专利名称：检测芜菁花叶病毒的一步多重rt-pcr法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测芜菁花叶病毒的一步多重RT-PCR 法及其专用引物。
背景技术：
完菁花叶病毒(TurnipMosaic Virus,TuMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae) 马铃薯Y病毒属(Potyvirus),病毒粒子呈弯曲线形，长约720nm,宽约15_20nm,由95 %的外壳蛋白和5%的RNA构成。病毒核酸为单链正义RNA，约由10，000个核苷酸组成。TuMV 寄主范围广泛，在人工接种条件下，可侵染43科156属，超过318种双子叶植物及部分单子叶植物；主要侵染十字花科蔬菜作物和观赏性物种，是仅次于黄瓜花叶病毒(CMV)浸染大田蔬菜最重要的病毒。据调查，我国白菜因TuMV危害平均每年造成5%的产量损失，有些年份减产10%以上，病害严重的地块几乎绝收。对该病毒的快速、准确检测有助于控制其传播流行，减轻危害和损失。常用的植物病毒检测方法有传统的生物学检测方法、血清学方法、电镜检测法和分子生物学方法等。传统生物学方法简单、直观、可靠，能准确反映病毒的生物学特性，但需要具备指示植物、温室、网室等隔离条件，且检测速度很慢，如隔离措施不当，容易交叉感染，影响准确性。电镜检测是最直接、最准确的检测病毒的手段，但用电镜观察时需要样品含有的病毒浓度较高，因此需要对被检病毒进行提纯，病毒提纯费时费力，且电镜法所需电镜及超速离心设备价格昂贵，操作对初学者掌握难度较大。血清学方法是检测植物病毒最常用的有效方法之一，该方法需要与被检病毒相对应的特异性抗血清。但抗血清制备需要的时间较长，且检测结果容易受抗血清的特异性影响，有时会有交叉反应。分子生物学方法是从核酸水平来检测病毒的存在，比血清学方法灵敏度高，可检测到皮克(Pg)级甚至飞克 (fg)级，并且特异性更强，可进行大批量样本的检测。由于分子生物学方法显著的优越性， 使得其在病毒检测中得以迅速广泛的应用。分子生物学方法包括核酸杂交、双链RNA电泳、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、 荧光定量PCR、芯片检测等方法，其中RT-PCR方法检测病毒是最为广泛应用的方法之一，该方法需要病毒基因特异性引物(GSP)对病毒核酸模板进行扩增检测。虽然ELISA技术已经广泛应用于植物病毒的检测，但其检测的灵敏性无法与RT-PCR方法相比，RT-PCR方法是 DAS-ELISA方法敏感度的1000倍。随着人们对不同来源的病毒进行基因组测序工作的进展，GenBank的数据不断丰富，使得利用RT-PCR方法检测病毒变得更加切实可行。在此基础上人们进而开发了多重RT-PCR，在同一反应体系中同时检测多种病毒。一般RT-PCR检测法需要分两步进行先提取样品总RNA，然后经反转录获得cDNA后进行PCR检测，步骤相对繁琐。在两步法的基础上人们为了简化步骤，开发了一步RT-PCR法，即反转录和PCR扩增在同一反应体系中进行。因此，建立快速、高灵敏度的病毒检测体系是对TuMV病毒防治的先决条件。发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测芜菁花叶病毒的引物组。
D本发明提供的检测芜菁花叶病毒的引物组，为如下引物组C、引物组A或引物组D
所述弓I物组C包括引物对a和引物对b ；
所述引物组A包括引物对a;
所述引物组B包括引物对b ;
所述引物对a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成；
所述引物对b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子组成。
上述引物组中，所述引物组C还包括随机引物和Oligo d (T) 18 ；
所述引物组A还包括随机引物和/或Oligo d (T) 18 ；
所述引物组B还包括随机引物和/或Oligo d(T) 18。
所述随机引物为Random Primer,购自TaKaRa公司，产品目录号为D3801 ；
所述Oligo d(T) 18为Oligo d(T) 18，购自TaKaRa公司，产品目录号为D511。
上述引物组中，所述引物组C由所述引物对a、所述引物对b、所述随机引物和所述Oligo (KT) 18 组成；
上述引物组中，所述引物组A由所述引物对a、所述随机引物和/或所述Oligod(T) 18 组成；
上述引物组中，所述引物组B由所述引物对b、所述随机引物和/或所述Oligod(T) 18 组成。
本发明的第二个目的是提供一种检测芜菁花叶病毒的PCR试剂。
本发明提供的PCR试剂，为如下I)-3)中的任意一种
I)由上述的引物组中的所述引物组C、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；
2)由上述的引物组中的所述引物组A、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；
3)由上述的引物组中的所述弓丨物组B、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成。
在上述PCR试剂中，所述反转录酶为M-MLV ；
所述各引物组中的所述引物对a和所述引物对b的各条引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为O. 125 μ mol/L ；
所述引物组A或所述引物组B中的所述随机引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为 I. 25 μ mol/L ；
所述引物组A或所述引物组B中的所述Oligo d(T) 18在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为O. 625 μ mol/L。
本发明的第三个目的是提供一种检测芜菁花叶病毒的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的PCR试剂。
上述的引物组、上述的PCR试剂或上述的试剂盒在鉴定或辅助检测芜菁花叶病毒中的应用也是本发明保护的范围。或上述的引物组、上述的PCR试剂或上述的试剂盒在制备鉴定或辅助检测芜菁花叶病毒产品中的应用也是本发明保护的范围；或上述的引物组、上述的PCR试剂或上述的试剂盒在鉴定或辅助检测待测植物是否感染芜菁花叶病毒中的应用也是本发明保护的范围；在上述应用中，上述待测植物具体为萝卜、甘蓝或四月慢油菜。本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助检测待测植物是否感染芜菁花叶病毒的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤以待测植物组织的RNA提取物作为模板，分别用上述的PCR试剂或上述的试剂盒中的所述的引物组C、所述的引物组A或所述的引物组B 进行一步RT-PCR扩增，得到扩增产物，检测扩增产物，若所述引物组C扩增产物的大小为156bp和/或377bp，则待测植物为或候选为感
染芜菁花叶病毒；若所述引物组A扩增产物的大小为156bp，则待测植物为或候选为感染芜菁花叶
病毒;若所述引物组B扩增产物的大小为377bp，则待测植物为或候选为感染芜菁花叶病毒。上述方法中，所述大小为156bp的扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列I或与其同源性大于90%的核苷酸序列；所述大小为377bp的扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列2或与其同源性大于90%的核苷酸序列；所述一步RT-PCR扩增的退火温度为55°C ；所述检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳；所述待测植物为萝卜、甘蓝或四月慢油菜；上述方法中的所述待测植物组织的RNA提取物按照如下方法制备将所述待测植物叶片在提取液中研磨，得到研磨液，即得到RNA提取物，所述提取液由Tris、NaCl, EDTA、 SDS和水组成；所述Tris在所述提取液中的终浓度为200mM，所述NaCl在所述提取液中的浓度为250mM，所述EDTA在所述提取液中的浓度为25mM，所述SDS在所述提取液中的浓度为0.5% (质量百分含量)；所述提取液的pH值为7.5 ;所述研磨在23 °C -28 °C条件下进行；所述组织为叶片。上述提取液在提取RNA中的应用；上述应用中，所述提取的温度具体为 230C -28O。本发明的实验证明，本发明根据GenBank数据，设计了两套针对TuMV的特异性引物，利用反转录酶M-MLV和普通Taq酶，建立了一步法多重RT-PCR，可以实现对TuMV进行快速、准确地检测，尤其是两套针对TuMV的特异性引物确保了检测的准确性；另外在一步法多重RT-PCR中的模板只需要在室温条件下对样品简单研磨即可制备，研磨的粗提液或经浓缩后的DNA-RNA混合物均可作为模板，方法简便,不需要经过先对总RNA的单独提纯步骤；再者，一步法多重RT-PCR中的M-MLV反转录酶比现有的一步法RT-PCR使用的 SuperscriptII价格便宜,在实际应用中应更容易被接受。
图I为多种引物组合对检测效果的影响
图2为病毒量对扩增效率的影响
图3为粗提物经分离纯化浓缩后的产物图
图4为用粗提液与浓缩产物为模板进行检测的对比
图5为用GSPl引物组合对TuMV的快速检测结果
图6为用GSP2引物组合对TuMV的快速检测结果
图7为用GSPl引物组合和GSP2引物组合对TuMV的快速检测结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中部分材料如下TuMV毒源为来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所的北京TuMV毒株Cl、C3、C4， 山东农业科学院蔬菜所提供的TuMV毒株Lu2。TuMV毒株Cl、TuMV毒株C3、TuMV毒株C4记载在冯兰香、徐玲、刘佳、钮心恪、李秀生“北京地区大白菜芜菁花叶病毒株系的鉴定”《中国蔬菜》1988(4) :11-13;公众均可从北京农业生物技术研究中心获得。TuMV毒株Lu2记载在国家蔬菜抗病育种课题TuMV株系研究协作组“我国十省 (市)十字花科蔬菜芜菁花叶病毒(TuMV)株系分化研究”《病毒学杂志》1990，5 (I). 82-87 ; 公众可从北京农业生物技术研究中心获得。将上述Cl、C3、C4、Lu2分别在温室(25°C )条件下人工接种在四月慢油菜和汉王白萝卜，网罩隔离，得到分别感染Cl、C3、C4、Lu2的四月慢油菜和分别感染Cl、C3、C4、Lu2 的汉王白萝卜，上述接种在四月慢油菜样本的叶片花叶皱缩、失绿，呈现出感染TuMV病毒的典型症状。接种在汉王白萝卜样本的表型极轻微，叶片无皱缩，有轻微的明脉。负对照为未接种上述各种TuMV毒株的四月慢油菜和汉王白萝卜(生长状态正常， 没有TuMV病毒感染病症)。反转录酶M-MLV(产品目录号为D2639A)、Oligo d(T) 18 (产品目录号为D511)、 Random Primer (产品目录号为D3801，含有6个碱基的随机序列引物，有46种可能序列，5' 末端憐酸化修饰。)为TaKaRa公司产品。DNA聚合酶EasyTaq (API 11)及DNA marker IOObp plus(BM311)为北京全式金生物技术有限公司产品。实施例I、一步RT-PCR法中相关引物的设计及条件摸索一、一步RT-PCR法中相关引物的设计在自然条件下芜菁花叶病毒(TurnipMosaic Virus, TuMV)非常容易通过基因重组，产生变异。通过查阅文献获知在TuMV-6Kl基因内没有发现基因重组位点，序列高度保守，且TuMV-CP基因的C端相对比较保守。经对GenBank登录的122个TuMV株系进行序列比对，根据TuMV的6K1区段(GenBank 号 HQ446217. I (C4)编码区的第 3526-3681 位)及 CP 保守区(GenBank 号 HQ446217. I (C4)编码区的第9074-9450位)设计了两套特异性引物GSPl和GSP2 (见表I)。 所设计的引物经NCBI的BLAST检测，确保对TuMV检测的唯一性与准确性。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。表I为两套特异性引物序列
权利要求
1.一种检测芜菁花叶病毒的引物组，为如下引物组C、引物组A或引物组B :所述弓I物组C包括引物对a和引物对b ；所述引物组A包括引物对a;所述引物组B包括引物对b;所述引物对a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成；所述引物对b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子组成。
2.根据权利要求I所述的引物组，其特征在于所述引物组C还包括随机引物和Oligo d(T) 18 ；所述引物组A还包括随机引物和/或Oligo d (T) 18 ；所述引物组B还包括随机引物和/或Oligo d(T) 18。
3.根据权利要求I或2所述的引物组，其特征在于所述引物组C由所述引物对a、所述引物对b、所述随机引物和所述Oligo d(T) 18组成；所述引物组A由所述引物对a、所述随机引物和/或所述Oligo d(T) 18组成；所述引物组B由所述引物对b、所述随机引物和/或所述Oligo d(T)18组成。
4.一种检测芜菁花叶病毒的PCR试剂，为如下1)-3)中的任意一种1)由权利要求1-3中任一所述的引物组中的所述引物组C、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；2)由权利要求1-3中任一所述的引物组中的所述引物组A、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；3)由权利要求1-3中任一所述的引物组中的所述引物组B、dNTPs、反转录酶、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成。
5.根据权利要求4所述的PCR试剂，其特征在于所述反转录酶为M-MLV ；所述各引物组中的所述引物对a和所述引物对b的各条引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为O. 125ymol/L；所述引物组A或所述引物组B中的所述随机引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为 L 25 μ mol/L ；所述引物组A或所述引物组B中的所述Oligo d(T) 18在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为O. 625 μ mol/L。
6.一种检测芜菁花叶病毒的试剂盒，包括权利要求4或5所述的PCR试剂。
7.权利要求1-3任一所述的引物组、权利要求4或5的所述的PCR试剂或权利要求6 所述的试剂盒在鉴定或辅助检测芜菁花叶病毒中的应用；或权利要求1-3任一所述的引物组、权利要求4或5的所述的PCR试剂或权利要求6 所述的试剂盒在制备鉴定或辅助检测芜菁花叶病毒产品中的应用；或权利要求1-3任一所述的引物组、权利要求4或5的所述的PCR试剂或权利要求6 所述的试剂盒在鉴定或辅助检测待测植物是否感染芜菁花叶病毒中的应用；所述待测植物具体为萝卜、甘蓝或四月慢油菜。
8.一种鉴定或辅助检测待测植物是否感染芜菁花叶病毒的方法，包括如下步骤以待测植物组织的RNA提取物作为模板，分别用权利要求4或5的所述PCR试剂或权利要求6 所述试剂盒中的所述的引物组C、所述的引物组A或所述的引物组B进行一步RT-PCR扩增， 得到扩增产物，检测扩增产物，若所述引物组C扩增产物的大小为156bp和/或377bp，则待测植物为或候选为感染芜菁花叶病毒；若所述引物组A扩增产物的大小为156bp，则待测植物为或候选为感染芜菁花叶病毒； 若所述引物组B扩增产物的大小为377bp，则待测植物为或候选为感染芜菁花叶病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述大小为156bp的扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列I或与其同源性大于 90%的核苷酸序列；所述大小为377bp的扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列2或与其同源性大于 90%的核苷酸序列；所述一步RT-PCR扩增的退火温度为55°C ；所述检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳；所述待测植物为萝卜、甘蓝或四月慢油菜；所述组织为叶片；所述待测植物组织的RNA提取物按照如下方法制备将所述待测植物叶片在提取液中研磨，得到研磨液，即得到RNA提取物，所述提取液由Tris、NaCl、EDTA、SDS和水组成；所述 Tris在所述提取液中的终浓度为200mM，所述NaCl在所述提取液中的浓度为250mM，所述 EDTA在所述提取液中的浓度为25mM、所述SDS在所述提取液中的浓度为O. 5% (质量百分含量)；所述提取液的PH值为7. 5 ;所述研磨在23 °C -28 °C条件下进行。
10.权利要求8或9所述方法中的所述提取液在提取RNA中的应用；所述提取的温度具体为 23 °C -28 °C。
全文摘要
本发明公开了一种检测芜菁花叶病毒的一步多重RT-PCR法及其专用引物。本发明提供了一种检测芜菁花叶病毒的引物组，为如下引物组C、引物组A或引物组B所述引物组C由引物组A和引物组B组成；所述引物组A包括引物对a；所述引物组B包括引物对b；所述引物对a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成；所述引物对b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子组成。本发明的实验证明，本发明建立了一步法多重RT-PCR，对TuMV进行快速、准确地检测。
文档编号C12Q1/70GK102586478SQ20121003865
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者叶艳英, 姚磊, 曾钢, 马荣才 申请人:北京农业生物技术研究中心