专利名称：一种制酸浆豆腐用菌粉的生产方法
技术领域：
本发明属于益生菌细胞固定化的延伸技术领域，特别涉及一种制酸浆豆腐用菌粉 的生产方法。
背景技术：
微胶囊技术包埋益生菌的方法亦是固定化细胞技术，是20世纪60年代发展起来 的一门新兴生物技术，是指利用化学或物理的手段将游离的细胞定位于限定的空间区域， 并使其保持活性，反复利用。固定化细胞技术因具有独特优势和广阔的应用前景而引起人 们的极大关注，其研究与应用也得到迅速发展。对于固定化细胞的制备前人做了大量的工 作，由于用途的多样化使得对其性能的要求也不一样，从现有文献来看，主要针对固定化细 胞的机械强度、弹性、传质性能、成球难易程度、载体对微生物的毒性等方面的研究。微胶囊包埋可保护益生菌免受噬菌体的侵害，提高其在冷冻干燥过程中的存活 率，增加贮存过程中的稳定性。Simione F P和Brown E M曾对过冷冻干燥过程中加入像甘 油、蔗糖等保护剂的研究，保护剂的加入大大提高了菌种的存活率，同时Kaasen I等也对海 藻糖作为保护剂进行了深入的研究，研究表明加海藻糖能够降低冷干过程对细胞膜、脂质 体等的伤害作用。利用冷冻干燥技术生产的乳酸菌粉具有菌数多、活力强、运输方便及保存 期长等优点。但由于生产成本较高，生产量小，一般多用于菌种保存而不宜作为母发酵剂或 生产发酵剂使用。近年来，一些单位曾试用热风喷雾干燥法制备乳酸菌粉，但由于热风温度 较高，干燥后的菌种的活菌数及活力受到较大影响，产品质量不稳定而未能在实际生产过 程中推广应用。喷雾干燥方法是生产干燥、稳定、小体积食品的常用方法，它也常用于微生物的浓 缩和保存，近年来有许多报道用喷雾干燥方法制备发酵产品应用的发酵剂。但由于喷雾干 燥过程中加热和脱水会对微生物产生破环作用，Lian等比较和研究了不同载体介质经喷雾 干燥后菌的存活情况，同时他们也研究载体浓度、排风温度对菌存活的影响。Charpeutier 等对喷雾干燥后获得的粉末进行电镜扫描，阿拉伯胶、明胶和可溶性淀粉微粒在球体表面 产生影响，如被脱水一样。另一方面以脱脂乳为载体时，脱脂乳微粒的表面具有可见裂缝， 这些裂缝使热的散失变得容易而减少了热对菌的破坏，所以用脱脂乳为载体的粉有更高的 存活率。真空冷冻干燥简称冻干是制备和保存生物材料最有效的方法之一，冻干是冷冻和 干燥技术的有机结合。细胞在冻干过程中要经受冷冻和干燥两种激烈因素的作用，损伤是 不可避免的。为了提高真空冷冻干燥后微生物的存活率人们进行了大量的研究。影响乳酸 菌冻干效果的因素有很多，如菌株、细胞大小及形状、生长阶段及速率、初始细胞浓度、保护 剂系统、预冻温度、降温速率、冷冻干燥条件、细胞含水量、细胞膜成分和复水条件等，其中 保护剂系统的影响最为突出。若在冻干时采取一定的保护措施，加入适宜的保护剂系统，可 在很大程度上减轻或避免冷冻干燥对细胞带来的损伤。冻干损伤主要包括机械损伤、溶质 损伤、细胞膜损伤和细胞代谢调节作用损伤。针对以上各种损伤可以选用各种保护剂。
目前国内外主要研究冷冻干燥法生产菌粉的加工工艺，虽然菌落活数较高，但是 所用生产成本也较高，市场前景并不乐观。
发明内容
为了使微胶囊达到其生物安全性，并适合于工业化生产，本发明将喷雾干燥技术 和生物微胶囊化原理结合起来，筛选出该菌体细胞适宜的生物相容性壁材并通过喷雾干燥 进行合理包埋，这样既达到了生物相容安全的目的，也延长了菌体在自然环境中的存活时 间。本发明的目的是在较低成本下生产益生菌粉提供工业化生产，促进本行业的发展。一种制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，其特征在于菌种筛选后，进行优化培养液的 制备，浓缩菌液的制备，然后在优化培养液中加入保护剂和包埋剂以及浓缩菌液振荡培养 得喷粉前的营养液，再将其喷雾干燥，最后保藏喷雾干燥所得的菌粉，本发明涉及到优化 培养液的制备、浓缩菌液的制备，保护剂的筛选，包埋剂比例与喷雾干燥条件，具体步骤如 下(1)优化培养液的制备，方法如下优化培养液配方为酵母膏5 10g，胰蛋白 胨5 10g，碳酸钙1 3g，葡萄糖5 10g，氯化钠1 5g，番茄汁100 200ml，黄 浆汁50 100ml，吐温-80 1 3ml，柠檬酸二胺1 3g，磷酸氢二钾2 4g，硫酸镁 0. 5 2g，硫酸锰0. 5 2g，添加蒸馏水至1000ml，调pH值为7. 0 7. 2，121°C灭菌20min 备用；由于此菌种是从酸浆豆腐的黄浆汁中提取，故在做培养基时向培养液中添加了一定 量的黄浆汁，以促使细菌更好的生长；(2)浓缩菌液的制备，方法如下取步骤(1)制备的优化培养液，向其中加入筛选 的菌种(菌种为从酸浆水中筛选出的植物乳杆菌)，35 40°C，100 150r/min振荡培养 24 48h，调节菌液pH值为4 7，再用高速冷冻离心机进行浓缩，浓缩条件为温度5 15°C，转速4000 5000r/min，离心时间10 20min，最终菌泥与生理盐水按0. lg/ml进 行4°C冷藏；在此浓缩条件下，菌落成活率高达90% ；(3)取步骤(1)制备的优化培养液，向其中加入保护剂和包埋剂以及浓缩菌液振 荡培养得喷粉前的营养液，以脱脂奶粉、糊精、葡萄糖、谷氨酸钠为保护剂，其添加量分别占 喷粉前的营养液质量的5 10%、4 8%、2 5%和1 5% ；以海藻酸钠和阿拉伯胶为 包埋剂，海藻酸钠添加量占喷粉前的营养液质量的1 6%。，阿拉伯胶添加量占喷粉前的营 养液质量的1 5%0 ；加入的浓缩菌液与喷粉前的营养液的体积比一般为5% ；(4)再将步骤(3)所得的喷粉前的营养液振荡培养，振荡培养时间可为3 5h，然 后喷雾干燥，喷雾干燥条件如下进口温度170 190°C，出口温度65 90°C，最后保藏喷 雾干燥所得的菌粉。喷雾干燥致死主要原因是高温致死，高温使微生物的蛋白质和核酸等重要物质发 生变性，例如使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂成分等。常用保护 剂分为糖类、多元醇类、感胶离子盐类、氨基酸类和蛋白质及肽类等大分子物质，它们可以 起到稳定蛋白结构、占位性屏障和包埋性屏障等作用，从而减小高温致死率。本发明以脱脂 奶粉、糊精、葡萄糖、谷氨酸钠为保护剂，其添加量分别占喷粉前的营养液质量的5 10%、 4 8%、2 5%和1 5%。喷粉前的营养液中加入本发明的保护剂，恒温振荡培养后经 80 90°C，30min水浴后菌落活数可达107，结果证明这几种保护剂可以起到很好的保护效果。喷雾干燥条件与包埋剂比例的选择包埋剂一般都是一些天然大分子物质或人工 合成大分子有机物质，包括一些胶体类物质、大分子多糖、蛋白质类物质等。本发明以海藻 酸钠和阿拉伯胶为包埋剂，海藻酸钠添加量占喷粉前的营养液质量的1 6%。，阿拉伯胶添 加量占喷粉前的营养液质量的1 5%。;喷雾干燥条件如下进口温度170 190°C，出口温 度65 90°C，菌粉菌落活数可达到109，成活率可达12. 5%。本发明的有益效果为按照本工艺流程生产的菌粉菌落活数可达到109，实现了在 较低成本下生产具有较高菌落数的工业化要求，能够满足生产酸浆豆腐的实际需要，并为 工业化生产益生菌粉提供了一定的理论基础。相比冷冻干燥来说，本发明的加工工艺简单、 成本较低，有很大的生产市场。同时，通过此种新微胶囊化方法包埋的微胶囊粒子直径比较 均勻，较挤压法等其他方法包埋的粒子直径要小，便于菌种更好更安全地应用于生物保健 品中，适宜于大规模工业化生产。
图1是整个工艺的流程图；图2是菌落数随培养时间变化趋势。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明实施例1一种制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，整个工艺的流程图如图1所示，菌种筛选后， 进行优化培养液的制备，浓缩菌液的制备，然后在优化培养液中加入保护剂和包埋剂以及 浓缩菌液振荡培养得喷粉前的营养液，再将其喷雾干燥，最后保藏喷雾干燥所得的菌粉，本 实施例涉及到优化培养液的制备、浓缩菌液的制备，保护剂的筛选，包埋剂比例与喷雾干燥 条件，具体步骤如下(1)制备优化培养液，优化培养液配方为酵母膏5g，胰蛋白胨5g，碳酸钙 1. 5g，葡萄糖:5g,氯化钠4. 5g，番茄汁:100ml,黄浆汁:100ml，吐温-80 :1ml，柠檬酸二 胺lg，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰0. 5g，添加蒸馏水至1000ml，调pH值为 7. 0 7. 2，121°C 灭菌 20min 备用；(2)菌液的制备取3个灭菌的100ml三角瓶，分别将步骤⑴制备的优化培养液 50ml放入其中，然后把活化好的植物乳杆菌(植物乳杆菌从酸浆水中筛选)接种到优化培 养液内，恒温振荡培养(35 40°C，100 150r/min) 24h，作为母菌液，然后把3瓶母菌液混 合摇勻备用；浓缩菌液的制备，方法如下取4个灭菌的100ml三角瓶，分别装入45ml步骤⑴ 制备的优化培养液，向其中各加入5ml母菌液，摇勻，恒温振荡培养(35°C，100r/min)24h， 然后调节菌液PH值为6. 5，各取4. 0ml分装到5ml离心管中离心，再用高速冷冻离心机进行 浓缩，浓缩条件为温度10°C，转速4500r/min，离心时间lOmin，最终菌泥与生理盐水按 0. lg/ml进行4°C冷藏；(3)取步骤(1)制备的优化培养液，向其中加入保护剂和包埋剂以及浓缩菌液振荡培养得喷粉前的营养液，以脱脂奶粉、糊精、葡萄糖、谷氨酸钠为保护剂，其添加量分别占 喷粉前的营养液质量的5%、4%、3%和2% ；以海藻酸钠和阿拉伯胶为包埋剂，海藻酸钠添 加量占喷粉前的营养液质量的2. 5%。，阿拉伯胶添加量占喷粉前的营养液质量的2%0 ；加入 的浓缩菌液与喷粉前的营养液的体积比为5% ；(4)再将步骤(3)所得的喷粉前的营养液振荡培养，菌落数随培养时间变化趋势 如图2所示，从图中可以看出振荡培养时间3 5h，培养液菌落数含量较高，可达1013，而且 对营养液的营养成分几乎不消耗，能够保证喷雾干燥后粉末营养成分的充足，以保证菌粉 中细菌的长时间存活，本实施例振荡培养5h，然后喷雾干燥，喷雾干燥条件如下进口温度 170°C，出口温度65°C，最后保藏喷雾干燥所得的菌粉。所得菌粉菌落活数为7 . 86X 109。实施例2 —种制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，整个工艺的流程图如图1所示，菌种筛选后， 进行优化培养液的制备，浓缩菌液的制备，然后在优化培养液中加入保护剂和包埋剂以及 浓缩菌液振荡培养得喷粉前的营养液，再将其喷雾干燥，最后保藏喷雾干燥所得的菌粉，本 实施例涉及到优化培养液的制备、浓缩菌液的制备，保护剂的筛选，包埋剂比例与喷雾干燥 条件，具体步骤如下(1)优化培养液的制备，优化培养液配方为酵母膏5g，胰蛋白胨5g，碳酸钙 3g，葡萄糖:8g,氯化钠:5g,番茄汁:150ml,黄浆汁:80ml，吐温-80 :3ml，柠檬酸二胺 1.5g，磷酸氢二钾:2g，硫酸镁lg，硫酸锰lg，添加蒸馏水至1000ml，调pH值为7.0 7. 2， 121°C灭菌20min备用；(2)菌液的制备取3个灭菌的IOOml三角瓶，分别将步骤⑴制备的优化培养液 50ml放入其中，然后把活化好的植物乳杆菌(植物乳杆菌从酸浆水中筛选)接种到优化培 养液内，恒温振荡培养(35 40°C，100 150r/min) 20h,作为母菌液，然后把3瓶母菌液混 合摇勻备用；浓缩菌液的制备，方法如下取4个灭菌的IOOml三角瓶，分别装入45ml步骤(1) 制备的优化培养液，向其中各加入5ml母菌液，摇勻，恒温振荡培养(35°C，120r/min)24h， 然后菌液PH值为6，各取4. Oml分装到5ml离心管中离心，再用高速冷冻离心机进行浓缩， 浓缩条件为温度5°C，转速4500r/min，离心时间lOmin，最终菌泥与生理盐水按0. lg/ml 进行4°C冷藏；(3)取步骤(1)制备的优化培养液，向其中加入保护剂和包埋剂以及浓缩菌液振 荡培养得喷粉前的营养液，以脱脂奶粉、糊精、葡萄糖、谷氨酸钠为保护剂，其添加量分别占 喷粉前的营养液质量的8%、5%、2%和3% ；以海藻酸钠和阿拉伯胶为包埋剂，海藻酸钠添 加量占喷粉前的营养液质量的3%。，阿拉伯胶添加量占喷粉前的营养液质量的2. 5%0 ；加入 的浓缩菌液与喷粉前的营养液的体积比为4% ；(4)再将步骤(3)所得的喷粉前的营养液振荡培养，振荡培养4h，然后喷雾干燥， 喷雾干燥条件如下进口温度175°C，出口温度70°C，最后保藏喷雾干燥所得的菌粉。所得 菌粉菌落活数为6. 14X109o实施例3本实施例的制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，除了优化培养液配方与实施例1不同 夕卜，其他与实施例1相同，本实施例的优化培养液配方为为酵母膏7g，胰蛋白胨7g，葡萄糖10g，氯化钠4. 5g，番茄汁200ml，黄浆汁:150ml，吐温-80 :3ml，柠檬酸二胺1. 5g，磷 酸氢二钾4g，硫酸镁lg，硫酸锰lg，添加蒸馏水至1000ml，调pH值为7. 0 7. 2，121°C 灭菌20min备用。本实施例所得菌粉菌落活数为6. 55 X 109。实施例4本实施例的制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，除了保护剂比例与实施例1不同外， 其他与实施例1相同，本实施例的保护剂比例为脱脂奶粉、糊精、葡萄糖、谷氨酸钠添加量 分别占喷粉前的营养液质量的10%、6%、3%和5%。本实施例所得菌粉菌落活数为6. 78 X 109。实施例5本实施例的制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，除了包埋剂比例与实施例1不同外， 其他与实施例1相同，本实施例的包埋剂比例为海藻酸钠添加量占喷粉前的营养液质量 的3%。，阿拉伯胶添加量占喷粉前的营养液质量的2%0。本实施例所得菌粉菌落活数为7. 35X 109。实施例6本实施例的制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，除了喷雾干燥条件与实施例1不同 外，其他与实施例1相同，本实施例的喷雾干燥条件为进口温度180°C，出口温度75°C，最 后保藏喷雾干燥所得的菌粉。本实施例所得菌粉菌落活数为7. 03X 109。效果验证试验证明由本发明加工的菌粉发酵黄浆水pH值在3. 5左右，可以用来做 酸浆豆腐，而且得到的豆腐保水性好，质地细腻，口味清淡略带甘甜。
权利要求
一种制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，其特征在于菌种筛选后，进行优化培养液的制备，浓缩菌液的制备，然后在优化培养液中加入保护剂和包埋剂以及浓缩菌液振荡培养得喷粉前的营养液，再将其喷雾干燥，最后保藏喷雾干燥所得的菌粉，其中，优化培养液的制备，浓缩菌液的制备，保护剂的筛选，包埋剂比例与喷雾干燥条件的选择如下所述优化培养液的制备方法如下优化培养液配方为酵母膏5～10g，胰蛋白胨5～10g，碳酸钙1～3g，葡萄糖5～10g，氯化钠1～5g，番茄汁100～200ml，黄浆汁50～100ml，吐温-801～3ml，柠檬酸二胺1～3g，磷酸氢二钾2～4g，硫酸镁0.5～2g，硫酸锰0.5～2g，添加蒸馏水至1000ml，调pH值为7.0～7.2，121℃灭菌20min备用；浓缩菌液的制备方法如下在上述方法制备的优化培养液中加入筛选的菌种，35～40℃，100～150r/min振荡培养24～48h，调节菌液pH值为4～7，再用高速冷冻离心机进行浓缩，最终菌泥与生理盐水按0.1g/ml进行4℃冷藏；保护剂的筛选以脱脂奶粉、糊精、葡萄糖、谷氨酸钠为保护剂，其添加量分别占喷粉前的营养液质量的5～10％、4～8％、2～5％和1～5％；包埋剂比例与喷雾干燥条件的选择以海藻酸钠和阿拉伯胶为包埋剂，海藻酸钠添加量占喷粉前的营养液质量的1～6‰，阿拉伯胶添加量占喷粉前的营养液质量的1～5‰；喷雾干燥条件如下进口温度170～190℃，出口温度65～90℃。
2.根据权利要求1所述的一种制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，其特征在于所述菌种为 从酸浆水中筛选出的植物乳杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，其特征在于制备浓缩 菌液时，用高速冷冻离心机进行浓缩的浓缩条件为温度5 15°C，转速4000 5000r/ min，离心时间10 20min。
4.根据权利要求1所述的一种制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，其特征在于喷粉前的营 养液振荡培养3 5h，再喷雾干燥。
全文摘要
本发明公开了属于益生菌细胞固定化的延伸技术领域的一种制酸浆豆腐用菌粉的生产方法，菌种筛选后，进行优化培养液的制备，浓缩菌液的制备，然后在优化培养液中加入保护剂和包埋剂以及浓缩菌液振荡培养得喷粉前的营养液，再将其喷雾干燥，最后保藏喷雾干燥所得的菌粉，本发明涉及到优化培养液的制备、浓缩菌液的制备，保护剂的筛选，包埋剂比例与喷雾干燥条件，按照本工艺流程生产的菌粉菌落活数可达到109，实现了在较低成本下生产具有较高菌落数的工业化要求，能够满足生产酸浆豆腐的实际需要，并为工业化生产益生菌粉提供了一定的理论基础。相比冷冻干燥来说，本发明的加工工艺简单、成本较低，有很大的生产市场。
文档编号A23C20/02GK101869149SQ201010180329
公开日2010年10月27日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者于章龙, 张惠, 武慧媛, 薛文通 申请人:中国农业大学