCK、MDBK、HEK、H9、CEM 和 CD4 表达型 HUT78、 PerC6、BHK-21细胞、BSC和LLC-MK2。在相关实施方案中，哺乳动物细胞是Vero细胞。在某些实施方案中还设想了以上描述的病毒和组合物缺乏流感的所有6个内部基因。在一个实施方案中，重排病毒包含2、3、4或5个流感病毒的内部基因。例如，在一个实施方案中，重排病毒和/或其组合物和/或疫苗缺乏所有或部分NSl基因。在另一个方面，设想了使用任何甲型和乙型流感病毒株来执行本发明。在一个实施方案中，重排病毒可以具有来自甲型流感的8个流感基因的任何组合。在相关实施方案中，重排病毒可以具有来自乙型流感病毒的8个流感基因的任何组合。本发明排除了以前公开的或例如使用骨架如A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)、A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)、A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)和 B/Ann Arbor/1/66 生产的、具有来自于第一种亚型的一种毒株的内部基因和来自于同一亚型的不同毒株的HA和NA基因的任何病毒(甲型流感和乙型流感)，这些病毒公开在本文引用的任何现有出版物中，包括但不限于美国专利 4，552，758,7, 037，707,7, 601，356,7, 566，458,7, 527，800,7, 510，719、 7，504， 109、7，465，456 和 7，459， 162 ；美国专利公布 20090297554、20090246225、 20090208527,20090175909,20090175908,20090175907,20090136530,20080069821, 20080057081,20060252132,20060153872,20060110406,20050158342,20050042229 和 20070172929 ；国际专利公布 Nos. WO 2008/157583、WO 2008/021959、WO 2007/048089、WO 2006/098901、WO 2006/063053、WO 2006/041819、WO 2005/116260、WO 2005/116258、WO 2005/115448, WO 2005/062820、WO 2003/091401、以及在其中鉴定到的可用于 FLUMIST 疫苗的病毒，其可以在重组病毒中包含来自一种甲型流感亚型毒株的内部基因和同一亚型的不同毒株的HA和NA基因。所有这些文献在此以其全文引为参考。在实施方案中，本发明还排除了包含流感亚型的第一种毒株的骨架以及来自同一流感亚型的第二种毒株的HA和NA基因的天然存在的重排病毒。当在本文中使用时，术语 “天然存在的重排病毒”是指在自然环境例如病毒宿主中没有外部源的干预下重组的重排病毒。在又一个实施方案中，本发明排除了具有来自于作为骨架的第一种甲型或乙型流感亚型例如突变的 A/Puerto Rico/8/34(HlNl)、A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)或 B/Ann Arbor/1/66的一个或多个修饰过的内部基因、以及来自于相同流感病毒株的HA和NA基因的重排病毒，例如在美国专利公布No. 20070172929中所示例的。然而，本发明设想了将包含流感亚型的骨架毒株的修饰过的内部基因以及来自同一亚型但是不同毒株的HA和NA基因的病毒，包括在本发明的范围内。在另一个实施方案中，本发明排除了使用冷适应病毒例如A/Arm Arbor/6/60 (H2N2) ,A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) ,B/Ann Arbor/1/66 以及本技术领域中已知的其他冷适应病毒作为骨架/供体毒株所产生的重排病毒，其中内部骨架基因来自于第一种亚型，HA和NA基因来自于同一亚型的不同毒株。附图简述


图1显示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非编码区修饰的A/ Vietnam/1203/04(H5N1)的HA切割位点核苷酸序列和其他内部基因序列。源自于A/Hong Kong的序列用下划线标出。图2显示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非编码区修饰的A/ Indonesia/5/05 (H5N1)的HA切割位点核苷酸序列和其他内部基因序列。源自于A/Hong Kong的序列用下划线标出。图3显示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非编码区修饰的A/Turkey/ Turkey/1/05 (H5N1)的HA切割位点核苷酸序列和其他内部基因序列。源自于A/Hong Kong 的序列用下划线标出。图4显示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非编码区修饰的A/ Anhui/1/05(H5N1)的HA切割位点核苷酸序列和其他内部基因序列。源自于A/Hong Kong 的序列用下划线标出详细说明书本发明提供了包含重排病毒的改进的疫苗，所述重排病毒具有源自于各种流感毒株的病毒结构蛋白——血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)以及病毒内部基因[PB1、PB2、PA、 NS (NSl、NS2)、Ml、M2和NP]。本发明的疫苗是其中病毒内部基因源自于特定流感毒株，并且HA和NA基因源自于相同毒株的疫苗，但是内部基因所来源的毒株是甲型流感亚型或乙型流感毒株，其不同于HA和NA基因所来源的甲型流感亚型或乙型流感毒株。一种情况下， HA和NA基因源自于相同甲型流感亚型，而在另一种情况下，HA和NA基因源自于不同甲型流感亚型。尽管本发明通篇具体参考H5W疫苗和抗原性组合物作为示例，但应该理解，按照描述所构建的任何流感毒株都被本发明所涵盖。本发明的疫苗包括针对甲型和乙型流感毒株的疫苗。甲型流感毒株包括16种HA亚型和9种NA亚型。重排病毒能够在细胞培养物中有效生长，这是超越于含胚卵中生长的传统方法的改进生产方法。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通专业人员所通常理解的相同的含义。下面的参考文献为专业人员提供了本发明中使用的许多术语的通用定义=Singleton等，《微生物和分子生物学词典》(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (第二版，1994)；《剑桥科学技术词典》(THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) (Walker 主编，1988)；《遗传学词汇》(THE GLOSSARY OF GENETICS)第五版，R. Rieger 等主编，Springer Verlag(I99I)；以及 Hale 和 Marham，((HARPER COLLINS 生物学词典》(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)(1991)。在本文中引用的每个出版物、专利申请、专利和其他参考文献，在与本公开内容没有冲突的程度上以其全文引为参考。这里指出，当在本说明书和所附的权利要求书中使用时，没有具体数量的指称包括其复数形式，除非上下文明确指明不是如此。当在本文中使用时，下列术语具有属于它们的意义，除非明确表明不是如此。术语“重排病毒”是其中来自于目标病毒株的编码抗原性蛋白(例如血凝素和神经氨酸酶基因)的基因区段与来自不同病毒株的编码病毒聚合酶复合物(PB2、PB1和PA) 的基因或其他类似基因(例如非糖蛋白基因，包括M基因和NS基因，以及核蛋白(NP)基因)的基因区段组合的病毒。当在本文中使用时，“毒株”是指给定物种例如甲型或乙型流感物种和甲型流感病毒的亚型的特定病毒变体。例如，病毒A/Vietnam/1203/2004是甲型流感病毒H5m亚型，毒株名称为A/Vietnam/1203/2004。术语“源自于”是指与野生型或天然存在的多核苷酸或多肽序列相比发生改变或突变的多核苷酸或多肽序列的全部或部分，其中源自于野生型序列的多核苷酸或多肽在一个或多个碱基或氨基酸中发生改变，使其不再具有与野生型序列相同的序列。当在本文中使用时，术语“亚型”是指甲型流感毒株中的不同病毒可以根据病毒株中表达的HA和NA基因分类成亚型。甲型流感亚型的命名是根据HA亚型，例如亚型是本技术领域已知的16种不同HA基因中的任一种，以及NA亚型，例如本技术领域已知的9种不同NA基因的任一种。示例性亚型包括但不限于H5m、HlNl、H3N2和本技术领域中已知的许多其他亚型。当在本文中使用时，术语“进化枝”是指现有的甲型流感病毒H5W的不同分类。 H5N1进化枝中的病毒是遗传相关的，但是不共有完全相同的病毒基因组。在本技术领域中指明了至少7种不同的H5W亚型进化枝，例如进化枝1、进化枝2、进化枝3、进化枝4、进化枝5、进化枝6和进化枝7。进化枝2被进一步分成亚进化枝。术语“抗原性组合物”是指包含在宿主或对象中刺激免疫系统并引发免疫应答的物质的组合物。术语“引发免疫应答”是指在体内对刺激物例如抗原做出响应刺激免疫细胞。免疫应答由细胞免疫应答例如T细胞和巨噬细胞刺激、和体液免疫应答例如B细胞和补体刺激和抗体产生两者构成。细胞和体液免疫应答不相互排斥，并且设想了其一种或两种被本文描述的抗原性组合物、病毒或疫苗刺激。免疫应答可以使用本技术领域公知的技术来测量，所述技术包括但不限于抗体免疫测定法、增殖测定法和详细说明书中更详细描述的其他技术。术语“减毒的”用于描述显示出毒力降低(与野生型病毒相比)的病毒或抗原性组合物。修饰的HA是从野生型HA发生改变的HA基因，其编码的蛋白被切开的程度比野生型HA蛋白低，引起病毒生长降低。减毒病毒典型但并不总是通过鼻内给药。设想了通过本文描述的任何途径进行减毒病毒的给药。术语“失活的”在本文中用于描述在本技术领域中也称为“被杀死”或“死亡”病毒的病毒。失活的病毒是没有毒力性质的完整病毒，并且从“活的”病毒产生，而不论病毒是否以前以任何方式减毒。失活的病毒典型但并不总是通过肌肉内注射给药。设想了通过本文描述的任何途径进行失活病毒的给药。当在本文中使用时，术语“疫苗，，是指包含本文所述的重排病毒的组合物，其可用于在对象中建立针对病毒的免疫力。设想了疫苗包含可药用载体和/或佐剂。设想了疫苗是预防性或治疗性的。“预防性”治疗是对没有表现出疾病征兆或仅表现出早期征兆的对象施用的、目的在于降低发生疾病的风险的治疗。本发明的化合物可以作为预防治疗提供，以降低发生疾病的可能性或者如果疾病发生，将其严重性降到最低。“治疗性”治疗是对表现出疾病征兆或症状的对象施用的、目的在于减轻或消除那些征兆或症状的治疗。征兆或症状可以是生物化学、细胞、组织学、功能性的，可以是主观的或客观的。多肽的“片段”是指多肽的小于全长多肽或蛋白表达产物的任何部分。在一种情况下，片段是全长多肽的缺失类似物，其中已经从全长多肽的氨基端和/或羧基端移除一个或多个氨基酸残基。因此，“片段”是下面描述的缺失类似物的亚组。“模拟物”、“类似物”或“衍生物”可以互换使用，是指与天然存在的分子在结构上基本类似并具有相同生物活性、尽管在某些情况下程度有所不同的化合物，例如肽或多肽。 类似物与类似物所来源的天然存在的多肽相比，差异在于其氨基酸序列的组成，这种差异是基于一个或多个突变，所述突变包括(i)删除位于多肽一个或多个末端的一个或多个氨基酸残基、和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域，(ii)在多肽的一个或多个末端插入或添加一个或多个氨基酸(典型为“添加”类似物)，和/或插入或添加天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域(典型为“插入”类似物)，或(iii)将天然存在的多肽序列中的一个或多个氨基酸取代成其他氨基酸。设想了本发明的重排病毒包含病毒基因的类似物，所述基因包括ΗΑ、ΝΑ、PB1、PB2、PA, M (Ml和M2)、NS (NSl和NS2)和NP基因中的任一个或一个以上。一种情况下，类似物与野生型或天然存在的序列例如肽表现出约70%但低于 100%的序列相似性。在一种情况下，这样的类似物或衍生物包含非天然存在的氨基酸残基，包括例如但不限于高精氨酸、鸟氨酸、青霉胺和正缬氨酸，以及天然存在的氨基酸残基。 在另一种情况下，这样的类似物或衍生物由一个或多个D-氨基酸残基构成，或在两个或多个氨基酸残基之间含有非肽互连。在一个实施方案中，类似物或衍生物可以是多肽的片段， 其中所述片段与野生型多肽在至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的长度上基本同源(即至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同源)。根据被取代的氨基酸和取代它的氨基酸的物理化学或功能相关性，取代是保守或非保守的。这种类型的取代在本技术领域中是公知的。供选地，本发明也包含了非保守取代。示例性的保守取代描述在Lehninger，[《生物化学》(第二版)(Biochemistry，2nd Edition) ；Worth Publishers, Inc. , New York(1975), pp. 71-77]中，并在下面列出。保守取代
侧链性质氨基酸
非极性(疏水)
A.脂族ALIVP
B.芳香族FW
C.含硫M
D.临界(borderline)G不带电荷-极性A.羟基STY
B.酰胺NQ
C.巯基C
D.临界G
带正电荷(碱性)KRH
带负电荷(酸性)DE或者，示例性保守取代直接在下面列出。保守取代II
原始残基示例性取代Ala (A)Val, Leu, lieArg (R)Lys, Gin, AsnAsn (N)Gin, His, Lys, ArgAsp (D)GluCys (C)SerGln (Q)AsnGlu (E)AspHis (H)Asn5 Gin, Lys, ArgHe (I)Leu, Val, Met, Ala, PheLeu (L)lie, Val, Met, Ala, PheLys (K)Arg, Gin, AsnMet (M)Leu, Phe, liePhe(F)Leu, Val, lie, AlaPro (P)GlySer (S)ThrThr (T)SerTrp (W)TyrTyr (Y)Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V)lie, Leu, Met, Phe, Ala当在本文中使用时，术语“分离的”是指病毒或抗原性组合物从其天然环境中取出。因此，分离的生物材料不含某些或所有细胞组分，即天然存在天然材料的细胞组分(例如细胞质或膜组分)。在一种情况下，如果病毒或抗原性组合物存在于细胞提取物或上清液中，其被视为分离的。在核酸分子的情况下，分离的核酸包括PCR产物、分离的mRNA、cDNA 或限制性片段。当在本文中使用时，术语“纯化的”是指病毒或抗原性组合物已经在减少或消除存在的无关材料的条件下分离，所述无关材料即污染物、包括从中获得组合物的内源材料。例如而非限制性的，纯化的病毒粒子基本上不含宿主细胞或培养物组分，包括组织培养物或卵蛋白和非特异性病原体。在各种实施方案中，基本上不含污染物的纯化材料是至少50% 纯；至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 % 或甚至至少99%纯的。纯度可以通过层析、凝胶电泳、免疫测定法、组成分析、生物测定法和本技术领域已知的其他方法来评估。术语“药物组合物”是指适合于给药到对象动物、包括人类和哺乳动物的组合物。 药物组合物包含药理有效量的本发明的病毒或抗原性组合物，并且也包含可药用载体。药物组合物涵盖了包含活性成分和构成可药用载体的惰性成分的组合物，以及由任两种或多种成分的组合、复合或聚合所直接或间接产生的任何产物。因此，本发明的药物组合物涵盖了通过将本发明的化合物或结合物与可药用载体混合而制成的任何组合物。术语“可药用载体”包括任何和所有临床有用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂和赋形剂，例如磷酸盐缓冲的盐水溶液、5%葡萄糖或甘露糖醇水溶液和乳液例如油/水乳液或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂和/或佐剂。适合的药物载体和制剂描述在《Remington药物学》第19版中(Remington' s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. ) (Mack Publishing Co.，Easton，1995)。可用于组合物的药物载体取决于活性药剂所打算的给药方式。典型的给药方式包括但不限于肠(例如口服)或肠胃外(例如皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射；或局部、透皮或经粘膜给药)。 “可药用盐”是能够配制在化合物或结合物中用于药物应用的盐，包括例如金属盐(钠、钾、 镁、钙等)以及氨或有机胺的盐。术语“可药用”或“药理学可接受”是指在生物学等方面没有不利的材料，即材料可以给药于个体而不引起任何不想要的生物效应，或与包含它的组合物中的任何组分或当使用下面描述的本技术领域公知的途径给药时以有害的方式发生相互作用。流感基因流感病毒是分节段的负链RNA病毒，其属于正粘病毒(Orthomyxoviridae)科。甲型流感病毒由9个结构蛋白构成，并另外编码一个具有调控功能的非结构性NSl蛋白。流感病毒分节段基因组含有8个负义RNA (nsRNA)基因区段( 82181、？4、呢、赂、撤和嫩)，其编码至少10个多肽，包括RNA指导的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB 1和PA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、血凝素(亚基HAl和HA2)、基质蛋白(Ml和M2)以及非结构蛋白(NSl和NS2) (Krug 等，《在流感病毒中》(In The Influenza Viruses), R.M. Krug 主编，Plenum Press, N. Y.，1989，pp. 89152)。流感病毒引起广泛传播的疾病的能力是由于其通过经历抗原性变化而避开免疫系统的能力，这种抗原性变化被认为在宿主被动物流感病毒和人类流感病毒两者同时感染时发生的。在宿主中突变和重排期间，病毒可以将来自于另一种病毒的HA和/或NA表面蛋白基因掺入到其基因组中，从而产生新的流感亚型并避开免疫系统。血凝素
HA是病毒表面糖蛋白，其包含约560个氨基酸，占病毒总蛋白的25%。它在感染的早期阶段负责病毒粒子附着及穿透到宿主细胞中。存在16种已知的HA亚型，其被分类为 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 或 H16 亚型。对于病毒感染细胞来说，病毒HAO前体切割成HAl和HA2亚片段是必需的步骤。因此，为了将宿主细胞中的新病毒粒子转变成能够感染新细胞的病毒粒子，需要进行切割。已知切割发生在整合的HAO膜蛋白从被感染细胞的内质网向质膜运输期间。在运输过程中， 血凝素经历一系列共翻译和翻译后修饰，包括前体HA通过蛋白水解切割成氨基端片段HAl 和羧基端片段HA2。在原代组织培养物或已建立的细胞系中生长流感毒株的一个主要困难， 在于宿主细胞中的流感血凝素需要蛋白水解切割活化。尽管已知未切割的HA能够介导病毒与其细胞表面上含神经氨酸的受体的附着， 但它不能进入感染周期的下一步，即融合。已经报道，需要通过切割暴露出HA2的疏水氨基端，以便它能够插入到靶细胞中，从而在病毒与靶细胞膜之间形成桥。在该过程之后，两个膜融合并使病毒进入靶细胞。HA的蛋白水解活化涉及通过类似胰蛋白酶的内切蛋白酶在精氨酸残基处切割，这种酶通常是钙依赖性的细胞内酶，并具有中性最适PH。因为活化性蛋白酶是细胞的酶，因此被感染细胞的类型决定了 HA是否被切割。哺乳动物流感病毒和非致病性禽流感病毒的 HA只对有限数量细胞类型中的蛋白水解切割敏感。另一方面，H5和H7亚型中致病性禽病毒的HA被广泛的不同宿主细胞中存在的蛋白酶切割。因此，存在着由于与病毒致病性相关的血凝素可切割性差异而导致的宿主范围的差异。可切割性的差异是由于HA的切割位点的氨基酸序列差异。序列分析显示，非致病性禽流感病毒和所有哺乳动物流感病毒的HA分子的HAl和HA2片段由单个精氨酸相连。相反，致病性禽毒株在切割位点处具有几个碱性氨基酸的序列，常见的共同特性是赖氨酸-精氨酸或精氨酸-精氨酸，例如RRRK (SEQ ID Ν0:Μ)。所有流感病毒的血凝素被导致消除碱性氨基酸的同样的通用机制切开。神经氨酸酶神经氨酸酶是甲型流感病毒的第二种膜糖蛋白。已经显示，病毒NA的存在对于产生对抗感染病毒的多方面保护性免疫应答来说是重要的。NA是413个氨基酸的蛋白，由 1413个核苷酸的基因编码。在流感病毒中已鉴定到9种不同的NA亚型(N1、N2、N3、N4、N5、 N6、N7、N8和N9)，它们都已在野生鸟类中发现。NA通过从被感染细胞表面上的糖部分切下末端神经氨酸(也称为唾液酸)残基，参与破坏病毒HA的细胞受体。NA也从病毒蛋白上切下唾液酸残基，防止病毒聚集。利用这种机制，假设了 NA通过阻止新形成的病毒粒子沿着细胞膜聚集并促进病毒运过黏膜表面上存在的黏液，而促成病毒子代的释放。NA是易发生抗原性变异的重要的抗原决定簇。给药神经氨酸酶的化学抑制剂限制了病毒感染的严重性和传播。神经氨酸酶抑制剂通过阻止病毒从宿主细胞出芽来对抗流感感染。示例性NA抑制剂包括但不限于通过吸入给药的扎那米韦、通过口服给药的奥司他韦和通过肠胃外给药的帕拉米韦。流感的内部基因除了表面蛋白HA和NA之外，流感病毒还包含6个其他内部基因，其产生8种不同蛋白，包括聚合酶基因PB1、PB2和PA、基质蛋白Ml和M2、核蛋白(NP)以及非结构蛋白NSl和 NS2 (Horimoto 等，Clin Microbiol Rev. 14(1) :129-49,2001) 为了包装在子代病毒粒子中，病毒RNA作为核糖核蛋白复合体从核中运输，所述复合体由三种流感病毒聚合酶蛋白、核蛋白(NP)和病毒RNA构成，并与流感病毒基质I(Ml) 蛋白和核外运蛋白结合(Marsh等，J Virol, 82 =2295-2304, 2008) 0位于包膜中的Ml蛋白被认为在装配和出芽中起作用。病毒粒子中整合了有限数量的M2 蛋白(Zebedee，J. Virol. 62 :2762-2772,1988) 它们形成具有H+离子通道活性的四聚体，并且当在内体中被低pH活化时，使病毒粒子内部酸化，便于其脱壳(Pinto等，Cell 69 =517-528,1992)。金刚烷胺是通过干扰M2离子通道活性从而抑制病毒脱壳以阻止病毒感染的抗流感药物。NSl蛋白是非结构蛋白，其具有多种功能，包括剪接的调控和细胞mRNA的核外运以及刺激翻译。NSl的主要功能似乎是抵消宿主的干扰素活性，因为NSl敲除的病毒在干扰素非缺陷型细胞中可以存活，但是其生长效率低于亲代病毒(Garcia-Mstre，Virology 252 :324-330,1998)。已经在病毒粒子中检测到NS2蛋白。病毒粒子中NS2的平均数量据估计为130-200 个分子。体外结合测定显示出Ml与NS2之间的直接蛋白质-蛋白质接触。也通过免疫沉淀在病毒感染的细胞裂解物中检测到NS2-M1复合物(Virology. 196 =249-55,1993) 0 NS2 蛋白已知存在于病毒粒子中(Richardson 等，Arch. Virol. 116 :69-80,1991 ；Yasuda 等， Virology 196 =249-255,1993)，据认为通过与Ml蛋白相互作用在RNP从核的外运中发挥作用(Ward 等，Arch. Virol. 140 :2067-2073,1995)。反向遗传学和重排病毒分离和修饰特定核酸和蛋白的技术对于本技术领域的专业人员来说是公知的。对于本发明来说，可以使用本领域技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术已在文献中充分解释。参见例如Sambrook，Fritsch & Maniatis，《分子克隆实验室指南》第二版(Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition.) Cold Spring Harbor,N. Y. :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (在本文中禾尔为"Sambrook等， 1989”)；《DNA 克隆实用方法》第 I 和 II 卷(DNA Cloning. A Practical Approach, Volumes I and II) (D.N. Glover 主编，1985)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis) (Μ· J. Gait 主编，1984)；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization) [B. D. Hames & S. J. Higgins 主编，(1985)]；《转录和翻译》(Transcription And Translation) [B. D. Hames & S. J. Higgins 主编，(1984)]；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture) [R. I. Freshney 主编，(1986)]；《固定化细胞与酶》(Immobilized Cells And Enzymes) [IRL Press, (1986)] ;B. Perbal，《分子克隆实用指南》(A Practical Guide To Molecular Cloning) (1984) ；Ausubel，F. M.等主编，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons，he.，1994。这些技术包括使用具有改变的核苷酸的寡核苷酸用于产生具有突变的PCR产物的位点定向诱变技术。—方面，本发明是基于通过本文中描述并在本技术领域中已知的反向遗传学方法产生禽流感病毒及其疫苗。流感病毒RNA转录的机制是独特的(Horimoto等，Clin Microbiol Rev. 14(1) 129-49，2001)。来自细胞mRNA的5’帽被病毒核酸内切酶切开，并被病毒的转录酶用作转录引物(Krug等，Cell 18 =329-334,1979) 0 8个RNA区段中的6个以单顺反子方式转录成 mRNA,并翻译成ΗΑ、ΝΑ、NP、PBl、PB2和PA。相反，两个RNA区段通过剪接各自转录成两个 mRNA。对于M和NS基因两者来说，编码mRNA以不同的阅读框翻译，分别产生Ml和M2蛋白以及NSl和NS2蛋白。据认为，游离NP浓度的增加触发了从mRNA合成向互补RNA(cRNA)和病毒 RNA(vRNA)合成的转变(Shapiro 等，J. Virol. 62 :2285-2290,1988)。新合成的 vRNA 在核中被NP包壳，在那里它们起到模板的作用，用于病毒mRNA的次级转录。最近开发的反向遗传学系统允许对流感病毒基因组进行操作O^lese等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :11354—58，1996 ；Neumann 禾口 Kawaoka，Adv. Virus Res. 53 :265, 1999 ；Neumann 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :9345,1999 ；Fodor 等，J. Virol. 73 :9679, 1999)。流感病毒情况下的反向遗传学的机理是将负义RNA工程化改造成cDNA，用于具有负链RNA基因组的生物体的重组制备。反向遗传学技术涉及制备合成的重组病毒RNA，其含有负链病毒的非编码区，是病毒RNA被病毒聚合酶识别以及产生成熟病毒粒子所需的包装信号所必需。重组RNA从重组DNA模板合成，并在体外与纯化的病毒聚合酶复合物重构，以形成可用于转染细胞的重组核糖核蛋白(RNP)。参见美国专利6，022，7 和6，001，634。这些重组方法允许产生在多肽氨基酸序列上具有特定改变的流感病毒类型。例如，含有所需取代的HA分子可以是重组流感病毒的一部分。在一种方法中，重组流感病毒通过遗传工程方法例如“唯质粒(plasmid only)”系统来制造(Hoffmann等，Vaccine 20 3165,2002)。在另一种用于产生重组病毒的方法中使用了 8质粒系统，其中负义RNA从pol I 启动子表达，并且聚合酶复合蛋白的共表达导致形成了感染性甲型流感病毒(Hoffmann 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :6108-13, 2000)。这种技术允许从cDNA快速生产嵌合疫苗用于流感大流行事件，并提供了为致病性毒株减毒的能力(SiAbarao等，Virology 305 192-200,2003)，同时消除筛选重排病毒6:2配置(即6个内部基因与2个HA和NA基因 (每种基因各一个))的需要。也参见美国专利7，037，707。在一个实施方案中，在高致病性流感病毒例如H5m的情况下，通过位点定向诱变除去造成病毒高致病性本质的HA的多碱性氨基酸切割位点，以将病毒减毒并将其类别从 BSL-3改变为BSL-2。此外，将原型供体毒株的一个或多个内部基因用其他亚型的病毒基因代替，以进一步改进生长特性。这样组合了高生长特性与H5W野生型病毒的免疫优势的病毒，节省了生产时间， 并且在一种情况下是6:2重排体，具有来自于H5W病毒例如越南(Vietnam)株或印度尼西亚andonesia)株的6个内部基因作为骨架，以及实际的H5W大流行(样)毒株的HA(带有用于减毒的突变的切割位点)和NA。具有高生长潜力的重排病毒的另一个实例是5:1:2 重排体，具有来自于H5W病毒例如越南株或印度尼西亚株的5个内部基因、HlNl毒株的 PB2 (用于改进在细胞培养物中的生长)作为骨架，以及实际的H5W大流行毒株的HA (带有用于减毒的突变的切割位点)和NA。在某些实施方案中，使用I^alese等的方法(Proc. Natl. Acad, ki USA 93: 11354-58,1996)制备重排病毒，所述方法描述了使用辅助病毒系统产生遗传工程病毒。在一个实施方案中，病毒使用流感辅助病毒方法产生。例如，为了构建6:2重排体，可以使用减毒的VN 1203病毒作为辅助病毒以导入来自第二个H5W毒株例如鸡埃及毒株的HA和NA (Aly等，Avian Dis. 52 =269-77, 2008) 转染体病毒的选择使用针对辅助病毒HA或NA 蛋白的中和抗体来进行(参见例如I^lese等，同上，其中的图2)。本文描述的两种示例性减毒H5m重排体具有H5m进化枝1毒株A/ Vietnam/1203/2004 的骨架，即 6 个内部基因(PB1、PB2、PA、NP、M、NS)；—个含有 H5m 进化枝IVietnam 1203毒株的突变的HA和NA，另一个含有不同进化枝的H5W病毒例如进化枝 2A/Indonesia/5/05毒株的突变和HA和NA。这两种减毒的RG重排体具有在标准Vero细胞(含有胎牛血清)或无血清蛋白的Vero细胞中的高生长潜力。这些重排病毒与现有的 RG H5N1/PR8重排体相比还具有诱导增强的H5W特异性免疫应答的潜力，因为它们含有主要负责诱导细胞免疫的所有H5W蛋白，即核蛋白和基质蛋白。这些H5W特异性免疫应答也可能具有通过特异性诱导辅助性T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和记忆细胞而诱导更广泛的免疫应答的能力，从而引起提高的加强效应。在使用现有的具有源自于卵适应性 HlNl亚型季节性毒株的内部蛋白的H5m/PR8重排体时，不会发生这样的结果，所述重排体不诱导强烈的H5W特异性细胞免疫应答。在本技术领域中已经鉴定到大量H5W毒株，其每个都适合本发明。参见例如 Govorkova 等，J Virol. 2005Feb ；79 (4) :2191-8 ；Proc Natl Acad Sci USA 103:2845-50， 2006 ；Horimoto 等，Clin Microbiol Rev 14 129-49，2001 和 Cauthen 等，J Virol. 74 6592-9，2000，以及其他(参见例如 Lee 等，J Virol 79 :3692-02,2005)。可用于本发明的H5W禽流感毒株的实例包括但不限于A/ Vietnam/1203/2004(H5N1)(CDC#2004706280) (VN1203)、A/Indonesia/05/2005(H5N1) (CDC#2005740199) (IN5/05)、A/Cambodia/R0405050/2007 (H5N1) (CamR04)、A/ Anhui/1/05(H5N1) (AH1/05)、A/turkey/Turkey/01/2005(H5Nl) (TTOl)(参见例如 Carter 等，BioDrugs. 22 :279-92,2008), A/Vietnam/1194/2004、土耳其流感病毒株 A/ Turkey/England/50-92/91 (H5N1)(参见例如 Horimoto 等，Clin Microbiol Rev 14 129-49,2001)、A/turkey/England/87-92BFC/91(H5N1) (Londt 等，Avian Pathology, 36 :347-350, 2007)、鸡流感病毒株 A/Chicken/Indonesia/03 (H5N 1)、鸡流感病毒株 A/ Chicken/Hong Kong/220/97 (参见例如 Tumpey 等，J Virol 76 :6344-55,2002)、鸡流感病毒株A/Chicken/^cotland/59(H5Nl)(参见例如Horimoto等，同上)、鸡流感病毒株 A/Chicken/Hong Kong/258/97 (H5N1)(参见例如 Horimoto 等，同上)、鸡流感病毒株 A/Chicken/Nakom-Patom/Thailand/CU-K2/2004(H5Nl)(参见例如 Anwar 等，In Silico Biol. 6 :161-8,2006 ；Viseshakul 等，Virology. 328 169-76，2004)、鸡流感病毒株 A/ Chicken/Hong Kong/31. 2/2002 (H5N1)(参见例如 Anwar 等，同上)、鸡流感病毒株 A/ Chicken/Vietnam/C58/04(H5N1)(参见例如 Anwar 等，同上)、鸡流感病毒株 A/Chicken/ Vietnam/38/2004 (H5N1)(参见例如 Anwar 等，同上)、鸡流感病毒株 A/Chicken/Hong Kong/1000/97 (H5N1)(参见例如 Shan 等，Biochem Biophys Res Commun. 302 :377-83, 2003)、鸡流感病毒株 A/Chicken/Hong Kong/317. 5/01 和鸭流感病毒株 A/Duck/Anyang/ A VL-1/01 (参见例如 Tumpey 等，J Virol 76 :6344_55，2002)、鸭流感病毒株 A/Duck/ Vietnam/11/2004 (H5N1)、A/Hatay/2004/ (H5N1)(参见例如 Anwar 等，同上)、鸭流感病毒株 A/Duck/Korea/ES/03(腳 1)、A/Duck/Korea/ESD1/03(腳 1)和 A/Duck/Hong Kong/821/02 (H5N1)(参见例如 Lee 等，J Virol 79 :3692_02，2005)、鸭流感病毒株A/Duck/Vietnam/11/2004 (H5N1)、A/Duck/China/E319-2/03 (参见 Lee 等，Vet Microbiol 124 193-201,2007)、白鹭流感病毒 A/egret/Hong Kong/757. 2/02 (H5N1)(参见例如 Lee 等， J Virol 79 :3692-02, 2005)、鹅流感病毒株 A/Goose/Guangdong/1/96 (参见例如 Cauthen 等，J Virol. 74 =6592-9,2000)、禽流感病毒株 A/Env/HK/437-4/99 (参见例如 Cauthen 等， 同上)、禽流感病毒株A/Env/HK/437-6/99 (参见例如Cauthen等，同上)、禽流感病毒株A/ Env/HK/437-8/99(参见例如 Cauthen 等，同上)、禽流感病毒株 A/Env/HK/437_10/99 (参见例如Cauthen等，同上)、禽流感病毒株A/Quail/Vietnam/36/04 (H5N1)(参见例如 Anwar 等，同上)、禽流感病毒株 A/Swan/Italy/179/06 (H5N1)(参见例如 Terregino 等， Vet Rec. 158 :491，2006)、禽流感病毒株 A/Hong Kong/156/97 (H5N1) (HK156)(参见例如 Cauthen 等，同上)和禽流感病毒株 A/Hong Kong/213/03 (H5N1) (HK213)(参见例如 Shinya 等，J. Virol. 79 :9926-32, 2005)，以及在 Lee 等，Emerging Infect Dis. 14 :487-90, 2008 中所公开的那些。在对来自于H5W毒株的内部基因与HA和NA基因了解后，将会认识到，在供选实施方案中，可以通过本技术领域公知和常用的技术合成编码这些基因的多核苷酸。在另一个实施方案中，其他甲型流感病毒亚型和乙型流感病毒的流感病毒可用于本发明的方法和组合物中。例如，设想了具有任何HA亚型、包括Hl至H16亚型中的任一种的甲型流感病毒。在另一个实施方案中，设想了可以在本发明中使用具有m至N9任一 NA 亚型的流感病毒。在某些实施方案中，设想了当产生重排体时，HA和NA亚型源自于相同毒株，并且骨架源自于同一亚型的流感病毒。示例性的组合包括但不限于例如H3N2骨架并具有来自于不同H3N2病毒株的H3和N2基因，或H15N8骨架并具有来自于不同H15N8病毒株的H15和 N8基因。此外，设想了在本发明中可以使用任一下列甲型流感病毒亚型HlNl、H2m、H3Nl、 H4N1、H5N1、H6N1、H7N1、H8N1、H9N1、H10N1、H11N1、H12N1、H13N1、H14N1、H15N1、H16N1 ；H1N2、 H2N2、H3N2、H4N2、H5N2、H6N2、H7N2、H8N2、H9N2、H10N2、Hl1N2、Hl2N2、Hl3N2、H14N2、Hl5N2、 H16N2 ;H1N3、H2N3、H3N3、H4N3、H5N3、H6N3、H7N3、H8N3、H9N3、H10N3、Hl 1N3、Hl2N3、Hl3N3、 H14N3、H15N3、H16N3 ；H1N4、H2N4、H3N4、H4N4、H5N4、H6N4、H7N4、H8N4、H9N4、H10N4、Hl 1N4、 H12N4、H13N4、H14N4、H15N4, H16N4 ； H1N5、H2N5、H3N5、H4N5、H5N5、H6N5、H7N5、H8N5、H9N5、 H10N5、H11N5、H12N5、H13N5、H14N5、H15N5、H16N5 ;H1N6、H2N6、H3N6、H4N6、H5N6、H6N6、H7N6、 H8N6、H9N6、H10N6、H11N6、H12N6、H13N6、H14N6、H15N6、H16N6 ；H1N7、H2N7、H3N7、H4N7、H5N7、 H6N7、H7N7、H8N7、H9N7、H10N7、H11N7、H12N7、H13N7、H14N7、H15N7、H16N7 ；H1N8、H2N8、H3N8、 H4N8、H5N8、H6N8、H7N8、H8N8、H9N8、H10N8、H11N8、H12N8、H13N8、H14N8、H15N8、H16N8 ；H1N9、 H2N9、H3N9、H4N9、H5N9、H6N9、H7N9、H8N9、H9N9、H10N9、Hl 1N9、Hl 2N9、Hl 3N9、H14N9、Hl 5N9 和H16N9。以前已经鉴定到下列亚型的甲型流感病毒；Hmi、H2N2、HlN2、H3N2、H3N8、H4N6、 H5N1、H5N2、H5N3、H5N9、H6N1、H6N2、H6N5、H7N1、H7N7、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、 H13N6、H14N5、H15N8、H15N9、H16N3。表1列出了来自于可用于产生重排病毒的甲型流感毒株的示例性HA和NA基因。
权利要求
1.一种重排流感病毒，其包含来自于第一种甲型流感病毒亚型的内部基因区段PBl、PB2、PA、M、NP和NS以及来自于内部基因区段所来源的该流感病毒亚型的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，内部基因区段源自于甲型流感亚型的第一种毒株，以及HA和NA基因源自于该甲型流感亚型的第二种毒株。
2.权利要求1的纯化的重排流感病毒，其包含甲型流感H5W毒株的内部基因区段 PB1、PB2、PA、M、NP和NS以及来自于甲型流感病毒H5W的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA) 基因，HA和NA基因源自于相同病毒株。
3.权利要求2的重排病毒，其中HA和NA基因来自于第一个H5W进化枝，和内部基因来自于第二个H5m进化枝。
4.权利要求2的重排病毒，其中HA和NA基因以及内部基因来自于同一个H5W进化枝。
5.权利要求1或2的重排病毒，其中HA基因被修饰以产生减毒病毒。
6.权利要求5的病毒，其中所述HA基因在多碱性氨基酸切割位点处被修饰。
7.权利要求1或权利要求2的病毒，其特征为在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。
8.权利要求7的病毒，其中哺乳动物细胞选自MRC-5、MRC-9、Lederle130、张氏肝细胞和 ffI-38 ；U937、Vero、CV-U IMR-90 和 IMR-91、MDCK, MDBK, HEK、H9、CEM 和 CD4 表达型 HUT78、PerC6、BHK-21 细胞、BSC 和 LLC-MK2。
9.权利要求7的病毒，其中哺乳动物细胞培养物是Vero细胞培养物。
10.权利要求1的病毒，其中所述内部基因源自于选自下列的H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004> A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05> A/turkey/Turkey/l/05> A/Anhui/1/05、A/Cambodia/R0405050/2007 (H5N1)、A/chicken/Nakorn-Patom/Thai 1 and/ CU-K2/04, A/chicken/Vietnam/C58/04, A/quail/Vietnam/36/04, MDk/JX/1653/05, MDk/1657/JX/05、 BH goose/QH/65/05、 Gs/GD/1/96-样、Dk/Vietnam/568/05、 Gs/ GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05, MDk/JX/2295/05、MDk/JX/2300/05、Dk/ GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/Vietnam/453/2004、A/ duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
11.权利要求1的病毒，所述HA和NA基因源自于选自下列的H5W毒 ^ :A/Vietnam/1203/2004, A/Hong Kong/213/03, A/Indonesia/5/05,A/Hong Kong/156/97 (H5N1)、A/Indonesia/5/05 (H5N1)、A/turkey/Turkey/01/2005 (H5N1)、A/ Anhui/1/05 (H5N1) 、 A/Cambodia/R0405050/2007 (H5N1) 、 A/chicken/Nakorn-Patom/ Thailand/CU-K2/04, A/chicken/Vietnam/C58/04, A/quail/Vietnam/36/04, MDk/ JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-样、Dk/Vietnam/568/05、 Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、MDk/JX/2300/05、Dk/ GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/Vietnam/453/2004、A/ duck/Singapore/3/97、A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
12.权利要求1的病毒，其中内部基因与HA和NA基因源自于相同病毒株。
13.权利要求1的病毒，其中内部基因与HA和NA基因源自于不同病毒株。
14.权利要求1到13任一项的病毒，其中所述内部基因来自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。
15.权利要求1到14任一项的病毒，其中HA和NA基因来自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。
16.权利要求1到14任一项的病毒，其中HA和NA基因来自于H5W毒株A/ Indonesia/5/05。
17.权利要求1到16任一项的病毒，其中多碱性氨基酸切割位点处的修饰是从 RERRRKKR(SEQ ID NO :13) — TETR(SEQ ID NO :14)的突变。
18.—种抗原性重排流感病毒组合物，其包含来自于第一种甲型流感病毒亚型的内部基因区段PBl、PB2、PA、M、NP和NS以及来自于内部基因区段所来源的流感病毒亚型的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，所述内部基因区段源自于甲型流感亚型的第一种毒株，以及HA和NA基因源自于该甲型流感亚型的第二种毒株。
19.权利要求18的抗原性重排病毒组合物，所述抗原性组合物包含源自于甲型流感 H5N1毒株的内部基因区段PB1、PB2、PA、M、NP和NS以及来自于甲型流感病毒H5W的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，所述HA和NA基因源自于相同病毒株。
20.权利要求18或权利要求19的抗原性重排流感病毒组合物，所述HA基因被修饰以产生减毒病毒。
21.权利要求20的抗原性重排流感病毒组合物，所述HA基因在多碱性氨基酸切割位点处被修饰。
22.权利要求18或权利要求19的抗原性重排流感病毒组合物，所述流感病毒的特征为在哺乳动物细胞培养物中繁殖的能力。
23.权利要求19的抗原性组合物，所述HA和NA基因源自于选自下列的H5W _ ^ :A/Vietnam/1203/2004, A/Hong Kong/213/03, A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05、A/Cambodia/R0405050/2007, A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-样、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004,A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
24.权利要求19的抗原性组合物，其中所述内部基因源自于选自下列的H5m _ ^ :A/Vietnam/1203/2004, A/Hong Kong/213/03, A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05、A/Cambodia/R0405050/2007、 A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-样、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004,A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
25.权利要求18的抗原性组合物，其中内部基因区段与HA和NA基因源自于相同病毒株。
26.权利要求18的抗原性组合物，其中内部基因区段与HA和NA基因源自于不同病毒株。
27.权利要求18-26任一项的抗原性组合物，其中内部基因区段来自于A/ Vietnam/1203/2004。
28.权利要求18到27任一项的抗原性组合物，其中HA和NA基因来自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。
29.权利要求18到27任一项的抗原性组合物，其中HA和NA基因来自于H5N1毒株 A/Indonesia/5/05。
30.权利要求21到四任一项的抗原性组合物，其中多碱性氨基酸切割位点处的修饰是从 RERRRKKR(SEQ ID NO :13) — TETR(SEQ ID NO :14)的突变。
31.权利要求18到四任一项的抗原性组合物，还包含可药用载体。
32.一种包含重排流感病毒的疫苗，所述病毒包含编码表面蛋白HA的多核苷酸和编码表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每个都源自于甲型流感病毒亚型的第一种毒株；编码PBl的多核苷酸，编码PA的多核苷酸，编码PB2的多核苷酸，编码M的多核苷酸，编码NP的多核苷酸，编码NS的多核苷酸，？81、 4182、呢和 NS的多核苷酸源自于甲型流感病毒亚型的第二种毒株，其中所述多核苷酸可操作地连接，以允许重排的多核苷酸包装在病毒粒子中。
33.权利要求32的包含重排甲型流感病毒的疫苗，所述病毒包含编码表面蛋白HA的多核苷酸和编码表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每个都源自于流感病毒H5W ；编码PBl 的多核苷酸，编码PA的多核苷酸，编码PB2的多核苷酸，编码M的多核苷酸，编码NP的多核苷酸，编码NS的多核苷酸，PB1、PA、PB2、M、NP和NS的多核苷酸源自于流感病毒H5W，所述多核苷酸可操作地连接，以允许重排的多核苷酸包装在病毒粒子中。
34.权利要求32或权利要求33的抗原性重排流感病毒组合物，所述HA基因被修饰以产生减毒病毒。
35.权利要求34的抗原性重排流感病毒组合物，所述HA基因在多碱性氨基酸切割位点处被修饰。
36.权利要求33的疫苗，其中所述内部基因源自于选自下列的H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03, A/Indonesia/5/05、A/Hong Kong/156/97、 A/turkey/Turkey/O 1/2005, A/Anhui/1/05、 A/Cambodia/R0405050/2007, A/ chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-样、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05, Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004、A/duck/Singapore/3/97、A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
37.权利要求33的疫苗，所述HA和NA基因源自于选自下列的H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Hong Kong/156/97、 A/turkey/Turkey/O1/2005, A/Anhui/1/05、 A/Cambodia/R0405050/2007 , A/ chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-样、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004,A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
38.权利要求32或33任一项的疫苗，其中内部基因区段与HA和NA基因源自于相同病毒株。
39.权利要求32或33任一项的疫苗，其中内部基因区段与HA和NA基因源自于不同病毒株。
40.权利要求32到39任一项的疫苗，其中HA和NA基因来自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。
41.权利要求32到39任一项的疫苗，其中HA和NA基因来自于H5N1毒株A/ Indonesia/5/05。
42.权利要求32到41任一项的疫苗，其中HA通过从RERRRKKR(SEQID NO 13) -TETR(SEQ ID NO 14)的突变在多碱性氨基酸切割位点处被修饰。
43.权利要求32到42任一项的疫苗，其还包含佐剂。
44.权利要求32到43任一项的疫苗，其中疫苗是灭活疫苗。
45.权利要求32到44任一项的疫苗，其包含的HA含量为1μ g至100 μ g HA。
46.一种用于在对象中引发针对至少一种大流行流感病毒株的免疫应答的方法，所述方法包含给药权利要求18到31任一项的抗原性组合物或权利要求32到45任一项的疫苗， 给药量有效保护对象免于至少一种H5W流感病毒株的感染。
47.一种用于预防对象被流感病毒感染的方法，所述方法包含向对象给药有效量的权利要求1到17任一项的病毒、权利要求18到31任一项的抗原性组合物或权利要求32到 45任一项的疫苗。
48.一种用于预防对象被H5W流感病毒感染的方法，所述方法包含向对象给药有效量的权利要求1到17任一项的病毒、权利要求18到31任一项的抗原性组合物或权利要求32 到45任一项的疫苗。
49.权利要求48的方法，其中疫苗包含的HA含量为1μ g至100 μ gHA。
50.权利要求49的方法，其中疫苗包含的HA含量为1μ g至30 μ gHA。
51.权利要求49的方法，其中疫苗包含Iyg至15μ g HA。
52.权利要求48的方法，其中疫苗包含的HA含量为IOng至1μ g HA单位。
53.一种制造包含重排流感病毒的疫苗的方法，所述重排流感病毒包含甲型流感H5W 毒株的内部基因区段PB1、PB2、PA、M、NP和NS以及来自于甲型流感病毒H5W的血凝素(HA) 和神经氨酸酶(NA)基因，HA和NA基因源自于相同病毒株并且HA基因在多碱性氨基酸切割位点处被修饰以产生减毒的HA基因，所述方法包含将病毒在适合于重排病毒生长的条件下转染到哺乳动物细胞中。
54.权利要求53的方法，其中哺乳动物细胞选自MRC-5、MRC-9、Lederle130、张氏肝细胞和 WI-38 ;U937、Vero、CV-l、IMR-90 和 IMR-91、MDCK、MDBK、HEK、H9、CEM 和 CD4 表达型 HUT78、PerC6、BHK-21 细胞、BSC 和 LLC-MK2。
55.权利要求53的方法，其中哺乳动物细胞是Vero细胞。
全文摘要
本发明涉及用于生产改进的抗流感病毒疫苗的材料和方法，其中疫苗包含重排病毒，所述重排病毒具有来自于相同甲型流感病毒亚型或乙型流感病毒株的血凝素基因和神经氨酸酶基因以及来自于不同甲型流感病毒亚型或乙型流感病毒株的内部基因。在一种情况下，HA和NA基因以及内部基因来自于高致病性甲型流感H5N1毒株。
文档编号C12N7/04GK102257135SQ200980150850
公开日2011年11月23日 申请日期2009年12月16日 优先权日2008年12月16日
发明者哈特穆特·埃利克, 奥特弗里德·基斯特纳, 法尔科-京特·法尔科纳, 诺埃尔·巴雷特 申请人:巴克斯特医疗保健股份有限公司, 巴克斯特国际公司