专利名称：重组鲤鱼tor基因、蛋白及其制备与检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组鲤鱼TOR基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。
背景技术：
TOR (Target of rapamycin)是一种Ser/Thr蛋白激酶，首先在酵母中发现。与酵 母不同，在哺乳动物细胞中只有一个TOR基因，但mTOR(Mammaliantarget of rapamycin) 蛋白与不同成分构成两种复合体，分别称为mTORCl和mT0RC2。mTORCl对雷帕霉素 (Rapamycin, RAP)敏感，介导与营养因子相关的信号转导过程，调节细胞的生长与增殖过 程，对其功能与调节机制了解较多；mT0RC2对雷帕霉素不敏感，目前仅知其对肌动蛋白 (Actin)的组织和细胞骨架的形成起作用，但其具体调节机制尚不清楚。TOR是大鼠卵母细胞、脂肪细胞、胰腺β-细胞和人肌细胞蛋白质合成调控的中 心。人和大鼠TOR基因cDNA全长序列分别为8733和8544bp，开放阅读框为7650bp，同源 性高达98% ；编码2549个氨基酸残基的TOR蛋白质，分子量为289kDa。TOR蛋白氨基酸序 列和功能从酵母到哺乳动物均非常保守，氨基酸序列同源性可达90%。其保守性主要表现 在与其功能密切相关的几个结构区域。mTOR从N-端到C-端由HEAT域，FAT域、FRB域、 Kinase域、FATC域等五个结构域组成，分别起不同的作用。HEAT域介导蛋白与蛋白间的相 互作用；FAT域可与C-端的FATC域形成空间结构，调控Kinase域的活性；FRB域，其功能是 激活TOR ；Kinase域，是TOR的催化功能域。TOR是细胞生长和增殖的关键调控因子，能够整合胞外生长信号和胞内营养物质 状态，控制细胞的翻译、转录和自溶等多种重要生理过程。TOR主要通过p70S6K和4E-BP1 的信号途径调节细胞生长，使各种组织细胞合成各自代谢需要的功能相关蛋白质，调控细 胞总体的蛋白质合成能力。tIH#40s/JnMS S6(p70 ribosomal 40s submit protein s6kinase, P70S6K)，能够被各种细胞外信号激活。活化的P70S6K通过磷酸化核糖体小亚基S6蛋白，导 致一系列mRNAs的翻译表达上调，这些mRNAs的5’-端含有寡聚嘧啶核苷酸(5’-terminal oligopyrimidine，5，-T0P)。这些具有 5，-TOP 结构的 mRNAs 占细胞总 mRNAs 的 15 20%， 虽含量不多，但意义重大，它们翻译表达的主要产物包括大部分翻译元件成分，如核糖体 蛋白、延长因子EFla、EF2和polyA结合蛋白等。因此，TOR通过p70S6K调控着蛋白质翻 译元件的生物合成，这些元件是蛋白质生物合成的基础，控制着细胞的总体翻译能力。研究 表明短时(2h内)RAP抑制作用，可使细胞蛋白质合成率降低25%，随着RAP抑制作用时 间延长至20h，蛋白质合成率降低50%，这是由于RAP抑制TOR活性，导致翻译元件合成减 少，随时间延长细胞总的翻译能力逐渐降低所致。真核翻译起始因子 4E 结合蛋白 l(Eukaryotic translation initiationfactor 4E binding protein 1，4E-BP1)，可通过与真核翻译起始因子 4E (Eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)结合而抑制帽依赖性mRNA的翻译起始。eIF4E是三元真核起始因子 4F(Eukaryotic initiation factor 4F，eIF4F)复合物的组成亚基。eIF4F可以识别 5，-端具有帽结构的mRNAs。由于4E-BP1与eIF4E的结合受到4E-BP1磷酸化的调节。TOR可 4E-BP1磷酸化，导致其与eIF4E解离，游离的eIF4E结合到mRNAs 5，-端的帽结构，开启帽 依赖性mRNAs的翻译起始。RAP能阻断4E-BP1磷酸化和帽依赖性翻译。由于真核细胞的绝 大多数mRNAs 5’-端具有帽结构。因此，TOR通过4E-BP1控制着真核细胞蛋白的总体合成 起始。综上可见T0R通过p70S6K调控细胞蛋白合成所需元件的合成，而控制着细胞蛋 白质合成的总能力；通过4E-BP1控制了绝大多数帽依赖性mRNAs翻译的起始，成为真核细 胞蛋白质合成的调控中心。研究表明T0R是酵母、鼠卵细胞、鼠脂肪细胞、鼠胰腺β-细胞、 人肌细胞等真核细胞蛋白质合成调控的中心。迄今，关于TOR在哺乳动物细胞蛋白质合成、生长与增殖中发挥的调节作用的研 究已在人、大鼠、小鼠等哺乳动物细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见有关低等脊椎动 物鱼类细胞中TOR的研究报道，也未见有鲤鱼TOR基因的cDNA核苷酸序列和与其对应的氨 基酸序列的报道。研究和开发与鲤鱼TOR蛋白相关的基因克隆及其重组表达具有极其重要的作用， 因为研究清楚鲤鱼的TOR基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养存活率、控制细胞蛋 白质合成，以调控细胞生长等方面，由重组TOR基因序列设计的荧光定量引物和表达蛋白 制备的抗体可以检测TOR基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段 的表达情况，对进一步阐明TOR调控这些基本生物过程的机理意义重大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种重组鲤鱼TOR基因、蛋白及其制备与检测 方法和应用。本发明解决上述问题所采用的技术方案是一种具有SEQID NO :1所示的重组鲤 鱼TOR基因。一种具有SEQ ID NO :2所示的由SEQ ID NO :1所示重组鲤鱼TOR基因所表达的氨
基酸序列。一种SEQID NO :1所示的重组鲤鱼TOR基因的制备方法，包括下述步骤1)采集鲤 鱼的总RNA并以其肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链；2)以步骤1) 中的cDNA第一链为模板，利用特异性引物T1、T2进行PCR扩增，得到SEQ ID Ν0:1所示的 序列，所述Tl、Τ2的序列分别如下Tl :5’ -ATGTCTGGCACTGCCACAGTTCTGCAGC-3，，Τ2 5，-CTACCAAAAAGGGCACCATCCAATGTAGC-3，。具体地，所述步骤2)中以Tl、Τ2为引物利用DNA聚合酶进行PCR反应的50 μ 1 PCR 扩增体系中各组分及其比例为cDNA第一链，2. 5μ 1 ；50μΜ的Τ1，0. 25 μ 1 ；50μΜ的Τ2， 0. 25μ 1 ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus)，5· 0 μ 1 ；2. 5mM each 的 dNTP Mixture, 8. 0 μ 1 ； ddH20, 33. 5 μ 1 ；5U/y 1的DNA聚合酶，0. 5 μ 1 ；反应循环条件94°C预变性Imin ；94°C变性 30sec，68°C退火延伸8min，共30个循环；最后68°C退火延伸8min，反应完成。一种根据上述方法制备的重组鲤鱼TOR基因的检测方法，将Tl和T2PCR回收产 物的PCR扩增采用2 X Taq PCR Master Mix进行检测，50 μ 1 PCR扩增体系中各组分及其比例为50倍稀释的TOR回收产物1. 0 μ 1 ;50 μ M的T3，0. 25 μ 1禾口 50 μ M的Τ4，0. 25 μ 1 ； 2 X Taq PCR Master Mix, 25. 0 μ 1 ；ddH20，23. 5μ 1 ；反应循环条件94°C预变性 Imin ；94°C 变性 30sec，55. 3°C退火 30sec，72°C延伸 Imin 30sec，共 32 个循环；最后 72°C延伸 5min， 反应完成；所述T3、T4的序列分别如下上游引物T3，5，-CTGAAATACAGGACCAGTAAGAA-3，，下游引物T4，5，-AGTGATGCCAACCACAAGTAG-3，；2)取5 μ 1 PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶在100V，15min的条件下进行电泳检测，
凝胶成像系统观察分析结果。一种根据上述方法所制备的重组鲤鱼TOR基因的检测方法，其特征在于，将Tl 和T2PCR回收产物的PCR扩增采用2 X Taq PCR Master Mix进行检测，50 μ 1 PCR扩增体 系各组分及其比例为50倍稀释的GLS回收产物1. 0 μ 1 ;50 μ M的Τ3，0. 25 μ 1和50 μ M 的 Τ40. 25μ 1 或 50μΜ 的 Τ5，0. 25μ 1 和 50μΜ 的 Τ6，0. 25μ 1 ;2XTaq PCR Master Mix, 25. 0μ 1 ； ddH20,23. 5 μ 1 ；反应循环条件94°C 预变性 Imin ；94°C 变性 30sec，56°C 退火 30sec，72°C延伸Imin 30sec，共32个循环；最后72°C延伸5min，反应完成；所述T5、T6的 序列分别如下上游引物T5，5，-GTGGAATCTGGACCTATGAAG-3，，下游引物T6，5，-CCTCTAACTCCGAAAGCATCT-3 ；2)取5 μ 1 PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶在100V，15min的条件下进行电泳检测，
凝胶成像系统观察分析结果。上述检测方法中，50倍稀释的凝胶回收产物指重组鲤鱼TOR基因cDNA编码区核苷 酸序列的制备方法中所制备的重组鲤鱼TOR基因cDNA序列。上述重组鲤鱼TOR基因在检测鲤鱼TOR基因的表达情况中的应用。包括鲤鱼TOR 基因在各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的表达情况。在检测鲤鱼TOR基因的表达情况时，根据SEQ ID NO=I所示序列设计下述引物上游引物TD1，5' -ATCATACGCATCCAGTCCATTG-3 ‘；下游引物TD2，5' -GGTCATTAGCCAGTAGAGTGTTC-3‘。采用荧光定量PCR扩增，20 μ 1 PCR扩增体系中各组分及其比例为cDNA，2. 0μ 1 ； ΙΟμΜ 的 TDl，1.0y 1 ;10μΜ 的 TD2，1.0y 1 ;SYBR Premix Ex Taq II (2 X)，10. 0 μ 1 ; dH20，6. 0μ 1 ；反应循环条件95°C IOsec ；95 °C 5sec,60°C 30sec，共 44 个循环；最后延伸 720C 2min，反应完成。本发明从鲤鱼的不同组织细胞中分离TOR基因。作为结果，本发明从鲤鱼肠道组 织细胞分离了 TOR基因的cDNA编码区7548bp片段，并且确定了它的核苷酸序列和由此推 断的氨基酸序列。本发明人通过比对已知的斑马鱼、人、大鼠、小鼠的TOR基因的核苷酸序 列，找到保守区，然后根据斑马鱼胚胎的TOR基因(AB290031) cDNA编码区的序列，在不打破 氨基酸编码的前提下设计上游引物(5’-从起始密码子ATG的开始)，下游引物5’端起始于 斑马鱼TOR基因的天然终止密码子TGA，设计出了一对用于通过RT-PCR方法扩增鲤鱼TOR 基因cDNA编码区片段的引物(上游引物称为Tl，下游引物称为T2)，并应用这对引物扩增 出了特异性片段，测序后得到了鲤鱼TOR基因的cDNA编码区7548bp片段，序列分析表明与 斑马鱼的序列(AB290031)同源性为90.2%，且保持了正确的编码，推导出的由此序列编码的氨基酸序列与斑马鱼的蛋白氨基酸残基数目相同。这一 cDNA片段称为“cTOR”。所以，本发明的目的是通过已知的不同物种的TOR的核苷酸序列设计引物，然后 通过RT-PCR方法克隆鲤鱼TOR基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提供编码鲤鱼 TOR蛋白的基因的cDNA的编码区7548bp的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列(序列详 见序列表)。综上所述，本发明的有益效果是根据本发明获得的鲤鱼TOR基因cDNA的核苷酸 序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测TOR基因的组织表达特异性，也可进一步实现 鲤鱼TOR基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载体上可能会表达出完整的 TOR蛋白，进而可用于抗体生产，检测鲤鱼各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的 TOR基因的表达情况等。
图1是从鲤鱼肠细胞分离的总RNA的RT-PCR的结果(7548bp的cDNA cTOR)的电 泳图；图2是以Tl和T2引物的扩增产物为模板，以T3、T4为引物或以Τ5、Τ6为引物进 行PCR鉴定的电泳图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图，对本发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式 不限于此。本发明的重组鲤鱼TOR基因cDNA编码区核苷酸序列及其表达蛋白的氨基酸序列 分别如=SEQ ID NO =USEQ ID NO 2 所示。为了从鲤鱼组织细胞中分离cTOR基因(即SEQ ID NO 1所示序列)，本发明首 先按照提取总RNA的标准要求采集鲤鱼(Common carp, Cyprinus carpio)的各类组织样 本。现场宰杀鲤鱼后立即取肾脏、肠道、肌肉、脾脏及肝胰脏等组织块，放入冷冻管后立即入 液氮保存，带回实验室后置于_80°C冰箱保存备用。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂盒 (TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取鲤鱼肠道、肌肉、、肾脏、肝胰 脏及脾脏等组织的总RNA，最后根据文献报道的哺乳动物TOR基因在各类组织中的表达情 况和总RNA提取结果，选定以肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再 以此cDNA第一链为模板，利用特异性引物Tl、T2进行PCR扩增，得到目的片段。之后将电 泳后分离的目的片段切胶回收，测定双链cDNA的浓度，以巢式PCR方法对扩增产物进行鉴 定。Tl和T2引物对的扩增产物通过T3和T4、T5和Τ6的PCR扩增，电泳鉴定的得到预期大 小的DNA片段，初步验证了 Tl和Τ2扩增产物的正确性。将Tl和Τ2引物对的扩增产物的 样品送宝生物(大连)生物技术有限公司测序。作为结果，获得了 7548bp的鲤鱼cTOR基 因cDNA编码区的核苷酸序列。显示上面提到的特征的本发明的特异性PCR引物Tl和T2，可以利用RT-PCR方法 扩增出鲤鱼的cTOR基因的cDNA编码区片段。根据本发明获得的鲤鱼TOR基因cDNA的核 苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测TOR基因的组织表达特异性，也可进一步 实现鲤鱼TOR基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载体上可能会表达出完整的TOR蛋白，进而可用于抗体生产，检测鲤鱼各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状 态下的TOR基因的表达情况等等。鲤鱼TOR基因的cDNA编码区7548bp片段的克隆为了克隆来自鲤鱼肠道组织细胞的TOR基因包含7548bp编码区的cDNA，根据公 开的核苷酸序列(AB290031、XM_417614、NM_020009、NM_004958)，首先设计合成允许扩增 7548bp的cDNA的PCR引物对，即上游引物5，-ATGTCTGGCACTGCCACAGTTCTGCAGC-3，(Tl)下游引物5，-CTACCAAAAAGGGCACCATCCAATGTAGC-3，(T2)。然后设计合成了另外两对用于鉴别Tl和T2扩增产物的引物，即上游引物T3，5，-CTGAAATACAGGACCAGTAAGAA-3，，下游引物T4，5，-AGTGATGCCAACCACAAGTAG-3，；上游引物T5，5，-GTGGAATCTGGACCTATGAAG-3，，下游引物T6，5，-CCTCTAACTCCGAAAGCATCT-3，。为了利用RT-PCR方法克隆TOR基因的cDNA，从鲤鱼肠道组织提取总RNA，利用 TaKaRa总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取鲤 鱼肠道组织总RNA，进行电泳检测和紫外测定RNA浓度后置于-80°C冰箱保存备用。然后， 利用TaKaRa的M-MLV反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录反应，得到cDNA
第一链。以上面得到的cDNA第一链为模板，Tl、T2为引物，利用TaKaRa LA Taq DNA聚合 酶进行 PCR 反应。50 μ 1 PCR 扩增体系cDNA，2. 5μ 1 ;Τ1(50μΜ)，0. 25μ 1 ;Τ2(50μΜ)， 0. 25μ 1 ;10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus)，5. 0 μ 1 ；dNTP Mixture (each 2. 5mM), 8. 0 μ 1 ； ddH20, 33. 5 μ 1 ；TaKaRa LA Taq (5U/ μ 1)，0· 5 μ 1。反应循环条件94°C预变性 Imin ；94°C 变性30seC，68°C退火延伸8min，共30个循环；最后68°C退火延伸8min，反应完成。取5μ 1 PCR产物用0. 8%琼脂糖凝胶进行电泳检测(100V，15min)，凝胶成像系统观察分析结果。作 为结果，得到了 7548bp的特异性目的片段(图1)。Tl 和 T2 PCR 回收产物的 PCR 扩增采用 2 X Taq PCR Master Mix (KT201)进行， 50 μ 1 PCR扩增体系TOR 回收产物(50 X 稀释)，1.0 μ 1 ；Τ3 (50 μ Μ)，0. 25 μ 1 禾口 Τ4(50μΜ) 或 Τ5(50 μ Μ)，0. 25 μ 1 禾口 Τ6(50 μ Μ)，0· 25 μ 1 ;2 X TaqPCR Master Mix,25. 0 μ 1 ；ddH20, 23. 5 μ 1。反应循环条件94°C预变性 Imin ；94°C变性 30sec，55. 3°C (T3 和 T4)或 56°C (T5 和Τ6)退火30sec，72°C延伸Imin 30sec，共32个循环；最后72°C延伸5min，反应完成。取 5μ1 PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测(100V，15min)，凝胶成像系统观察分析结 果。作为结果，分别得到了约1800 (图2)和约700bp(图2)的扩增产物。其大小与T3T4 引物对设计的扩增产物1778bp和T5T6引物对设计的扩增产物676相符，表明扩增产物的 特异性。经过两次鉴定的T1T2扩增产物送往宝生物工程(大连)有限公司用测序。作为 结果，获得了 7548bp的鲤鱼TOR基因的cDNA编码区的核苷酸序列(SEQIDN0 1)。鲤鱼TOR基因的cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO 1显示了按上述方法所获得的cDNA克隆的核苷酸序列，和由此推断的 氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。在SEQ ID NO 1中，显示的序列是TOR基因的核苷酸序列，它包括了 cDNA编码区的7548bp的核苷酸序列，编码形成分子量286. 03kDa，含2515个氨基酸 残基的的TOR蛋白质。将鲤鱼TOR基因cDNA的核苷酸序列与斑马鱼TOR基因的cDNA的核苷酸序 列(GenBank登陆号AB290031)、原鸡TOR基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号 XM_417614)、小鼠TOR基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号NM_020009)、人TOR基 因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号NM_004958)进行比较。比较结果表明1)鲤鱼 TOR基因cDNA的核苷酸序列与斑马鱼、原鸡、小鼠和人的TOR基因cDNA的核苷酸序列分别 有91. 0,78. 0,78. 4和78. 0%的相似性。由鲤鱼的这段核苷酸序列推导出的氨基酸序列与 斑马鱼、原鸡、小鼠和人的相似性分别为98. 8,90. 3,85. 1和90. 8%。综上所述，本发明提供利用RT-PCR法克隆鲤鱼TOR基因cDNA编码区的引物和编 码鲤鱼的TOR蛋白质的7548bp的cDNA和由此推断的氨基酸序列。此cDNA包括了 7548bp 的核苷酸序列，它编码含有2515个氨基酸残基的蛋白质，经过进一步的改造后它可以亚克 隆到如pET或pcDNA3. 1等原核或真核表达载体上进行表达。重组的cDNA片段可能会表达 出完整的TOR蛋白多肽段，进而可用于抗体生产，检测鲤鱼各类细胞和组织、早期胚胎、个 体在不同状态下的TOR基因的表达情况等。不同体重阶段鲤鱼不同肠段TOR基因表达本实例以鲤鱼肠道对象，利用荧光定量PCR技术分析确定了 TOR基因在鲤鱼不同 体重生长阶段不同肠段的表达情况。不同体重鱼在其体重分别达到20、30、40、60、70g左 右，选取体重接近的4尾鱼进行取样，分别测定前肠，中肠和后肠TOR mRNA的表达量。样品液氮研磨，提取总RNA。荧光定量用鲤鱼肠道cDNA第一链采用PrimeScript RT reagent Kit (宝生物工程(大连)有限公司，DRR037AS)合成，按试剂盒说明书的方法 操作。TOR cDNA荧光定量扩增，根据本发明克隆得到的鲤鱼TOR基因的cDNA编码区序 列，设计成一对TOR特异性定量扩增引物上游引物TD1，5' -ATCATACGCATCCAGTCCATTG-3‘；下游引物TD2，5' -GGTCATTAGCCAGTAGAGTGTTC-3‘。荧光定量PCR扩增采用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II (Perfect RealTime) (宝生物工程(大连)有限公司，DRR083A)进行，20μ 1 PCR扩增体系(ΛΝΑ，2·0μ 1 ； TDl(IOyM), 1.0 μ 1 ；TD2 (10 μ Μ)，1. 0 μ 1 ；SYBR Premix Ex Taq II (2 X)，10. 0 μ 1 ； dH20，6. 0μ 1。反应循环条件95°C IOsec ；95°C 5sec,60°C 30sec，共 44 个循环；最后延伸 720C 2min，反应完成。相对定量计算和统计分析各肠段TOR mRNA相对表达量以同一体系中TOR与管家 基因β -actin的荧光值的相对比值X 100来表示。结果表明不同体重鲤鱼不同肠段肠道组织TOR mRNA相对表达量存在显著差异。 其中，前肠体重31. Ig时，TOR mRNA相对表达量显著高于18. Ig时的表达量(P < 0. 05)； 体重31. 1 73. 9g之间，差异不显著(P >0.05)。中肠和后肠体重18. 1 31. Ig时，TOR mRNA相对表达量差异不显著(P > 0. 05)；体重40. 6g时，显著高于体重为18. 1 31. Ig时 的表达量(P < 0. 05)；体重为40. 6 73. 9g时，TOR mRNA的相对表达量达差异不显著(P > 0. 05)。
体重为18. Ig,前肠TOR mRNA的相对表达量显著高于后肠(P < 0. 05)；前肠和中 肠，中肠与后肠之间差异不显著(P > 0. 05)。体重为31. Ig时，前肠TORmRNA的相对表达量 显著高于中肠和后肠(P <0.05)；中肠与后肠之间差异不显著(P >0.05)。体重为40. 6 73. 9g时，各肠段TOR mRNA相对表达量差异不显著(P > 0. 05)。表1不同体重鲤鱼不同肠段TOR mRNA的相对表达量(％，η = 4)
体重(g)前肠中肠后肠18.10.18±0.13aio.i4±o.nan0.09±0.06at31.10.25±0. Ilabl0.15±0.12at0.13±0.09at40.60.30±0.14bt0.29±0.05bt0.26±0.02bt58.00.25±0.07bt0.26±0.24bt0.26±0.18bt73.90.26±0.12bt0.25 士 0.15bt0.28±0.20bta, b表示同列统计显著性，如所标注字母相同，均为a或均为b，表示该两组数据 比较无显著性差异，如所标注字母不相同，如分别标注为a、ab，表示该两组数据有显著性差 异；t，$表示同行统计显著性，如所标注符号相同，表示该两组数据比较无显著性差异，如 所标注符号不相同，表示该两组数据有显著性差异(P < 0. 05)。通过检测鲤鱼TOR基因在各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的表达 情况，可以对检测的中间数据结果进行进一步的分析和研究，对鲤鱼GLS基因的表达情况、 其表达蛋白的形状及相关情况，做进一步研究，进而可用于抗体生产。
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权利要求
一种具有SEQ ID NO1所示的重组鲤鱼TOR基因。
2.一种具有SEQ ID NO :2所示的由SEQ ID NO 1所示重组鲤鱼TOR基因所表达的氨基酸序列。
3.一种SEQ ID NO :1所示的重组鲤鱼TOR基因的制备方法，其特征在于，包括下述步骤1)采集鲤鱼的总RNA并以其肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链；2)以步骤1)中的cDNA第一链为模板，利用引物T1、T2进行PCR扩增，得到SEQID NO 1所示的序列，所述Tl、T2的序列分别如下Tl :5’ -ATGTCTGGCACTGCCACAGTTCTGCAGC-3‘, T2 :5’ -CTACCAAAAAGGGCACCATCCAATGTAGC-3’。
4.根据权利要求3所述的重组鲤鱼TOR基因的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中 以Tl、T2为引物利用DNA聚合酶进行PCR反应的50 μ 1 PCR扩增体系中各组分及其比例 为cDNA 第一链，2· 5μ 1 ；50μΜ 的 Tl，0· 25 μ 1 ；50μΜ 的 Τ2，0· 25μ 1 ;10XLA PCR Buffer 11 (Mg2+Plus), 5.0 μ 1 ；2. 5mM each 的 dNTP Mixture, 8. 0 μ 1 ； ddH20,33. 5 μ 1 ；5U/y 1 的 DNA 聚合酶，0. 5μ 1 ；反应循环条件94°C预变性Imin ；94°C变性30sec，68°C退火延伸8min，共 30个循环；最后68°C退火延伸8min，反应完成。
5.一种权利要求3或4所制备的重组鲤鱼TOR基因的检测方法，其特征在于，包括下述 步骤1)将Tl和T2PCR回收产物的PCR扩增采用2 X Taq PCR Master Mix进行检测，50 μ 1 PCR扩增体系各组分及其比例为50倍稀释的GLS回收产物1. 0 μ 1 ;50 μ M的Τ3，0. 25 μ 1 和 50μΜ&Τ4，0. 25 μ 1 ；2XTaq PCR Master Mix, 25. 0 μ 1 ；ddH20，23. 5μ 1 ；反应循环条件 94°C预变性 Imin ；94°C变性 30sec，55. 3°C退火 30sec, 72°C延伸 Imin 30sec,共 32 个循环； 最后72°C延伸5min，反应完成；所述T3、T4的序列分别如下上游引物 T3，5，-CTGAAATACAGGACCAGTAAGAA-3，， 下游引物 T4，5，-AGTGATGCCAACCACAAGTAG-3，；2)取5μ 1 PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶在100V，15min的条件下进行电泳检测，凝胶 成像系统观察分析结果。
6.一种权利要求3或4所制备的重组鲤鱼TOR基因的检测方法，其特征在于，包括下述 步骤1)将Tl和T2PCR回收产物的PCR扩增采用2 X Taq PCR Master Mix进行检测，50 μ 1 PCR扩增体系中各组分及其比例为:50倍稀释的GLS回收产物Ι.Ομ 1 ；50μΜ&Τ3，0. 25 μ 1 和 50μΜ&Τ40. 25 μ 1 或50μΜ&Τ5，0. 25 μ 1 和 50μΜ&Τ6，0. 25 μ 1 ；2XTaq PCR Master Mix, 25. 0 μ 1 ；ddH20, 23. 5 μ 1 ；反应循环条件94°C预变性 Imin ；94°C变性 30sec, 56°C退火 30sec，72°C延伸Imin 30sec，共32个循环；最后72°C延伸5min，反应完成；所述T5、T6的 序列分别如下上游引物 T5，5，-GTGGAATCTGGACCTATGAAG-3，， 下游引物 T6，5，-CCTCTAACTCCGAAAGCATCT-3 ；2)取5μ 1 PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶在100V，15min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。
7.权利要求1所述重组鲤鱼TOR基因在检测鲤鱼各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不 同状态下的TOR基因的表达情况中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，根据SEQID NO :1所示序列设计下述引物上游引物 TD1，5 ‘ -ATCATACGCATCCAGTCCATTG-3 ‘； 下游引物 TD2，5 ‘ -GGTCATTAGCCAGTAGAGTGTTC-3 ‘。采用荧光定量PCR扩增，20μ 1 PCR扩增体系中各组分及其比例为cDNA，2.0y 1 ； ΙΟμΜ 的 TDl，1.0y 1 ;10μΜ 的 TD2，1.0y 1 ;SYBR Premix Ex Taq II (2 X)，10. 0 μ 1 ； dH20，6. 0μ 1 ；反应循环条件95°C IOsec ；95 °C 5sec,60°C 30sec，共 44 个循环；最后延伸 720C 2min，反应完成。
全文摘要
本发明公开了一种重组鲤鱼TOR基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。重组鲤鱼TOR基因具有SEQ ID NO1所示的序列。重组鲤鱼TOR蛋白具有SEQ IDNO2所示的序列。本发明获得的鲤鱼TOR基因cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测TOR基因的组织表达特异性，也可进一步实现鲤鱼TOR基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载体上可能会表达出完整的TOR蛋白，进而可用于抗体生产，检测鲤鱼各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的TOR基因的表达情况等。
文档编号C12N15/54GK101899455SQ20101018012
公开日2010年12月1日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者冯琳, 刘扬, 周小秋, 姜俊 申请人:四川农业大学