专利名称：一对大白菜芜菁花叶病毒病est-ssr标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一对EST-SSR标记，尤其是与大白菜芜菁花叶病毒(TuMV)抗病和感病 基因紧密连锁的EST-SSR标记，属于生物技术领域。
背景技术：
大白菜(Brassica rapa L. ssp. pekinensis)原产于我国，是我国乃至日本、朝鲜、 韩国等国家的重要蔬菜。病毒病是我国大白菜的三大病害之一，平均每年造成5%的产量 损失，有些年份减产10%以上，病害严重的地块几乎绝收。该病防治困难，目前，还没有可 以普遍适用的抗病毒病药剂或其它行之有效的控制技术，培育抗病品种仍然是一条最有效 且可持续的防治措施。但常规育种程序繁琐，在抗性选择时，表型观测困难，选育时间较长， 另一方面抗性遗传易受环境条件的影响，选择准确度不高，难以适应生产的需要。采用分子 标记辅助育种可大大加快育种进程。研究表明，我国大白菜病毒病主要是由三种病毒单独 或复合浸染所致，即芜菁花叶病毒病(Turnip mosaic virus，简称TuMV)、黄瓜花叶病毒病 (Cucumber mosaic virus，简称 CMV)和烟草花叶病毒病(Tobacco mosaicvirus，简称TMV)。 其中，TuMV是主要病原，占病毒分离物的71.9%。因此，筛选与大白菜TuMV抗性有关的分 子标记对指导今后大白菜抗病毒病育种具有重要意义。国内外许多学者报道过这方面的研究。如闫瑾琦(2000)采用RAPD方法找到2 个与大白菜抗TuMV基因紧密连锁的标记，遗传距离分别为9. 5cM和15.36cM。韩和平等 (2004)筛选到2个与大白菜TuMV感病基因紧密连锁的AFLP分子标记，其遗传距离分别为 7. 5和8. 4cM。张俊华等(2006)筛选出2个与大白菜TuMV_C3株系抗病基因紧密连锁的 EST-PCR-RFLP分子标记BS300及BS160，遗传距离均为6. 5cM。Gao等(2008)以甘蓝为材 料，采用BSA法，筛选到两个与TuMV抗性基因连锁的RAPD分子标记，连锁距离分别为7. 7c M和8. 38cM，并将其转化为SCAR标记。但相对于实际应用，这些标记的连锁遗传距离还较 远。一般情况下，5cM以下的分子标记才有应用价值。张晓伟等(2009)筛选到3个与大白 菜TuMV抗性有关的QTLs连锁距离分别为2. 9cM、2. 4cM和0. 5cM的AFLP标记，但均为显性 标记，在后代选择中难以区分纯合体和杂合体。因此，筛选与大白菜TuMV抗性基因连锁距 离在5cM以下且呈共显性的EST-SSR分子标记具有重要意义。
发明内容
为了克服现有分子标记在大白菜抗TuMV育种辅助选择应用中的不足，本发明提 供一对连锁距离为3. 8cM且呈共显性的EST-SSR分子标记，该对分子标记不仅能用于大白 菜抗TuMV育种辅助选择，而且能在后代选择中区分纯合体和杂合体，从而有利于抗病材料 的快速筛选和纯化。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一对大白菜芜菁花叶病毒病 EST-SSR标记，其特征是，其为一对等位标记ATA157和ATA154，与大白菜TuMV抗性位点间 的连锁距离为3. 8cM，其中，标记ATA157的片段长度为157bp，具有序列表SEQ ID No. 1中
3的序列；标记ATA154的片段长度为154bp，具有序列表SEQ ID No. 2中的序列。标记ATA157基因序列GCAAAACGGAGTACCCTAACGCCTTCATCAGGATCATCGGATTCGACAACAACCGTCAAGTCCAGTGC ATCAGTTTCATCGCCTACAAGCCACCAAGCTTCACCGGTGCTTAATTCGCTTTCATATAATAATAATATCTTCTCA TTTCATTTCCAAA(SEQ ID No. 1)标记ATA154基因序列TTGGAAATGAAATGAGAAGATATTATTATATGAAAGCGAATTAAGCACCGGTGAAGCTTGGTGGCTTG TAGGCGATGAAACTGATGCACTGGACTTGACGGTTGTTGTCGAATCCGATGATCCTGATGAAGGCGTTAGGGTACT CCGTTTTGCA(SEQ ID No. 2)本发明大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记的制备方法(1)采用改良CTAB法提取待测验单株的基因组DNA取幼叶0. lg，在液氮中研成粉末，装入1.5mL离心管中；加入700iiL 65°C预热 的 CTAB 提取缓冲液(2. 0 % CTAB(g/ml) ；1. 4mol/L NaCl ； lmol/LTris-HCl, pH = 8. 0 ； 0. 5mol/L EDTA ； 1. 0% 3 -巯基乙醇(V/V))，混勻，65°C 水浴 45min_lh，其间每 5_10min 摇一次；冷却至室温，离心取上清，用与所取上清液等体积的Tris饱和酚氯仿异戊醇 (25 24 1(V/V))抽提，摇勻后冰浴至分层；12000r/min离心lOmin，取上清液，用酚/氯 仿/异戊醇再抽提一次，取上清液加入热处理的Rnase至终浓度100 y g/mL，混勻后，37°C 水浴45min ；之后再次用酚/氯仿/异戊醇抽提，取上清，加入预冷的无水乙醇，_20°C保存 30min，离心，倒掉上清，用70%的酒精清洗，室温吹干；加入TE溶解DNA，-20°C保存备用； 用0. 8%的琼脂糖电泳检测DNA质量完整性。(2)利用本发明EST-SSR标记引物HCC259的上游引物和下游引物对上述基因组 DNA进行PCR扩增HCC259 的上游引物为GCAAAACGGAGTACCCTA (SEQ ID No. 3)HCC259 的下游引物为TTGGAAATGAAATGAGAAGA(SEQ ID No. 4)扩增采用20 u L 反应体系，其中，引物浓度 0. 75iimol I71，dNTPs 0. 2mmol I71， Taq 酶 1. 5U，模板 DNA 75ng，含 Mg2+的 10 X Buffer 2. 0 u L ；反应程序为94°C预变性 4min， 94°C变性lmin，48. 5°C退火45s，72°C延伸45s，共35个循环，72°C延伸10min，4°C保存；扩 增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上检测，每孔点样6 u L。(3)根据扩增结果，对照标准条带或通过测序，判断待测单株的抗、感特性，并推测 其基因型，以此达到辅助选育和纯化抗病材料的目的。本发明的有益效果是通过利用该引物，以待测单株的基因组DNA为模板，对本文 中所述的标记进行扩增，可实现对大白菜TuMV抗性的高效选择，加快大白菜抗TuMV新品系 的选育，建立新型的大白菜杂交种亲本选配体系；选育有自主知识产权的杂交一代品种，解 决我国目前生产上以常规种为主和花费大量外汇购买国外杂交种的难题。本发明可以不用 通过繁琐的病毒接种鉴定程序，在子叶期通过提取基因组DNA和PCR扩增，即可达到单株选 择的目的，选择的准确率高达96. 4%以上。
图1是标记ATA157和ATA154的筛选结果。
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图2是标记ATA157和ATA154在10个F2代分离群体单株中的扩增结果。图3是标记ATA157和ATA154在7个由抗病亲本材料“73”转育而来的抗病材料 中的扩增结果。图4是标记ATA157和ATA154在7个其它抗病材料中的扩增结果。图5是标记ATA157和ATA154在7个其它感病材料中的扩增结果。图中S1.感病亲本“71-36-2”，S2.感病对照材料“冠291 ”，R1.抗病亲本“73”， R2.抗病对照材料“8407”，A J.测验单株编号，1 7.测验材料编号。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。实施例1(1)采用改良CTAB法提取待测验单株的基因组DNA本实例中分别选用高抗TuMV的大白菜自交系材料“73”和高感TuMV的自交系材 料“71-36-2”为亲本材料，选用TuMV的大白菜国家级抗源“8407”和感TuMV的核心种质材 料“冠291”为对照材料。分别取0. 1克上述材料的幼叶在液氮中研成粉末，装入1. 5mL离 心管中。加入 700iiL 65°C预热的 CTAB 提取缓冲液(2.0% CTAB(g/ml) ； 1. 4mol/L NaCl ； lmol/L Tris-HCl, pH = 8. 0 ；0. 5mol/L EDTA ；1. 0% 3 _ 巯基乙醇(V/V)),混勻，65°C水浴 45min-lh，其间每5-lOmin摇一次。冷却至室温，离心取上清，与所取上清液等体积的Tris 饱和酚氯仿异戊醇(25 24 1(V/V))抽提，摇勻后冰浴至分层。12000r/min离心 lOmin,取上清液，用酚/氯仿/异戊醇再抽提一次，取上清液加入热处理的Rnase至终浓度 100 u g/mL,混勻后，37°C水浴45min。之后再次用酚/氯仿/异戊醇抽提，取上清，加入预冷 的无水乙醇，-20°C保存30min，离心，倒掉上清，用70%的酒精清洗，室温吹干。加入TE溶 解DNA，-20°C保存备用。用0. 8%的琼脂糖电泳检测DNA质量完整性。(2)利用本发明EST-SSR标记引物HCC259的上游引物和下游引物对上述基因组 DNA进行PCR扩增HCC259 的上游引物为GCAAAACGGAGTACCCTA (SEQ ID No. 3)HCC259 的上游引物为TTGGAAATGAAATGAGAAGA(SEQ ID No. 4)扩增采用20 u L 反应体系，其中，引物浓度 0. 75 ii mol I71，dNTPs 0. 2mmol I71， Taq 酶 1. 5U，模板DNA 75ng，含Mg2+的 10 XBufffer 2. Oy L。反应程序为94°C预变性 4min， 94°C变性lmin，48. 5°C退火45s，72°C延伸45s，共35个循环，72°C延伸10min，4°C保存。扩 增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上检测，每孔点样6 u L。(3)根据扩增结果，对照标准条带或通过测序，判断待测单株的抗、感特性，并推测 其基因型，以此达到辅助选育和纯化抗病材料的目的。实施例2如图1所示，利用引物HCC259，在抗病亲本材料“73”和抗病对照材料“8407”中分 别扩增出一条157bp的条带，命名为ATA157，在感病亲本材料“71-36-2”和感病对照材料 “冠291”中，分别扩增出一条154bp的条带，命名为ATA154。实施例3如图2所示，利用引物HCC259对10个F2代分离群体单株(A-J)进行检测，其中，
5CN 101838645 A
说明书
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一部分单株(如C、E、I号单株)扩出抗病标记条带ATA157，另一部分(F、J号单株)则扩 出感病条带ATA154，还有一部分仏、8、0、6、11号单株)扩出杂合条带。实施例4如图3所示，利用引物HCC259对7个由抗病亲本材料“73”转育而来的抗病亲本 材料(1-7号)进行检测，结果表明，7个抗病材料均扩出抗病标记ATA157，说明该标记可用 于以“73”及其转育材料为亲本所构建群体的TuMV抗性筛选。实施例5如图4所示，利用引物HCC259对7个其它抗病材料进行检测，其中，第2、4、5号抗 病材料均扩出抗病标记ATA157，表明利用该标记有望用于以这三个材料为亲本构建的群体 的TuMV抗性筛选；第1、3、6、7号抗病材料未扩出抗病标记ATA157，表明该标记不适用于以 此材料为亲本构建群体的TuMV抗性筛选。同时也表明抗病标记ATA157并不是一个通用标 记，目前仅适用于以抗病亲本“73”及其转育而来的抗病材料为亲本构建群体的TuMV抗性 筛选。有望用于本实例中第2、4、5号抗病材料后代的TuMV抗性选择，但还有待于进一步验 证。同样，对于抗病对照材料“8407”后代的TuMV抗性选择，也有待于进一步验证。实施例6如图5所示，利用引物HCC259对7个其它感病材料进行检测，结果表明，除第4个 材料外，其余六个均扩出感病标记ATA154，说明该标记有望间接用于以这六个材料为亲本 构建群体的TuMV抗性选择。同时也说明标记ATA154也不是一个通用标记，目前仅适用于感 病亲本“71-36-2”，同时有望用于实例中第1、2、3、5、6、7号材料，但还有待于进一步验证。 同样，对于感病对照材料冠291的实用性也有待于进一步验证。标记ATA154不适用于本实 例中第4号材料。另外，由于本专利中所涉及到的标记是一对等位标记，从图4可以看出，虽然利 用引物HCC259，在第1、3、6、7号抗病材料中未扩出抗病标记ATA157，但扩出了感病标记 ATA154。同样，由图5可以看出，尽管利用引物HCC259，在第4号感病材料中未扩出感病标 记ATA154，但扩出了抗病标记ATA157。因此，标记ATA157仍然有望适用于第4号感病材料， 同样，标记ATA154有望适用于第1、3、6、7号抗病材料后代的TuMV抗性选择。通过以上的标记筛选及适用性检验，可以得出以下结论由引物HCC259在大白菜 抗、感TuMV材料中扩增得到的标记ATA157和ATA154是一对等位标记，其中，标记ATA157 适用于大白菜自交系材料“73”的后代TuMV抗性选择，有望用于本文中第2、4、5号抗病材 料和第4号感病材料以及抗病对照材料“8407”后代的TuMV抗性筛选；标记ATA154适用于 大白菜自交系材料“71-36-2”后代的TuMV抗性筛查，有望用于本文中第1、2、3、5、6、7号感 病材料和第1、3、6、7号抗病材料以及感TuMV的大白菜核心种质材料“冠291”后代的TuMV 抗性筛查。
权利要求
一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记，其特征是，其为一对等位标记ATA157和ATA154，与大白菜TuMV抗性位点间的连锁距离为3.8cM，其中，标记ATA157的片段长度为157bp，具有序列表SEQ ID No.1中的序列；标记ATA154的片段长度为154bp，具有序列表SEQ ID No.2中的序列。
2.用于扩增权利要求1所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记的 引物序列HCC259，其特征是，其上游引物为GCAAAACGGAGTACCCTA ；下游引物为 TTGGAAATGAAATGAGAAGA。
3.权利要求1所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记的制备方法，其特征是 (1)采用改良CTAB法提取待测验单株的基因组DNA ； (2)利用权利要求2所述的引物HCC259 的上游引物和下游引物对步骤⑴获得的基因组DNA进行PCR扩增；(3)根据扩增结果，对 照标准条带或通过测序，判断待测单株的抗、感特性，并推测其基因型。
4.如权利要求3所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记的制备方法，其特 征是，所述步骤(1)采用改良CTAB法提取待测验单株的基因组DNA的具体步骤为取幼 叶0. lg，在液氮中研成粉末，装入1.5mL离心管中；加入700 μ L 65°C预热的CTAB提取缓 冲液，混勻，65°C水浴45min-lh，其间每5-lOmin摇一次；冷却至室温，离心取上清，用与 所取上清液等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇抽提，所述酚氯仿异戊醇的体积比为 25 24 1 ；摇勻后冰浴至分层；12000r/min离心lOmin，取上清液，用酚/氯仿/异戊醇再 抽提一次，取上清液加入热处理的Rnase至终浓度100 μ g/mL,混勻后，37°C水浴45min ；之 后再次用酚/氯仿/异戊醇抽提，取上清，加入预冷的无水乙醇，-20°C保存30min，离心，倒 掉上清，用70%的酒精清洗，室温吹干；加入TE溶解DNA，_20°C保存备用；用0.8%的琼脂 糖电泳检测DNA质量完整性；所述CTAB提取缓冲液为质量体积比为2. 0%的CTAB ；1. 4mol/ L NaCl ；lmol/L Tris-HCl, pH = 8. 0 ；0. 5mol/L EDTA ；体积比为 1. 0%的 β -巯基乙醇。
5.如权利要求3或4所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记的制备方 法，其特征是，所述步骤(2)进行PCR扩增为扩增采用20 μ L反应体系，其中，引物浓度 0. 75 μ mol · ΙΛ dNTPs 0. 2mmol · Λ Taq 酶 1. 5U,模板 DNA 75ng,含 Mg2+ 的 IOXBuffer 2. OyL ；反应程序为94°C预变性4min，94°C变性Imin, 48. 5°C退火45s，72°C延伸45s，共 35个循环，72°C延伸10min，4°C保存；扩增产物在8 %聚丙烯酰胺凝胶上检测，每孔点样 6 μ L0
6.权利要求1所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记在大白菜抗TuMV育种 辅助选择方面的应用。
7.权利要求1所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记在后代选择中区分纯合 体和杂合体方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一对与大白菜芜菁花叶病毒抗病和感病基因紧密连锁的EST-SSR标记ATA157和ATA154，属于生物技术领域。该标记是一对等位标记，与大白菜TuMV抗性位点间的连锁距离为3.8cM。其中，标记ATA157的片段长度为157bp；标记ATA154的片段长度为154bp。本发明还公开了一对EST-SSR标记引物HCC259，具有序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4中的序列。通过利用该引物，以待测单株的基因组DNA为模板，对本文中所述的标记进行扩增，可实现对大白菜TuMV抗性的高效选择，加快大白菜抗TuMV新品系的选育，建立新型的大白菜杂交种亲本选配体系。
文档编号C12N15/11GK101838645SQ20101018002
公开日2010年9月22日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者佟海申, 刘栓桃, 宋希云, 张志刚, 李巧云, 赵智中 申请人:山东省农业科学院蔬菜研究所;青岛农业大学