专利名称：真菌的菌落pcr方法和鉴别病原性真菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌的菌落PCR方法和鉴别病原性真菌的方法。
背景技术：
目前，浅部真菌感染仍在人群中保持着很高的发病率和复发率，其中头癣、甲真菌 病、皮肤癣菌肉芽肿、复发性念珠菌性阴道炎等还存在着诊断和治疗方面的难题。而由于 免疫受损人群的不断扩大，深部真菌感染的发病率更是逐年快速增加，且往往威胁着所感 染宿主的生命，其救治的成功率取决于能否早期诊断和针对病原菌的治疗。引起各种真菌 感染的病原菌多达300余种，其中常见的亦多达50余种。不同的真菌种属对不同抗真菌 药物的敏感性有较大差异，如白念珠菌、烟曲霉虽依然是深部真菌感染的主要病原菌，但随 着预防性抗真菌治疗的增多和病原菌种的迁移变化，很多对临床常规用药不敏感甚至耐 药的病原菌明显增加，呈现非白念珠菌(如近平滑念珠菌)、非烟曲曲霉(如土曲霉等) 以及非曲霉丝状真菌(如镰刀霉等)感染比例逐渐增加的特点[Arendrup MC. Invasive fungal infections :past achievements and challenges ahead. Clin Microbiol Infect, 2009,15 (7) :599_601.]。由于深部真菌感染在临床早期没有特征性的表现，病原 学诊断存在很大困难，以至深部真菌感染的死亡率高达70% 90% [McCoy D，Depestel DD, Carver PL. Primary antifungal prophylaxis in adult hematopoietic stem cell transplant recipients -current therapeutic concepts. Pharmacotherapy,2009, 29(11) :1306-1325.]。目前临床上对真菌感染的诊断主要依靠病原菌形态学、血清学和组 织病理学等方法，包括直接镜检、真菌培养、小培养、半乳甘露聚糖抗原检测(GM试验)等， 有耗时长、敏感性低及难以鉴定到菌种等弊端，难以在发病早期检测并鉴别病原菌。现阶段分子生物学技术飞速发展，鉴别菌种的分子诊断技术层出不穷，凭借快速、 特异、敏感的优势越来越多地被应用于临床检验的各个领域。但这些技术都是以菌种模板 DNA的成功提取为基础的。常规PCR扩增前的真菌DNA制备需要经过破壁、抽提、沉淀、纯化 等步骤，常用的方法有CTAB法、液氮法等，DNA提取时间由2小时到6小时不等，操作繁琐， 有时需要昂贵的试剂和一些特殊处理，有些试剂本身，如酚、氯仿等不利于操作者的身体健 康，并有可能会有菌体色素等杂质的残留，会影响后续的PCR扩增等分子实验[Fredricks DN, Smith C, Meier A. Comparison of Six DNA Extraction Methods for Recovery of Fungal DNA as Assessed by Quantitative PCR[J], J Clin Microbiol,2005,43(10) 5122-5128.]。临床常见的标本有血清(浆)、全血、分泌物、脓液、体液、新鲜组织等，在这些标 本中有人体细胞或粘蛋白、杂质的混合，提取DNA时需要预处理，处理不充分或不恰当，不 只会残留PCR反应抑制物，还会造成真菌模板DNA的流失，使本来就含量甚微的DNA更加 少，常规PCR可能检测不到，极易得到假阴性的结果[Bretagne S, Costa JM. Towards a molecular diagnosis of invasive aspergillosis and disseminated candidosis[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2005,45 (3) :361_318.]。现在我国临床检验科室极少使用直接从临床标本提取DNA的方法，正是由于该方法较难操作，实现这个跨越可能还会需要 一段时间。菌落PCR(Colony PCR)技术最早见于 D. Gussow 和 T. Clackson 的文章[Gussow D, Clackson T.Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction [J]. Nucleic Acids Res，1989，17 (10) :4000.]，是指以培养基 上生长的菌落为目标，经简单的煮沸和冷冻等物理方法，可不必提取基因组DNA，直接以菌 体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省去了繁琐的提取DNA过程，节省了时间，通常 利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。但由于本方法只用热裂解的方式破坏菌 体，以往最常用于细菌，而真菌细胞外层有较厚的细胞壁，由骨架(不溶性多糖晶体组成的 微细纤维)和基质(高分子复合物)构成，结构非常致密，单纯用热力裂解细胞较难，所以 罕见有用菌落PCR技术进行真菌学方面的实验研究，仅见到有零星的有关酵母菌方面的应 用，未见到用于丝状真菌的研究报告。
发明内容
本发明提供一种真菌的菌落PCR方法，扩增的阳性率高。本发明还提供了鉴别病原性真菌的方法，采用上述真菌的菌落PCR方法，检测时 间短、结果可靠。所述真菌的菌落PCR方法为，将真菌培养物接种于培养基上，进行培养，培养基上 刚长出肉眼可见的菌落，作为实验可用菌落，制备DNA模板，进行菌落PCR扩增。所述鉴别病原性真菌的方法，将临床标本或病原性真菌培养物接种于培养基上， 进行培养，培养基上刚长出肉眼可见的菌落，作为实验可用菌落，制备DNA模板，进行菌落 PCR扩增，检测扩增产物。上述培养基和培养温度，为公知常识，一股采用PDA培养基，在28°C下培养。菌落PCR的反应体系与普通的PCR体系相同，包含4iil 10X缓冲液，1.5iil MgCl2溶液，2iil dNTP溶液，上、下游引物各0. 5iil，DNA模板(0. 5 2) yl，Taq DNA聚合 酶2U，其中MgCl2溶液、dNTP溶液、引物的浓度分别为10mmol/L、10 u mol/L、10 u mol/L。DNA模板的制备方法为当真菌为丝状真菌时，制备DNA模板的方法为在20 yl无菌IX TE缓冲液中加入 高压灭菌的石英砂，加入实验可用菌落菌丝体，煮沸5min，然后立即冷冻5 lOmin，反复2 次，然后涡旋3 5min，12000 14000r/min离心5 lOmin，取上清液作为DNA模板；当 真菌为酵母菌时，制备DNA模板的方法为在20 yl无菌IX TE缓冲液加入实验可用菌落菌 体，煮沸3min，然后立即冷冻5 lOmin, 12000 14000r/min离心5 lOmin，取上清液作 为DNA模板。作为本领域公知常识，冷冻温度为-15 -20°C。作为优选方案，当真菌为丝状真菌时，制备DNA模板的方法为在20 yl无菌 1 X TE缓冲液中加入高压灭菌的石英砂，加入少量实验可用菌落菌丝体，煮沸5min，然后立 即置于_20°C下冷冻5min，反复2次，然后涡旋5min，14000r/min离心5min，取上清液作为 DNA模板；当真菌为酵母菌时，制备DNA模板的方法为在20iU无菌IX TE缓冲液加入少 量实验可用菌落菌体，煮沸3min，然后立即置于-20°C下冷冻5min，14000r/min离心5min，取上清液作为DNA模板。具体的操作步骤如下丝状真菌准备0. 2ml的无菌PCR管，加入少量高压灭菌的 石英砂，加入20 yl无菌IX TE缓冲液，备用。用取菌针刮取少量菌丝体，加入准备好的PCR 管中，标记，盖紧，煮沸，然后立即置于冰箱中进行冷冻，反复2次，放于涡旋器涡旋。然后离 心，取上清液作为模板进行PCR反应。其中，石英砂的用量一股为40-60 yg。酵母样 菌准备0. 2ml的无菌PCR管，加入20 yl无菌1 X TE缓冲液，备用。用取菌环刮取少量菌 体，加入准备好的PCR管中，标记，盖紧。煮沸，然后立即置于冰箱中冷冻，离心后，取上清液 llil作为模板进行PCR反应。真菌细胞外层有较厚的细胞壁，有保护菌体的作用。细胞壁的主要成分是多糖，组 成细胞壁的骨架(不溶性多糖晶体组成的微细纤维)和基质(高分子复合物)，结构非常 致密。而组成微细纤维的骨架中，丝状真菌以几丁质为主，酵母菌以葡聚糖为主。一种真菌 的细胞壁组分并不是固定的，在其不同生长阶段，细胞壁的成分有明显不同[Griffin Dff, Kellogg CA, Peak KK, et al. A rapid and efficient assay for extracting DNA from fungi [J], Lett Appl Microbiol, 2002, 34(3) :210_214.]。在菌种生长早期，真菌细胞壁主 要由几丁质层和蛋白质层两层构成，在菌种生长成熟期则由几丁质层、蛋白质层、葡聚糖蛋 白层和质层葡聚糖层四层构成。申请人经研究发现，在丝状真菌生长早期进行DNA模板制 备，能够成功进行PCR扩增，用生长成熟的菌落制备模板则不能，所以选择生长早期的菌落 进行实验是本发明菌落PCR实验成功的关键所在。选择早期菌落有如下优点制备的DNA与成熟菌落提取的DNA完全一致，且减少了 黑色素等杂质的混合，提高了 PCR扩增的阳性率，最重要的是临床应用时缩短诊断时间，为 临床治疗赢得时间。在所有的菌落PCR反应中，申请人都设置了阴性对照和阳性对照，由于菌落PCR的 特异性较普通PCR差，阴性对照和阳性对照非常有必要，可以减少假阳性或假阴性的结果， 以免混淆检测者对结果的分析。另外，经过煮沸、冻解后暴露出来的DNA要及时地进行PCR 反应，不能放置太久，否则扩增的效果变差。本发明提高了真菌菌落PCR扩增的阳性率，解决了真菌基因组DNA提取步骤繁 琐、破壁难、耗时长等问题，并在病原菌生长最初期即可进行菌种鉴定，较常规真菌表型 鉴定时间明显缩短，且结果可靠，其临床意义和价值在于明显缩短了确认菌种、确认诊断 的时间，而有研究显示深部真菌感染，治疗时间相差48小时就会导致死亡率的显著差异 [Nolla-Salas J, Sitges-Serra A, Leon-Gil C, et al. Candidemia in non-neutropenic critically ill patients analysis of prognostic factors and assessment of systemic antifungal therapy. Study Group of Fungal Infection in the ICU[J]. Intensive Care Med,1997,23(1) :23_30.]。
图1为16株菌种菌落PCR电泳结果M :100bp Ladder ；1 阴性对照；2 阳性对照 (烟曲霉)3 烟曲霉；4 黄曲霉；5 土曲霉；6 黑曲霉；7 杂色曲霉；8 尖端赛多孢；9 串 珠镰刀菌；10 尖孢镰刀菌；11 蓝色犁头霉；12 多变根毛霉；13 伞枝犁头霉；14 冻土毛 霉；15 微小毛霉；16 指状青霉；17 扩展青霉；18 绳状青霉。
图2为菌落PCR与常规PCR扩增产物电泳图M :100bp Ladder ；1 阴性对照；2 阳 性对照(烟曲霉)3、5、7、9、11、13、15为常规PCR结果；4、6、8、10、12、14、16为菌落PCR结 果；3、4为烟曲霉；5、6为黄曲霉；7、8为土曲霉；9,10为黑曲霉；11、12为杂色曲霉；13,14 为尖端赛多孢；15、16为串珠镰刀菌。图3为应用实施例1的菌落PCR扩增结果M :50bp标准参照物；1 阴性对照；2 阳 性对照(烟曲霉)；3 酵母菌落；4 丝状菌落。图4为应用实施例2标准菌株多重PCR电泳图M :50bp标准参照物；1 阴性对照； 2 烟曲霉；3 红色毛癣菌；4 近平滑念珠菌。图5为应用实施例2的临床株多重PCR电泳图M :50bp标准参照物；1 阴性对照； 2:阳性对照(烟曲霉)；3 13分别为临床株1 11。
具体实施例方式实施例11.菌落培养将实验所用丝状真菌在无菌条件下接种于制备好的PDA培养基上，28°C培养7 14d，待菌落生长成熟后，用无菌取菌针刮取少量菌丝或孢子到100 yl无菌生理盐水中，振 荡涡旋，尽量使菌丝团分散，取少量做好的菌溶液接种于PDA平板培养基上，28°C培养20 40h左右(具体视菌落生长情况而定)，培养基上长出肉眼可见的菌落，视为实验可用菌落。2.菌落PCR的DNA模板制备方法取0.2ml的无菌PCR管，加入少量高压灭菌的石英砂，加入20 ill无菌IX TE缓冲 液，备用。用取菌针刮取少量上述菌丝体，加入准备好的PCR管中，标记，盖紧，100°C煮沸 5min,然后立即置于-20°C冰箱中5min，反复2次，放于涡旋器涡旋5min。14000r/min离心 5min，取上清液1 y 1作为模板进行PCR反应。3.PCR 扩增用真菌通用引物ITS 1和ITS 4，PCR反应体系25 iil，含4 ill 10X缓冲液， 1. 5u 1 MgCl2(10mmol/L) ,2u 1 dNTPmix(10umol/L)，引物(lOumol/L)各0. 5ii 1，DNA模板 2u l,Taq DNA聚合酶2U。反应条件为 95°C 5min预变性后.95°C lmin，52°C lmin，72°C lmin, 共进行30个循环.最后72°C延伸lOmin。扩增产物采用1. 5%琼脂糖凝胶进行电泳，每个 加样孔点样4iU，电泳缓冲液为1XTAE，恒压80V，电泳约30min。电泳结束后，取琼脂糖凝 胶在凝胶成像仪上紫外线透射下观察结果并摄片。反应设阴性对照和阳性对照，阴性对照 用去离子水代替DNA模板，阳性对照用常规方法提取并检测过的烟曲霉的DNA基因组。结果显示，在所有实验所用的7属16种菌种中，均成功扩增出阳性条带，PCR产物 电泳具体结果见图1。4. ITS区基因序列分析PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行碱基序列测定，并与网上已知菌种 ITS区片段序列对比。测序结果见表1。表1:16株菌测序结果 5.菌落PCR与常规PCR的比较为了鉴别菌落PCR反应结果的可靠性，在相同条件下，用前期实验所提的7种丝状 真菌(烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、串珠镰刀菌和尖端赛多孢)的基因组模 板进行的常规PCR反应进行对比。菌落PCR结果与常规PCR电泳图结果一致，但条带稍暗， 见图2。在国内将菌落PCR应用于真菌的研究尚未见报道，国外应用于酵母菌的报道稍 多，用于丝状真菌的研究仅见于两位日本学者，但都不是单纯的直接菌落PCR，而是借助特 殊的试剂或缓冲液。以学者Alshahni匪等在2009年的研究为例，在所用的3属20种35 株丝状真菌中，直接菌落PCR实验阳性菌株只有11例，阳性率为31.4%。他们实验中所用的 烟曲霉、土曲霉、黄曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、扩展青霉和串珠镰刀菌都没有成功扩增，而本 发明均成功进行了菌落PCR并获得阳性结果。分析实验结果差别较大的原因在于，Alshahni MM等所用菌丝体为生长7 10d的成熟菌落，而本发明中所用菌落为生长最初期的菌落。应用实施例1 在皮下真菌感染病原菌鉴定中的应用1. 1临床资料患者男，7月婴儿，4个月前无明显原因于右侧眼角处发生红色丘疹，顶端有脓疱， 继而破溃，在皮损周围发生多个类似皮损，逐渐增多蔓延至眼周皮肤、右侧面颊、鼻部、额部 等处，皮损为浸润性红斑结节，含有较多脓液，在当地门诊及医院多次用针头抽脓处理，并 给予青霉素、庆大霉素等抗生素静滴，皮损仍继续扩展。2010年3月29日来中国医学科学院皮肤病医院门诊就诊。皮肤科检查右侧面部、额部、鼻梁及左侧内眼角可见大片浸润性 红斑结节，中央皮损融合成片，上覆较厚黄棕色痂皮，右眼睑上方皮损明显凹陷，大小约为 lcmX 3cm，右眼睁眼受限。皮损边缘为多个隆起的红色结节，部分融合，约0. 5cmX lcm lcmX 1. 5cm大小，结节表面光滑，部分可见脓头，质软，右耳下有一个lcmX 3cm红色结节， 压之有波动感。1. 2 方法真菌学实验室检查菌落PCR基因组DNA模板制备真菌培养出2种菌落，分别为丝状菌落和酵母菌 落，丝状菌落基因组DNA模板制备方法同实施例1，酵母菌落基因组DNA模板制备方法为 在20iU无菌1XTE缓冲液加入少量菌体，100°C煮沸3min，然后立即置于-20°C冰箱中冷 冻5min，14000r/min离心5min，取上清液作为DNA模板。PCR 扩增对制备的每一菌落PCR基因组DNA模板，分别进行PCR扩增，具体方法同实施例1。ITS区基因序列分析1.3菌落PCR扩增结果结果见图3。1. 4产物测序结果测序片段如上图所示，为ITS1和ITS4之间的ITS区序列，酵母菌落测序结果显示 为489bp，丝状菌落测序结果显示为557bp，经BLAST(网址http //blast, ncbi. nlm. nih. Rov/Blast. cRi)比对后，酵母菌落为近平滑念珠菌，丝状菌落为细极链格孢。测序诊断与形 态学诊断一致。1. 5 讨论本实验中收集1例皮下真菌感染患者，该患者为7月大婴儿，发病部位在面部，病 理取材受到限制，无法得到组织病理及特殊染色结果，在这种情况下，真菌学的证据显得尤 为重要。该患者皮损表面及痂下多次真菌镜检和培养均为阳性，在真菌培养后的第3天，长 出肉眼可见的两种菌落，挑取进行菌落PCR的检测，从处理标本到PCR扩增结束共需要3h 时间，然后送测序，第2天可以得到测序结果，从取材到得到测序结果共需要5天时间。传统 形态学方法鉴定酵母菌落为近平滑念珠菌约耗时7d，鉴定丝状真菌为链格孢约耗时10d。 菌落PCR测序结果与后来的丝状真菌小培养和念珠菌的柯玛嘉显色培养鉴定结果一致，验 证了菌落PCR的正确性。实施例21.菌落培养真菌采用标准菌菌株烟曲霉，培养方法同实施例1。2.菌落PCR的DNA模板制备方法同实施例1。3.PCR 扩增多重PCR体系引物用真菌通用引物NS，皮肤癣菌特异性引物和酵母菌特异性引 物(见表 2)。PCR 反应体系 25 iil，含 4 ill 10X 缓冲液，1.5iU MgCl2 (10mmol/L), 2 u 1 dNTPmix(10umol/L)，引物(10 u mol/L)各 0. 5 ii 1，DNA 模板 2u 1, Taq DNA 聚合酶 2U。反应条件为95°C 5min预变性后.95 V lmin，52°C lmin，72°C lmin，共进行30个循环.最后 72°C延伸lOmin。扩增产物采用1. 5%琼脂糖凝胶进行电泳，每个加样孔点样4 yl，电泳缓 冲液为1XTAE，恒压80V，电泳约30min。电泳结束后，取琼脂糖凝胶在凝胶成像仪上紫外线 透射下观察结果并摄片。反应设阴性对照，阴性对照用去离子水代替DNA模板。实施例3除真菌采用标准菌菌株红色毛癣菌，其余同实施例2。实施例41.菌落培养真菌采用标准菌菌株近平滑念珠菌，培养方法同实施例1。2.菌落PCR的DNA模板制备方法在20iU无菌1XTE缓冲液加入少量菌体，100°C煮沸3min，然后立即置于_20°C 冰箱中冷冻5min，14000r/min离心5min，取上清液作为DNA模板。3. PCR 扩增同实施例2。结果如图4所示，实施例2-4能分别扩增出310bp、450bp和271bp大小的片段。应用实施例22. 1临床资料收集的临床标本对象为医科院皮研所真菌检验室的浅部真菌病患 者，均为真菌镜检阳性标本，其中股癣6例，手癣2例，甲真菌病3例。2. 2 方法真菌学实验室检查菌落PCR基因组DNA模板制备同临床实施例1。PCR扩增对制备的每一菌落PCR基因组DNA模板，分别进行PCR扩增，具体方法 同实施例2。表2 多重PCR所用特异性引物情况 2. 3多重PCR反应结果11株临床株用上述多重PCR反应体系进行鉴定，结果电泳图见图5，根据50bp Ladder对比并与标准株图谱比较可以鉴别真菌到种属。临床株1 7及11均为皮肤癣菌， 临床株8和10首先考虑为丝状真菌属。浅部真菌病是最常见的真菌感染性疾病，世界范围内人群患病率为20% 25%， 浅部真菌病的主要病原菌为皮肤癣菌，但酵母菌所占的比例较以前有大幅增多。将病原菌 快速鉴定至种属水平对临床指导用药有重大意义。现真菌培养鉴定菌种需要14天，得到药
9敏结果需要21天，个别菌种生长较慢，需要时间更长。本实验所用的多重PCR体系为本发明研究者前期工作中所建立，在同一体系中能 够鉴别3个种属的菌种，即皮肤癣菌、酵母菌和丝状真菌。若3对引物扩增均为阳性，则提 示可能为皮肤癣菌、酵母和霉菌，或皮肤癣菌和酵母的混合感染；若前2对引物扩增阳性， 则提示可能为皮肤癣菌和霉菌的混合感染或皮肤癣菌的单纯感染；若第1对和第3对引物 扩增阳性，则提示可能为酵母和霉菌的混合感染或酵母的单纯感染；若仅有第1对引物扩 增阳性，则可能为霉菌的单纯感染。这样，在较短时间内，为临床医生提供了病原菌的参考 信息，医生结合临床表现可以选择针对某一患者的最适药物。实验结果也显示，该反应体系比较稳定，能扩增出清晰的目的片段，未见明显非特 异性条带的干扰，同时用PDA培养基进行了真菌培养，培养鉴定结果同菌落多重PCR结果一 致。说明菌落PCR技术能够用于浅部真菌感染的临床检测，初步鉴定到种属需要3-5天的 时间。由于时间仓促，本发明研究者只收集了十余例标本，旨在验证菌落PCR的可行性，没 有进行大规模的临床资料与菌种资料的实验研究。本实验的成功为以后的研究奠定了一定 的实验基础，该方法操作简单，所用试剂较少，省时省力，特别适合大规模的实验研究，明显 缩短实验研究周期。
权利要求
一种真菌的菌落PCR方法，其特征在于，将真菌培养物接种于培养基上，进行培养，培养基上刚长出肉眼可见的菌落，作为实验可用菌落，制备DNA模板，进行菌落PCR扩增。
2.如权利要求1所述的真菌的菌落PCR方法，其特征在于，当真菌为丝状真菌时，制备 DNA模板的方法为在20 μ 1无菌1 XTE缓冲液中加入高压灭菌的石英砂，加入实验可用 菌落菌丝体，煮沸5min，然后立即冷冻5 lOmin，反复2次，然后涡旋3 5min，12000 14000r/min离心5 lOmin，取上清液作为DNA模板。
3.如权利要求1所述的真菌的菌落PCR方法，其特征在于，当真菌为酵母菌时，制备 DNA模板的方法为在20 μ 1无菌1 X TE缓冲液加入实验可用菌落菌体，煮沸3min，然后立 即冷冻5 IOmin, 12000 14000r/min离心5 lOmin，取上清液作为DNA模板。
4.如权利要求2或3所述的真菌的菌落PCR方法，其特征在于，冷冻温度 为-15 -20°C。
5.一种鉴别病原性真菌的方法，其特征在于，将临床标本或病原性真菌培养物接种于 培养基上，进行培养，培养基上刚长出肉眼可见的菌落，视为实验可用菌落，制备DNA模板， 进行菌落PCR扩增，检测扩增产物。
6.如权利要求5所述的鉴别病原性真菌的方法，其特征在于，当病原性真菌为丝状真 菌时，制备DNA模板的方法为在20 μ 1无菌1 X TE缓冲液中加入高压灭菌的石英砂，加入 少量菌丝体，煮沸5min，然后立即冷冻5 lOmin，反复2次，然后涡旋3 5min，12000 14000r/min离心5 lOmin，取上清液作为DNA模板。
7.如权利要求5所述的鉴别病原性真菌的方法，其特征在于，当病原性真菌为酵母菌 时，制备DNA模板的方法为在20 μ 1无菌1 X TE缓冲液加入少量菌体，煮沸3min，然后立 即冷冻5 lOmin，12000 14000r/min离心5 lOmin，取上清液作为DNA模板。
8.如权利要求6或7所述的鉴别病原性真菌的方法，其特征在于，冷冻温度 为-15 -20°C。
全文摘要
本发明涉及真菌的菌落PCR方法，扩增的阳性率高。本发明还涉及鉴别病原性真菌的方法，检测时间短、结果可靠。所述真菌的菌落PCR方法为，将真菌培养物接种于培养基上，进行培养，培养基上刚长出肉眼可见的菌落，作为实验可用菌落，制备DNA模板，进行菌落PCR扩增。所述鉴别病原性真菌的方法，将临床标本或病原性真菌培养物接种于培养基上，进行培养，培养基上刚长出肉眼可见的菌落，作为实验可用菌落，制备DNA模板，进行菌落PCR扩增，检测扩增产物。本发明提高了真菌菌落PCR扩增的阳性率，解决了真菌基因组DNA提取步骤繁琐、破壁难、耗时长等问题，并在病原菌生长最初期即可进行菌种鉴定，较常规真菌表型鉴定时间明显缩短，且结果可靠。
文档编号C12Q1/68GK101851684SQ20101022757
公开日2010年10月6日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者刘维达, 吕桂霞, 张晓利, 沈永年, 王淼淼, 葛一平, 鲍伟 申请人:中国医学科学院皮肤病研究所